Name: השתקת BRCA2 לזיהוי פונקציות ביולוגיות-מוסדר BRCA2 רומן בתאי אדם בתרבית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: למדו להשתיק את BRCA2 בתאי אדם בתרבית באמצעות siRNA ו-Western blotting. שיטה זו מאפשרת זיהוי יעיל של חלבונים במשקל מולקולרי גבוה ומסייעת בחקר ביולוגיית סרטן.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענקי FIRB-Merit RBNE08YFN3_005 ו-RBNE08HWLZ_012, ומשרד הכלכלה והאוצר האיטלקי ל-CNR עבור הפרויקט "FaReBio di Qualità".

1. הכן את פתרונות siRNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend 5 nmol של מקושקשת (Ctrl) ו -5 nmol של כדורים מיובשים BRCA2 siRNA במים RNase ללא 100 μl (ריכוז siRNA סופי: 50 מיקרומטר). זהו מניית siRNA וחייבים להיות מאוחסנים ב -20 ° C ב 10 aliquots μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח aliquot של 10 μl ממניות siRNA ולהוסיף 40 μl מים RNase ללא להשיג הפתרון עובד 10 מיקרומטר siRNA. דילול זה חייב להיות מאוחסן ב -20 ° C עד לשימוש. הערה: הפתרון עובד siRNA לא צריך לעבור הקפאה / פשרה יותר מ 3 פעמים. </li></ol> 2. זריעה של שורות תאי אפיתל האדם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את מדיום גידול משורות תאי אפיתל אדם גדלו כמו monolayers תא בצלחות תרבית רקמת חממה humidified על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים בצלחת פעם אחת עם RT PBS (10 מיליליטר של PBS לצלחת 100 מ&quot;מ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לנתק את התאים מהצלחת,להוסיף 2 מיליליטר של טריפסין 0.25% / 0.53 פתרון mM EDTA ודגירה 3-5 דקות, תלוי בסוג התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני איסוף התאים מנותקים, לנטרל טריפסין על ידי הוספת 2 מיליליטר של מדיום גידול מלא המכיל 10% בסרום שור עוברי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את תאי צינור 15 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה התאים ב320-330 XG במשך 3 דקות על 4 מעלות צלזיוס בהרוטור דלי מתנדנד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את כדורי תא ב5 מיליליטר של מדיום אנטיביוטיקה-חינם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת התאים תחת מיקרוסקופ בתא &quot;שודד גופות או על ידי שימוש במערכת ספירה אוטומטית בהתאם להוראות היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרעי התאים בצלחות 6-גם להיות מחוברים כ -80% לאחר 24 שעות (0.5-1 x10 6 תאים ב 2 מיליליטר של מדיום לכל טוב). מספר תאים אופטימלי לזרע עשוי להשתנות בהתאם לשורות תאים הספציפיות וקצב הצמיחה. הערה: אל תוסיף אנטיביוטיקה במדיום בשלב זה בגלל אנטיביוטיקה שלילי להפריע ליעילות של transfeסיפורת. זה מאוד חשוב כי התאים במעברים נמוכים תרבות (&lt;10) כדי להשיג יעילות גבוהה של transfection BRCA2 siRNA. </li></ol> 3. תאי Transfect עם siRNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עשרים וארבע שעות לאחר ציפוי התאים, להמשיך בסיבוב הראשון של transfection. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל 6 μl של מגיב transfection שומנים מבוסס siRNA ספציפי 10 ב -130 μl של מדיום סרום מופחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל 3 μl של 10 מיקרומטר siRNA (30 pmol) ב -130 μl של מדיום סרום מופחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את siRNA המדולל עם מגיב transfection המדולל ודגירה של 5-10 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך הדגירה, להסיר את המדיום מן התאים ולהוסיף 2 מיליליטר של מדיום טרי מחומם מראש על 37 מעלות צלזיוס (ללא אנטיביוטיקה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 250 μl של המתחמים מגיב siRNA-transfection לתאים (סכום זה הוא לטוב אחד של צלחת 6-היטב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים בחממה humidified ב 3776; C עם 5% CO 2. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 24 שעות, להמשיך בסיבוב השני של transfection ידי חזרה על שלבי 3.1.1-3.1.5 עם השינוי הבא לצעד 3.1.2: לדלל 5 μl של 10 מיקרומטר siRNA (50 pmol) ב -130 μl של מדיום סרום מופחת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים במשך 1-2 ימים על 37 מעלות צלזיוס לפני הניתוח. הערה: שני סבבים של transfections ושימוש ביחס מגיב siRNA / transfection הגבוה בסיבוב השני הם חיוניים כדי לקבל יעילות גבוהה של השתקת BRCA2. </li></ol></li></ol> 4. תאי Lyse לניתוח immunoblotting <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מאגר תמוגה טרי עם PBS (pH 7.4) המכיל 1% מאינם denaturing octylphenoxypolyethoxyethanol nonionic, חומרי הניקוי, pyrophosphate נתרן 5 מ&quot;מ, orthovanadate נתרן 1 מ&quot;מ, פלואוריד נתרן 10 מ&quot;מ, פלואוריד phenylmethylsulfonyl 2 מ&quot;מ, 10 מיקרוגרם / מיליליטר leupeptin, 10 מיקרוגרם / מיליליטר aprotinin. שמור את זה על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדיום מן התאים וwאפרם פעם אחת עם PBS הקר (2 מיליליטר / טוב) בצלחת. כדי למנוע כל שריד PBS, להסיר אותו לחלוטין מהצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200 μl של חיץ תמוגה היטב כל אחד. הערה: אם התאים