Name: הדמיה של חלבונים תיקון ה- DNA miniSOG תייג בשילוב עם אלקטרונים Spectroscopic הדמיה (ESI) (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 6 s
Description: חקור את מבנה הכרומטין בנזקי DNA באמצעות הדמיית ספקטרוסקופית אלקטרונים ותיוג miniSOG. שיטה זו מאפשרת מיפוי חלבוני תיקון DNA ברזולוציה ננומטרית לניתוח מרחבי מדויק.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לד"ר רוג'ר ציין על שסיפק לנו את מבני ה-miniSOG. ד"ר שואה-ג'ון סון על עזרתו ב-TEM. ליסה לם ופיטר שיפל מהמכון לסרטן צולב על אספקת חמצן. הילמר סטריקפדן מחזיק במלגת פוסט-דוקטורט מטעם קרן אלברטה למלחמה בסרטן ונתמך על ידי Bayrische Forschungsallianz. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכונים הקנדיים לחקר הבריאות וקרן הסרטן של אלברטה.

<ol><li>Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+super-resolution+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A guide to super-resolution fluorescence microscopy.</a> The Journal of Cell Biology. 190, 165-175 (2010).</li>
<li>Bazett-Jones, D. P., Hendzel, M. J., Kruhlak, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stoichiometric+analysis+of+protein-+and+nucleic+acid-based+structures+in+the+cell+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Micron+%28Oxford%2C+England%3A+1993%29%22%5BJournal%5D)">Stoichiometric analysis of protein- and nucleic acid-based structures in the cell nucleus.</a> Micron (Oxford, England: 1993). 30, 151-157 (1999).</li>
<li>Michael J Hendzel, F. M. B., Bazett-Jones, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Visualization+of+a+Protein+Nuclear+Architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Direct Visualization of a Protein Nuclear Architecture.</a> Molecular biology of the cell. 10, 2051(1999).</li>
<li>Ottensmeyer, F. P., Andrew, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+microanalysis+of+biological+specimens+by+electron+energy+loss+spectroscopy+and+by+electron+spectroscopic+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+ultrastructure+research%22%5BJournal%5D)">High-resolution microanalysis of biological specimens by electron energy loss spectroscopy and by electron spectroscopic imaging.</a> Journal of ultrastructure research. 72, 336-348 (1980).</li>
<li>Leapman, R. D., Ornberg, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+electron+energy+loss+spectroscopy+in+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Quantitative electron energy loss spectroscopy in biology.</a> Ultramicroscopy. 24, 251-268 (1988).</li>
<li>Simon, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+spectroscopic+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrastructural+pathology%22%5BJournal%5D)">Electron spectroscopic imaging.</a> Ultrastructural pathology. 11, 705-710 (1987).</li>
<li>Egerton, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEgerton%2C+R+%22Electron+Energy-Loss+Spectroscopy+in+the+Electron+Microscope%22">Electron Energy-Loss Spectroscopy in the Electron Microscope</a>. , Springer. (2011).</li>
<li>Aronova, M. A., Kim, Y. C., Zhang, G., Leapman, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+and+thickness+correction+of+EFTEM+phosphorus+maps%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Quantification and thickness correction of EFTEM phosphorus maps.</a> Ultramicroscopy. 107, 232-244 (2007).</li>
<li>Hopkins, C., Gibson, A., Stinchcombe, J., Futter, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+molecules+employing+horseradish+peroxidase+as+reporter+enzyme+for+protein+localization+in+the+electron+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Chimeric molecules employing horseradish peroxidase as reporter enzyme for protein localization in the electron microscope.</a> Methods in enzymology. 327, 35-45 (2000).</li>
<li>Shu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Genetically+Encoded+Tag+for+Correlated+Light+and+Electron+Microscopy+of+Intact+Cells%2C+Tissues%2C+and+Organisms%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+biology%22%5BJournal%5D)">A Genetically Encoded Tag for Correlated Light and Electron Microscopy of Intact Cells, Tissues, and Organisms.</a> PLoS biology. 9, e1001041(2011).</li>
<li>Gaietta, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+and+electron+microscopic+imaging+of+connexin+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+NY%29%22%5BJournal%5D)">Multicolor and electron microscopic imaging of connexin trafficking.</a> Science (New York, NY). 296, 503-507 (2002).</li>
<li>Fernandez-Capetillo, O., Celeste, A., Nussenzweig, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focusing+on+foci%3A+H2AX+and+the+recruitment+of+DNA-damage+response+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+cycle+%28Georgetown%2C+Tex%29%22%5BJournal%5D)">Focusing on foci: H2AX and the recruitment of DNA-damage response factors.</a> Cell cycle (Georgetown, Tex). 2, 426-427 (2003).</li>
<li>Haaf, T., Golub, E. I., Reddy, G., Radding, C. M., Ward, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+foci+of+mammalian+Rad51+recombination+protein+in+somatic+cells+after+DNA+damage+and+its+localization+in+synaptonemal+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Nuclear foci of mammalian Rad51 recombination protein in somatic cells after DNA damage and its localization in synaptonemal complexes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 2298-2302 (1995).</li>
<li>Maser, R. S., Monsen, K. J., Nelms, B. E., Petrini, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((hMre11+and+hRad50+nuclear+foci+are+induced+during+the+normal+cellular+response+to+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">hMre11 and hRad50 nuclear foci are induced during the normal cellular response to DNA double-strand breaks.</a> Molecular and Cellular Biology. 17, 6087-6096 (1997).</li>
<li>Bekker-Jensen, S., Mailand, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+and+function+of+DNA+double-strand+break+repair+foci+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+repair%22%5BJournal%5D)">Assembly and function of DNA double-strand break repair foci in mammalian cells.</a> DNA repair. 9, 1219-1228 (2010).</li>
