Phenomics הפאג: גישות פיזיולוגיות לאפיין חלבונים חדשים ויראלי

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לסנן ולאפיין גנים של פאג'ים עם פונקציות לא ידועות. ראשית, פאג' משוער. מסגרות קריאה פתוחות ויראליות הנקראות ORFs מתבטאות ב-e coli.

שיבוטים של הפאג'. Orff המבטא e coli מחוסנים לתוך לוחות בדיקה או מפות רב-פנוטיפיות, המכילות מצעים גדילה, בינוניים ושונים. לאחר מכן, צמיחת חיידקים מנוטרת לאורך זמן על ידי ספקטרומטריה כשיטת ניתוח שנייה, גן פאג'ים המבטא e coli גדלים בתרבית רציפה או על ידי תרבית אצווה סדרתית.

לאחר מכן נאספים מטבוליטים של הצמיחה המתקבלים ונשלחים לניתוח מטבולומי על ידי כרומטוגרפיה של גז, ספקטרומטריית מסה של זמן טיסה. הנתונים המתקבלים מציעים פרופיל פנוטיפי הקשור לביטוי של מסגרת קריאה פתוחה של פאג' משוער יחיד. שיטה זו פותחה בתחילה כדי להבהיר את תפקודם של חלבוני בקבוקון לא ידועים.

ניתן ליישם אותו גם במחקרים הבוחנים את הקשר בין גנוטיפים לפנוטיפים, ובבחינת האינטראקציות בין חיידקים פאג' לפונדקאי על פני ביומות. התחל הליך זה על ידי תיוג לוחות מיקרוטיטר סטריליים של 96 באר עם מספר זיהוי שיבוט e coli וסוג סכמטי של מפה, המציין את המצעים הנבדקים מולם בבדיקה. העבירו מים סטריליים באופן אספטי למאגר נוזלים.

לאחר מכן, בעזרת פיפטה רב-ערוצית, העבירו 60 מיקרוליטר מים לכל באר של צלחת המיקרוטיטר. לאחר מכן, העבירו באופן אספטי שלושה מדיום בסיסי X למאגר נוזלי. לאחר מכן, באמצעות פיפטר רב ערוצי, העבירו 50 מיקרוליטר לכל באר של צלחת המיקרוטיטר.

באותה טכניקה פיפטה 50 מיקרוליטר מכל מדיום בסיסי המשמש בסכימת המפה. לאחר מכן, העבירו 30 מיקרוליטר מכל מצע למתאים. ובכן, באמצעות צינור רב ערוצי, העבירו 10 מיקרוליטר של תאי חיידקים לכל באר.

הקפד לשנות טיפים לפני שתחזיר את הפיפטה למלאי התרבית. מכסים כל צלחת בסרט צלחת דבק. לחץ בחוזקה על הסרט על גבי בארות הצלחת ולאורך הקצוות ליצירת אטימה אחידה ומהודקת.

בעזרת סכין גילוח סטרילי, הסר את כל הסרט העודף משולי לוחית המיקרוטיטר. הנח את המפה המוכנה בשרוול הקלט של ספקטרופוטומטר מרובה. פתח את תוכנת קורא הצלחות וצור פרוטוקול למדידת הספיגה כל 30 דקות למשך 32 שעות בסך הכל

עם 60 שניות של טלטול בין קריאות, הגדר את הטמפרטורה במנגנון ל-37 מעלות צלזיוס. לאחר שהמפה מאוזנת לטמפרטורה שנקבעה, התחל את הפרוטוקול לאחר 32 שעות, הסר את המפה משרוול הפלט של קורא הלוחות. סמן כל קובץ נתונים עם מספר הזיהוי של e coone, התאריך וסוג הסכימה של המפה.

נתח את הנתונים כמתואר במסמך הנלווה כדי להעריך את הצמיחה ואת הגידול הרלוונטי מבחינה ביולוגית. פרמטרים מתאי ניתוח מטבוליט עשויים להיות מתורבתים על ידי אצוות מעבר רציף או סדרתי טיורינג. כדי לשמור על מצב יציב.

כאן נדגים תרבות מתמשכת. עקרו את הרכיבים של כור תרבית רציף של 75 מיליליטר, ובקבוק הזנה של שני ליטר כמתואר במסמך הנלווה לאחר הסטריליזציה, הכניסו את כל חומרי החיטוי לארון בטיחות ביולוגי והדליקו את האור האולטרה סגול בזמן שהמדיום מתקרר. לאחר קירור המדיום, הוסיפו 0.1% ליטר ארבינוז ו -100 מיקרוגרם למיליליטר.

אמפיצילין ל -75 מיליליטר של מרק 0.5 XLB ולהעביר אותו לכור הרציף. שחרר את מכסה כור התרבות הרציפה והברג אותו על הכור. הימנע מלגעת בצינור הדגימה, פתח את מכסה בקבוק ההזנה והברג אותו על בקבוק ההאכלה.

הימנע מלגעת בצינור הדגימה, תוך שמירה על צינור ה-18 אינץ' מחובר לפורט אפסילון סטרילי. פרקו את צינורות ה-18 אינץ' וצינורות המשאבה הפריסטלטית. המתאם מתאים קצה אחד של צינור ה-18 אינץ' לקצה אחד של מתאם צינורות המשאבה הפריסטלטית, התאם את הקצה השני של מתאם צינורות המשאבה הפריסטלטית לצינור 18 אינץ'.