צריכים לשמש גם למבחנים אחרים, trypsinize התאים כמתואר בשלב 2.1-2.6 וresuspend התאים במאגר / בינוני מתאימים בהתאם ליישום לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות לסובב את הצלחת להפיץ באופן אחיד מאגר תמוגה ודגירה במשך 15 דקות ב 4 ° C על הכתף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את lysate התא בצינור microcentrifuge על קרח באמצעות מגרד תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 17900 XG במשך 25 דקות ב 4 מעלות צלזיוס ולאסוף את supernatant בצינור חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד את ריכוז החלבון באמצעות assay חלבון זמין מסחרי על פי הוראות היצרן. </li></ol> ניתוח immunoblotting 5. BRCA2 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את המאגר פועל על ידי דילול 50 מיליליטר של 20x טריס-אצטט SDS ב פועליםuffer (50 מ&quot;מ tricine, 50 מ&quot;מ טריס בסיס, 0.1% SDS, pH 8.24) עם 950 מיליליטר של מים מזוקקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את המדגם באופן הבא: להוסיף 15 מיקרוגרם בסך הכל lysate תא, 5 μl של חיץ מדגם 4x מכיל סולפט dodecyl ליתיום ב- pH 8.4, 2 μl 10x מדגם סוכן צמצום (0.5 M DTT) של, ומאגר תמוגה לנפח סופי של 20 μl. הערה: פרוטוקול זה מאפשר זיהוי של BRCA2 בשורות תאים נורמלים גם בעת שימוש בכמות נמוכה יותר של חלבונים כולל (עד 5 מיקרוגרם). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפגל דגימות ב 55 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. הערה: זה חיוני כדי להשתמש 55 מעלות צלזיוס. מאז חלבון BRCA2 הוא thermosensitive 11, טמפרטורות denaturing גבוהות לגרום לאובדן של באורך מלא בשלמות (390 KDA) חלבון BRCA2 עקבי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקים את תא electrophoretic לפי הוראות היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את הדגימות ו -10 μl לסטנדרטים של חלבון משקל מולקולרי גבוה מראש צבעונית על ג&#39;ל precasted (טריס-אצטט 3-8%) ולהפעיל ב 120 V לabמתוך 2 שעות 12. לעצור את ריצת electrophoretic לפני הסמן הכחול kDa 55 משאיר את הג&#39;ל precasted. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את חיץ ההעברה עם 50 מיליליטר של 20x חיץ העברה, של מתנול 100% 100 מיליליטר ו -850 מיליליטר מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל קרום PVDF (גודל נקבובית 0.45 מיקרומטר) על ידי השרייה במתנול 100% במשך 5 דקות, לשטוף עם מים מזוקקים ולאזן במאגר העברה לפחות במשך 5 דקות. משרים את ספוגים של מנגנון ההעברה בהעברת חיץ על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר electrophoretic הריצה נגמרה, להרכיב את הכריך בערימת ההעברה בהזמנה (מלמטה למעלה) הבאה: שלושה ספוגים רוויים במאגר העברה, גיליון נייר כיתה 3 מ&quot;מ אחד רווי במאגר העברה, ג&#39;ל, קרום PVDF הופעל, אחד 3 מ&quot;מ גיליון נייר כיתה רווי במאגר העברה, שלושה ספוגים רוויים במאגר העברת 13,14. הנח את המחסנית לתוך חלבוני המנגנון והעברה ב 350 מילי-אמפר לשעה 4 על 4 מעלות צלזיוס או 180 מילי-אמפר הלילה ב 4 מעלות צלזיוס. הערה: להיות BRCA2 חלבון גדול מאוד, זה הוא חיוני כדי להאריך את זמן העברה מהשעה 1 (כפי שהוצע על ידי היצרן ורוב פרוטוקולי העברה) 4 שעות או לילה על מנת להבטיח העברה של חלבוני משקל מולקולריים גבוהים מלאה. בנוסף, בשל הזמן ארוך העברה, זה הכרחי כדי לבצע את סופג בחדר קר ב 4 ° C כדי למזער התחממות יתר ולהקל פירוק כריך. מערכות העברת חצי יבשות הן לא טובות להעברת חלבונים גדולים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר העברה, לשטוף את הממברנה עם כפות, לחסום אותו במשך שעה 1 ב RT ב0.25% TBS-Tween (TBS-T) המכילה חלב ללא שומן 5% יבשים ובדיקת הלילה ב 4 ° C עם נוגדן הארנב polyclonal 30 μl אנטי-BRCA2 ( 200 מיקרוגרם / מיליליטר), בדילול מלא 9 מיליליטר TBS-T + 5% שומן חלב יבש [1: 300 (V / V) דילול]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הממברנה שלוש פעמים (10 דקות כל אחד) עם כפות-T, אז דגירה המסנן עבור שעה 1 עם 1 μl של נוגדן נגד ארנב חזרת peroxidase מצומדות המשני מדולל ב 10 מיליליטר של TBS-T + 5% שומן חלב יבש. לאחר מכן, לשטוף את הממברנה שלוש פעמים (10 דקות כל אחד) עם כפות-T. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע immunodetection ידי ECL לחשוף חלבון BRCA2 באמצעות chemiluminescence המשופרת (ECL) מערבית סופג איתור מגיב, הבאים להוראות היצרן. דמיינו להקות immunochemiluminescent בסרטים ברזולוציה גבוהה ECL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע immunodetection עם נוגדן לגן משק, כמו β-טובולין (55 KDA), באותו המסנן בקרת טעינה באמצעות נוגדנים חד שבטיים לβ-טובולין בדילול של 1: 1,000 (10 μl של נוגדן אנטי-טובולין ב 10 מיליליטר TBS-T + 5% חלב יבש ללא שומן) במשך שעה 1 ב RT. לשטוף דגירה נוגדנים משני כמתואר עבור BRCA2 (5.10-5.11), פרט לשימוש בחזרת אנטי עכבר peroxidase מצומדות במקום נוגדנים משני נגד ארנב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש תמונה דיגיטלית של הסרטים הרשימו עם להקות immunochemiluminescent ולנתח את עוצמת הלהקה על ידי תוכנת ניתוח תמונה ייעודית (לדוגמא., ImageJ). </li></ol>