<li>Chapman, J. R., Sossick, A. J., Boulton, S. J., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRCA1-associated+exclusion+of+53BP1+from+DNA+damage+sites+underlies+temporal+control+of+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+cell+science%22%5BJournal%5D)">BRCA1-associated exclusion of 53BP1 from DNA damage sites underlies temporal control of DNA repair.</a> Journal of cell science. 125, 3529-3534 (2012).</li>
<li>Dellaire, G., Kepkay, R., Bazett-Jones, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+imaging+of+changes+in+the+structure+and+spatial+organization+of+chromatin%2C+gamma-H2A.X+and+the+MRN+complex+within+etoposide-induced+DNA+repair+foci%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+cycle+%28Georgetown%2C+Tex%29%22%5BJournal%5D)">High resolution imaging of changes in the structure and spatial organization of chromatin, gamma-H2A.X and the MRN complex within etoposide-induced DNA repair foci.</a> Cell cycle (Georgetown, Tex). 8, 3750-3769 (2009).</li>
<li>Kruhlak, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+chromatin+structure+and+mobility+in+living+cells+at+sites+of+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Changes in chromatin structure and mobility in living cells at sites of DNA double-strand breaks.</a> The Journal of Cell Biology. 172, 823-834 (2006).</li>
<li>Goodson, H. V., Dzurisin, J. S., Wadsworth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+stable+cell+lines+expressing+GFP-tubulin+and+photoactivatable-GFP-tubulin+and+characterization+of+clones%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of stable cell lines expressing GFP-tubulin and photoactivatable-GFP-tubulin and characterization of clones.</a> Cold Spring Harbor protocols. 2010, (2010).</li>
<li>Zeyda, M., Borth, N., Kunert, R., Katinger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+sorting+conditions+for+the+selection+of+stable%2C+high-producing+mammalian+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+progress%22%5BJournal%5D)">Optimization of sorting conditions for the selection of stable, high-producing mammalian cell lines.</a> Biotechnology progress. 15, 953-957 (1999).</li>
<li>Dellaire, G., Nisman, R., Bazett-Jones, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+light+and+electron+spectroscopic+imaging+of+chromatin+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Correlative light and electron spectroscopic imaging of chromatin in situ.</a> Methods in enzymology. , 375-456 (2004).</li>
<li>Campbell, S., Ismail, I. H., Young, L. C., Poirier, G. G., Hendzel, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polycomb+repressive+complex+2+contributes+to+DNA+double-strand+break+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+cycle%22%5BJournal%5D)">Polycomb repressive complex 2 contributes to DNA double-strand break repair.</a> Cell cycle. 12, 2675-2683 (2013).</li>
<li>Mortusewicz, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruitment+of+RNA+polymerase+II+cofactor+PC4+to+DNA+damage+sites%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Recruitment of RNA polymerase II cofactor PC4 to DNA damage sites.</a> J Cell Biol. 183, 769-776 (2008).</li>
<li>Bekker-Jensen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+organization+of+the+mammalian+genome+surveillance+machinery+in+response+to+DNA+strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Spatial organization of the mammalian genome surveillance machinery in response to DNA strand breaks.</a> The Journal of Cell Biology. 173, 195-206 (2006).</li>
<li>Ferrando-May, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highlighting+the+DNA+damage+response+with+ultrashort+laser+pulses+in+the+near+infrared+and+kinetic+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+genetics%22%5BJournal%5D)">Highlighting the DNA damage response with ultrashort laser pulses in the near infrared and kinetic modeling.</a> Frontiers in genetics. 4, 135(2013).</li>
<li>Lukas, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((53BP1+nuclear+bodies+form+around+DNA+lesions+generated+by+mitotic+transmission+of+chromosomes+under+replication+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">53BP1 nuclear bodies form around DNA lesions generated by mitotic transmission of chromosomes under replication stress.</a> Nature. 13, 243-253 (2011).</li>
<li>Harrigan, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+stress+induces+53BP1-containing+OPT+domains+in+G1+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Replication stress induces 53BP1-containing OPT domains in G1 cells.</a> The Journal of Cell Biology. 193, 97-108 (2011).</li>
<li>Aronova, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprint+of+%27Three-dimensional+elemental+mapping+of+phosphorus+by+quantitative+electron+spectroscopic+tomography+%28QuEST%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Reprint of 'Three-dimensional elemental mapping of phosphorus by quantitative electron spectroscopic tomography (QuEST).</a> J. Struct. Biol. 161, 322-335 (2007).</li>
<li>Fussner, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constitutive+heterochromatin+reorganization+during+somatic+cell+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">Constitutive heterochromatin reorganization during somatic cell reprogramming.</a> The EMBO journal. 30, 1778-1789 (2011).</li>
<li>Kepkay, R., Attwood, K. M., Ziv, Y., Shiloh, Y., Dellaire, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KAP1+depletion+increases+PML+nuclear+body+number+in+concert+with+ultrastructural+changes+in+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+cycle%22%5BJournal%5D)">KAP1 depletion increases PML nuclear body number in concert with ultrastructural changes in chromatin.</a> Cell cycle. 10, Georgetown, Tex. 308-322 (2011).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

ESI יכול לשמש ככלי מצוין לבחינת מצבים שונים של הכרומטין וribonucleoproteins בגרעין, כי הוא מסוגל למפות במיוחד אזורים עשירים בזרחן. זה עמוק מרחיב את כמות הפרטים שניתן להשיג על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים ואינה תלוי בשיטות מנוגדות ספציפיות. אחד חסרונות של ESI הוא שהיא דורשת חלקים רזים יותר TEM הקונבנציונלי באותו המתח מאיץ. זה ניתן להתגבר על ידי עבודה עם חלקים סידוריים או בשיטות טומוגרפיה 28. למרות שניתן להשי...