אפסילון יציאה מצורף של מכסה בקבוק ההזנה מחבר יחידות סינון אפס נקודה 22 מיקרון על יציאות, בטא ודלתא של כור התרבות הרציפה. חבר יחידת מסנן נקודת אפס 22 מיקרון על המתאם של יציאת אלפא. ולזה, חבר את צינור ה-18 אינץ' במכסה המנוע.

לחסן את כור התרבות הרציפה ב-100 מיקרוליטר של תרבית לילה של אי קולי שהוכנה כמתואר במסמך הנלווה. הדק את מכסי הכור ובקבוקי ההאכלה ולאחר מכן העבר את המערכת לאינקובטור של 37 מעלות צלזיוס. מצויד בפלטת ערבוב מגנטית ומשאבה פריסטלטית מיני התאימו את מתאם צינורות המשאבה הפריסטלטית למשאבה הפריסטלטית.

הצינור מבקבוק ההאכלה נכנס למשאבה ומוביל החוצה לכור. הגדר את המשאבה למהירות ואז כדי להפעיל אותה. עבור לבדיקה קדימה כדי לוודא שהמדיום מתחיל לזרום דרך הצינור.

הנח את הכור על צלחת הערבוב המגנטית והתחל לערבב. אפשר לכור התרבות הרציף להתאזן במשך 24 שעות לפני הדגימה למחרת. כדי לדגום את התרבית הרציפה, הברג מזרק נעילת פיתוי של חמישה מיליליטר על גמא יציאה ומשוך 4.5 מיליליטר תרבית.

השתמש ב-500 מיקרוליטר של התרבית כדי למדוד את הצפיפות האופטית ב-600 ננומטר. לאחר מכן השתמש בשארית האליקוט כדי ליצור ארבע תרביות של מיליליטר אחד ב-OD 600 של צינורות מיקרו-פוגה של 0.35 ו-1.7 מיליליטר כדי להכין את הדגימות לכרומטוגרפיה של גז, ספקטרומטריית מסה של זמן טיסה או GC עד F ms. צנטריפוגה של התאים ב-16, 900 פעמים G למשך שתי דקות כדי לגלול אותם.

לאחר סילוק הסיבוב, הסופרנטנט שוטף עם 500 מיקרוליטר PBS. בצע שטיפה זו. צעד פעם שנייה, שפכו את הסופרנטנט לזמן האחרון, ואז טבלו את צינורות המיקרו-פוגה המכילים תאים גלוליים בחנקן נוזלי.

עד שהבעבוע ייפסק, אחסנו את הדגימות במקפיא מינוס 80 מעלות צלזיוס. חזור על הדגימה כל 12 שעות במשך ארבעה ימים לאחר איסוף כל הדגימות. שלח שלוש דגימות לכל שיבוט על קרח יבש למתקן ליבה מטבולומית לעיבוד דגימות, ניתוח ונורמליזציה של GC ל-f ms כדי לקבל מסגרות קריאה פתוחות ויראליות.

מי ים נאספו מהאי סטארבאק וקרוליין AOL של איי הקו הדרומי מתחת לשכבת גבול האלמוגים. גידול חיידקים בתנאים ספציפיים לפחמן 72 הוערך עבור 47 שיבוטים באמצעות מפות. הנתונים שהתקבלו שימשו לאחר מכן כדי לסווג את השיבוטים כצמיחה צפויה, עלייה בתפקוד, אובדן תפקוד וללא פנוטיפים של גדילה.

לבחון את ההשערה כי לשיבוטים המכילים חלבונים דומים מבחינה תפקודית יש פרופילים מטבולומיים. שפע מטבוליטים חציוני נקבע עבור 84 שיבוטים שגדלו בתרבית רציפה על ידי GC TOF ms. הנתונים שהתקבלו שימשו לאחר מכן לקיבוץ היררכי של השיבוטים על סמך שפע המטבוליטים היחסי שלהם, המסומנים על ידי צבע.

המטבוליטים הנפוצים ביותר מוצגים באדום, בעוד שהשכיחות הנמוכה ביותר מוצגת בכחול כהה. ניתוח מטבולומי ראשוני גילה כי בעוד שגנים מבניים ומטבוליים אינם נפרדים בבירור זה מזה, אותם גנים המציגים השפעות דומות על המארח אכן מתואמים. לדוגמה, אשכולות הגנים של הקפסיד המבוארים צמודים לגנים המטבוליים המשוערים שהודגשו במחקר זה EDT 24 40 ו-EDT 24 41 חקירות באמצעות טופולוגיה טרנסממברנית זמינה לציבור ותוכנית חיזוי פפטיד אותות הראו ראיות לכך ששני הגנים המטבוליים המשוערים מכילים תחום טרנסממברני יחיד.

מעניין שחמישה מתוך תשעת השיבוטים בקבוצת האשכול הראשונה חזו תחומים טרנסממברניים באמצעות אותה טופולוגיה. יחד עם הנתונים הללו, שיטה זו מסוגלת לספק מידע על פרופילי מטבוליט של שיבוטים, שיבוטים פוטנציאליים עם פונקציות קשורות וחריגים של מטבוליט שיבוטים. בעת ניסיון הליך זה חשוב לזכור שהשיטות המוצגות מושפעות מאוד מהפיזיולוגיה של החיידקים.

יש לקחת בחשבון שיקולים כדי להבטיח שקבוצות בלתי תלויות משובטות יעברו ניסויים עם זיהום מונע ומשתנה יחיד נבדק באמצעות הבקרות המתאימות.