תשואה גבוהה ומערכת ביטוי עלות-יעילה של Granzymes האדם בתאי יונקים

המטרה הכוללת של הליך זה היא לייצר תפוקות גבוהות של גראנזימים פוליים מסוכררים ופעילים אנזימטית בתאי T 2 93 T עובריים אנושיים. זה מושג על ידי הרחבה ראשונה של תאי HEC 2 93 T בכלי תרבית רקמה מתאימים. גודל ההכנה הרגיל לאחר ההרחבה מורכב מ -20 עד 25 מנות תרבות.

השלב השני הוא להעביר באופן חולף את התאים המורחבים עם פלסמיד ביטוי גרנזים בשיטת סידן פוספט יעילה. לאחר מכן, נקצרים הסופרנטים של התאים והאנזימים הגדולים המופרשים מטוהרים על ידי כרומטוגרפיה של זיקה מתכתית משותקת. השלבים האחרונים הם הפעלת האנזימים הגדולים על ידי כניסה לטיפול בקינאז וטיהור נוסף של הפרוטאזות באמצעות כרומטוגרפיה של חילופי קטיונים.

בסופו של דבר, הפעילות האנזימטית נבדקת באמצעות מבחן מטרי צ'ול מהיר ואמין מכיוון שהזמינות של פרוטאז פעיל בכמויות מספיקות היא גורם מגביל במחקר גרנזים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום, כגון אפיון מסלולי מוות תאים חדשים באורגניזמים שונים, או זיהוי מצעי פרוטאז חדשים בגישות פרוטאום שלמות לבטא אנזימים גדולים. ראשית גדל תאי HEC 2 93 T ב-20 מיליליטר של מדיום תרבית, תוך שימוש בכלי תרבית רקמה בגודל 150 על 25 מילימטר מפצלים את התאים ב-80% תאי Co fluency מחוברים באופן רופף, אך ניתן לנתק אותם מכנית ללא טריפסין על ידי פיפטינג קפדני למעלה ולמטה של הצלחת.

התאים בלילה שלפני הטרנספקציה נותנים שטף של 60 עד 70% ביום הטרנספקציה. גודל הכנה רגיל מורכב מ -20 עד 25 מנות תרבות. שעה אחת לפני הטרנספקציה שינתה את מדיום התרבית הסטנדרטי ל-20 מיליליטר של מדיום טרנספקציה לקראת סוף שלב הדגירה של שעה, ערבב 400 מיקרוגרם של DNA פלזמה עם 10.95 מיליליטר של מים מזוקקים כפולים ו-1.55 מיליליטר של שני סידן כלורי מולארי בצינורות של 50 מיליליטר דקה עד שתי דקות לפני הטרנספקציה.

ב-12.5 מיליליטר של שתי ערימות x חצצו מי מלח ל-12.5 מיליליטר מתמיסת הסידן של ה-DNA מעורבבת על ידי היפוך הצינורות לפני הדגירה למשך 30 שניות. בטמפרטורת החדר מוסיפים את התערובת הזו, טיפתית ישירות לתאים בחמישה מיליליטר למנה, מפזרים באופן שווה על כל האזור, והופכים את המדיום לצבע כתום מעט. דגרו את כלי התרבות במשך שבע עד 11 שעות בחממת תרבית רקמות.

לאחר הדגירה נראה משקעים דקים. הסר את מדיום הטרנספקציה. יש לשטוף בזהירות עם PBS חם מראש ולהוסיף 20 מיליליטר של מדיום תרבית ללא סרום לפני הדגירה למשך 72 שעות בחממת תרבית רקמות, לנתח את יעילות הטרנספקציה והביטוי על ידי הפעלת דגימה של סופרנטנט התא על דף SDS וצביעה בקומאסי.

כחול מבריק. לדמיין להקת גרנזים. לאחר הדגירה יש לשפוך את תרבית התאים לצינורות של 250 מיליליטר ולנקות אותם על ידי צנטריפוגה.

בצע סיבוב ראשון שינקה את המדיום מהתאים המנותקים. העבירו את הסופרנטנט לצינורות טריים של 250 מיליליטר וסובבו ב-4,000 גרם למשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי להסיר את כל שאריות התאים שנותרו. לאחר מכן, הוסף חמישה מיליליטר נתרן כלורי, 6.25 מיליליטר בסיס טריס ומיליליטר אחד של ניקל סולפט בתוספת 250 מיליליטר של סופרנטנט מנוקה.