למרות ההתקדמות המשמעותית במיקרוסקופ אור בשנים האחרונות 1, תא-ביולוגים עדיין סובלים מפער ברזולוציה. זה מגביל את ההבנה של מערכות היחסים מבנה-תפקוד בתהליכים תאיים בסיסיים שכוללים את יחסי גומלין בין מתואמים מתחמי macromolecular (למשל, בשיפוץ הכרומטין, תיקון DNA, שעתוק RNA ושכפול ה- DNA). למרות שמיקרוסקופי אלקטרונים הילוכים (TEM) זה לספק את הרזולוציה הנדרשת, זה כבר מאתגר להגדיר תהליכים מבני בגלל חוסר היכולת אלה לתייג חלבונים ספציפיים בעת גם להיות מסוגל לקבוע את ההרכב הביוכימי של המבנים דמיינו. בהעדר הקרום הפנימי כדי לעזור להבדיל מבנים גרעיניים, הגרעין היה מאתגר במיוחד. הדמיה ספקטרוסקופיות אלקטרונים (ESI) פותרת חלק ממגבלות אלה על ידי המאפשרים זיהוי ובידול בו זמניים של DNA, RNA, וprotעין מבוססת מבנים גרעיניים 2-5. הדמיה ספקטרוסקופיות אלקטרונים: כדי למפות הפצות יסודות ברגישות גבוהה ורזולוציה במיקרוסקופ האלקטרונים, אחד יכול להשתמש בספקטרומטר הדמיה שבוחר אלקטרונים שכבר פזורים inelastically דרך אינטראקציות עם אלקטרונים מעטפת פנימיים של אלמנט בדגימה 6. בגלל כמויות אלמנט ספציפי של אנרגיה הולכות לאיבוד כתוצאה מיינון של האטומים בדגימה, ניתן להפריד אלקטרונים אלה ומדמיינים באמצעות ספקטרומטר המחובר למיקרוסקופ האלקטרונים. לפיכך, ניתוח של הספקטרום של האלקטרונים שתקשרו עם הדגימה חושף מידע איכותי וכמותי על הרכב היסודות של המדגם 7. אלקטרונים שלא לאבד אנרגיה כאשר עוברים דרך הדגימה נמצאים ב&quot; שיא אפס האובדן &quot;של אובדן אנרגיית האלקטרוןספקטרום. השפע של אלקטרונים אלה קשור למסה, הצפיפות והעובי של הדגימה ומורכבת מאלקטרונים שעוברים דרך הדגימה ללא התנגשות עם הדגימה או לאבד אנרגיה במהלך מעבר בדגימה. מידע זה יכול להיות שימושי לכימות מוחלט של המספרים של אטומים של יסוד מסוים בהווה הדגימה 8. מאז דגימות ביולוגיות מורכבות בעיקר של אלמנטי אור שגרוע להסיט את האלקטרונים באלומת האירוע של TEM, שיטות צביעה באמצעות מתכת כבדה מלחים צריכים להיות מיושמים על מנת ליצור ניגוד במדגם. חוסר הספציפי של רוב הסוכנים המנוגדים הללו וחוסר היכולת לחזות כתם אחד או יותר שבו סגוליות הוא אפשרי הגביל את הערך של מיקרוסקופ אלקטרונים הקונבנציונלי במחקר של הגרעין. יש ESI יתרונות משמעותיים על פני TEM הקונבנציונלי, במיוחד לחקר מבנים של גרעין התא.אפשר לנצל את טבע זרחן העשיר של דנ&quot;א ומתחמי macromolecular המכיל RNA להבחין מתחמי nucleoprotein מקומפלקסי חלבונים ולפתור מתחמי nucleoprotein שונים המבוססים על צפיפותם של חומצות גרעין. ניתן הדמיה החומר ביולוגי שנותר מבוסס על השפע של חנקן. מיפוי רק שני אלמנטים אלה וניתוח של ההפצה שלהם ושפע יחסי בתוך מבנים אנטומיים שונים מספק לנו הרבה מידע על הגרעין. לדוגמא, קל לזהות הכרומטין והריבוזומים במפה מייצגים שפע זרחן. חלל interchromatin, מתחמים נקבוביות גרעיניים, וגופים גרעיניים, לעומת זאת, ניתן לאתר בקלות בתמונה מפת החנקן. מערכת מחולל חמצן גופיית מיני (miniSOG) בעוד ESI מייצג טכניקה חזקה ללמוד במבנה הכרומטין אתר כי זה ייקחיתרון של של היחסים האופייניים ברכב יסודות בין זרחן וחנקן, הרכב היסודות לא יכול בדרך כלל לשמש להפלות בין אוכלוסיות השונות של קומפלקסי חלבונים. נוגדנים שכותרתו עם חלקיקי זהב קטנים בטווח ננומטר היו בשימוש נרחב כדי למפות את המיקום של מולקולות בודדות. מאז חלקיקי הזהב הוא בדרך כלל מצורף לנוגדנים משני, היא תופיע בהיקף של כ 20 ננומטר סביב epitope זוהה על ידי הנוגדן הראשוני. בדגימות שלאחר ההטבעה, נוגדנים יכולים רק לזהות את אפיטופים שנחשפים על פני השטח של החלקים. למרות שניתן להוכיח את קיומו של אנטיגן ומתייחס זה למבנה האנטומי מסוים של התא, המידע שמתקבל אינם שלם, שכן רוב epitopes הם מוסתרים על ידי שרף. טרום הטבעת טכניקות, המשתמשות בפרוטוקולים דומים לאלה המשמשים למיקרוסקופ פלואורסצנטי, לאפשר גישה לאנטיגנים בכלכל העומק של המדגם אבל צעדי permeabilization הנדרשים על מנת לאפשר את הנוגדן לחדור לתא בדרך כלל דורש הסרת קרומי שומנים ולהסיר רכיבים שלא ניתן לתקן על ידי אלדהידים. יתר על כן, מקבע אלדהיד העדיף לשימור ultrastructure, glutaraldehyde, בדרך כלל הורס epitopes וכתוצאה מכך, נדרש בדרך כלל paraformaldehyde. זה פחות יעיל בcrosslinking חלבונים. חסרון נוסף של נוגדנים שכותרתו עם ננו-חלקיקי זהב הוא שזהב הוא חומר אלקטרון-צפוף מאוד שיוצר ניגוד חזק שיכול לטשטש פרטים מבניים מעניינים של המדגם, שבה יש ניגוד חלש. ההופעה של חלבון הניאון הירוק (GFP) כתג חלבון הביע הפכה את השימוש במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לענות על שאלות בביולוגיה של תא. תיוג חלבון עם תחום ניאון קטן מאפשר מיפוי של ההפצה שלה בvivo </eמ &#39;&gt; ללא צורך בהליכי permeabilization שיכול לשנות את המבנה. כדי לתרגם את העיקרון האלגנטי של שימוש בתגי חלבון למפות הפצות חלבון בתא למיקרוסקופי אלקטרונים, הייתה צורך במערכת שהיא מסוגלת לייצר קרובה אות למבנה של עניין וליצור ניגוד בTEM. diaminobenzidine polymerized הוא כתם המשמש לעתים קרובות בהיסטולוגיה כדי לזהות נוגדנים מחייבים. כתם זה הוא בדרך כלל שהופקד באמצעות peroxidase חזרת (HRP) מצומדת לנוגדנים משני. למרות התגובה מייצרת תוצאה אמינה, HRP הוא לא catalytically פעיל בcytosol של תאים 9. תוצרי התגובה של HRP יכול גם לפזר מהאתר של ייצור, כך שהרזולוציה שלהם היא יותר גרועה מאשר בשיטת nanogold 10. כדי לעקוף בעיות אלה, המערכת / ReAsH הבזק פותחה 11. הוא מורכב מחלבוני היתוך רקומביננטי שיש מוטיב tetracysteine. מוטיב זה מאפשר קשירה שלfluorophore biarsenic. כאשר נרגש, פלאש הכבול או ReAsH הוא מסוגל לייצר חמצן תגובתי הגופייה וdiaminobenzidine כך photoconvert (DAB) לפולימר שמשקע באופן מיידי באתר של החלבונים המתויגים. פולימר DAB יכול להיות מוכתם עם tetroxide אוסמיום, אשר הוא אלקטרון צפוף ובכך יכול לשמש כדי למפות את ההפצה של חלבון היתוך רקומביננטי בTEM. בשינה 2011, שו et al. 10 הציגו את מערכת miniSOG, אשר מורכבת תג היתוך חומצות אמינו קטן 106 נגזר מflavoprotein של ארבידופסיס שהוא ניאון ומסוגל ליצור רדיקלים רבים גופייה כאשר נרגשים עם אור כחול 448 ננומטר. אלה רדיקלים גופייה יכולים לשמש לdiaminobenzidine צילום חמצן כדי ליצור פולימרים ובסמכו לפני השטח של החלבון מתויג, שהוא במידה ניכרת קרוב יותר מנוגדנים שכותרת immunogold 11. בעוד מערכת Flash / ReAsH דורשת להביא fluoroכרום וdiaminobenzidine לתוך התאים לפני שאני עושה photoconversion, מערכת miniSOG דורשת רק diaminobenzidine ואור ובנוסף היא פי שניים יעיל בpolymerizing diaminobenzidine. כאן, miniSOG מועסק בשילוב עם ESI כדי למפות את ultrastructure של מוקדי תיקון DNA. מוקדי תיקון DNA (DRF) הפסקות גדיל הדנ&quot;א כפולות מתוקן מהוות איום רציני לתא שכן הם יכולים להוביל לטרנסלוקציות ואובדן של מידע גנטי. בתורו, זה יכול להוביל להזדקנות, סרטן, ומוות של תאים. חלבונים רבים שעוסקים בתיקון הפסקת גדיל הדנ&quot;א כפול מצטברים במוקדים שסביב להרכיב גדיל הדנ&quot;א כפול לשבור 12-14. למרות שתפקידם אינו ידוע, הם מייצגים את האתר בגרעין המכיל את הפסקת גדיל הדנ&quot;א הכפולה, והוא האתר של תיקון הפסקת גדיל הדנ&quot;א כפול. foc תיקון DNAאני (DRF) מתאפיינים על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי והם משמשים כסמנים ביולוגיים לנזק לדנ&quot;א 12,15. הם מסיביים יחסית לגודל של הפסקת גדיל פעמיים ונחשבו הומוגנית יחסית עד מחקרי מיקרוסקופ ברזולוציה הסופר האחרונים חשפו כמה עדויות של תת-מידור של מולקולות בתוך כל להתמקד 16. על מנת להבין כיצד אתרים אלו מאורגנים, יש צורך לדמיין את כל המבנים ביולוגיים הבסיסיים ביחס לזה. זה לא יכול להיות מושגת על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי אבל אפשרי באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים 17,18. הנה, שיטה מתוארת המשלבת הדמיה ספקטרוסקופיות אלקטרון עם שיטת miniSOG כדי להמחיש את הפוטנציאל של גישה משולבת זו כדי לחקור את ultrastructure של תיקון הפסקה כפול גדיל DNA.

