הדמיה חיה של צילה Ependymal בחדרים לרוחב של מוח העכבר

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לספק תצפית ex vivo של פעימות Motr append CLIA הממוקמות בתוך פרונטריקולים (חדרים) של מוח העכבר. דבר זה מושג תחילה על ידי קצירת המוח השלם ולאחר מכן השגת חתכים דקים דרך הפרונטריקולים הלטרליים. בשלב הבא, הפרוסות מדגרות בצלחת עם תחתית זכוכית מותאמת אישית המכילה מצע עם רמת גלוקוז גבוהה בטמפרטורת הגוף כדי לשמור על הרקמה חיה במהלך הניסוי.

לבסוף, פעימות הריסונים נרשמות באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות הפרעה דיפרנציאלית (DIC) ברזולוציה גבוהה. בסופו של דבר, ניתן להדמיות את המבנה ואת לוקליזציית החלבונים של הריסונים באמצעות דימוי אימונופלורסצנציה. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני השיטה הקיימת שלנו הוא שזוהי הטכניקה הראשונה המאפשרת סיווג של תאי האפידרמיס לשלוש קבוצות נפרדות, בהתבסס על תדרי החזרה והזוויות הייחודיים של הריסונים שלהם.

זהו ממצא חיובי. ההשלכות של טכניקה זו משתמעות לכיוון הטיפול בהידרוצפלוס, מאחר שתפקוד לקוי של ה-CLIA האפידרמלי מוביל להצטברות של נוזל מוחי-שרירי במוח.

חדרים בלב. את הפרוצדורה ידגימו גברת זאהה עלם וגברת חנה סאט, סטודנטיות מוכשרות מאוד מהמעבדה שלנו. התחילו בניקוי ראשו של עכבר בוגר באמצעות 70% ethanol. לאחר מכן, החל מהחלק העליון של הראש, השתמשו במספריים ופינצטה סטריליות כדי להסיר את העור ולחשוף את הגולגולת.

לאחר מכן, רפאו את העצם חלק אחר חלק, החל מהצד האחורי לכיוון הצד הקדמי. כדי להסיר את הגולגולת, הוציאו את המוח כולו והניחו אותו בצלחת פטרי של 100 millimeter עם מצע בעל ריכוז גלוקוז גבוה בטמפרטורה של 37 degrees Celsius. באמצעות להב חד, חתכו את המוח במישור הסגיטלי החצוי כדי לקבל את החתך הראשון בעובי 100 to 200 micron מכל חצי.

לאחר מכן, שטפו את החתכים ב-PBS בטמפרטורה של 37 °C, והעבירו מיד את הרקמה למדיום גלוקוז לעיניים ב-37 °C. כדי לדגום את החתכים, הניחו את פרוסות המוח בצלחות תרבית עם תחתית זכוכית בנפח 30 mm המכילות 1 mL של מדיום גלוקוז גבוה, וכוונו את סביבת תא המיקרוסקופ הסגור ל-37 °C ו-5% carbon dioxide תוך שימוש בעדשת שמן (oil immersion) בפיעור של 60x. לאחר מכן, התמקדו בתאים באמצעות אור תמסור DIC רגיל.

לאחר מכן, עקבו אחר כיוון תנועת בועת ה-DMEM כמדריך לאיתור ה-append clia הניידות. השתמשו במסנן DIC כדי לבחור אזור המכיל תאים בריאים עם CLIA ניידות בחדר הצדי של המוח. לאחר זיהוי ה-append clia, כווננו את התאורה והמיקוד כדי לקבל תמונה מספקת.

בשלב הבא, הגדירו את פרמטרי הדימות החי בתוכנת הדימות. לדוגמה, כאן נרכשות תמונות של 24 bit כאשר ה-camera binning מוגדר כ-1x1 בשילוב עם עדשה של 60x וזמן חשיפה של 5 עד 10 milliseconds. פתחו את מפתח המיקרוסקופ לרמה האופטימלית עבור זמן חשיפה מינימלי ואספו את תמונות ה-DIC.

עקבו אחר התמונות בשידור חי המועברות למצלמה כדי לאפשר רכישת תמונות מהירה ומיידית ללא השהיה. ניתן לחשב את מהירות הפעימות על בסיס הדרישה לזמני חשיפה מינימליים להשגת ניגודיות תמונה מספקת להקלטת איתות סידן. לאחר חיתוך המוח, שטפו קצרה את הרקמה ב-PBS והדגירו מיד את הפרוסות ב-20 µg/mL של lu O2 שהוכן טרי, בתוך פלטה עם תחתית זכוכית.

לאחר 30 דקות ב-37 degrees Celsius, רשמו את תנודות הסידן בקצב לכידה של חמישה milliseconds למשך שנייה אחת לפחות. תחילה באורך גל עירור של 488 nanometers, ולאחר מכן באורך גל פליטה של 515 nanometers. כדי להדמיות של סמני התאים הרלוונטיים באמצעות מיקרוסקופיה של אימונופלואורסצנציה, קבעו את הדגימות ב-4%para formaldehyde ו-2%sucrose ב-PBS למשך 10 דקות.

שטפו את הרקמה שלוש פעמים ב-PBS למשך חמש דקות בכל שטיפה. לאחר מכן, הדגירו את פרוסות המוח ב-0.1%Triton X למשך חמש דקות. לאחר שטיפת הדגימות כפי שהודגם הרגע, הדגירו אותם עם נוגדן עכבר נגד acetylated alpha tubulin.

לאחר שטיפה נוספת ב-PBS, דגרו את הדגימות ב-fluorescein anti-US IgG למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. לבסוף, בצעו צביעה נגדית של החתכים ב-DPI למשך חמש דקות ודמיינו מיד את התאים בזמן החשיפה המינימלי האפשרי. נוכחות של penal CLIA מאושרת באמצעות הסמן השריפי acetylated alpha tubulin עם צביעה נגדית ב-DPI. כדי לזהות את הגרעינים, ניתוח זרימת הניידות של penal CLIA מבוצע על ידי ספירת תדירות הפעימות ותבנית הזווית של התאים הנעים.

ניתן לחלק את ה-CLIA לשלוש קבוצות על בסיס נתונים אלו. חשוב לציין כי חשיפת ה-CLIA ל-0.25%Ethanol מדכאת באופן משמעותי את תדירות הפעימה של ה-CLIA ללא קשר לסוגן. כיפוף נוסף של ה-CLIA מעורר סיגנל סידן תוך-תאי תלוי-ריסון (cilium), המאפשר מדידה של סיגנל הסידן התוך-תאי בתוך חדרי המוח. לאחר רכישת המיומנות, ניתן להשלים טכניקה זו בתוך שעה אחת אם היא מבוצעת כראוי.

בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לטפל ברקמת המוח בעדינות וביעילות, כדי לא להרוס את חדרי המוח לאחר פיתוחם. טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום מדעי המוח לחקור את התפקוד של append CLIA ושל רקמת מוח של עכבר חי.