Name: נקודת רקמות נכונות בכל זמן בלוקים רב-רקמה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: למדו כיצד לבנות תגי SpOT לזיהוי רקמות בבלוקי פרפין רב-רקמה באמצעות HistoGel וצבע סימון. שיטה זו משפרת דיוק בהזדהות רקמות בהיסטולוגיה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות לד&quot;ר ברנט האריס למתן סקירה ביקורתית של כתב היד. מחקרים אלה נערכו בומברדי המקיף מרכז הסרטן histopathology והמשאבים משותפים רקמות אשר נתמך בחלקו על ידי P30-CA051008 מענק NIH / NCI. התוכן הוא באחריות בלעדית של הכותבים ולא בהכרח מייצג את הדעות הרשמיות של המכון הלאומי לסרטן או המכונים הלאומי לבריאות.

1. בנייה של המקום <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 מ&quot;ג של סרום שור אלבומין (BSA) 1 צבע סימון מיליליטר רקמות בצינור 15 מיליליטר חרוטי או 2 מיליליטר צינור microfuge ומערבולת דקות 1 או עד שהיא נמסה לחלוטין. הערה: פרוטוקול זה, להשתמש ביוכימיים כיתה BSA. ואילו בכיתות וpurities אחרים לא נבדקו, צפוי כי בכיתה וטוהר לא היו השפעה משמעותית על ההצלחה של המקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חום 9 ג&#39;ל מיליליטר hydroxyethyl עיבוד agarose בצינור חרוטי 15 מיליליטר במיקרוגל בעצמה של 30% במשך 10 שניות במרווחים עד הג&#39;ל נמס לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשלב ג&#39;ל העיבוד נמס ופתרון הצבע-BSA בצינור חרוטי 15 מיליליטר אחת ומערבבים היטב עם טפטפת. מערבולת הפתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צינור חרוטי במקרר לכמה שעות או עד מוצק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש,, מרית מתכת דקה ארוכה או בדיקה בעדינות כדי לשחרר את תקע ג&#39;ל בצבע מצינור חרוטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בלהב סכין מנתחים או סכין גילוח למ&quot;קt ג&#39;ל לחבר רוחבי ל5 מ&quot;מ חלקים עבים. הסר את הקצוות מעוגלים ולהשליך לפח האשפה (איור 2 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את חלקי תקע ג&#39;ל שטוחים בקלטות היסטולוגיה ולהחזיק ב -70% אתנול עבור שעה 1. לשנות את פתרון אתנול 70% בכל שעות 2-4 לפחות 3 שינויים לאורך תקופה של 24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ידני לעבד את חלקי ג&#39;ל באמצעות סדרת אתנול (1 שעה כל אחד: 70% אתנול, 80% אתנול, 95% אתנול, 100% אתנול (שינויי 3x), אז ברורים בניקוי 3x פתרון לשעה 1 כל אחד (לדוגמא, פחמימנים aliphatic ( xylenes תחליף)) היה בשימוש בפרוטוקול זה, xylenes גם מקובל), ולחדור עם פרפין המותך (3x עבור שעה 1 כל אחד), באופן ידני או בProcesser רקמה. הערה: לפני התייבשות מלאה ב 100% אתנול, הצבע עלול לדלוף מתקע ג&#39;ל שעלול להשפיע על רקמות אחרות וריאגנטים נוזליים במעבד רקמות אוטומטי. כהתייבשות כגון, הוראות מומלצת מאוד, עיבוד עם זאת אוטומטי הוא סוסיםברית יעילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סעיפים להטביע מרובים מעובד ג&#39;ל באמצעות פרפין הסטנדרטי הטבעת המתודולוגיה (איור 2). לאפשר בלוקים לקירור ולהקשיח ואז מגיעים לטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במחט אגרוף עורי של גודל רצוי להסיר ליבות נקודה מסעיפי ג&#39;ל מוטבעים עד הבלוק הוא מותש (איור 2 ג). בלוק אחד עשוי לספק עד 20 x 2 מ&quot;מ 2 ליבות. אחסן את הליבות באזור קריר. השתמש אגרוף עורי בפרוטוקול זה ראה איורים, 1.5 מ&quot;מ (1D דמויות, ו2D) או 2 מ&quot;מ (1B דמויות, 1C, 2C ו). </li></ol> 2. שימוש כתמים ללוקים-ערוכים ללא אוריינט <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור תרשים אוריינטצית רקמות כדי לציין את המקומות הרצויים וזהותם של כל חלקי הרקמה הבודדים להיות משובצים ביחד, ואת מיקומו של המקום. הערה: תרשים הנטייה הרקמה היא מפה מאוירת הכוללת את עמ &#39;מקומות hysical של כל חלקי הרקמה שכותרתו עם מזהים והמיקום של הנקודה. זה יכול להיות שנוצר באופן אלקטרוני או יכול להיות מצויר ביד. התרשים צריך להיות שנוצר באמצעות כל שיטה המתאימה ביותר לטכנאי וחוקר שימוש במוצר הסופי. מפה זו תשמש כמדריך לחוקר כך ניתן