השתקת

המטרה הכללית של הליך זה היא להשתיק את הביטוי של B RCA two באמצעות טרנספקציה של SIR A. דבר זה מושג תחילה על ידי הכנת קומפלקסים של SIR a וחומר ריאגנט לטרנספקציה. לאחר מכן, מבוצע סבב ראשון של טרנספקציה על ידי הוספה טיפה-טיפה של הקומפלקסים לשכבה אחת של תאים שנמצאים ב-80% co fluency. לאחר מכן, מבוצע סבב שני של טרנספקציית SIR a תוך שימוש ביחס גבוה יותר של SIR A לריאגנט הטרנספקציה.

לבסוף, שוטפים את השכבות החד-שכבתיות של התאים ב-PBS קר מאוד, ומבצעים ליזיס לתאים בטמפרה של 4°C באמצעות באפר ליזיס מבוסס דטרגנט. לבסוף, נעשה שימוש בניתוח Western blotting כדי להראות השתקה של B RCA A two ברמת החלבון. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות הוא שהיא מאפשרת השתקה יעילה של גנים וכן זיהוי אופטימלי של חלבונים בעלי משקל מולקולרי גבוה, כגון מדכא הגידול B RCA two. כדי להתחיל, לאחר גידול של שכבות חד-שכבתיות של תאי אפיתל אנושיים ב-37°C ו-5% carbon dioxide בתא לח, מסירים את מצע הגידול ומשתמשים ב-PBS בטמפרטורת החדר לשטיפת התאים.

כדי לנתק את התאים מהפלטה, יש להוסיף 2 mL של תמיסת trypsin 0.25% ו-EDTA 0.53 mM ולהדגיר למשך שלוש עד חמש דקות, בהתאם לסוג התא. יש לנטרל את ה-trypsin על ידי הוספה של 2 mL של מצע גידול מלא המכיל 10% FBS לפני העברת התאים לפרועת 15 mL. יש להניח את הפרועות ברוטור מסוג swinging bucket ולסבב בצנטריפוגה במהירות של 320 עד 330 Gs ובטמפרטורה של 4 °C למשך שלוש דקות.

השתמשו ב-5 mL של מצע ללא אנטיביוטיקה כדי לסספנד מחדש את המשקעים לפני ספירת התאים באמצעות תא בורקר (Burker chamber) או מערכת ספירה אוטומטית. לאחר מכן, שתלו כ-0.5 עד 1×10⁶ תאים ב-2 mL של מצע ללא אנטיביוטיקה בכל באער של פלטת 6 באערים, והדגרימו למשך 24 שעות עד להגעה ל-80% התמסכות (confluency). לאחר ההדגירה, התמידו בסבב הראשון של טרנספקציה על ידי דילול של 6 µL של ריאגנט טרנספקציה ספציפי ל-irna מבוסס ליפידים ב-130 µL של מצע עם סרום מופחת.

דללו 3 µL של S irna בריכוז 10 µM בתוך 130 µL של מצע עם סרום מופחת. ערבבו את ה-irna המדולל עם ריאגנט טרנספקציה מדולל והדגירו למשך 5 עד 10 דקות בטמפרטורת החדר. במהלך ההדגרה, הסירו את המצע מהתאים והוסיפו 2 mL של מצע טרי ללא אנטיביוטיקה.

חממו מראש בטמפרטורה של 37 °C. לאחר מכן, הוסיפו 250 µL של קומפלקס ריאגנט הטרנספקציה של ה-siRNA לכל באער של תאים בלוח בעל שישה באערים. לאחר מכן, דגרו את התאים באינקובטור לח בטמפרטורה של 37 °C עם 5% CO2.

לאחר 24 שעות, יש לדלל 5 µL של 10 µM siRNA ב-130 µL של מצע סרום מופחת ולהמשיך לסבב שני של טרנספקציה כפי שהודגם. הריכוז הגבוה של siRNA בסבב השני חיוני להשגת יעילות גבוהה של השתקה כפולה של Brca.

דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 °C למשך יום עד יומיים לפני האנליזה, כדי להכין ליזט תאים (cell lysate) עבור אנליזת אימונו-בלוטינג (immuno blotting). הכינו באפר ליזיס (lysis buffer) טרי לפי המתכון המוצג כאן. הסירו את המצע מהתאים והוסיפו 2 mL לכל באר של PBS קר מהקרח כדי לשטוף את התאים.

לאחר מכן, הסירו לחלוטין את ה-PBS מהפלטה והוסיפו 200 microliters של lysis buffer קר מאוד לכל באר. סובבו בעדינות את הפלטה כדי להפיץ את ה-lysis buffer באופן אחיד והדגירו במכשיר סיבוב (rotator) בטמפרטורה של ארבעה degree Celsius למשך 15 דקות. לאחר מכן, השתמשו בגרד תאים (cell scraper).

אספו את ליזאט התאים לשפופרת מיקרו-צנטריפוגה על קרח, סובבו בצנטריפוגה במהירות של 17,900 Gs ובטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך 25 דקות, ואספו את העלייה (supernatant) לביצוע אנליזת אימונו-בלוטינג (immuno blotting). הכינו את תמיסת ההרצה על ידי דילול של 50 milliliters של 20 x tris acetate SDS running buffer ב-950 milliliters של מים מזוקקים. הכינו את הדגימה באופן הבא.