<table><tbody><tr><td>כלי תחתית זכוכית 35 מ"מ</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>כלי תחתית זכוכית 35 מ"מ מרושתים</td><td>MatTek</td><td>P35G-2-14-CGRD&nbsp;</td><td>לא נועד למטרות טבילה</td></tr><tr><td>LR לבן: שרף אקריל</td><td>emsdiasum</td><td>14381</td><td></td></tr><tr><td>LR מאיץ לבן</td><td>emsdiasum</td><td>14385</td><td></td></tr><tr><td>3,3&prime;-Diaminobenzidine tetrahydrochloride 10 טבליות</td><td>Sigma</td><td>D5905</td><td></td></tr><tr><td>Slim Bar Grids 300 Mesh</td><td>SPI</td><td>1161123</td><td></td></tr><tr><td>טונגסטן-פוינט מעבדה עט</td><td>emsdiasum</td><td>41148</td><td></td></tr><tr><td>אוסמיום טטרוקסיד</td><td>emsdiasum</td><td>19100</td><td></td></tr><tr><td>Carbon Coater 208 Carbon</td><td>Cressington</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultra microtome Leica EM UC6</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Photoshop CS5</td><td>Adobe</td><td></td><td>עשויה אפילו לעבוד עם גרסאות ישנות יותר</td></tr><tr><td>Digital Micrograph V.2.30</td><td>Gatan</td><td></td><td>עשוי אפילו לעבוד עם גרסאות ישנות יותר</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma</td><td>H-1399</td><td></td></tr><tr><td>Effectene</td><td>Quiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MiniSOG-Constructs</td><td>Tsien-Lab</td><td></td><td><a href="mailto:tsienlab@yahoo.com">tsienlab@yahoo.com</a></td></tr><tr><td>MDC1 miniSOG mCherry</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>53BP1 miniSOG mCherry</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rad52 miniSOG mCherry</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>צזיום 137 מקור קרינה "סימן 1"</td><td>&nbsp;( ג'יי.ל. שפרד & קשור)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>ImageJ / FiJi</td><td>קוד</td><td></td> פתוח <td>http://fiji.sc/Fiji</td></tr><tr><td>צינורות אפנדורף 2 מ"ל</td><td>פישרברנד</td><td>05-408-146</td><td></td></tr><tr><td>סכין יהלום אולטרה 35& מעלות;</td>סכין זמירה <td>דיאטומית</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ultratrim</td><td>דיאטומית</td><td></td><td></td></tr><tr><td>נתרן קקודילאט טריהידראט</td><td>emsdiasum</td><td>12300</td><td>זהירות רעיל!</td></tr><tr><td>גלוטראלדהיד EM דרגה 8%</td> <td>emsdiasum</td><td>16020</td><td>זהירות רעיל!</td></tr><tr><td>נתרן פוספט דו-בסיסי</td><td>emsdiasum</td><td>21180</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פוספט מונו-בסיסי</td><td>emsdiasum</td><td>21190</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>emsdiasum</td><td>19202</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת אוסמיום טטרוקסיד 4%</td><td>emsdiasum</td><td>19150</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך Axiovert 200M</td><td>חומצה</td> הידרוכלורית Zeiss <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fisherbrand</td><td>A142-212</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת נתרן הידרוקסיד 10M</td><td>Fluka</td><td>72068</td><td></td></tr><tr><td>חמצן</td><td>מדיגס</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3-אמינו-1,2,4-טריאזול</td><td>סיגמא</td><td>A8056</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן ציאניד</td><td>סיגמא</td><td>207810</td><td>זהירות רעיל!</td></tr><tr><td>אתנול</td><td>emsdiasum</td><td>15058</td><td>זהירות רעיל!</td></tr><tr><td>סכין גילוח קצה יחיד פלדת פחמן</td><td>emsdiasum</td><td>71960</td><td>זהירות חדה!</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma</td><td>D 5546</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life Technologies</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>Life Technologies</td><td>11811-023</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ אלקטרונים שידור 200 kV</td><td>JEOL</td><td>2100</td><td></td></tr><tr><td>GIF Tridiem 863 מסנן אנרגיה</td><td>Gatan</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