<ol><li>Thorslund, T., West, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRCA2%3A+a+universal+recombinase+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">BRCA2: a universal recombinase regulator.</a> Oncogene. 26, 7720-7730 (2007).</li>
<li>Yoshida, K., Miki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+BRCA1+and+BRCA2+as+regulators+of+DNA+repair%2C+transcription%2C+and+cell+cycle+in+response+to+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Sci%22%5BJournal%5D)">Role of BRCA1 and BRCA2 as regulators of DNA repair, transcription, and cell cycle in response to DNA damage.</a> Cancer Sci. 95, 866-871 (2004).</li>
<li>Martin, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+mutations+in+BRCA1+and+BRCA2+in+breast-ovarian+families+from+a+breast+cancer+risk+evaluation+clinic%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Germline mutations in BRCA1 and BRCA2 in breast-ovarian families from a breast cancer risk evaluation clinic.</a> J Clin Oncol. 19, 2247-2253 (2001).</li>
<li>Castro, E., Eeles, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+BRCA1+and+BRCA2+in+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Asian+J+Androl%22%5BJournal%5D)">The role of BRCA1 and BRCA2 in prostate cancer.</a> Asian J Androl. 14, 409-414 (2012).</li>
<li>Vencken, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemosensitivity+and+outcome+of+BRCA1-+and+BRCA2-associated+ovarian+cancer+patients+after+first-line+chemotherapy+compared+with+sporadic+ovarian+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Oncol%22%5BJournal%5D)">Chemosensitivity and outcome of BRCA1- and BRCA2-associated ovarian cancer patients after first-line chemotherapy compared with sporadic ovarian cancer patients.</a> Ann Oncol. 22, 1346-1352 (2011).</li>
<li>Farmer, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+DNA+repair+defect+in+BRCA+mutant+cells+as+a+therapeutic+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Targeting the DNA repair defect in BRCA mutant cells as a therapeutic strategy.</a> Nature. 434, 917-921 (2005).</li>
<li>Arbini, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+DNA+depletion+sensitizes+cancer+cells+to+PARP+inhibitors+by+translational+and+post-translational+repression+of+BRCA2%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogenesis%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial DNA depletion sensitizes cancer cells to PARP inhibitors by translational and post-translational repression of BRCA2.</a> Oncogenesis. 2, e82(2013).</li>
<li>Yang, F., Guo, X., Yang, G., Rosen, D. G., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AURKA+and+BRCA2+expression+highly+correlate+with+prognosis+of+endometrioid+ovarian+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Mod+Pathol%22%5BJournal%5D)">AURKA and BRCA2 expression highly correlate with prognosis of endometrioid ovarian carcinoma.</a> Mod Pathol. 24, 836-845 (2011).</li>
<li>Guaragnella, N., Marra, E., Galli, A., Moro, L., Giannattasio, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+of+BRCA2+decreases+anoikis+and+its+heterologous+expression+sensitizes+yeast+cells+to+acetic+acid-induced+programmed+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">Silencing of BRCA2 decreases anoikis and its heterologous expression sensitizes yeast cells to acetic acid-induced programmed cell death.</a> Apoptosis. 19, 1330-1341 (2014).</li>
<li>Mahato, R. I., Rolland, A., Tomlinson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cationic+lipid-based+gene+delivery+systems%3A+pharmaceutical+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm+Res%22%5BJournal%5D)">Cationic lipid-based gene delivery systems: pharmaceutical perspectives.</a> Pharm Res. 14, 853-859 (1997).</li>
<li>Su, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+BRCA2%3A+temperature+sensitivity+of+detection+and+cell-cycle+regulated+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Characterization of BRCA2: temperature sensitivity of detection and cell-cycle regulated expression.</a> Oncogene. 17, 2377-2381 (1998).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227, 680-685 (1970).</li>
<li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets%3A+procedure+and+some+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76, 4350-4354 (1979).</li>
<li>Burnette, W. N. ' <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%27Western+blotting%27%3A+electrophoretic+transfer+of+proteins+from+sodium+dodecyl+sulfate--polyacrylamide+gels+to+unmodified+nitrocellulose+and+radiographic+detection+with+antibody+and+radioiodinated+protein+A%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">'Western blotting': electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate--polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A.</a> Anal Biochem. 112, 195-203 (1981).</li>
<li>Hunter, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+targeting+of+hypoxia+and+homologous+recombination+repair+dysfunction+in+triple-negative+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">Dual targeting of hypoxia and homologous recombination repair dysfunction in triple-negative breast cancer.</a> Mol Cancer Ther. , (2014).</li>
<li>Drew, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+potential+of+poly%28ADP-ribose%29+polymerase+inhibitor+AG014699+in+human+cancers+with+mutated+or+methylated+BRCA1+or+BRCA2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Therapeutic potential of poly(ADP-ribose) polymerase inhibitor AG014699 in human cancers with mutated or methylated BRCA1 or BRCA2.</a> J Natl Cancer Inst. 103, 334-346 (2011).</li>
<li>Bryant, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+killing+of+BRCA2-deficient+tumours+with+inhibitors+of+poly%28ADP-ribose%29+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Specific killing of BRCA2-deficient tumours with inhibitors of poly(ADP-ribose) polymerase.</a> Nature. 434, 913-917 (2005).</li>
<li>Ihnen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+potential+of+the+poly%28ADP-ribose%29+polymerase+inhibitor+rucaparib+for+the+treatment+of+sporadic+human+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">Therapeutic potential of the poly(ADP-ribose) polymerase inhibitor rucaparib for the treatment of sporadic human ovarian cancer.</a> Mol Cancer Ther. 12, 1002-1015 (2013).</li>
<li>Jeong, J. H., Jo, A., Park, P., Lee, H., Lee, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brca2+Deficiency+Leads+to+T+Cell+Loss+and+Immune+Dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cells%22%5BJournal%5D)">Brca2 Deficiency Leads to T Cell Loss and Immune Dysfunction.</a> Mol Cells. , (2015).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

