הדמיה של חלבונים תיקון ה- DNA miniSOG תייג בשילוב עם אלקטרונים Spectroscopic הדמיה (ESI)
24 בספטמבר 2015
הדמיה ספקטרוסקופית אלקטרונית יכולה לדמות ולהבחין בין חומצת גרעין לחלבון ברזולוציה ננומטרית. ניתן לשלב אותו עם מערכת miniSOG, המסוגלת לתייג באופן ספציפי חלבונים מתויגים בדגימות מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת. אנו מדגימים את השימוש בטכנולוגיות אלה באמצעות מוקדי תיקון שברים כפולים כדוגמה.
המטרה הכללית של הניסוי הבא היא למפות את התפלגותם של חלבוני תיקון DNA סביב שברים של DNA בעלי גדילה כפולה ברמה הננומטרית. זאת כדי לחקור את העל-מבנה (ultra structure) של כרומטין פגוע בתהליך תיקון באמצעות דימוי ספקטרוסקופי אלקטרוני. דבר זה מושג על ידי יצירת קונסטרוקטים לביטוי DNA המקודדים לחלבוני היתוך (fusion proteins) של חלבוני תגובה לנזקי DNA, תוך שימוש בחלבון פלואורסצנטי ובתווית mini SOG.
בשלב השני, המבנים מוחדרים לתאים באמצעות טרנספקציה, ולאחר מכן התאים פוגעים באמצעות לייזר או הקרנת גמא. לאחר מכן, התאים שהוקרנו וקובעו עוברים שלבי הכנה למיקרוסקופיה אלקטרונית, כדי להפוך את התפלגות חלבון התיקון המסומן ב-mini SOG לנראית במיקרוסקופ האלקטרוני. דימוי הספקטרוסקופיה האלקטרונית המתקבל מספק תמונות מפורטות המאפשרות ניתוח של אולטרה-מבנה הכרומטין והקשר של חלבונים ספציפיים עם מוקדי תיקון DNA.
היתרון המרכזי של טכנולוגיה זו על פני טכנולוגיות קיימות אחרות, כגון סימון ImmunoGold, הוא שהיא אינה תלויה בזמינות של נוגדנים ושהיא מסמנת את המבנים המבוקשים בצפיפות רבה למדי. בדרך כלל, אנשים שאינם מכירים את השיטה יתקשו בביצועה מכיוון שהחמצון הפוטוכימי רגיש מאוד ל-pH, לעוצמת התאורה ולרוויית חמצן. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, כיוון ששלבי החמצון הפוטוכימי, רוויית החמצן וההארה רגישים לשינויים קטנים מאוד, ולכן חשוב להדגים כיצד מבצעים את השיטה כדי שניתן יהיה לשחזר אותה.
ד"ר הילמר פדן, פוסט-דוקטורנט במעבדה שלי, ידגים עבורכם את שיטת התרבית. תאי אוסטאוסרקומה אנושיים המבטאים באופן יציב את חלבוני התיקון המסומנים ב-mini SOG ו-M cherry, כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט המצורף. לאחר פיצול התאים מתוך צלחת של 10 סנטימטר, גדלו את התאים עד להגעה ל-80% קונפלואנציה.
בשלב הבא, הניחו את התאים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנציה והשתמשו בעט יהלום סטרילי כדי לסמן שטח קטן של כ-מילימטר רבוע אחד המכיל תאים המבטאים את החלבונים האקטופיים לאחר שסומנו; רגשו את התאים על ידי הוספת herx לתמיסה כך שהריכוז הסופי יהיה 0.5 µg/mL, ולאחר מכן הניחו אותם באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C למשך 20 דקות. לאחר מכן, בצעו הקרנה מיקרוסקופית בלייזר לתאים באמצעות לייזר מצב מוצק של 405 nm של מיקרוסקופ קונפוקלי כדי להשריות נזק ל-DNA. בעקבות הנזק ל-DNA, קבעו את התאים בחושך באמצעות 1 mL של 4% פאראפורמאלדהיד בבופר סודיום ציטראט 0.1 M בטמפרטורת החדר לאחר 30 דקות.