הדמיה של חלבונים תיקון ה- dna minisog תייג בשילוב עם אלקטרונים spectroscopic הדמיה (esi)

Visualization of miniSOG Tagged DNA Repair Proteins in Combination with Electron Spectroscopic Imaging (ESI)

הגבולות לרזולוציה אופטית והאתגר של זיהוי אוכלוסיות חלבון ספציפיות במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים היו מכשולים בביולוגיה של תא. לא ניתן להסביר תופעות רבות על ידי ניתוח במבחנה במערכות פשוטות וזקוקים למידע מבני נוסף באתר, במיוחד בטווח שבין 1 ננומטר ו 0.1 מיקרומטר, כדי להבין באופן מלא. כאן, הדמיה ספקטרוסקופיות אלקטרון, טכניקה מיקרוסקופית אלקטרונים הילוכים שמאפשרת מיפוי בו זמנית של ההפצה של חלבונים וחומצות גרעין, ותג ביטוי, miniSOG, משולבת כדי לחקור את המבנה וארגון של מוקדי תיקון הפסקה כפולים גדיל DNA.

ESI השוואת תמונות ESI של הגרעין (איור 1) עם תמונות TEM קונבנציונליות (לדוגמא, איור 7-1) כי חל גידול דרמטי במבנים אנטומיים שניתן להבחין בקלות. רכסי הכרומטין מופיעים בצהוב וזה די קל לזהות chromocenters בתאי עכבר. בקלות ניתן להבחין nucleoli מהכרומטין על ידי המבנה העגול שלהם וצבע שונה, מאז הריבוזומים מראש התאספו כבר מכילים כמויות גבוהות של חלבון, אשר עשיר בח...

הדמיה ספקטרוסקופית אלקטרונית יכולה לדמות ולהבחין בין חומצת גרעין לחלבון ברזולוציה ננומטרית. ניתן לשלב אותו עם מערכת miniSOG, המסוגלת לתייג באופן ספציפי חלבונים מתויגים בדגימות מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת. אנו מדגימים את השימוש בטכנולוגיות אלה באמצעות מוקדי תיקון שברים כפולים כדוגמה.