בגלל מוטציות בתאי מין של עופרת גן BRCA2 לעלייה בסיכון למספר סוגי הסרטן, כוללים סרטן נשי וגברי השד, סרטן השחלות, סרטן הערמונית, סרטן לבלב, ולנומה 3,4, מספר מחקרים נעשו על מנת להבין את התפקיד הביולוגי של חלבון BRCA2. רוב המחקרים האלה הם בעיקר מבוסס גנטיים בשל קשיים טכניים בניתוח חלבון ענק כמו BRCA2. השיטה המתוארת כאן להשתקה וניתוח ביטוי חלבון BRCA2 מספקת כלי יעיל כדי לחקור את הפונקציות של הגן המדכא גידולי BRCA2 בקשת רחבה של מבחני ביולוגיים. פרוטוקול ההשת...

גן BRCA2 (רגישות לסרטן שד גן-2) מקודד לחלבון מדכא גידולים שממלא תפקיד מכריע בתיקון הפסקות פעמיים גדיל DNA על ידי המסדיר את התפקוד של אנזים recombinase 1 Rad51. BRCA2 גם היה מעורב באפנון של שעתוק ובבקרת מחזור תא 2. מוטציות בתאי מין בגן BRCA2 לגרום רגישות אוטוזומלית דומיננטית לסרטן שד ושחלות בנשים וסרטן הערמונית אצל גברים, כמו גם נטייה לסוגי סרטן אחרים 3,4. עם זאת, למרות העלייה בסיכון בהתפתחות סרטן, מוטציות BRCA2 המדכאות או להפחית פונקצית BRCA2 עלול להפוך תאים סרטניים פגיעים יותר לתרופות כימותרפיות הגורמות לניזק לדנ&quot;א 5-7. סרטן סדיר להציג שיעור נמוך של מוטציות BRCA2 (&lt;3%) למרות שרמות מופחתות של חלבון BRCA2 של אותרו בכמה סוגי הסרטן, טוען כי חלבון BRCA2עלול ללכת לאיבוד במהלך tumorigenesis בסרטן סדיר באמצעות מנגנונים שאינן מוטציה תלויה 7,8. לכן, חשוב להבין באופן מלא פונקציות BRCA2 בהקשר של ביולוגיה של הסרטן, כמו גם בהגדרות ביולוגיות אחרות. כלי רב עוצמה המשמש לזיהוי פונקציות רומן של גן בתאי יונקים הוא להשתיק את ביטויה. כדוגמא, ביטוי BRCA2 השתקה במגוון רחב של תאי האפיתל נורמלים הוביל לאחרונה לזיהוי של תפקוד רומן של BRCA2 כרגולטור של התנגדות anoikis, צעד חשוב ברכישה של תאים סרטניים יכולת פולשנית וגרורתי 9. השתקת גנים יכולה להיות מושגת על ידי החדרת בתאים או RNA הקטן מפריע (si) או מולקולות RNA סיכה קצרה (SH) מיקוד הגן הספציפי. העוצמה הגבוהה של siRNA וקלות שימוש להפוך אותו לכלי המועדף להשתקת ניסויים שמטרתם תובנה חדשות תהליכים ביולוגיים קריטייםND לזהות מטרות טיפוליות חדשניות. עם זאת, מציאה יעילה של ביטוי גנים לא יכולה להיות ברת השגה בקלות לכל הגנים ויכולה להיות מאוד משתנה בהתאם לסוג התא. בגלל ירידה ברמות חלבון תאיות הוא הפנוטיפ הרלוונטי ביותר בחקירה, חשוב לכמת השתקת גנים על ידי immunoblotting ניתוח של מוצר הגן. עם כל כבוד זה, חלבון BRCA2 מציב אתגר נוסף: להיות חלבון גדול (כ 390 KDA), קשיים טכניים קיימים לאנליזה ביוכימית קונבנציונלית, כוללים immunoblotting. אנו מדווחים כאן פרוטוקול מותאם להשתקה יעילה של BRCA2 בשורות תאי אפיתל אדם ולזיהוי מהיר ומוצלח חלבון BRCA2 מציאה ידי immunoblotting ניתוח.