לזהות בקלות דגימות במהלך ניתוח מיקרוסקופי. מפת שימוש בפרוטוקול זה היה מצוירת ביד. הוא מתאר שקופיות מיקרוסקופ בלוק וזכוכית רקמה עם כל פיסת הרקמה והמקום נמשך ושהכותרת באותה התנוחה כמו בלוק הרקמה בפועל ושקופיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבד את פיסות הרקמה בדרך כלל, על מנת להבטיח שהם יישארו מזוהים כראוי לאורך כל שלבי גילום ועיבוד. לפרוטוקול זה, לעבד את הרקמות לשעה 1 בכל: אתנול 70%, 80% אתנול, 95% אתנול, 100% אתנול (שינויי x3), פחמימנים aliphatic (תחליף xylenes) (שינויי x3), ופרפין חדירת רקמה המותך ב 60 ° C (שינויי x3). הערה:צריכים להיות מעובד רקמות ll הבא נהלי מעבדה היסטולוגיה סטנדרטית. זה עשוי להיות משתנה בשל הליך מעבדה בודד, גודל וסוג רקמה, אבל זה לא ישפיע על היכולת להשתמש במקום ככלי אורינטציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לארגן פיסות רקמה בתחנת ההטבעה במקומות שהוקצו הנכונים על פי תרשים הנטייה רקמה. השתמש בתרשים התמצאות הרקמה כנקודת התייחסות כדי להנחות את הטכנאי על איך לסדר את חתיכות נקודה ורקמות בכל בלוק. הערה: בפרוטוקול זה טכנאי ההטבעה לשים מפת ההתמצאות המצוירת ביד ליד תחנת ההטבעה וסידרה את חתיכות הרקמה בתחנת ההטבעה בדיוק באותו הסדר כפי שצייר בתרשים. הדבר מבטיח כי כל חלקי הרקמה יישארו בצורה נכונה לזיהוי במוצר הסופי. זה קריטי לשימוש המוצלח של בלוקים רב-רקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא ליבת הנקודה היא גבוהה יותר מכל חלקי הרקמה להיות מוטבעים בגוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להטביע את פיסות רקמה ולאחר מכן את המקום בסופו של דבר (רוחבי) במקומות הנכונים על פי תרשים אוריינטצית רקמות באמצעות מתודולוגיה הטבעה סטנדרטית. בהתאם לצורך, להחזיק את המקום (ים) זקוף עם מלקחיים עד פרפין בסס מספיק שהמקום (ים) לא ייפול על (1-2 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סעיפי סעיף ופרפין הכתם עם המקום באמצעות מתודולוגיה סטנדרטית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר הסעיפים לצוף על אמבט מים ב 40 ° C ודבקו שקופיות זכוכית טעונות חיובי (שקופיות בלתי טעונות לא נבדקו). ייבש את השקופיות בתנור ייבוש ב 60 מעלות צלזיוס במשך לפחות 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את השקופיות בstainer אוטומטית ומעובד באמצעות חומרים כימיים הבאים: xylenes (xylenes 1-5 דקות, xylenes 2 ו3-2 דקות, כל אחד), 100% אתנול (2 דקות), 95% אתנול (1 דקות), 80 % אתנול (30 שניות), 70% אתנול (30 שניות), במים ברז זורמים (2 דקות), hematoxylin (1.5 דקות), במים ברז זורמים (3 דקות), אלכוהול חומצה (1 דקות), במים ברז זורמים (2 דק &#39; ), BLמגיב uing (1 דקות), מים זורמים (2 דקות), 80% אתנול (30 שניות), eosin (1 דקות), מים זורמים (10 שניות), 80% אתנול (1 דקות), 100% אתנול (3 שינויים, 2 דקות כל אחד), xylenes (3 שינויים, 30 שניות כל אחד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכסות את השקופיות עם coverslips זכוכית, רכוב עם ההרכבה בינונית. הערה: בפרוטוקול זה, histotechnician מחולק בלוקים פרפין על microtome ב5 מיקרומטר סעיפים. לפרוטוקול זה השתמשנו stainer אוטומטי, אך ניתן להשיג תוצאות שווים באמצעות צביעה ידנית. </li></ol></li></ol> 3. מקום בTMAs (ערכת TMA ידנית) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור תרשים נטייה רקמה, כפי שתואר ב2.1 ולהקצות את המיקום הרצוי (ים) של המקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממלא את תבנית TMA עם פרפין נמס בתחנת הטבעה. כעובש קירור, להטביע את המקום (ים) בסופו של דבר בשולי תבנית TMA במקומות הרצויים שצוינו על ידי תרשים הנטייה רקמה. בהתאם לצורך, להחזיק את המקום (ים) זקוף עם מלקחיים עד חה פרפיןים הגדילו מספיק שהמקום (ים) לא ייפול על (1-2 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב את ליבות TMA פי הוראות יצרן ובנוגע למיקומו של המקום (ים) בשולי המערך (איור 2 ד), ואחרי פרוטוקולי חתך וצביעה סטנדרטיים. הערה: אנא ראה שלב 2.6 לראות את שיטות חתך והכתים שימוש בפרוטוקול זה. </li></ol>