הדמיה של חלבונים תיקון ה- DNA miniSOG תייג בשילוב עם אלקטרונים Spectroscopic הדמיה (ESI)

The limits to optical resolution and the challenge of identifying specific protein populations in transmission electron microscopy have been obstacles in ...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא למפות את התפלגותם של חלבוני תיקון DNA סביב שברים של DNA בעלי גדילה כפולה ברמה הננומטרית. זאת כדי לחקור את העל-מבנה (ultra structure) של כרומטין פגוע בתהליך תיקון באמצעות דימוי ספקטרוסקופי אלקטרוני. דבר זה מושג על ידי יצירת קונסטרוקטים לביטוי DNA המקודדים לחלבוני היתוך (fusion proteins) של חלבוני תגובה לנזקי DNA, תוך שימוש בחלבון פלואורסצנטי ובתווית mini SOG.בשלב השני, המבנים מוחדרים לתאים באמצעות טרנספקציה, ולאחר מכן התאים פוגעים באמצעות לייזר או הקרנת גמא. לאחר מכן, התאים שהוקרנו וקובעו עוברים שלבי הכנה למיקרוסקופיה אלקטרונית, כדי להפוך את התפלגות חלבון התיקון המסומן ב-mini SOG לנראית במיקרוסקופ האלקטרוני. דימוי הספקטרוסקופיה האלקטרונית המתקבל מספק תמונות מפורטות המאפשרות ניתוח של אולטרה-מבנה הכרומטין והקשר של חלבונים ספציפיים עם מוקדי תיקון DNA.היתרון המרכזי של טכנולוגיה זו על פני טכנולוגיות קיימות אחרות, כגון סימון ImmunoGold, הוא שהיא אינה תלויה בזמינות של נוגדנים ושהיא מסמנת את המבנים המבוקשים בצפיפות רבה למדי. בדרך כלל, אנשים שאינם מכירים את השיטה יתקשו בביצועה מכיוון שהחמצון הפוטוכימי רגיש מאוד ל-pH, לעוצמת התאורה ולרוויית חמצן. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, כיוון ששלבי החמצון הפוטוכימי, רוויית החמצן וההארה רגישים לשינויים קטנים מאוד, ולכן חשוב להדגים כיצד מבצעים את השיטה כדי שניתן יהיה לשחזר אותה.ד"ר הילמר פדן, פוסט-דוקטורנט במעבדה שלי, ידגים עבורכם את שיטת התרבית. תאי אוסטאוסרקומה אנושיים המבטאים באופן יציב את חלבוני התיקון המסומנים ב-mini SOG ו-M cherry, כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט המצורף. לאחר פיצול התאים מתוך צלחת של 10 סנטימטר, גדלו את התאים עד להגעה ל-80% קונפלואנציה.בשלב הבא, הניחו את התאים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנציה והשתמשו בעט יהלום סטרילי כדי לסמן שטח קטן של כ-מילימטר רבוע אחד המכיל תאים המבטאים את החלבונים האקטופיים לאחר שסומנו; רגשו את התאים על ידי הוספת herx לתמיסה כך שהריכוז הסופי יהיה 0.5 µg/mL, ולאחר מכן הניחו אותם באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C למשך 20 דקות. לאחר מכן, בצעו הקרנה מיקרוסקופית בלייזר לתאים באמצעות לייזר מצב מוצק של 405 nm של מיקרוסקופ קונפוקלי כדי להשריות נזק ל-DNA. בעקבות הנזק ל-DNA, קבעו את התאים בחושך באמצעות 1 mL של 4% פאראפורמאלדהיד בבופר סודיום ציטראט 0.1 M בטמפרטורת החדר לאחר 30 דקות.שטפו את התאים פעמיים עם ארבעה מיליליטר של בופר sodium Cate 0.1 מולרי ב-pH של 7.4. לאחר מכן, טפלו בתאים המקובעים בשני מיליליטר של תמיסה המכילה 50 מילימולר glycine, חמישה מילימולר amino triazole ו-10 מילימולר potassium cyanide ב-pH של 7.4 למשך 30 דקות. החליפו את הבופר בשני מיליליטר של בופר photo oxidation ב-pH של 7.4, שהוכן כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה.לאחר מכן, הדגרו את הדגימה בחושך על קרח תוך써 בעבוע של חמצן בתוך התמיסה כדי לשמור על רוויית חמצן. בשלב הבא, הניחו בזהירות את הצלחת עם התאים המקובעים על מיקרוסקופ פלואורסצנציה הפוך המצויד בעדשת שימור שמן 40x, והזיזו אותה לאזור העניין שסומן קודם לכן. עוררו את תג ה-mini SOG באמצעות אור כחול תוך שימוש בקוביות מסננים עבור חלבון פלואורסצנטי ירוק.המשיכו בהארה גם לאחר שפלואורסצנציית ה-SOG הירוקה נעלמה לחלוטין, ועד שמוצר הפוטו-חמצון החום של ה-diaminobenzidine הפולימרי מופיע בערוץ האור המועבר. לאחר מכן, בצעו קיבוע (postfix) לתאים באמצעות 1 mL של glutaraldehyde בריכוז 2% בבופר sodium citrate בריכוז 0.1 M ב-pH 7.4 למשך 30 דקות.בשלב הבא, קבע את ממברנות התאים באמצעות 0.1 עד 0.5% osmium tetroxide בבופר sodium Cate ריכוזו 0.1 molar למשך 20 דקות ב-pH 7.4. לאחר הקיבוע, בצע דהידרטציה לתאים באמצעות סדרה של שטיפות ethanol. לאחר מכן, דגור את התאים בתערובת ביחס של אחד לאחד של 100% ethanol ושרף אקרילי (acrylic resin) על שייקר למשך ארבע שעות.בשלב הבא, הוציאו את התערובת והוסיפו לדגימות שרף אקרילי 100% למשך ארבע שעות נוספות. כדי לפולימריז את השרף, חתכו את המכסה של מבחנת מיקרו-צנטריפוגה מסומנת בנפח 2 ml באמצעות להב תער ומריחו על השפה מאיץ לשרף אקרילי. מלאו בזהירות את המבחנה עד לשני שלישים בקירוב בשרף LR לבן באמצעות פיפטה.