<table><tbody><tr><td>BRCA2 siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>L-003462-00</td><td>SMARTpool: ON-TARGETplus BRCA2 siRNA</td></tr><tr><td>Ctrl siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>&nbsp; D-001810-10-05</td><td>ON-TARGETplus</td></tr><tr><td>ריאגנט RNAiMAX ליפופקטמין</td> בריכה לא ממוקד&nbsp;<td>Life Technologies</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/13778075">13778075</a></td><td>Transfection Reagent</td></tr><tr><td>OPTI-MEM I סרום מופחת Medium</td><td>Life Technologies</td><td>31985-070</td><td>מדיום להליך טרנספקציה</td></tr><tr><td>NuPAGE Tris-Acetate 3-8% 1,5 מ"מ ג'ל טרומי</td><td>Life Technologies</td><td>EA0378</td><td>ג'ל לאלקטרופורזה של חלבון</td></tr><tr><td>NuPAGE LDS מאגר לדוגמא&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>NP0007</td><td>מגיב לאלקטרופורזה של חלבון</td></tr><tr><td>NuPAGE חומר להפחתת דגימה (פי 10)</td><td>Life Technologies</td><td>NP0004</td><td>מגיב לאלקטרופורזה של חלבון</td></tr><tr><td>NuPAGE Antioxidant</td><td>Life Technologies</td><td>NP0005</td><td>מגיב לאלקטרופורזה של חלבון</td></tr><tr><td>HiMark תקן חלבון צבוע מראש</td><td>Life Technologies</td><td>LC5699</td><td>סמן צבוע מראש לג'ל אלקטרופורזה</td></tr><tr><td>XCell SureLoc Mini-Cell&nbsp; System</td><td>Life Technologies</td><td>EI0002</td><td>ציוד לאלקטרופורזה/העברה של חלבונים</td></tr><tr><td>NuPAGE Tris-Acetate SDS Running Buffer</td><td>Life Technologies</td><td>LA0041</td><td>מגיב למערב ספוג</td></tr><tr><td>PVDF ממברנה</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td>Reagent למערב ספיגה</td></tr><tr><td>NuPAGE Transfer Buffer</td><td>Life Technologies</td><td>NP0006-1</td><td>מגיב לספיגה מערבית</td></tr><tr><td>BRCA2 H-300 ארנב נוגדן פוליקלונלי</td><td>סנטה קרוז ביוטכנולוגיה</td><td>SC-8326</td><td>1:300 דילול</td></tr><tr><td>בטא-טובולין נוגדן חד שבטי</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>T4026-100UL</td><td>1:1,000 דילול</td></tr><tr><td>אבקת חלב רזה</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>70166</td><td>מגיב לספיגה מערבית</td></tr><tr><td>טווין-20</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>P1379</td><td>מגיב לספיגה מערבית</td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico/Femto Chemiluminescent Substrate</td><td>Pierce Thermo Scientific</td><td>34080/34096</td><td>תאי מערכת כימילומינסנציה</td></tr><tr><td>תאי PNT1A</td><td>SIGMA Aldrich (עבור ECACC)</td><td>95012614</td><td>PNT1A אנושי, אפיתל ערמונית תקין אימורטליזציה עם תאי SV40</td></tr><tr><td>Nthy</td><td>SIGMA Aldrich (עבור ECACC)</td><td>90011609</td><td>Nthy-ori 3-1 קו תאים אנושי, תאי אפיתל זקיקי בלוטת התריס</td></tr><tr><td>התפשטות תאים ערכה I (MTT)</td>ערכת <td>Roche</td><td>11465007001</td><td>לבדיקות שגשוג תאים</td></tr></tbody></table>

השתקת<em&gt; brca2</em&gt; לזיהוי פונקציות ביולוגיות-מוסדר brca2 רומן בתאי אדם בתרבית

Silencing of BRCA2 to Identify Novel BRCA2-regulated Biological Functions in Cultured Human Cells

השתקה של BRCA2 החלבון המדכא הסרטן וגילויה על ידי ניתוח ביוכימי קונבנציונלי מהווה אתגר טכני גדול בגלל הגודל הגדול של חלבון BRCA2 האנושי (כ 390 KDA). אנו מדווחים שינויים של פרוטוקולי transfection וimmunoblotting siRNA סטנדרטיים להשתיק BRCA2 האנושי ולזהות חלבון אנדוגני BRCA2, בהתאמה, בשורות תאי אפיתל אנושיות. צעדים עיקריים כוללים siRNA גבוה יחס מגיב transfection ושני סיבובים הבאים של transfection siRNA בתוך אותו הניסוי. באמצעות שינויים אלה ואחרים לפרוטוקול הסטנדרטי באופן עקבי להשיג השתקה יותר מ -70% מגן BRCA2 האנושי כמו להישפט על ידי immunoblotting ניתוח עם נוגדנים נגד BRCA2. בנוסף, denaturation של lysates התא ב 55 מעלות צלזיוס במקום C הקונבנציונלי 70-100 מעלות ואופטימיזציות טכניות אחרות של הליך immunoblotting לאפשר זיהוי חלבון BRCA2 שלם של אפילו ש&quot;שen סכומים נמוכים מאוד של חומר מוצא זמינים או כאשר רמות ביטוי חלבון BRCA2 הן נמוכות מאוד. השתקה יעילה של BRCA2 בתאים אנושיים מציעה אסטרטגיה יקרה להפריע לפעילות של BRCA2 בתאים עם BRCA2 שלם, כוללים תאים סרטניים, לבחון מסלולים מולקולריים חדשים ותפקודים תאיים שעלולים להיות מושפע על ידי מוטציות BRCA2 פתוגניים בגידולים. העיבוד של פרוטוקול זה להשתקה וניתוח של חלבונים אחרים &#39;גדולים&#39; כמו BRCA2 יעילים צריך להיות בר השגה בקלות.

לפני שתמשיך עם assay ביולוגי / ביוכימי לבחון את ההשפעה של השתקת BRCA2 על פונקציות תא, הצעד הראשון הוא לאשר את הספציפיות של ההשתקה באמצעות siRNA מקושקשת (ללא מיקוד siRNA) זה לצד זה עם BRCA2 siRNA (איור 1 א ). חשוב לבצע סיבוב של transfection siRNA שני עם יחס גבוה siRNA / transfection כדי לקבל יעילות גבוהה של השתקת BRCA2. ואכן, ביצוע רק סיבוב אחד של transfection siRNA או באמצעות siRNA נמוך יחס transfection בסיבוב השני (25 pmol של siRNA ו -6 μl של מג...