שטפו את התאים פעמיים עם ארבעה מיליליטר של בופר sodium Cate 0.1 מולרי ב-pH של 7.4. לאחר מכן, טפלו בתאים המקובעים בשני מיליליטר של תמיסה המכילה 50 מילימולר glycine, חמישה מילימולר amino triazole ו-10 מילימולר potassium cyanide ב-pH של 7.4 למשך 30 דקות. החליפו את הבופר בשני מיליליטר של בופר photo oxidation ב-pH של 7.4, שהוכן כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה.
לאחר מכן, הדגרו את הדגימה בחושך על קרח תוך써 בעבוע של חמצן בתוך התמיסה כדי לשמור על רוויית חמצן. בשלב הבא, הניחו בזהירות את הצלחת עם התאים המקובעים על מיקרוסקופ פלואורסצנציה הפוך המצויד בעדשת שימור שמן 40x, והזיזו אותה לאזור העניין שסומן קודם לכן. עוררו את תג ה-mini SOG באמצעות אור כחול תוך שימוש בקוביות מסננים עבור חלבון פלואורסצנטי ירוק.
המשיכו בהארה גם לאחר שפלואורסצנציית ה-SOG הירוקה נעלמה לחלוטין, ועד שמוצר הפוטו-חמצון החום של ה-diaminobenzidine הפולימרי מופיע בערוץ האור המועבר. לאחר מכן, בצעו קיבוע (postfix) לתאים באמצעות 1 mL של glutaraldehyde בריכוז 2% בבופר sodium citrate בריכוז 0.1 M ב-pH 7.4 למשך 30 דקות.
בשלב הבא, קבע את ממברנות התאים באמצעות 0.1 עד 0.5% osmium tetroxide בבופר sodium Cate ריכוזו 0.1 molar למשך 20 דקות ב-pH 7.4. לאחר הקיבוע, בצע דהידרטציה לתאים באמצעות סדרה של שטיפות ethanol. לאחר מכן, דגור את התאים בתערובת ביחס של אחד לאחד של 100% ethanol ושרף אקרילי (acrylic resin) על שייקר למשך ארבע שעות.
בשלב הבא, הוציאו את התערובת והוסיפו לדגימות שרף אקרילי 100% למשך ארבע שעות נוספות. כדי לפולימריז את השרף, חתכו את המכסה של מבחנת מיקרו-צנטריפוגה מסומנת בנפח 2 ml באמצעות להב תער ומריחו על השפה מאיץ לשרף אקרילי. מלאו בזהירות את המבחנה עד לשני שלישים בקירוב בשרף LR לבן באמצעות פיפטה.
הקפידו שהשרף לא יבוא במגע עם המאיץ שעל השפה. הסירו את השרף שחדר לתאים בצלחת והניחו את הצלחת הפוכה על מבחנת מיקרו-צנטריפוגה העומדת זקוף, כך שרוחב המבחנה ימלא כמעט לחלוטין את חלון התצפית המכוסה בזכוכית של משקולת הצלחת. המתינו דקה עד שתי דקות כדי שהמאיץ יאטום את המבחנה ואת ליתרית הכיסוי.
לאחר מכן הפוך את המבחנה כך שהשרף שבתוכה יכסה כעת את התאים. הנח את הצלחת עם המבחנה בתנור בטמפרטורה של 60 °C והשאר לה להתקשות במשך 12 שעות. כאשר הבלוק התקשה, הוצא מהתנור את הצלחת עם מבחנת המיקרו-צנטריפוגה המלאה בשרף המחוברת אליה, והפרד את מבחנת המיקרו-צנטריפוגה מהצלחת.
השליכו את הכלי בעל התחתית הזכוכיתית וחתכו בזהירות את מבחנת המיקרו-צנטריפוגה בעזרת להב תער כדי לשחרר את הבלוק. בעזרת להב תער, קצצו את הבלוק כך שיישאר רק אזור של מילימטר רבוע אחד המכיל את השטח שסומן קודם לכן בעט יהלום או טונגסטן. לאחר מכן, רכבו את הבלוק במיקרוטום אולטרה (ultra microtome) וקצצו אותו באמצעות סכין קיצוץ עד להגעה לתאים.