<ol><li>Jawhar, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+microarray%3A+a+rapidly+evolving+diagnostic+and+research+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Saudi.+Med%22%5BJournal%5D)">Tissue microarray: a rapidly evolving diagnostic and research tool.</a> Ann. Saudi. Med. 29 (2), 123-127 (2009).</li>
<li>Dhir, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+microarrays%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Bio%22%5BJournal%5D)">Tissue microarrays: an overview.</a> Methods Mol. Bio. 441, 91-103 (2008).</li>
<li>Parsons, M., Grabsch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+make+tissue+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Diagn.+Histopath%22%5BJournal%5D)">How to make tissue microarrays.</a> Diagn. Histopath. 15 (3), 142-150 (2009).</li>
<li>Saxena, R., Bade, S. Ch. 7 Tissue Microarray – Construction and Quality Assurance. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSaxena%2C+R+%22Immunohistochemical+Staining+Methods+6th+ed%22">Immunohistochemical Staining Methods 6th ed</a>. , Available from:
 
 <a target="_blank" href="http://www.dako.com/08002_ihc_staining_methods_5ed.pdf">http://www.dako.com/08002_ihc_staining_methods_5ed.pdf</a> (2013).</li>
<li>Nocito, A., Kononen, J., Kallioniemi, O., Sauter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+microarrays+%28TMAs%29+for+high-throughput+molecular+pathology+research%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Tissue microarrays (TMAs) for high-throughput molecular pathology research.</a> Int. J. Cancer. 94, 1-5 (2001).</li>
<li>Rangel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tissue+microarray%3A+helpful+hints%5BTitle%5D)+AND+%22J.Histotech%22%5BJournal%5D)">The tissue microarray: helpful hints.</a> J.Histotech. 25 (2), 93-100 (2002).</li>
<li>Hammer, A., Williams, B., Dietz, H., Hamilton-Dutoit, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+immunophenotyping+of+43+ferret+lymphomas+using+tissue+microarray+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Vet.+Path%22%5BJournal%5D)">High-throughput immunophenotyping of 43 ferret lymphomas using tissue microarray technology.</a> Vet. Path. 44, 196-203 (2007).</li>
<li>Eckel-Passow, J., Lohse, C., Sheinin, Y., Crispen, P., Krco, C., Kwon, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+microarrays%3A+one+size+does+not+fit+all%5BTitle%5D)+AND+%22Diagn+Pathol%22%5BJournal%5D)">Tissue microarrays: one size does not fit all.</a> Diagn Pathol. 5, 48-57 (2010).</li>
<li>Lin, Y., Hatem, J., Wang, J., Quinn, A., Hicks, D., Tang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+microarray-based+immunohistochemical+study+can+significantly+underestimate+the+expression+of+HER2+and+progesterone+receptor+in+ductal+carcinoma+in+situ+of+the+breast%5BTitle%5D)+AND+%22Biotech.+Histochem%22%5BJournal%5D)">Tissue microarray-based immunohistochemical study can significantly underestimate the expression of HER2 and progesterone receptor in ductal carcinoma in situ of the breast.</a> Biotech. Histochem. 86 (5), 345-350 (2011).</li>
<li>Wampfler, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+the+optimal+numbers+of+cores+based+on+tissue+microarray+antibody+assessment+in+non-small+cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cancer+Sci.+Ther%22%5BJournal%5D)">Determining the optimal numbers of cores based on tissue microarray antibody assessment in non-small cell lung cancer.</a> J Cancer Sci. Ther. 3, 120-124 (2011).</li>
<li>Quagliata, L., Schlageter, M., Quintavalle, C., Tornillo, L., Terracciano, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+new+players+in+hepatocarcinogenesis%3A+Limits+and+opportunities+of+using+tissue+microarray+%28TMA%29%5BTitle%5D)+AND+%22Microarray%22%5BJournal%5D)">Identification of new players in hepatocarcinogenesis: Limits and opportunities of using tissue microarray (TMA).</a> Microarray. 3, 91-102 (2014).</li>
<li>Miettinen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+generating+multitissue+blocks+without+special+equipment%5BTitle%5D)+AND+%22Immunohistochem.+Mol.+Morphol%22%5BJournal%5D)">A simple method for generating multitissue blocks without special equipment.</a> Immunohistochem. Mol. Morphol. 20 (4), 410-412 (2012).</li>
<li>Jones, M., Calabresdi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agar-gelatin+for+embedding+tissues+prior+to+paraffin+processing%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Agar-gelatin for embedding tissues prior to paraffin processing.</a> BioTechniques. 42, 569-570 (2007).</li>
<li>Carson, F., Hladik, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCarson%2C+F+%22Histotechnology%3A+A+Self-Instructional+Text%22">Histotechnology: A Self-Instructional Text</a>. , 3rd ed, American Society for Clinical Pathology Press. Chicago, IL. (2009).</li>
<li>Suvarna, S., Layton, C., Bancroft, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSuvarna%2C+S+%22Bancroft%E2%80%99s+Theory+and+Practice+of+Histological+Techniques.+7th+ed%22">Bancroft’s Theory and Practice of Histological Techniques. 7th ed</a>. , 7th ed, Churchill Livingstone Elsevier Ltd. London, UK. (2013).</li>
</ol>

יש המחברים אין לחשוף.