השתקת גנים על ידי siRNA מייצגת אסטרטגיה ניסויית נוחה לניתוח פונקציות ביולוגיות תלויות BRCA2 עם השלכות מיידיות להבנה טובה יותר של הביולוגיה של הסרטן. מוצגת שיטה להשתקה יעילה של BRCA2, יחד עם ההליך הניסיוני לאיתור וכימות שינויים בביטוי חלבון BRCA2 על ידי אימונובלוטינג בשורות תאים אנושיים.

השתקת<em&gt; BRCA2</em&gt; לזיהוי פונקציות ביולוגיות-מוסדר BRCA2 רומן בתאי אדם בתרבית

Silencing of the tumor suppressor protein BRCA2 and its detection by conventional biochemical analyses represent a great technical challenge owing to the ...

המטרה הכללית של הליך זה היא להשתיק את הביטוי של B RCA two באמצעות טרנספקציה של SIR A. דבר זה מושג תחילה על ידי הכנת קומפלקסים של SIR a וחומר ריאגנט לטרנספקציה. לאחר מכן, מבוצע סבב ראשון של טרנספקציה על ידי הוספה טיפה-טיפה של הקומפלקסים לשכבה אחת של תאים שנמצאים ב-80% co fluency. לאחר מכן, מבוצע סבב שני של טרנספקציית SIR a תוך שימוש ביחס גבוה יותר של SIR A לריאגנט הטרנספקציה.לבסוף, שוטפים את השכבות החד-שכבתיות של התאים ב-PBS קר מאוד, ומבצעים ליזיס לתאים בטמפרה של 4°C באמצעות באפר ליזיס מבוסס דטרגנט. לבסוף, נעשה שימוש בניתוח Western blotting כדי להראות השתקה של B RCA A two ברמת החלבון. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות הוא שהיא מאפשרת השתקה יעילה של גנים וכן זיהוי אופטימלי של חלבונים בעלי משקל מולקולרי גבוה, כגון מדכא הגידול B RCA two. כדי להתחיל, לאחר גידול של שכבות חד-שכבתיות של תאי אפיתל אנושיים ב-37°C ו-5% carbon dioxide בתא לח, מסירים את מצע הגידול ומשתמשים ב-PBS בטמפרטורת החדר לשטיפת התאים.כדי לנתק את התאים מהפלטה, יש להוסיף 2 mL של תמיסת trypsin 0.25% ו-EDTA 0.53 mM ולהדגיר למשך שלוש עד חמש דקות, בהתאם לסוג התא. יש לנטרל את ה-trypsin על ידי הוספה של 2 mL של מצע גידול מלא המכיל 10% FBS לפני העברת התאים לפרועת 15 mL. יש להניח את הפרועות ברוטור מסוג swinging bucket ולסבב בצנטריפוגה במהירות של 320 עד 330 Gs ובטמפרטורה של 4 °C למשך שלוש דקות.השתמשו ב-5 mL של מצע ללא אנטיביוטיקה כדי לסספנד מחדש את המשקעים לפני ספירת התאים באמצעות תא בורקר (Burker chamber) או מערכת ספירה אוטומטית. לאחר מכן, שתלו כ-0.5 עד 1×10⁶ תאים ב-2 mL של מצע ללא אנטיביוטיקה בכל באער של פלטת 6 באערים, והדגרימו למשך 24 שעות עד להגעה ל-80% התמסכות (confluency). לאחר ההדגירה, התמידו בסבב הראשון של טרנספקציה על ידי דילול של 6 µL של ריאגנט טרנספקציה ספציפי ל-irna מבוסס ליפידים ב-130 µL של מצע עם סרום מופחת.דללו 3 µL של S irna בריכוז 10 µM בתוך 130 µL של מצע עם סרום מופחת. ערבבו את ה-irna המדולל עם ריאגנט טרנספקציה מדולל והדגירו למשך 5 עד 10 דקות בטמפרטורת החדר. במהלך ההדגרה, הסירו את המצע מהתאים והוסיפו 2 mL של מצע טרי ללא אנטיביוטיקה.חממו מראש בטמפרטורה של 37 °C. לאחר מכן, הוסיפו 250 µL של קומפלקס ריאגנט הטרנספקציה של ה-siRNA לכל באער של תאים בלוח בעל שישה באערים. לאחר מכן, דגרו את התאים באינקובטור לח בטמפרטורה של 37 °C עם 5% CO2.לאחר 24 שעות, יש לדלל 5 µL של 10 µM siRNA ב-130 µL של מצע סרום מופחת ולהמשיך לסבב שני של טרנספקציה כפי שהודגם. הריכוז הגבוה של siRNA בסבב השני חיוני להשגת יעילות גבוהה של השתקה כפולה של Brca.דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 °C למשך יום עד יומיים לפני האנליזה, כדי להכין ליזט תאים (cell lysate) עבור אנליזת אימונו-בלוטינג (immuno blotting). הכינו באפר ליזיס (lysis buffer) טרי לפי המתכון המוצג כאן. הסירו את המצע מהתאים והוסיפו 2 mL לכל באר של PBS קר מהקרח כדי לשטוף את התאים.לאחר מכן, הסירו לחלוטין את ה-PBS מהפלטה והוסיפו 200 microliters של lysis buffer קר מאוד לכל באר. סובבו בעדינות את הפלטה כדי להפיץ את ה-lysis buffer באופן אחיד והדגירו במכשיר סיבוב (rotator) בטמפרטורה של ארבעה degree Celsius למשך 15 דקות. לאחר מכן, השתמשו בגרד תאים (cell scraper).אספו את ליזאט התאים לשפופרת מיקרו-צנטריפוגה על קרח, סובבו בצנטריפוגה במהירות של 17,900 Gs ובטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך 25 דקות, ואספו את העלייה (supernatant) לביצוע אנליזת אימונו-בלוטינג (immuno blotting). הכינו את תמיסת ההרצה על ידי דילול של 50 milliliters של 20 x tris acetate SDS running buffer ב-950 milliliters של מים מזוקקים. הכינו את הדגימה באופן הבא.