כימות של דביקות תא האנדותל במבחנה

המטרה הכוללת של הליך זה היא לכמת את ההדבקה של תאי אנדותל במבחנה. זה מושג על ידי הכנה ראשונה של תלושי כיסוי מצופים פיברונקטין בלוח אשכול 24 עולמי. לאחר מכן מורחים תאי אנדותל של העורקים הכליליים האנושיים על החלקות כיסוי הזכוכית ומניחים לדגור עד שנוצרת חד-שכבת תאי אנדותל קונפלונטיים.

לאחר מתן הטיפול הרצוי לתאי האנדותל, מונוציטים בעלי תווית פלואורסצנטית נוספו להחלקות כיסוי הזכוכית והודגרו עם חד-שכבת תא האנדותל. השלב האחרון הוא הסרת מונוציטים לא קשורים מהחד-שכבת האנדותל על ידי הליך טבילה וכביסה קפדני של החלקות הכיסוי. בסופו של דבר, שיטה זו מאפשרת לכמת את אחוז אוכלוסיית תאי האנדותל הדביקה לאחר טיפול מסוים.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מודדת את המספר או האחוז בפועל של תאי אנדותל דביקים בניגוד לדביקות הכוללת של שכבת מונו-אנדותל כפי שנמדדת בכל השיטות הנוכחיות. הרעיון לשיטה זו עלה לנו לראשונה כאשר ניסינו למדוד ADI של תאי אנדותל בשיטות הזמינות כיום ונתקלנו בשונות גדולה באופן בלתי מתקבל על הדעת בתוצאות עקב אתגרים טכניים הטמונים בשיטות אלה. החלקות כיסוי זכוכית עגולות בקוטר 12 מילימטר מעוקרות על ידי השרייתן באתנול 70% למשך 10 דקות לפחות עם תסיסה מדי פעם כדי להבטיח חשיפה מוחלטת של כל החלקות הכיסוי לאתנול.

ואז כל מכסה הזכוכית מחליק ואתנול לתוך צלחת תרבית תאים סטרילית עם זוג מלקחיים סטריליים של חמישה B. הרם והניח כל החלקה של כיסוי זכוכית בודד לבאר של צלחת אשכול 24 בארות. הקפד לוודא שהחלקות הכיסוי אינן נוגעות בגודל הבאר ונמצאות בערך באמצע, השאר את צלחת האשכול העולמית 24 החשופה עם החלקות כיסוי זכוכית לייבוש בארון הזרימה.

הנסיעה אורכת כ-10 דקות. כאשר החלקות הכיסוי יבשות, אני מלטף 100 מיקרוליטר של תמיסת ציפוי על כל החלקה של כיסוי זכוכית כך שהתמיסה מכסה רק את הזכוכית מבלי למשוך סביב החלק החיצוני של הבאר. מניחים את צלחת האשכול המכוסה של 24 בארות בחממת תרבית תאים למשך שעה לפחות.

תרבית, תאי אנדותל של העורקים הכליליים האנושיים במדיום ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני שואבים מאמצעי התרבות ושוטפים את חד-שכבת התא האנדותל עם 10 מיליליטר של תמיסת מלח איזון של האנק או HBSS ואז שואבים מה-HBSS בשני מיליליטר של 0.5% נסיעות בתמיסת EDTA של 0.2% ומודגרים בטמפרטורת החדר למשך כחמש דקות כאשר ניתן לעקור את תאי האנדותל על ידי הקשה לצד בקבוק. בחמישה מיליליטר של מעכב טריפסין פולי סויה משפריץ על פני הבקבוק. כדי לעקור עוד יותר את התאים, העבירו את התאים לצינור של 15 מיליליטר וצנטריפוגה של הצינור ב-200 פעמים G למשך חמש דקות, שאפו מהסופינאט והשעו מחדש את כדור האנדותל בחמישה מיליליטר מדיה.

ספרו את התאים בעזרת המו ציטומטר והתאימו את ריכוז התאים ל-50,000 תאי אנדותל למיליליטר מדיה. הוצא מיליליטר אחד של תרחיף התאים לכל באר של צלחת 24 הבארות המכילה החלקות כיסוי זכוכית מצופות דגירה על התאים למשך הלילה בחממת תרבית תאים ב-37 מעלות צלזיוס בתוספת 5% פחמן דו חמצני. התאים מוכנים לטיפול הרצוי.

כאשר נוצרת חד-שכבתית קונפלונטית תוך שלושה ימים, העברת תאי HL 60 המתורבתים ב-RPMI מתווספת עם סרום עגל עוברי של 10% לתוך צינור של 15 מיליליטר וצנטריפוגה של התאים ב-200 פעמים G למשך חמש דקות. לאחר מכן הסר את הסופינט והשהה מחדש את התאים בחמישה מיליליטר מדיה ללא סרום לתיוג פלואורסצנטי של תאי HL 60. ספור והעביר את כמות התאים המתאימה לצינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר.

צנטריפוגה של התאים ב -200 פעמים G למשך חמש דקות. לאחר הסרת הסופינאט, השעו מחדש את גלולת התא במעקב התאים במדיית PMI שלנו ללא סרום. בריכוז של מיליון תאים למיליליטר, יש לדגור על התאים בחממת תרבית התאים למשך שעה לאחר הדגירה, לצנטריפוגה את התאים ב-200 פעמים G למשך חמש דקות ולהשליך את ה-Reese הסופי.