סנן את הסופרנטנט באמצעות יחידת מסנן ואקום של 500 מיליליטר. לאזן עמודת כרומטוגרפיה של זיקה של יוני מתכת משותקת ניקל עם מאגר הכריכה שלו. A באמצעות מערכת FPLC מתאימה.

לאחר מכן מרחו את הסופרנטנט המנוקה על העמודה המאוזנת בקצב זרימה של 0.5 מיליליטר לדקה בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מריחת הסופרנטנט, שטפו את העמוד עם מאגר הקישור שלו עד שמגיעים לקו הבסיס הסופג אולטרה סגול או UV. יש להוציא את הגראנזימים עם שיפוע ILE ליניארי של 20 מיליליטר בקצב זרימה של 0.5 מיליליטר לדקה תוך איסוף שני שברים של מיליליטר.

נתח את השברים האלוציאניים לפי דף SDS וצביעה קומאסי. משוך את הזימה הגדולה המכילה שברים בצינור מסנוור. אחסן דגימה קטנה במינוס 20 מעלות צלזיוס כבקרת קדם אנטרו קינאז.

הוסף אנטרו קינאז ב-0.02 יחידות לכל 50 מיליליטר של סופרנטנט ראשוני ישירות לחלק המאוגד בצינור הדיאליזה ודיאליזה למשך הלילה בטמפרטורת החדר במאגר אנטרו קינאז. למחרת לנתח קינאז שטופל בגדול בהשוואה לבקרת קינאז לפני הכניסה על ידי דף SDS וצביעה כחולה קומאסי. לאחר השלמת עיבוד המסוף הסופי.

החלף את מאגר הדיאליזה למאגר S A ובצע דיאליזה למשך ארבע שעות נוספות בטמפרטורת החדר לפני סינון ה-DIALATE 8. לאחר מכן, אזנו עמודת S עם מאגר S. א. טען את הדגימה על העמודה בקצב זרימה של 0.5 מיליליטר לדקה בארבע מעלות צלזיוס לאחר טעינת הדגימה.

שטפו את העמודה עם מאגר S A עד שמגיעים לקו הבסיס הסופג UV. מסלק את הגראנזימים עם שיפוע נתרן כלורי ליניארי של 30 מיליליטר גרנזים A נפלט בכ-650 מילי-מולרי נתרן כלורי גרנזים B בכ-700 מילי-מולרי נתרן כלורי וגראנזים M בכ-750 מילי-מולרי נתרן כלורי. אוגדים את השברים המכילים גראנזימים ומתרכזים לכ-100 מיקרומולר במסנני ספין, מכניסים את תכשירי הגראנזים המרוכזים ומאחסנים במינוס 80 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן, נתח שברים אלוציאניים על ידי דף SDS ומבחנים מטריים של צ'ול כדי לבצע את הבדיקות המטריות של צ'ול להפיץ דגימות גרנזים קטנות משברים אלוסיאניים או מלאים מרוכזים ב-96. ובכן, צלחות תחתונות שטוחות כוללות שליטה חיובית ושליטה שלילית. הוסף 100 מיקרוליטר של מאגר בדיקה לכל אחד.

ובכן דוגרים את הצלחת למשך 10 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס. לבסוף, מדוד את הצפיפות האופטית ב-405 ננומטר בקורא מיקרו-פלטות. פרוטוקול זה יפיק תפוקות גבוהות של גראנזימים טהורים כפי שמודגם בג'ל דף SDS מוכתם קומאסי מייצג זה המציג גרנזים BE מהעמודה S.

הגראנזימים הרקומביננטיים מציגים פעילות דומה לתכשירי פרוטאז מקוריים כפי שמוצג בבדיקת מדד צבע זו המשווה בין פעילות רקומביננטית לפעילות גרנזים B מקורית. חשוב לציין, טיפול באנדו H מצביע על כך שהגראנזימים המיוצרים בתאי HEC 2 93 T הם מגליקוזילטים במלואם. האנזימים הגדולים הרקומביננטיים מסוגלים לבקע מצעי חלבון מקרומולקולריים, כפי שמודגם בבדיקת גרנזים מייצגת זו, באמצעות מצע החלבון החיידקי ו-UOCD.

כאן, הרצועה המייצגת N-O-U-C-D שסוע נעלמת לאט לאט עם ריכוז גרנזים הולך וגובר. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לייצר אנזימים גדולים מגליקוזילטים ופרו-אקטיביים בתפוקות גבוהות בתאי HK 2 93 T.