הוסיפו 15 µg של ליזט תאים כולל. הוסיפו 5 µL של באפר דגימה בריכוז פי 4 המכיל ליתיום ESAL sulfate pH 8.4, 2 µL של 0.5 M DTT ובאפר ליזיס לנפח כולל של 20 µL. דנטורו את הדגימות בטמפרטורה של 55 °C למשך 10 דקות.חיוני להשתמש בטמפרטורה זו מאחר שחלבון RCA two רגיש לחום. לאחר מכן, הכינו את תא האלקטרופורזה לפי הוראות היצרן. לאחר מכן, טענו את הדגימות עם 10 µL של סטנדרט חלבון לצביעה חוזרת בעל משקל מולקולרי גבוה לתוך ג'ל מוכן מראש, והריצו במתח של 120 V למשך כשעתיים.בינתיים, הכינו את תמיסת ההעברה עם 50 milliliters של 20 x transfer buffer, 100 milliliters של 100% methanol ו-850 milliliters של מים. הפעילו את ממבנה ה-PVDF על ידי השריה ב-100% methanol למשך חמש דקות. שטפו במים מזוקקים והמתינו להשמה בתמיסת ההעברה למשך חמש דקות לפחות.השרו את הספוגים של מכשיר ההעברה במאפר העברה בטמפרה של 4 °C עד לשימוש. הפסיקו את ההרצה לפני שהסמן הכחול של 55 kilodalton יוצא מהג'ל המוכן מראש (precast gel) והרכיבו את ה"סנדוויץ'", החל משלושה ספוגים השרויים במאפר העברה. לאחר מכן, הניחו דף נייר אחד בעובי 3 mm הרווי בבופר העברה.בשלב הבא, הוסיפו את הג'ל, לאחר מכן את ממבני ה-PVDF המופעל, ואשריהם בנייר דרג 3M ספוג בבופר ובסוף שלושה ספוגים ספוגים. הניחו את הערימה במכשיר והעבירו את החלבונים בזרם של 350 milliamps למשך ארבע שעות ובטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס, או בזרם של 180 milliamps ובטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס למשך הלילה. לאחר ההעברה, השתמשו ב-TBS כדי לשטוף את הממברנה ובצעו חסימה למשך שעה עם TBST וחלב רזה מיובש בריכוז 5%.לאחר מכן, החליפו את הבאפר בתשעה מיליליטרים של TBST milk buffer המכיל 30 µL של נוגדן שפנפני פוליקלונלי anti BCA two, והדגירו בטמפרטורה של 4 °C למשך לילה. לאחר שטיפת הממברנה שלוש פעמים עם TBST למשך 10 דקות בכל פעם, הדגירו את המסנן למשך שעה אחת עם 1 µL של נוגדן משני anti rabbit המשולב עם horse radish peroxidase, המדולל ב-10 מיליליטרים של TBST milk buffer. לאחר שטיפת הממברנה שלוש פעמים, בצעו גילוי אימונולומינצנציה בשיטת KEMMA לפי הוראות היצרן.הדמיאו את הפסים על סרטי ECL ברזולוציה גבוהה כדי לאשר את הספציפיות של השתיקה של B rca. A two. irna scrambled שימש לצד B RCA two irna כפי שמוצג כאן; כפי שהוזכר קודם לכן, חשוב לבצע סבב שני של טרנספקציית irna עם יחס טרנספקציה גבוה של irna כדי להשיג יעילות גבוהה של השתיקה של B RCA A two.התוצאות המוצגות כאן מראות את ההבדל ביעילות הש knockdown בהתאם לסוג התא, כאשר נעשה שימוש ביחס נמוך לעומת גבוה של siRNA לת transfection. הזמן המינימלי האופטימלי להשגת הרמה הגבוהה ביותר של השתקה גנית עשוי להשתנות לאחר סבב שני של transfection של siRNA; כך למשל, כפי שמוצג בדמות זו, 24 שעות מספיקות לתאי בלוטת התריס NTHY, אך נדרשים עד 48 שעות עבור knockdown יעיל של BRCA2 בתאי פרוסטטה PNT1A. השתקה של BRCA2 יציבה למדי עד היום השביעי לאחר סבב ה-transfection השני. כפי שהוזכר קודם לכן, דנטורציה של ליזאטים של תאים בטמפרטורה מעל 55 °C גורמת לאובדן של עד 50% מחלבון BRCA2.בניסוי זה, נבדקה הרגישות של תאי PNT one A שבהם הושתק B RCA A שתיים למעכב PARP שנקרא rucaparib, לאחר טיפול בתרופה למשך 24 שעות. נצפתה ירידה תלוית-זמן בשגשוג התאים בתאי PNT one A שבהם נוضب B RCA שתיים בהשוואה לקבוצות הביקורת. לאחר צפייה בסרטון זה, תיווצר הבנה טובה כיצד להשתיק גנים ארוכים המקודדים לחלבונים באמצעות CRNA, וכיצד לזהות ביעילות את תוצר החלבון שלהם באמצעות פרוצדורת חסימה אימונולוגית (immuno blockin) מותאמת, מעבר ל-BRC שתיים.ניתן להחיל גישה זו על חלבונים גדולים ומאתגרים רבים אחרים, בייחוד כאשר הם מובעים ברמות נמוכות מאוד בתאים.

silencing-brca2-to-identify-novel-brca2-regulated-biological

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אנו מספקים שיטה לבדיקת גרסאות BRCA1 ב assay רקמה תרבות המבוססת לתיקון הומולוגיים רקומבינציה של נזק לדנ"א על ​​ידי depleting החלבון BRCA1 אנדוגני מתא באמצעות RNAi והחלפתו מוטציה נקודת BRCA1 המכיל לשנות קידוד.