הקפידו שהשרף לא יבוא במגע עם המאיץ שעל השפה. הסירו את השרף שחדר לתאים בצלחת והניחו את הצלחת הפוכה על מבחנת מיקרו-צנטריפוגה העומדת זקוף, כך שרוחב המבחנה ימלא כמעט לחלוטין את חלון התצפית המכוסה בזכוכית של משקולת הצלחת. המתינו דקה עד שתי דקות כדי שהמאיץ יאטום את המבחנה ואת ליתרית הכיסוי.לאחר מכן הפוך את המבחנה כך שהשרף שבתוכה יכסה כעת את התאים. הנח את הצלחת עם המבחנה בתנור בטמפרטורה של 60 °C והשאר לה להתקשות במשך 12 שעות. כאשר הבלוק התקשה, הוצא מהתנור את הצלחת עם מבחנת המיקרו-צנטריפוגה המלאה בשרף המחוברת אליה, והפרד את מבחנת המיקרו-צנטריפוגה מהצלחת.השליכו את הכלי בעל התחתית הזכוכיתית וחתכו בזהירות את מבחנת המיקרו-צנטריפוגה בעזרת להב תער כדי לשחרר את הבלוק. בעזרת להב תער, קצצו את הבלוק כך שיישאר רק אזור של מילימטר רבוע אחד המכיל את השטח שסומן קודם לכן בעט יהלום או טונגסטן. לאחר מכן, רכבו את הבלוק במיקרוטום אולטרה (ultra microtome) וקצצו אותו באמצעות סכין קיצוץ עד להגעה לתאים.לאחר מכן, עברו להשתמש בסכין יהלום וחתכו חתכים דקים במיוחד בעובי של כ-50 nanometers דרך התאים. אספו את החתכים על גבי רשתות 300 mesh להעברה גבוהה. לאחר מכן, הניחו את הרשתות בתוך מכל פחמן וצפו את החתכים בשכבה של כ-0.2 עד 0.4 nanometers של פחמן כדי לסייע בייצובם תחת קרן האלקטרונים של מיקרוסקופ האלקטרונים למשלוח (TEM).העמיסו את הרשתות לתוך מיקרוסקופ אלקטרונים חודר (TEM) המצויד במסנן אנרגיה. בחנו את התאים בחתכים באמצעות מצב תמסורת רגיל בהגדלה נמוכה והשוו אותם לתמונות פלואורסצנציה שצולמו קודם לכן. ברגע שנמצא גרעין עם עקבה של נזק ל-DNA או מוקדי תיקון DNA, עברו למצב סינון אנרגיה והקליטו את הדגימה עם מפת עובי.בשלב הבא, רשמו את תמונות ה-post edge של מפת הזרחן באובדן אנרגיה של 175 electron volts עם רוחב חריץ (slit) של 20 electron volts. רשמו בנוסף תמונות pre-edge באובדן אנרגיה של 120 electron volts, גם הן עם רוחב חריץ של 20 electron volts, עבור רישום מפות החנקן. תמונות post edge ב-447 electron volts עם רוחב חריץ של 35 electron volts ותמונות pre-edge ב-358 electron volts.כמו כן, עם רוחב סד של 35 electron volts. פתחו את מפות היחס האלמנטרי בתוכנה לעיבוד תמונות, כגון זו. העתיקו את מפת החנקן לערוץ האדום ואת מפת הפספור לערוץ הירוק של תמונת RGB.לאחר מכן, בצעו סמיכה ויישור של המפות. ייצאו את התמונה המורכבת כקובץ בפורמט TIFF (tagged image file format), ולאחר מכן פתחו את התמונה בתוכנה לעיבוד תמונות התומכת בשכבות. לאחר מכן, כוונו את הטווח הדינמי של כל ערוץ על ידי שינוי קנה המידה של הערכים המינימליים והמקסימליים בתמונה למערך נתונים של שמונה ביטים.לאחר מכן, הפחיתו את תכולת הפספורוס ממפת החנקן בחלון השכבות. המירו את התמונה לצבעים מודeksים (indexed color) וצרו טבלת חיפוש (lookup table) בצבע צהוב במרחב הצבע CMYK עבור המפה המראה את התפלגות חומצות הגרעין, וטבלת חיפוש בצבע ציאן להצגת מפת החלבונים שאינם כרומטין. לאחר מכן, צרו תמונה חדשה וייבאו את המפות המראות את התפלגות הפספורוס והחלבונים שאינם כרומטין כשכבות נפרדות.השתמשו במצב שקיפות המסך כדי לראות את שתי השכבות חופפות זו לזו. מוצגות כאן מפות יחס ספקטרוסקופיות אלקטרוניות מתוך גרעין תא, המראות את מיקומי הפספורס והחנקן כאשר שתי מפות היחס חופפות זו לזו במרחב הצבע RGB. תמונה כזו מתקבלת בתהליך זה.מבנים צהובים מייצגים חלבוני גרעין המשקפים נוכחות של זריחון וחנקן כאחד. כאן, נעשה שימוש בדימוי ספקטרוסקופי אלקטרוני כדי לצפות בשינויים במבנה המוקדים (foci) בעקבות הקרנת גמא בתאי U2 OS. בשורה העליונה מוצגים תמונות של תאים שלא הוקרנו, המבטאים באופן יציב חלבוני תיקון המסומנים ב-M cherry.השורה השנייה מציגה תאים שקובעו שלוש שעות לאחר ההקרנה. השורה השלישית מציגה תאים שקובעו שש שעות לאחר ההקרנה. ההדמיה הספקטרוסקופית האלקטרונית חושפת כי נראה שנבנהו מחדש מבני המוקדים (foci) עם הזמן, שכן הכמות היחסית של חלבון 53 BP1 במוקד, כפי שמעידה העלייה באות החנקן, נראית כעולה, בעוד שהכרומטין, כפי שמעיד אות הפספור, תופס מיקום פריפרי יותר.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן הכנת תאים מקרינים המבטאים חלבוני תיקון של mini so, במטרה לנתח את העל-מבנה של כרומטין במוקדי תיקון DA באמצעות דימות ספקטרוסקופי אלקטרוני. זכרו כי עבודה עם בופר sodium ca correlate, potassium cyanide ו-osmium oxide עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון עבודה במבתח פuming (fume hood) וחבישת כפפות, בעת ביצוע פרוצדורה זו.