הכנה וניצול מוצלחת של הכתמים דורשים דבקות מקפידה כמה צעדים טכניים. היתוך של agarose hydroxyethyl צריך להיעשות לאט ובחום נמוך. התכה במהירות בחום גבוה יכולה לגרום להתמוטטות של כמה agarose פחות מתוצאות אופטימליות. בעת חיתוך תקעי הצבע-לאדן לחתיכות לעיבוד, להבטיח כי העובי של כל חתיכה גדולה מ -4.5 מ&quot;מ ואינו עולה על 7 מ&quot;מ. הקצוות מעוגלים יוסרו כפסולת כמו שהם לא אחיד 5 מ&quot;מ עובי. חתיכות פחות מ -5 מ&quot;מ תגרום ליצירת כתמים קצרים שמסתכנים מותשת מחתך לפני מיצוי חומר רקמות סמו...

היכולת להטביע דגימות רקמה מאנשים מרובים בבלוק פרפין יחיד מאפשרת השוואת Side-by-צד קל בין טיפולים ויחידים, מבטלת השתנות בין שקופיות, ומפחיתה את העלות ועומס עבודה של חתך ומכתים דגימות. בלוקים רבי רקמות אלה מיוצרים בדרך כלל כשני microarrays הרקמות (TMA) או בלוקים פרפין המכיל רקמות מאנשים רבים בפריסה הלא מערך. תחזוקה של זהות מדגם היא קריטית להצלחתו של כל ניתוח רב-רקמה. החוקרים השתמשו TMAs מאז פיתוחם כדי לשפר את היעילות של ניתוח, להפחית וריאציה בין שקופיות, לחסוך במשאבים יקרי ערך רקמה, ולהפחית את הזמן ועלות של ניסויי 1. כיוון נכון של TMAs יכול להיות מושלם תוך שימוש במגוון של שיטות, כולל רווחים, שורות או עמודות ריקות בין ליבות רקמת 2-4, הסדר סימטרי של קבוצות ליבה 3, 5 (למשל, ניהול עבודותl לעומת טיפול), ליבות &quot;מגדלור&quot; 6, וליבות אורינטציה מיועדות ממוקמות מחוץ למטריצת TMA 3. למרות ששיטות אלו עובדות היטב עבור TMAs, רוב לצרוך שטח יקר ליבת TMA וTMAs עם פערים וחללים כמזהים עלולים להיות מבלבלים כמו ליבות רקמה מותשות לאורך זמן. בנוסף, שיטות אלה אינן מתאימות לשימוש בבלוקים רב-רקמה בלי פורמט מערך כי הם מסתמכים על חריגות בדפוס הורה ההדוקה של ליבות microarray אחידות כמזהים. רוב לוקים רב-רקמה-ערוך שאינם חייבים להכיל רקמות לא אחידים ו, ​​מעצם הגדרתו, אינו מציגים את רשת המערך המובנה שגורמת סטיות אלה עומדות בתור ציוני דרך. למרות שיש יתרונות רבים לשימוש TMA, אחד החסרונות הגדולים ביותר הוא בגודל הקטן של הליבות וזה לא תמיד נציג של רקמה במידה רבה הטרוגנית 1. בלוקים רב-רקמה ערוכות שאינם מספקים רבים של tהוא היתרונות של TMA, אך מכיל דגימות רקמה גדולות יותר, או איברים שלמים ממחקרים בבעלי חיים. microarrays רקמות באמצעות ליבות יחידים ששונה התאמה עם חלקי רקמות שלמים המבוססים על החלבון של עניין ורב דורשים ליבות מרובות עבור התאמה מוגברת 7-11. בשל המורכבות והטבע הטרוגנית של כמה פנוטיפים סמן ביולוגי, TMAs באמצעות אפילו מספר גדול של ליבות (&gt; 10) עדיין יכול להיות מספק ועשויה לדרוש שיטות אחרות מאשר microarrays לניתוח 8. בנוסף, בניית TMA היא לצרוך זמן, תובעני מבחינה טכנית, ודורשת את העלות הראשונית והשקעה באו גישה לarrayer רקמה. בלוקים רב-רקמה ללא ערוכה יכולים להתבצע בכל מעבדה בסיסית עם פחות זמן ומאמץ והוא אלטרנטיבה חוקית ללימודים שדורשים יותר מאשר רקמת מערכים לאפשר או כאמצעי כדי לקצץ בעלויות ולפשט את הניתוח. בלוקים רב-רקמה-ערוך שאינו דומים דורשים אמין אוientation סמן כדי לעקוב אחר זיהוי מדגם, עם זאת, הפיתוח של סמנים אלה היה מוגבל. חלק גדול מהספרות המתארת ​​אוריינטצית רקמות מתמקד בנטייה פיזיולוגית נכונה להטבעת חתיכות רקמה בודדות, כגון קעקוע הרקמה עם דיו 12, טרום הטבעת רקמות באגרו-ג&#39;לטין לפני עיבוד 13, וסימון רקמות מסוימות עם חריצים 14 או 15 תפרים . למרות פונקציונלי, שיטות אלה אינן אידיאליים כסמנים בלוקים רבי רקמות בשל המגבלות שלהם. תפר יהיה מחולק במהירות ולא יכול להיות גלוי בכל סעיף. טרום הטבעת טכניקות באמצעות אגר-ג&#39;לטין עשוי לשמור על הרקמה בכיוון נכון בזמן עיבוד והטבעה, אך אינו מספק רמז חזותי להבחין בין דוגמאות רבות בבלוק פרפין ושקופיות. חריצים או צבע על הרקמה עלולים לסבך ניתוח או לחסום פרטים מורפולוגיים חשובים. לחלופין, זהות רקמהבגוש רב-רקמה-ערוך שאינו יכול להישמר באמצעות הטבעה של חתיכות רקמה בהסדר סימטרי, אבל זה דורש 3 או יותר חתיכות רקמה ועשוי שלא לאפשר להסדר אופטימלי של רקמות לצורך הניתוח. תג אוריינטציה הדגימה (SPOT) פותח כשיטת קלה וזולה לזיהוי רקמות בלוקים רב רקמה באופן ברור ומציע יתרונות רבים על פני שיטות נטייה קיימות. הנקודה היא קטנה, צבעונית, מורכבת מליבת ג&#39;ל Hydroxyethyl agarose עיבוד וצבע סימון רקמה, והסתננה עם פרפין (איור 2 ג). ליבת המקום מוטבעת על קצה ליד רקמה יחידה בבלוק פרפין רב-רקמה ומופיעה כנקודה צבעונית בגוש ובכל סעיף (איור 1 א - ד), באופן ברור המעידה על הכיוון הנכון של הבלוק וחתכים לזיהוי רקמות קל.