השעו את חבר התא במדיה לריכוז של 2 מיליון תאים למיליליטר. הוסף מיליליטר אחד של גשש תאים שכותרתו תרחיף תאים HL 60 לכל באר של צלחת אשכול 24 הבארות המכילה את חד-שכבת התא האנדותל ודגר את הצלחת בחממת תרבית תאים של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני לפרק זמן קבוע נבחר בין שעה לשלוש שעות לאחר תקופת הדגירה. השתמש בזוג מלקחיים עדינים של חמישה B והרם את החלקת כיסוי הזכוכית מהבאר, קרע רק את הקצה החיצוני של הכיסוי, החליק, גם את החלקת הכיסוי וגם טפח את קצה המכסה.

החלק על פיסת טישו על הספסל למשך שלוש שניות. הקפד לא לגעת במשטח המכוסה בתא של החלקת הכיסוי כאשר הרקמה המחזיקה את החלקת הכיסוי בחוזקה בעזרת זוג מלקחיים. הטביע את החלקת הכיסוי פנימה והחוצה מה-HBSS חמש פעמים לאחר ההטבעה החמישית.

HBSS טפח את קצה הכריכה. החלק על הטישו למשך שלוש שניות. חזור על הליכי ההטבעה והטבילה בסך הכל שלושה סטים של חמישה דאנקים ואחריהם דאב.

לאחר מכן העבירו את החלקת הכיסוי לבאר המכילה נוסחת טנסנט כדי לתקן את התאים בטמפרטורת החדר. החלקה הצבעונית מוכנה לספירה לאחסון לטווח ארוך או להיות נתונה לצביעה נגדית לנוגדנים או לפעילות בטא גלקטו סאס הקשורה להזדקנות כמתואר בפרוטוקול הטקסט כדי לספור את תאי האנדותל הדביקים, להרכיב את פתקי הכיסוי על שקופיות מיקרוסקופ עם כתם נגד DPI כדי לזהות תאים בודדים באמצעות מיקרוסקופ הפוך עם מטרה של ארבע או פי 10. רכוש תמונות של מספר שדות וספור את המספר הגבוה ביותר של מונוציטים המצטברים על תאי אנדותל לא מוקרנים.

הגדר מספר כפול זה כסף של מונוציטים בתא אנדותל שיוגדר כאשכול במידת הצורך. ניתן להשתמש בקריטריון אחר להגדרת אשכול בהתאם לאופי הניסוי. ספרו את מספר האשכולות ואת מספר תאי האנדותל בשדה.

חלקו את הטופס באחרון כדי לקבל את אחוז תאי האנדותל הדביקים. ציין שדות רבים כדי לקבל ממוצע וסטיית תקן של הספירות. חד-שכבות אנדותל בשבעה ימים לאחר הקרינה האפורה לפני הדגירה עם מונוציטים נקשרו על ידי מונוציטים באשכולות סביב תאי אנדותל בודדים.

למרות שתופעה זו ניתנת לצפייה בקלות תחת ניגודיות פאזה, מיקרוסקופיה פלואורסצנטית חושפת תמונה ברורה עוד יותר של צבירי המונוציטים. לאחר ביצוע בדיקת ה-ADI המתוארת, ניתן להמשיך לצבוע את התאים עבור חלבונים ציטופלזמיים או גרעיניים ממברניים באמצעות נוגדנים מתאימים. בשיטות אימונופלואורסצנטיות סטנדרטיות, היזהר בשלבי הכביסה מכיוון שכוח מופרז יכול לעקור את המונוציטים.

יתר על כן, ניתן לבצע בדיקות מבוססות אנזימים כגון becyase הקשור להזדקנות. זה גורם לליזוזומים של תאים מזדקנים להפוך לכחולים, כפי שניכר בתא האנדותל הקשור באופן סלקטיבי על ידי מונוציטים רבים המזוהים בשל גודלם הקטן וצורתם הכדורית. מכיוון שכל אשכול מונוציטים מתאים לתא אנדותל בודד, ספירת האשכולות חושפת את המספר האמיתי של תאי אנדותל דביקים בתוך השכבה החד-שכבתית ומכאן את אחוז תאי האנדותל הדביקים בתוך האוכלוסייה.

זוהי השיטה היחידה עד כה המאפשרת כימות של הדבקות תאי האנדותל אם רוצים ניתן לעקור מונוציטים המחוברים לחד-שכבות אנדותל על ידי תמיסת טריפסין EDTA, והפלואורסצנטיות נמדדת באמצעות קורא צלחות כפי שקורה בשיטות עכשוויות. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך ארבע שעות ועם מעט מאוד ידיים בזמן. חשוב, זכרו שכל שלבי הכביסה והטבילה חייבים להתבצע בצורה זהה ועם אותו מספר חזרות בין כל הדגימות בעקבות הליך זה.

ניתן לבצע שיטות אחרות כגון אימונופלואורסצנציה ומבחני בטא גלקטו הקשורים להזדקנות על מנת לענות על שאלות כמו מהם המאפיינים של תאי אנדותל שהם דביקים בהשוואה לאלה שלא.