לאחר מכן, עברו להשתמש בסכין יהלום וחתכו חתכים דקים במיוחד בעובי של כ-50 nanometers דרך התאים. אספו את החתכים על גבי רשתות 300 mesh להעברה גבוהה. לאחר מכן, הניחו את הרשתות בתוך מכל פחמן וצפו את החתכים בשכבה של כ-0.2 עד 0.4 nanometers של פחמן כדי לסייע בייצובם תחת קרן האלקטרונים של מיקרוסקופ האלקטרונים למשלוח (TEM).
העמיסו את הרשתות לתוך מיקרוסקופ אלקטרונים חודר (TEM) המצויד במסנן אנרגיה. בחנו את התאים בחתכים באמצעות מצב תמסורת רגיל בהגדלה נמוכה והשוו אותם לתמונות פלואורסצנציה שצולמו קודם לכן. ברגע שנמצא גרעין עם עקבה של נזק ל-DNA או מוקדי תיקון DNA, עברו למצב סינון אנרגיה והקליטו את הדגימה עם מפת עובי.
בשלב הבא, רשמו את תמונות ה-post edge של מפת הזרחן באובדן אנרגיה של 175 electron volts עם רוחב חריץ (slit) של 20 electron volts. רשמו בנוסף תמונות pre-edge באובדן אנרגיה של 120 electron volts, גם הן עם רוחב חריץ של 20 electron volts, עבור רישום מפות החנקן. תמונות post edge ב-447 electron volts עם רוחב חריץ של 35 electron volts ותמונות pre-edge ב-358 electron volts.
כמו כן, עם רוחב סד של 35 electron volts. פתחו את מפות היחס האלמנטרי בתוכנה לעיבוד תמונות, כגון זו. העתיקו את מפת החנקן לערוץ האדום ואת מפת הפספור לערוץ הירוק של תמונת RGB.
לאחר מכן, בצעו סמיכה ויישור של המפות. ייצאו את התמונה המורכבת כקובץ בפורמט TIFF (tagged image file format), ולאחר מכן פתחו את התמונה בתוכנה לעיבוד תמונות התומכת בשכבות. לאחר מכן, כוונו את הטווח הדינמי של כל ערוץ על ידי שינוי קנה המידה של הערכים המינימליים והמקסימליים בתמונה למערך נתונים של שמונה ביטים.
לאחר מכן, הפחיתו את תכולת הפספורוס ממפת החנקן בחלון השכבות. המירו את התמונה לצבעים מודeksים (indexed color) וצרו טבלת חיפוש (lookup table) בצבע צהוב במרחב הצבע CMYK עבור המפה המראה את התפלגות חומצות הגרעין, וטבלת חיפוש בצבע ציאן להצגת מפת החלבונים שאינם כרומטין. לאחר מכן, צרו תמונה חדשה וייבאו את המפות המראות את התפלגות הפספורוס והחלבונים שאינם כרומטין כשכבות נפרדות.
השתמשו במצב שקיפות המסך כדי לראות את שתי השכבות חופפות זו לזו. מוצגות כאן מפות יחס ספקטרוסקופיות אלקטרוניות מתוך גרעין תא, המראות את מיקומי הפספורס והחנקן כאשר שתי מפות היחס חופפות זו לזו במרחב הצבע RGB. תמונה כזו מתקבלת בתהליך זה.
מבנים צהובים מייצגים חלבוני גרעין המשקפים נוכחות של זריחון וחנקן כאחד. כאן, נעשה שימוש בדימוי ספקטרוסקופי אלקטרוני כדי לצפות בשינויים במבנה המוקדים (foci) בעקבות הקרנת גמא בתאי U2 OS. בשורה העליונה מוצגים תמונות של תאים שלא הוקרנו, המבטאים באופן יציב חלבוני תיקון המסומנים ב-M cherry.