<table><tbody><tr><td>ג'ל עיבוד דגימות היסטוג'ל</td><td>Thermo Scientific</td><td>HG-4000-012</td><td><a href="http://www.thermoscientific.com/en/product/richard-allan-scientific-histogel-specimen-processing-gel.html" target="_blank">http://www.thermoscientific.com/en/product/richard-allan-scientific-histogel-specimen-processing-gel.html</a></td></tr><tr><td>Tissue Marking Dye</td><td>Triangle Biomedical Sciences, Inc. </td><td>TMD-5</td><td>כל צבע לסימון רקמות ככל הנראה יספיק.</td></tr><tr><td>ערכת מערך A 2 מ"מ (60 ליבות)</td><td>Arraymold</td><td>20015A</td><td>כל מערך רקמות ידני יעבוד באופן דומה.</td></tr></tbody></table>

נקודת רקמות נכונות בכל זמן בלוקים רב-רקמה

SpOT the Correct Tissue Every Time in Multi-tissue Blocks

בלוקים פרפין רב-רקמה לספק ניתוח תפוקה גבוה עם התייעלות, אחידות ניסיונית, וזמן מופחת ועלות. microarrays רקמות מרכיבים את רוב לוקי פרפין רב-רקמה, אבל יותר ויותר, חוקרים משתמשים בלוקים-ערוך שאינם מכילים רקמות גדולות יותר מאנשים רבים אשר יכול לספק רב של היתרונות של microarrays רקמות ללא השקעה משמעותית בתכנון ובציוד. מרכיב קריטי בכל ניתוח רב-רקמה הוא שיטת הנטייה משמשת לזיהוי כל רקמה בודדת. למרות ששיטות קיימות כדי לשמור על התמצאות וזיהוי של רקמות בלוקים רב-רקמה תקינה, רובם לא מתאימים היטב ללוקים-ערוך עישון, עשוי לצרוך שטח יקר בתוך מערך ו / או קשים לייצר במעבדה היסטולוגיה סטנדרטית. תג אוריינטציה הדגימה (SPOT) הוא כלי פשוט, נמוך נטייה עלות שנראית בבירור בלוקים פרפין וכל סעיפי הרקמות FOr זיהוי דגימה אמין בפריסות ערוכות ולא ערוכים. המקום מספק יתרונות על פני שיטות נטייה קיימות בלוקים-ערוך שאינם כפי שהוא אינו דורש כל שינוי ישיר לרקמות ומאפשר גמישות בסידור של יצירות רקמה.

