שיתוף immunoprecipitation של חלבון העכבר MX1 עם nucleoprotein וירוס השפעת

פרוטוקול קו-אימונו-משקעים זה מאפשר לחקור את האינטראקציה בין נוקלאופרוטאין של נגיף השפעת A לבין החלבון האנטי-ויראלי Mx1 בתאים אנושיים. הפרוטוקול מדגיש את החשיבות של N-ethylmaleimide להצלחה של קו-אימונו-משקעים של Mx1 ונוקלאופרוטאין של נגיף השפעת A.

המטרה הכוללת של הליך זה היא להדגים את האינטראקציה בין חלבון MX אחד אנטי-ויראלי לבין המטרה הנגיפית שלו, חלבון גרעין השפעת באמצעות משקעים חיסוניים. זה מושג על ידי ליזה ראשונה של תאים שעברו טרנספטציה המכילים את שני החלבונים בנוכחות ide. השלב השני הוא הוספת נוגדן ספציפי לחלבון גרעיני שייקשר לחלבון הגרעיני של השפעת ולחלבון האינטראקציה MX one.

לאחר מכן, הקומפלקסים החיסוניים המתקבלים מזורזים בחרוזי חלבון G והחלבונים המזהמים מוסרים באמצעות שטיפות נרחבות. השלב האחרון הוא לסלק את החלבון הגרעיני של השפעת והחלבון הזריז MX one מחרוזי החלבון G. בסופו של דבר, נעשה שימוש בכתמים מערביים כדי להראות את האינטראקציה בין החלבון הגרעיני של השפעת לבין החלבון האנטי-ויראלי MX one.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו שתי ההיברידיות הללו הוא שהחלבונים המקיימים אינטראקציה מתאימים לסביבתם הטבעית, שהיא התא האנושי. שיטות אלה יכולות לספק תובנה לגבי האינטראקציה בין החלבון הגרעיני של שפעת, לבין החלבון האנטי-ויראלי AMX one, אך ניתן גם לשנות אותו כדי לחקור אינטראקציות חלבון חלבון חלשות או חולפות אחרות. הטכניקה תודגם על ידי עמית מהמעבדה שלי, הכן את כל מאגרי הטרנספקציה כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה.

לדלל את ה-DNA של הפלזמה ל-600 מיקרוליטר של tris EDTA. לאחר מכן הוסף 150 מיקרוליטר של ערימות סידן כלורי חוצץ בצורה טיפתית לדגימות הפלסמיד, ולערבב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה שלוש פעמים. הוסף את התוצאה ב-750 מיקרוליטר של תמיסת פלסמיד טיפתית ל-750 מיקרוליטר של ערימות מלח חוצצות המונחות בצלחת טרייה של שש בארות.

הקפידו להפיץ את תמיסת הפלסמיד באופן שווה על פני כל הבאר. לאחר מכן הניחו את תמיסת הטרנספקציה על שייקר צלחת למשך 90 שניות ב-1000 סל"ד, ולאחר מכן דגרו את התערובת בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. קח צלחת פטרי מצופה תרבית רקמה של תשעה סנטימטרים עם תאי HEC 2 9 3 T עם תאים תת-מתכנסים ביום הטרנספקציה.

בעזרת מיקרו פיפט P 1000, הוסיפו את תמיסת הטרנספקציה לתאים, והקפידו לפזר את התערובת באופן שווה על כל הצלחת. לאחר הוספת כל 1.5 מיליליטר של תמיסת הטרנספקציה, יש לנער בעדינות את הצלחת, לדגור את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני למשך שש שעות. לאחר מכן שאפו את המדיום והחליפו מיד ב -12 מיליליטר טרי חם מראש, בינוני בעדינות.

כדי למנוע ניתוק תאים. הכן פתרונות ליזה של allstock כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה. לאחר ההכנה, שטפו את התאים עם שני מיליליטר PBS קר כקרח בצע את הכביסה בעדינות כאשר תאי HEC 2 9 3 T מתנתקים בקלות.

לאחר מכן, הסר את ה-PBS והוסף 600 מיקרוליטר של מאגר קרח קר ודל מלח לכל צלחת והניח אותם על קרח למשך 20 דקות כל חמש דקות, נער בעדינות כל צלחת וודא שהצלחות נשמרות אופקיות. אסוף את הליזאט של התא בצינור מיקרו צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר וצנטריפוגה אותו במשך שלוש דקות בארבע מעלות צלזיוס ו-16,000 פעמים G.To גלולה, החלק הבלתי מסיס. העבירו את השבר המסיס לצינור מיקרו צנטריפוגה טרי של 1.5 מיליליטר והניחו אותו על קרח.

בצע את השלבים הנותרים ככל האפשר על קרח או בארבע מעלות כדי להגביל את הפעילות הפרוטאוליטית בליזאטים. להכנת הקומפלקסים החיסוניים מערבבים 135 מיקרוליטר ליזאט עם שני מיקרוליטרים של נוגדן חד שבטי אנטי NP ו-113 מיקרוליטר של מאגר ליזה דל מלח. לנפח כולל של 250 מיקרוליטר, אחסן את הליזט הנותר במינוס 20 מעלות צלזיוס.