visualization-minisog-tagged-dna-repair-proteins-combination-with

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אנו מציגים הליך שבאמצעותו דו מימדי agarose ג'ל ניתוח יכול לשמש כדי לזהות את מבנה ביניים שכפול המתרחשות בעקבות קרינה UV.

ויזואליזציה של UV-Induced ביניים שכפול א coli באמצעות דו מימדי agarose ג&#39;ל ניתוח

בסרטון זה, אנו מתארים את שיטת האימונופלואורסנציה כדי לדמיין את הלוקליזציה של חלבוני תיקון הדנ"א γH2AX ו- 53BP1 באתרים של הפסקות DNA דו-גדילי בגרעין התא המוקרנ.

הדמיה מבוססת אימונופלואורסנציה של אינטראקציות חלבון תיקון DNA

כאן, המחקר של גישות שונות לזיהוי נגעי DNA באמצעות הדמיית AFM של מולקולה בודדת מודגם עם מערכת תיקון כריתת נוקלאוטידים כדוגמה. מתוארים ההליכים של הכנת דגימות DNA וחלבון ופרטים ניסיוניים כמו גם אנליטיים עבור ניסויי AFM.

כוח מיקרוסקופי אטומי חקירות של דלקת הנגע הכרה תיקון כריתה נוקליאוטידים

הנה, הוא הוכיח כיצד באתרו Proximity Ligation Assay (PLA) ניתן להשתמש כדי לזהות ולחזות אינטראקציות חלבונים ישיר חלבון בין כספומט p53 בתרביות תאים ההשעיה חשופים ללחץ genotoxic.

איתור ויזואליזציה של DNA הנזק- Induced חלבון קומפלקסים ההשעיה תא תרבויות באמצעות Assay קשירת הקרבה

Microirradiation לייזר הוא כלי שימושי עבור מחקרים של תיקון ה-DNA בתאים חיים. בגישה מתודולוגי לשימוש של לייזרים UVA לזירוז נגעים דנ א שונים מוצג. לנו יש אופטימיזציה שיטה microirradiation המקומי המתחזק מחזור תא נורמלי; לפיכך, תאים לקרינה להמשיך לעבור מיטוזה.

מיקרוסקופיה קונפוקלית טכניקות ללמוד אינטראקציות חלבון-חלבון וקינטיקה ב DNA נגעים מתקדמות

לומד DNA נזק תיקון קינטיקה דורש מערכת לזירוז נגעים ב גרעיני תת אזורים מוגדרים. אנו מתארים שיטה ליצור מעברי גדילי זוגיות המותאמות לשפות אחרות באמצעות סריקה בלייזר מיקרוסקופ קונפוקלי מצויד 405 ננומטר לייזר ולספק שגרות אוטומטיות כדי לכמת את הדינמיקה של הגורמים תיקון הפצעים כאלה.

חקירה של חלבון הגיוס נגעים הדנ א באמצעות 405 ננומטר לייזר מיקרו-הקרנה

תיקון של זוגיות-גדיל DNA מעברי הוא תהליך דינמי, הדורשים לא רק היווצרות תיקון מכלולי השברים, אבל גם הרזולוציה שלהן לאחר הנגע הוא ממוען. כאן, אנו משתמשים מיקרוסקופ immunofluorescence עבור ארעי לטווח ארוך כפול גדילי ומעברי ככלי לנתח מנגנון תחזוקה זה הגנום.

אפיון תהליכי תיקון DNA-ארעי ומעברי DNA ארוך כפול-strand על ידי מיקרוסקופ Immunofluorescence

בעקבות נזק DNA, תאים אנושיים להפעיל מסלולי תיקון חיוניים כדי לשחזר את שלמות הגנום שלהם. כאן, אנו מתארים את השיטה של חיסון עקיף כאמצעי לזיהוי חלבוני תיקון DNA, לנתח את הגיוס המרחבי והזמני שלהם, ולעזור לחקור אינטראקציה חלבון-חלבון באתרים של נזק DNA.

הדמיה של אינטראקציה חלבוני תיקון DNA על ידי אימונופלואורסץ

מאמר זה מציג שלבים חיוניים של חיסונים ואימונופרציפיטציה של כרומטין. פרוטוקולים אלה משמשים בדרך כלל כדי לחקור תהליכים תאיים הקשורים נזק DNA כדי לדמיין ולכומת את הגיוס של חלבונים מעורבים בתיקון DNA.

הדמיה וכימות נזק DNA ספציפי לאתר מבוסס אנדונוקלאז

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטות להערכת חלבונים לתיקון נזקי DNA באורגנואידים של סרטן השחלות שמקורם במטופלות. להלן שיטות ציפוי וצביעה מקיפות, כמו גם הליכי כימות מפורטים ואובייקטיביים.

הדמיה של חלבונים לתיקון נזקי DNA באורגנואידים של סרטן השחלות שמקורם במטופל באמצעות בדיקות אימונופלואורסנציה

הפרוטוקול הבא מציג זיהוי של מוקדי DNA חד-גדיליים בשלב G1 של מחזור התא תוך שימוש בסנכרון מחזור התא ואחריו צביעה אימונופלואורסצנטית RPA2.

הדמיה של מוקדי DNA חד-גדיליים בשלב G1 של מחזור התא

חקור את מבנה הכרומטין בנזקי DNA באמצעות הדמיית ספקטרוסקופית אלקטרונים ותיוג miniSOG. שיטה זו מאפשרת מיפוי חלבוני תיקון DNA ברזולוציה ננומטרית לניתוח מרחבי מדויק.

הדמיה של חלבונים תיקון ה- DNA miniSOG תייג בשילוב עם אלקטרונים Spectroscopic הדמיה (ESI)

גלה סרטונים נוספים