המקום נראה כמו סיבוב, נקודה צבעונית בבלוק פרפין (איור 1 א ו 2 ד), בכל סעיפי פרפין, ונשאר בשקופית הזכוכית בהליך צביעת H &amp; E או IHC (1B המספרים - 1D, ו2D). עזרים זה ברור חזותי קיו שני histotechnician והחוקר בזיהוי כל פיסת רקמה בודדת ומפשט תקשורת כhistotechnician יכולים להשתמש רמז חזותי זה כדי לציין את הסדר של חלקי הרקמה לחוקר איסוף נתונים מהשקופיות במיקרוסקופ. תרשים הנטייה הרקמה צריך להיות כלול עם השקופיות הניתנ...

המטרה של תג אוריינטציה הדגימה (SPOT) היא לתפקד ככלי נטייה לסייע בזיהוי רקמה בודד בלוקים פרפין רב-רקמה. פרוטוקולים אלה מדגימים כיצד הוא נבנה בקלות מחומרי היסטולוגיה משותפות, עלות נמוכה ומשמש כסמן חזותי אמין בלוקים פרפין וחתכים.

Multi-tissue paraffin blocks provide high throughput analysis with increased efficiency, experimental uniformity, and reduced time and cost. Tissue ...

המטרה הכללית של הליך זה היא לבנות כלי שיסייע בזיהוי רקמות בבלוקי פראפין של רקמות מרובות. דבר זה מושג תחילה על ידי שילוב של HistoGel עם צבע לסימון רקמות ליצירת פקק ג'ל צבעוני ובוהק. השלב השני הוא עיבוד והטמעה של פקקי ה-HistoGel הצבעוניים בהתאם לטכניקות סטנדרטיות לעיבוד והטמעה של רקמות.בשלב הבא, נעשה שימוש במנקב ביופסיה להסרת הגליליים הקטנים. אלו הם תגי הת方向 או סימוני המיקום של הדגימה. השלב הסופי הוא הטמעה של הסימון בבלוק רקמות מרובה, כאשר מיקום הסימון וכל דגימה מתועדים בקפידה לצורך התייחסות קלה.בסופו של דבר, הנקודה מספקת רמז חזותי ברור לאוריינטציה ולזיהוי של הדגימות במערכי מיקרו-רקמות (tissue microarrays) ובבלוקים של רקמות מרובות. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון תפרים או ליבות אסימטריות, הוא שהנקודה אינה משנה את הרקמה ומאפשרת גמישות בסידור הדגימות לצורך ניתוח אופטימלי. הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה כאשר קיבלנו בקשות מחוקרים לשלב דגימות רקמה ממספר בעלי חיים לתוך בלוק פראפין יחיד כדי לחסוך בעלויות ולפשט את הניתוח. כדי להכין את הנקודות, התחילו בהוספת 50 milligrams של BSA בדרגה ביוכימית לתוך מיליליטר אחד של צבע לסימון רקמות בתוך מבחנה קונית של 15 milliliters.ערבב את התערובת במכשיר וורטקס למשך דקה אחת לפחות עד להמסה מלאה. לאחר מכן, העבר תשעה מיליליטר של ג'ל עיבוד hydroxyethyl aros לשפופרת קונית של 15 מיליליטר וחמם אותה במיקרוגל בהספק של 30%. בצע חימום בפולסים במרווחי זמן של עשר שניות עד להמסה מלאה של הג'ל.כעת ערבבו את ג'ל העיבוד המומס ואת תמיסת ה-BSA עם הצבע בתוך מבחנה קונית אחת בנפח 15 מיליליטר, וערבבו היטב באמצעות פיפטה. לאחר מכן, ערבבו את התמיסה ב-vortex והעבירו אותה למקרר למספר שעות כדי שתתגבש. לאחר שהג'ל התקשה, הוציאו את הג'ל המוצק על ידי שחרור עדין בעזרת שפכטל צר.חתכו את הגליל לפרוסות בעובי של 5 מילימטרים. אין להשתמש בקצוות המעוגלים. העבירו שלוש עד שש פרוסות לקסית היסטולוגית ושקעו אותן ב-70% Ethanol; החליפו את תמיסת ה-70% ethanol כל שעתיים עד ארבע שעות, ולפחות שלוש פעמים במהלך 24 שעות, עד שהגלילים יהיו מיובשים לחלוטין.הן ישחררו חלק מצבע הסימון אל תמיסת האתנול. שימוש בהחלפות של אתנול טרי בשלב הראשוני מסייע לשטוף חלק מהצבע העודף, מה שיוביל לקסטט נקי יותר ופחות נוטה לשחרר צבע. לאחר מכן, העבירו את הקסטטות לאתנול 80% ואז לאתנול 95% למשך שעה בכל אמבטיה.