השורה השנייה מציגה תאים שקובעו שלוש שעות לאחר ההקרנה. השורה השלישית מציגה תאים שקובעו שש שעות לאחר ההקרנה. ההדמיה הספקטרוסקופית האלקטרונית חושפת כי נראה שנבנהו מחדש מבני המוקדים (foci) עם הזמן, שכן הכמות היחסית של חלבון 53 BP1 במוקד, כפי שמעידה העלייה באות החנקן, נראית כעולה, בעוד שהכרומטין, כפי שמעיד אות הפספור, תופס מיקום פריפרי יותר.
לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן הכנת תאים מקרינים המבטאים חלבוני תיקון של mini so, במטרה לנתח את העל-מבנה של כרומטין במוקדי תיקון DA באמצעות דימות ספקטרוסקופי אלקטרוני. זכרו כי עבודה עם בופר sodium ca correlate, potassium cyanide ו-osmium oxide עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון עבודה במבתח פuming (fume hood) וחבישת כפפות, בעת ביצוע פרוצדורה זו.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מדגים את השימוש בדימוי ספקטרוסקופי אלקטרוני להדמיה ולהבחנה בין חומצות גרעין לחלבונים ברזולוציה ננומטרית. באמצעות שימוש במערכת miniSOG, חוקרים יכולים לסמן חלבונים באופן ספציפי בדגימות למיקרוסקופיה אלקטרונית חודרת, דבר המאפשר ניתוח מפורט של תהליכי תיקון DNA.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- מיקרוסקופיה אלקטרונית
רקע
- תיקון DNA הוא חיוני לשמירה על יציבות גנומית.
- הבנת ההתפלגות המרחבית של חלבוני תיקון חיונית להבהרת מנגנוני התיקון.
- דימיון ספקטרוסקופי אלקטרוני מספק תובנות ברזולוציה גבוהה לגבי מבנים תאיים.
- תג ה-miniSOG מאפשר סימון ספציפי של חלבונים במיקרוסקופיה.
מטרת המחקר
- מיפוי ההתפלגות של חלבוני תיקון DNA סביב שברים של DNA רב-גדילי.
- לימוד העל-מבנה של כרומטין פגום במהלך התיקון.
- שימוש בטכניקות דימוי מתקדמות לניתוח מפורט של אינטראקציות בין חלבונים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- יצירת סמימנטים (constructs) לביטוי DNA המקודדים לחלבוני היתוך.
- טרנספקציה של הסמימנטים לתאים.
- השראת נזק ל-DNA באמצעות לייזר או הקרנת גמא.
- הכנת תאים למיקרוסקופיה אלקטרונית להדמיית חלבונים מסומנים.
תוצאות עיקריות
- הדמיה מוצלחת של חלבוני תיקון המסומנים ב-miniSOG במיקרוסקופיה אלקטרונית.
- דימוי מפורט של אולטרה-מבנה הכרומטין סביב מוקדי תיקון DNA.
- תובנות לגבי הקשר המרחבי בין חלבונים ספציפיים לנזקי DNA.
- הדגמה של יעילות השילוב בין דימוי ספקטרוסקופי אלקטרוני לבין סימון ב-miniSOG.
מסקנות
- דימוי ספקטרוסקופי אלקטרוני הוא כלי רב עוצמה לחקר מנגנוני תיקון DNA.
- מערכת ה-miniSOG משפרת את הספציפיות של סימון חלבונים במיקרוסקופיה.
- גישה זו מספקת תובנות בעלות ערך לגבי דינמיקת כרומטין במהלך תהליכי תיקון.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
שיטה זו מאפשרת מיפוי ברמה הננומטרית של התפלגות חלבוני תיקון DNA, ומספקת תובנות מבניות קריטיות לתיקוף מטרות במחקרים בתחומי האונקולוגיה והיציבות הגנומית. באמצעות שילוב של דימות ספקטרוסקופי אלקטרוני עם תיוג miniSOG, חוקרים משיגים סימון צפוף ללא תלות בנוגדנים, המגביר את הפחתת הסיכונים המכניסטית של נתיבי תגובה לנזקי DNA. גישה זו תומכת בביטחון ניבוי בשלבים מוקדמים של הגילוי על ידי חשיפת ארגון מחדש מרחבי של מוקדי תיקון לאורך זמן, מה שמסייע במיון תיקי פיתוח עבור תרופיות המכוונות ל-DDR.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות ויזואליזציה של דינמיקת חלבונים באתרי שבירה של גדיל כפול של DNA.