זיהוי השפעות של מוטציות BRCA1 על רקומבינציה הומולוגיים באמצעות תאים אקספרס BRCA1 אנדוגני wild-type

מולקולרי איתות דרך גם אסטרוגן ומייקרו RNA הם קריטיים בהתפתחות סרטן השד וצמיחה. אסטרוגן מפעיל את קולטני האסטרוגן, שהם גורמי שעתוק. גורמי שעתוק רבים יכולים לווסת את הביטוי של מיקרו RNA, והוא יכול להיות צדודית מיקרו RNA מוסדר אסטרוגן תוך שימוש בטכניקות שונות בקנה מידה גדולה.

פרופיל של מיקרו RNA המוסדר אסטרוגן בתאי סרטן השד

העשרת gDNA לריצוף NGS היא כלי קל ורב עוצמה לחקר מוטציות חוקתיות. במאמר זה, אנו מציגים את ההליך לניתוח פשוט של הרצף המלא של 11 גנים המעורבים בתיקון נזק ל-DNA.

gDNA העשרה על ידי טכנולוגיה מבוססת Transposase לניתוח NGS של הרצף השלם של BRCA1, BRCA2, ו -9 גנים המעורבים בתיקון נזק לדנ"א

כאן, ניטור בזמן אמת של חילוף החומרים של תאי הגידול, בשילוב עם מודל ממברנה כוריו-אלנטואית של עובר עוף (CAM) של גרורות, משמשים להערכת מטרות/סוכנים אנטי-סרטניים חדשים על יכולתם לעורר רגישות לתאי גידול לכימותרפיה הפוגעת ב-DNA.

הערכת היעילות של תרופות למלחמה בסרטן רגישות<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; In vivo</em

זיהוי מטרות תרופות חדשות שעוברות מניסויים פרה-קליניים לניסויים בבני אדם הוא בראש סדר העדיפויות המדעי. לשם כך, אנו מתארים כאן גישה גנומית פונקציונלית לבחינת ההשפעה של דלדול גנים על ספרואידים בקו תאים סרטניים, אשר מודלים בצורה מתאימה יותר סרטן אנושי in vivo.

ניצול הקרנת Genomics פונקציונלית כדי לזהות מטרות תרופה חדשנית פוטנציאלי תרבויות אליפטית תא סרטני

רגולציה של הסביבה כרומטין הוא תהליך חיוני הדרוש עבור ביטוי נאות גנים. כאן, אנו מתארים שיטה לפיקוח על ביטוי גנים דרך הגיוס של שינוי כרומטין מכונות באופן ספציפי ג'ין הפיך.

הדחקת שעתוק גנים על ידי ניתוב מחדש מכונות הסלולר עם המגבילים Epigenetic כימי

אנשים עם מוטציות BRCA1 יש סיכון גבוה יותר לפתח סרטן, אשר מצדיק הערכה מדויקת של הפונקציה של גרסאות BRCA1. בזאת, תיארנו פרוטוקול להערכה פונקציונלית של גרסאות BRCA1 באמצעות עורכי בסיס ציטוצין בתיווך CRISPR המאפשרים המרת C:G ממוקדת ל- T:A בתאים חיים.

הערכה פונקציונלית של גרסאות BRCA1 באמצעות עורכי בסיס בתיווך CRISPR

פרוטוקול זה מתאר זרימת עבודה של עריכת גנים של גנים חוזרים פלינדרומיים קצרים (CRISPR) בתפוקה גבוהה, המקובצים באופן קבוע, עבור ניתוח רשת של אשכולות מיקרו-רנ"א, המאפשרת ייצור מהיר של פאנל של קווי תאים מהונדסים גנטית הנושאים שילובי מחיקה ייחודיים של חברי אשכול miRNA בגודל של עד 35 קילו-בתים בתוך ניסוי יחיד.

כלי עריכת גנים CRISPR לניתוח רשת אשכולות מיקרו-רנ"א

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבחירה חוץ גופית של מדכאי שעתוק מהונדסים (ETR) עם יעילות השתקה גבוהה, ארוכת טווח, יציבה, על המטרה ופעילות נמוכה מחוץ למטרה. תהליך עבודה זה מאפשר לצמצם רפרטואר ראשוני ומורכב של תעודות סל מועמדות לרשימה קצרה, המתאימה להערכה נוספת במסגרות רלוונטיות מבחינה טיפולית.

במבחנה בחירת מדכאי שעתוק מהונדסים להשתקה אפיגנטית ממוקדת

מחקר זה מציג מערכת CRISPRi כפולה המכוונת ל-RNA ארוכים שאינם מקודדים בתאי מלנומה. הוא מאפשר הפלת גנים קומבינטוריים ובדיקה קטלנית סינתטית, זיהוי אינטראקציות lncRNA ספציפיות לסרטן לאסטרטגיות טיפוליות פוטנציאליות.

אסטרטגיית הפרעות CRISPR כפולות למיקוד אינטראקציות קטלניות סינתטיות בין RNA לא מקודדים בתאים סרטניים

למדו להשתיק את BRCA2 בתאי אדם בתרבית באמצעות siRNA ו-Western blotting. שיטה זו מאפשרת זיהוי יעיל של חלבונים במשקל מולקולרי גבוה ומסייעת בחקר ביולוגיית סרטן.

השתקת

גלה סרטונים נוספים