הצבע עלול לדלוף מפסנת הג'ל, דבר שעלול להשפיע על רקמות אחרות ועל הריאגנטים הנוזליים במכשיר לעיבוד רקמות אוטומטי. בשל כך, מומלץ מאוד לבצע התייבשות ידנית. עם זאת, עיבוד אוטומטי יעיל באותה מידה.השלימו את תהליך ההתייבשות באמצעות שלושה שטיפות באתנול 100% למשך שעה בכל פעם. בצעו שקיפות של הדגימות על ידי טבילה בפחמימנים ארומטיים או בקסילנים שלוש פעמים למשך שעה בכל אמבטיה. כעת בצעו חדירה של חומרי הסגירה (infiltration) לחתיכות באמצעות שלוש אמבטיות של שעה אחת כל אחת.בפראפין מומס. הטמיעו את החתכים המעובדים כרגיל, וכאשר הבלוק מגיע לטמפרטורת החדר, השתמשו במחט דגירה לעור (dermal punch needle) כדי ליצור דגימות גליל (cores). בלוק אחד יכול להניב 22 גלילים של 1 מילימטר או אף יותר גלילים של 1.5 מילימטר.התחילו בהכנת תרשים המציין את המיקומים הרצויים ואת זהותן של כל פיסות הרקמה הבודדות שיוטמעו יחד, וכן את מיקום נקודת הייחוס (the spot). הכינו עותק שיישאר זמין לעבודתכם. שימוש מוצלח בתגיות אוריינטציה של דגימות מחייב מפה ברורה ופשוטה למעקב של הדגימות הביולוגיות, המפרטת במדויק את כל הדגימות הביולוגיות, את מיקומן ואת פוזיצייתן ביחס לנקודת הייחוס.לאחר עיבוד נתיבי הרקמה, סדרו אותם בתחנת הטיפסה (embedding station). בהתאם לדיאגרמת כיוון הרקמה, קביעת כיוון נכון היא קריטית ביותר. כמו כן, חיוני שגרעין ה-spot יהיה גבוה יותר מכל נתיבי הרקמה שיוטמנו בבלוק.לאחר השלמת סידור הרקמות, יש להטמיע את הדגימות. החזק כל דגימה במצב זקוף באמצעות פינצטה עד להתגבשות הפרפין, כדי למנוע את התהפכותן. דקה או שתיים אמורות להספיק.בעת שימוש בערכה ידנית ל-TMA, מלאו את תבנית ה-TMA בפרפין מומס. בעוד התבנית מתקררת, הצמידו את הדגימות (spots) באופן דומה בשולי המערך. כעת בצעו חיתוך של הדגימות וצבעו את הסיכים עם הדגימה.בגישה סטנדרטית, נחתכים כאן חתכים בעובי של 5 מיקרון. כדי להעביר את החתכים לשקופיות, צופים אותם באמבט מים בטמפרטורה של 40 °C, ולאחר מכן מעבירים אותם לשקופיות זכוכית בעלות מטען חיובי. לאחר שהם נצמדו לשקופיות, מייבשים אותם בטמפרטורה של 60 °C למשך 20 דקות לפחות.כעת ניתן לצבוע את השקופיות באופן ידני או באמצעות מערכת צביעה אוטומטית. עבור צביעות שגרה של h ו-d, צביעות מיוחדות או נקודות של אימונוהיסטוכימיה הופיעו כעיגולים בצבע בהיר בתוך בלוק הפרפין ובכל חיתוכי הפרפין.נקודות המאתרות מאפשרות התמצאות קלה וזיהוי רקמות בבלוקים של רקמות מרובות המכילים רקמות בעלות מראה דומה מאנשים שונים ומקבוצות טיפול שונות. כאשר נעשה בהן שימוש ברקמה, נקודות המערך המיקרוסקופי (microarray spots) אפשרו ניצול של כל ליבה עבור דגימות רקמה בעלות ערך, וניתן היה להפריד בקלות את הנקודות הסמוכות לליבת מערך הרקמות. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור כי תיעוד מדויק וברור של הדגימה הביולוגית ושל הנקודה בבלוק הוא קריטי להצלחת השימוש בהן.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן ליצור ולהשתמש בקלות בתגית התווית של כיוון הדגימה כעזר לזיהוי רקמות בבלוקים של פאראפין המכילים מספר רקמות.

spot-the-correct-tissue-every-time-in-multi-tissue-blocks

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

Microarrays רקמות מאפשר שיטה יעילה לקבל מידע מקבילים ממספר רב של רקמות. חלקים מייצגים של רקמות נאספו לידי בלוק פרפין אחת. קטעים מתוך בלוק משמשים אימונוהיסטוכימיה וניתוח דפוסי ביטוי חלבון. סריקה דיגיטלית מייצר תמונות המתאימות להפצה של נתונים.

