מתאם Confocal ו3D מיקרוסקופית אלקטרונים של תא חושי ספציפי

המטרה הכוללת של הליך זה היא לתעד את מבנה האולטרה השלם של תא חישה ספציפי במעי המפוזר בין תאי אפיתל אחרים ברקמת המעי הטבעית. זה מושג על ידי קבלת מקטע רקמה בגודל 300 על 50 מיקרון מהמעי. לאחר מכן מתקבלות ערימות Z אופטיות של הקטע באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית.

לאחר מכן הנתונים הקונפוקליים משמשים כמדריך לעיבוד והדמיה של הרקמה באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סריקת פנים בלוק סדרתי או SBEM. לבסוף, נתוני ה-SBEM מפולחים כדי לעבד את מבנה האולטרה של תא חיישן מעיים ספציפי בתלת מימד. בסופו של דבר מיקרוסקופיה קונפוקלית מתאמת וסריקת פנים בלוק סדרתי.

מיקרוסקופ אלקטרונים משמש להצגת תא ספציפי ברקמה המקורית שלו ולחשוף את מבנה האולטרה שלו בתלת מימד. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה של התא, כגון אינטראקציות ספציפיות בין תא לתא שלא ניתן היה לדמיין אחרת ברמת מיקרוסקופ אור. על ידי שימוש בשיטה זו, דיווחנו בעבר על קשר כימי פיזיקלי נסתר בין תאים אנדוקריניים נכנסים חושיים ל-ggl.

לאחר בידוד המעי הגס של העכבר, על פי פרוטוקול הטקסט, הניחו אותו ב-PBS קר ונעים ובעודו שקוע חתכו את הרקמה לאורך המזנטריה, העבירו את הרקמה לכמה טיפות של PBS על יריעת שעווה דנטלית ובעזרת אזמל קללו כשישה קטעי רקמה קטנים מהמעי הגס הדיסטלי. לאחר הכנת ארוס נמס נמוך של 5% ב-PBS, השתמש בו כדי להטמיע את מקטעי הרקמה במיכל פלסטיק קטן כגון תבנית קריו טכנית לרקמות בגודל סטנדרטי, הרכיב את החלקים המוטבעים על מיקרוטום להב רוטט והשתמש ב-PBS קר כקרח כדי למלא את מגש החיץ. לאחר מכן חותכים רצועות רקמה של 300 מיקרון במשרעת של 0.8 ומהירות של 0.04 מילימטרים לשנייה.

קנו את רצועות הרקמה של 300 מיקרון בארוס והרכיבו אותן על מיקרוטון בניצב ללהב. לאחר מכן חותכים רצועות רקמה בעובי של 50 מיקרון תוך התייחסות לפרוטוקול הטקסט לפרטים לפני אחסון בלוקים ב-PBS בארבע מעלות צלזיוס. לאחר הדמיית גושי רקמות באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית על פי פרוטוקול הטקסט לחדירה והטמעה של קטעי רקמה בשרף.

הסר את הרקמה מ-PBS והשתמש במאגר ציפוי מולארי 0.1 כדי לשטוף אותה שלוש פעמים במשך חמש דקות כל אחת. לאחר הכנת השרף והרקמות הוכתמו למיקרוסקופ אלקטרונים, על פי פרוטוקול הטקסט, השתמש בו כדי לסנדוויץ' גושי רקמות בין שקופיות זכוכית שנרפאו בחומר שחרור נוזלי לאחר הטמעת גושי הרקמות, לרפא את הבלוקים למשך 48 שעות נוספות ב-60 מעלות צלזיוס. לאחר מכן משוך את השקופיות זו מזו כדי לשחרר את הבלוקים תחת טווח ניתוח, התאם את כיוון גושי הרקמה המוטבעים בשרף לזה של המיקרוגרפים הקונפוקליים.

כדי להקל על זיהוי האזורים המכילים את התאים המעניינים, הרכיבו את הבלוק שטוח על סיכה המכילה אפוקסי מוליך וייבשו למשך 30 דקות. לאחר מכן הניחו את הבלוק שטוח על משטח וייבשו למשך הלילה בחום של 60 מעלות צלזיוס למחרת. מצפים את הבלוק בנוזל כסף קולואידי.

שמור על חלקי הרקמה שטוחים כדי להבטיח חיתוך של הבלוק בזווית הנכונה כדי להקל על מתאם פני הבלוק הסדרתי והמיקרוגרפים הקונפוקליים. לאחר ביצוע מיקרוסקופ אלקטרונים סורק על פי פרוטוקול הטקסט, המר את תמונות ה-SPEM מפורמט DM גולמי שלוש לתמונות TIFF של שמונה סיביות באמצעות מסנן טשטוש גאוס 0.8 בפיג'י. סנן את תמונות ה-TIFF.

הקטן את מערך הנתונים ל-25% מהגודל המקורי ושמור אותו כמחסנית TIFF כדי למזער את כמות זיכרון ה-RAM הדרושה לטיפול במערך הנתונים עם יישור המחסנית הליניארית של תוסף פיג'י עם ניפוי במצב תרגום. יישר את ערימת תמונות ה-SPEM והשתמש בתוסף Crop 3D כדי לחתוך אותן. כדי לעבד את הנתונים, השתמש בכלי המשטחים במצב ציור ובאפשרות המתאר במצב ציור של 50 אלפיות השנייה כדי לפלח ולעבד את התא המעניין באופן ידני.

עקבו אחר קווי המתאר בכל פרוסה בתא לעיבוד חלק יותר או כל חמש פרוסות לעיבוד מהיר יותר. השתמשו בכלי תצלום בזק כדי לייצא את התמונות הסופיות ברזולוציה של 300 DPI או יותר באמצעות העכבר P-Y-Y-G-F-P. כל התאים האנטרואנדוקריניים של החלק הדיסטלי של המעי הדק מזוהים ומעובדים עבור SBEM כפי שמוצג כאן.

קטע רקמה נבחר צולם על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית כדי לקבל תמונות זאק, המרוחקות אופטית מיקרון אחד זה מזה. אופטימיזציה של מידות גושי הרקמה היא קריטית למתאם טופוגרפי בין נתונים קונפוקליים ל-SBEM. תצוגה זו של תא אנטרואנדוקריני באילאום של העכבר מציגה תרמיל נוירולוגי בולט המשתרע מתחת לתאי אפיתל כ-60 מיקרון.

על ידי מתאם של ערימות Z קונפוקליות עם תמונת SBEM של כל פני הבלוק, התא המעניין מזוהה כאן בבלוק מהמעי הגס הדיסטלי של עכבר A-P-Y-Y-G-F-P. חשוב לשמור על כיוון הבלוק שטוח ככל האפשר כדי להתאים לפרוסות האופטיות בתמונות SBEM. לאחר זיהוי התא, הדמיית SBEM נעשית ברזולוציה גבוהה מספיק כדי לזהות אברוני הפרשה ואברוני תא אחרים.

סרטון זה מכיל עיבוד בתלת-ממד של התא האנטרואנדוקריני. מערך הנתונים מכיל 643 תמונות המשתרעות על פני 45 מיקרון מעומק הרקמה. התא מכיל תרמיל נוירולוגי עמוס בהפרשות כמו גם מיקרוווילים.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לתעד את מבנה האולטרה השלם של מעי ספציפי תא חושי מפוזר בין תאי אפיתל אחרים ברקמת המעי המקורית על ידי שימוש בפלואורסצנציה כמדריך לזיהוי התא או התאים המעניינים ולעיבוד הרקמה למיקרוסקופ אלקטרונים סורק שלב בלוק סדרתי.