- ערך תפעולי: מספק סימון צפוף וספציפי של חלבוני תיקון ללא מגבלות של נגישות נוגדנים.
- ערך ניבוי: חושף ארגון מחדש זמני של מוקדי חלבון (foci), התומך בתיקוף של מטרות תפקודיות ובבירור מסלולים ביולוגיים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: מייצר מפות כמותיות של חנקן וזרחן לצורך ניתוח סטנדרטי של אולטרה-מבנה הכרומטין.
- שחזוריות: מחייבת בקרה קפדנית על תנאי הפוטו-חמצון (pH, חמצן, אור) כדי להבטיח הופעה עקבית של האות.
- סקביליות: תואם לזרימות עבודה של TEM ברזולוציה גבוהה לצורך השוואה של מוקדי תיקון תחת תנאים מרובים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלות: ישימות ישירה למודלים של חוסר יציבות גנומית בסרטן ובניוון עצבי.
- רציפות תרגומית: מגשר בין ממצאים in vitro להקשר אולטרה-מבני in situ בטווח של 1 nm–0.1 µm.
- קידום מותאם סיכונים: תומך בהחלטות go/no-go על ידי חשיפת יחסים מרחביים בין כרומטין לחלבון הקריטיים לדיוק התיקון.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת היפותזת המטרה ועד לתיקוף פרה-קליני, במיוחד עבור מודולטורים של נתיב ה-DDR שבהם ארגון חלקי של חלבונים מנבא את התוצאה התפקודית.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בבדיקת היפותזות על ידי מיפוי גיוס חלבוני תיקון ושחזור כרומטין באתרי נזק.
- סריקה: מאפשר סטנדרטיזציה של בדיקות באמצעות תיקוף של טרנספקציה והשראת נזק באמצעות מיקרוסקופיה אלקטרונית ואורית קורלטיבית (CLEM).
- אנליטיקה: מספק מפות כמותיות של יחסי יסודות (חנקן/זרחן) להשוואת התפלגות חלבונים וחומצות גרעיניות בתנאים שונים.
- מחקר תרגומי: מקשר תצפיות מולקולריות לפנוטיפים אולטרה-מבניים במערכות רלוונטיות למחלות, כגון תאי U2OS שהקרנו.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמת דימוי הניתנת לשימוש חוזר עבור כל חלבון המסומן ב-miniSOG במחקרי דינמיקה של כרומטין או תיקון DNA.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית בתיקון DNA על ידי מתאם בין לוקליזציה של חלבונים למבנה הכרומטין.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של מיפוי חלבונים ברמה הננומטרית באמצעות שלבי פוטו-חמצון ושיכון (embedding) קבועים ו可שחזרים.
- ערך אסטרטגי: משפר את היעילות ההונית על ידי הפחתת סיכונים ביעדים באמצעות ויזואליזציה ישירה של מעורבותם in situ.
- השפעה על הפורטפוליו: מספק תובנות לתעדוף מותאם-סיכון של מעכבי DDR בהתבסס על קינטיקה של ארגון מחדש מוקדי.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות במיקרוסקופיה אלקטרונית, כימיה של פוטו-חמצון ותהליכי עבודה של CLEM.
- תלוי ב-TEM עם סינון אנרגיה וברוויית חמצן יציבה במהלך הפולימריזציה של diaminobenzidine.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של הקיבוע, הצביעה והחיתוך כדי לשמר את שלמות האות דמוי-האנטיגן.
- שיקולי התאמה כוללים רגישות pH של miniSOG ותאימות עם מיזוגים שונים של חלבוני תיקון.
- מגבלות מעשיות כוללות חוסר יציבות של האות במידה והחמצון או התאורה סוטים מהטווחים המוגדרים בפרוטוקול.