לניתוח נוסף כגון כתמים מערביים, דגרו את תערובת הליזאט של הנוגדנים למשך שלוש שעות עד לילה על גלגל מסתובב בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הכינו את חרוזי החלבון G על ידי הוספת 100 מיקרוליטר של תמיסת חרוזים לכל דגימה לצינור יחיד. צנטריפוגה את התרחיץ בטמפרטורה של 8, 000 פעמים גרם וארבע מעלות צלזיוס למשך 30 שניות והסר את תמיסת האתנול בה הם מאוחסנים.

הוסף נפח שווה של קרח קר, מאגר ליזה דל מלח, וערבב בעדינות את הצנטריפוגה של תמיסת חרוזי החלבון G שוב ב-8, 000 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס למשך 30 שניות. ואז הסר בזהירות את הסופרנטנט. העריכו את נפח חרוזי החלבון G שנותרו, והוסיפו נפח שווה של מאגר ליזה דל מלח קר כקרח כדי ליצור תמיסת חרוזים חדשה של 50% במאגר ליזה דל מלח.

השעו את התרחיץ והעבירו 100 מיקרוליטר לצינור צנטריפוגה טרי של 1.5 מיליליטר. אחסן את הצינור על קרח עד שיהיה צורך בו לפני השימוש בחרוזי החלבון G לצנטריפוגה חיסונית, כל הצינורות למשך 30 שניות ב-8,000 פעמים גרם וארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, ודא על ידי בדיקה ויזואלית שיש כמויות שוות של חרוזים בכל הדגימות.

במידת הצורך, התאם שוב את כמות החרוזים בחלק מהדגימות והצנטריפוגה. ברגע שכל הדגימות נראות שוות בערך 50 מיקרוליטר, השליכו את הסופרנטנטים תוך הקפדה לא להפריע לחרוזי החלבון G הגלולים. לאחר מכן, לזמן קצר, צנטריפוגה של קומפלקסים חיסוניים למשך 30 שניות בטמפרטורה של 8,000 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס כדי לאסוף את הדגימה בתחתית הצינור.

לאחר מכן העבירו את כל קומפלקסי החיסון לחרוזי החלבון G. דגירה במשך 60 דקות על גלגל מסתובב בארבע מעלות צלזיוס כדי לא לדגור את הפעימות עם קומפלקסים חיסוניים למשך יותר מ-75 דקות. דגירה לפרק זמן ארוך יותר מגדילה את הקישור הלא ספציפי של חלבונים להימורי החלבון G.

לאחר מכן צנטריפוגה את חרוזי החלבון G עם הקומפלקסים החיסוניים הקשורים כעת. הסר את הסופרנטנטים, אך היזהר לא להפריע לחרוזי החלבון G הגלולים. לאחר מכן, שטפו את חרוזי החלבון G למשך כחמש דקות עם 900 מיקרוליטר של מאגר ליזיס מלח גבוה.

ודא שהחרוזים תלויים לחלוטין במאגר הכביסה. לצנטריפוגת כביסה אופטימלית, חרוזי החלבון G למשך 30 שניות בטמפרטורה של 8, 000 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס והשליכו את הסופרנטנטים. היזהר לא להפריע לחרוזי החלבון G הגלולה כדי למנוע אובדן של החומר המשקע החיסוני.

לאחר שלב הכביסה האחרון, הוסיפו לחרוזים 50 מיקרוליטר של שני מאגר דגימה צולע וחממו את התרחיף למשך 10 דקות בחום של 95 מעלות צלזיוס. כדי להוציא. הקון זירז חלבונים לאחר חימום צנטריפוגה, החלבון G חרוזים למשך 30 שניות ב -8,000 פעמים.

ז. לאחר מכן אחסן את הדגימות בארבע מעלות צלזיוס אם ישמשו אותן מיד או במינוס 20 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח ארוך. מוצג כאן כתם מערבי של ניסוי קו-אימונו-משקעים שבו שתי דגימות, אחת, המכילה גם את החלבון האנטי-ויראלי MX אחד וגם את נגיף השפעת A, חלבונים גרעיניים נוכחים, ובקרה שבה קיים רק חלבון MX אחד. בלוק זה בחר כי חלבון ה-MX one יושקע רק בנוכחות שפעת המתבטאת במשותף, חלבון גרעיני של נגיף.

כאן ניתן לראות את החשיבות של שימוש בחומר האלקילציה N ide. בעת הכנת הליזאטים של התא בנוכחות N ylm, ניתן לזהות את האינטראקציה NP MX one, אך בהיעדרו, אינטראקציה זו אינה ניתנת לזיהוי. שיטה זו היא מגוונת מאוד וניתן להשתמש בה כדי להעריך את המשקעים החיסוניים של MX אחד עם שפעת, נגיף, חלבון גרעיני מליזאטים, שמקורו בתאים שעברו טרנספטציה, תאים נגועים או נגזרים מווריאנים.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד לבצע ניסוי אימונו-משקעים משותפים. יתר על כן, הוספת מדיה לליזה של התא מאפשרת לחקור אינטראקציות חלבון חלבון חלשות או חולפות כגון האינטראקציה בין שפעת, נגיף, חלבון גרעיני וחלבון Amex One האנטי-נגיפי.