הפקה של microarrays רקמות, צביעה אימונוהיסטוכימיה ו דיגיטציה בתוך אטלס החלבון האנושי

המוני רקמות מורכבים, מאיברים לגידולים, מורכבים מאלמנטים הסלולר שונים. אנו הובהר התרומה של פנוטיפים הסלולר בתוך רקמת ניצול עכברים הטרנסגניים ניאון רב שכותרתו בשילוב עם מכתים immunofluorescent multiparameter אחרי unmixing רפאים לפענח מוצא תא, כמו גם מאפייני תא המבוססים על ביטוי חלבון.

כמותיים Multispectral ניתוח בעקבות השתלת רקמות פלורסנט וליזואליזציה של מקורות ניידים, סוגים, ואינטראקציות

אנו מציגים גישת רישום תמונה לשחזור נפח היסטולוגיה תלת מימדית (תלת מימדית), המאפשרת לחקור את השינויים של איבר ברמת מבני המאקרו המורכבים מתאים. באמצעות גישה זו, חקרנו את השינויים התלת-ממדיים בין בלוטות חלב מסוג בר לבלוטות חלב Igfbp7-null.

שחזור נפח היסטולוגיה 3 ממדים ויישומו לחקר מאוס החלב בלוטות

הפרוטוקול שמטרתו לייעל את הבנייה ואיכות של microarrays רקמות למחקר סמן ביולוגי. הוא כולל היבטים של תכנון ועיצוב, פתולוגיה הדיגיטלית, ביאור שקופיות וירטואלי, וarraying רקמות האוטומטית.

פרוטוקול Microarray רקמות הדור הבא (ngTMA) לביומרקר לימודים

אימונוהיסטוכימיה היא טכניקת מעבדה רבת עוצמה להערכת לוקליזציה וביטוי של חלבונים בתוך רקמות. שיטות אוטומטיות למחצה לכימות מציגות סובייקטיביות ולעתים קרובות יוצרות תוצאות בלתי ניתנות לשחזור. כאן, אנו מתארים שיטות לאימונוהיסטוכימיה מרובה וכימות אובייקטיבי של ביטוי חלבון ולוקליזציה משותפת באמצעות הדמיה מולטי-ספקטרלית.

כימות של ביטוי חלבון ו Co-לוקליזציה שימוש חיסונית-histochemical Multiplexed מכתים והדמיה Multispectral

היישום המעשי והביצועים של שיטות לדור של דגימות רקמה נציג של חזירי מודלים בבעלי חיים עבור קשת רחבה של ניתוחים במורד הזרם בפרויקטים biobank מודגמות, כולל volumetry, דגימה אקראית שיטתית, ועיבוד דיפרנציאלית של דגימות רקמה עבור סוגי ניתוחים כמותיים מורפולוגיות ומולקולרית.

אסטרטגיות דגימה ועיבוד של דגימות רקמה Biobank של מודלים ביו חזירי

כאן, אנו מתארים אסטרטגיה פשוטה ונגישה להמחיש, לכמת, ומיפוי תאים חיסוניים ב-formalin-קבוע פרפין מוטבע רקמת הגידול סעיפים. מתודולוגיה זו משלבת הדמיה קיימת טכניקות ניתוח דיגיטלי עם המטרה של הרחבת יכולת ריבוב וניתוח רב פרמטרים של הדמיה מספר.

הדמיה, קוונפיקציה, ומיפוי של אוכלוסיות תאים החיסונית במיקרו סביבה הגידול

אנו מתארים פרוטוקולים עבור הערכת מידת התמרה על ידי תאי-חודר פפטידים ניצול מערכות הדמיה vivo ex ולאחר מכן הטבעה פרפין, ומיקרוסקופית פלורסנט קונפוקלית וקד באמצעות מיקוד הלב פפטיד כדוגמה. בפרוטוקול שלנו, בעל חיים יחיד יכול לשמש לרכישת שני סוגים של הערכת הדמיה של אותם איברים, ובכך לחתוך את מספר בעלי החיים הדרושים ללימודים על ידי חצי.

ב Vivo הדמיה של התמרה יעילות של מיקוד הלב פפטיד

מאמר זה מתאר שיטות לדור, טיפול תרופתי וניתוח של explants נגזרים על ידי המטופל להערכת תגובות לתרופות גידול במערכת מודל חי, רלוונטי למטופל, פרה-קלינית.

גידול שמקורו במטופל explants כפלטפורמה פרה-אקלינית "חיה" לחיזוי עמידות לתרופות בחולים

פרוטוקול זה מתווה את שיטת הקלטת כיצד לבנות באופן ידני מיקרו-מערך רקמות באמצעות בלוקים של תורמי FFPE בעומקים שונים.

בנייה ידנית של מיקרו-מערך רקמות בשיטת הקלטת ובמיקרו-מערך כף יד

למדו כיצד לבנות תגי SpOT לזיהוי רקמות בבלוקי פרפין רב-רקמה באמצעות HistoGel וצבע סימון. שיטה זו משפרת דיוק בהזדהות רקמות בהיסטולוגיה.

נקודת רקמות נכונות בכל זמן בלוקים רב-רקמה

גלה סרטונים נוספים