הוסיפו 15 µg של ליזט תאים כולל. הוסיפו 5 µL של באפר דגימה בריכוז פי 4 המכיל ליתיום ESAL sulfate pH 8.4, 2 µL של 0.5 M DTT ובאפר ליזיס לנפח כולל של 20 µL. דנטורו את הדגימות בטמפרטורה של 55 °C למשך 10 דקות.

חיוני להשתמש בטמפרטורה זו מאחר שחלבון RCA two רגיש לחום. לאחר מכן, הכינו את תא האלקטרופורזה לפי הוראות היצרן. לאחר מכן, טענו את הדגימות עם 10 µL של סטנדרט חלבון לצביעה חוזרת בעל משקל מולקולרי גבוה לתוך ג'ל מוכן מראש, והריצו במתח של 120 V למשך כשעתיים.

בינתיים, הכינו את תמיסת ההעברה עם 50 milliliters של 20 x transfer buffer, 100 milliliters של 100% methanol ו-850 milliliters של מים. הפעילו את ממבנה ה-PVDF על ידי השריה ב-100% methanol למשך חמש דקות. שטפו במים מזוקקים והמתינו להשמה בתמיסת ההעברה למשך חמש דקות לפחות.

השרו את הספוגים של מכשיר ההעברה במאפר העברה בטמפרה של 4 °C עד לשימוש. הפסיקו את ההרצה לפני שהסמן הכחול של 55 kilodalton יוצא מהג'ל המוכן מראש (precast gel) והרכיבו את ה"סנדוויץ'", החל משלושה ספוגים השרויים במאפר העברה. לאחר מכן, הניחו דף נייר אחד בעובי 3 mm הרווי בבופר העברה.

בשלב הבא, הוסיפו את הג'ל, לאחר מכן את ממבני ה-PVDF המופעל, ואשריהם בנייר דרג 3M ספוג בבופר ובסוף שלושה ספוגים ספוגים. הניחו את הערימה במכשיר והעבירו את החלבונים בזרם של 350 milliamps למשך ארבע שעות ובטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס, או בזרם של 180 milliamps ובטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס למשך הלילה. לאחר ההעברה, השתמשו ב-TBS כדי לשטוף את הממברנה ובצעו חסימה למשך שעה עם TBST וחלב רזה מיובש בריכוז 5%.

לאחר מכן, החליפו את הבאפר בתשעה מיליליטרים של TBST milk buffer המכיל 30 µL של נוגדן שפנפני פוליקלונלי anti BCA two, והדגירו בטמפרטורה של 4 °C למשך לילה. לאחר שטיפת הממברנה שלוש פעמים עם TBST למשך 10 דקות בכל פעם, הדגירו את המסנן למשך שעה אחת עם 1 µL של נוגדן משני anti rabbit המשולב עם horse radish peroxidase, המדולל ב-10 מיליליטרים של TBST milk buffer. לאחר שטיפת הממברנה שלוש פעמים, בצעו גילוי אימונולומינצנציה בשיטת KEMMA לפי הוראות היצרן.

הדמיאו את הפסים על סרטי ECL ברזולוציה גבוהה כדי לאשר את הספציפיות של השתיקה של B rca. A two. irna scrambled שימש לצד B RCA two irna כפי שמוצג כאן; כפי שהוזכר קודם לכן, חשוב לבצע סבב שני של טרנספקציית irna עם יחס טרנספקציה גבוה של irna כדי להשיג יעילות גבוהה של השתיקה של B RCA A two.

התוצאות המוצגות כאן מראות את ההבדל ביעילות הש knockdown בהתאם לסוג התא, כאשר נעשה שימוש ביחס נמוך לעומת גבוה של siRNA לת transfection. הזמן המינימלי האופטימלי להשגת הרמה הגבוהה ביותר של השתקה גנית עשוי להשתנות לאחר סבב שני של transfection של siRNA; כך למשל, כפי שמוצג בדמות זו, 24 שעות מספיקות לתאי בלוטת התריס NTHY, אך נדרשים עד 48 שעות עבור knockdown יעיל של BRCA2 בתאי פרוסטטה PNT1A. השתקה של BRCA2 יציבה למדי עד היום השביעי לאחר סבב ה-transfection השני. כפי שהוזכר קודם לכן, דנטורציה של ליזאטים של תאים בטמפרטורה מעל 55 °C גורמת לאובדן של עד 50% מחלבון BRCA2.

בניסוי זה, נבדקה הרגישות של תאי PNT one A שבהם הושתק B RCA A שתיים למעכב PARP שנקרא rucaparib, לאחר טיפול בתרופה למשך 24 שעות. נצפתה ירידה תלוית-זמן בשגשוג התאים בתאי PNT one A שבהם נוضب B RCA שתיים בהשוואה לקבוצות הביקורת. לאחר צפייה בסרטון זה, תיווצר הבנה טובה כיצד להשתיק גנים ארוכים המקודדים לחלבונים באמצעות CRNA, וכיצד לזהות ביעילות את תוצר החלבון שלהם באמצעות פרוצדורת חסימה אימונולוגית (immuno blockin) מותאמת, מעבר ל-BRC שתיים.

ניתן להחיל גישה זו על חלבונים גדולים ומאתגרים רבים אחרים, בייחוד כאשר הם מובעים ברמות נמוכות מאוד בתאים.