Name: כימות של דביקות תא האנדותל במבחנה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: למדו שיטה לכימות דביקות תאי אנדותל במבחנה באמצעות כיסוי פיברונקטין ומונוציטים מסומנים בפלואורסצנציה. טכניקה זו מספקת מדידה מדויקת של אחוז התאים הדביקים לאחר טיפולים שונים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו אסירי תודה לסיימון בופלר על תמיכתו המלאה ולבריאות הציבור באנגליה על תמיכת התשתיות. עבודה זו נתמכה על ידי בריאות הציבור באנגליה באמצעות מענק המכון הלאומי לחקר הבריאות (NIHR). דו"ח זה הוא עבודה שהוזמנה על ידי ה-NIHR. הדעות המובעות בפרסום זה הן של המחברים ולאו דווקא של ה-NHS, ה-NIHR או משרד הבריאות. למממנים לא היה כל תפקיד בתכנון המחקר, איסוף וניתוח נתונים, החלטה לפרסם או הכנת כתב היד.

1. הכנת Coverslips הזכוכית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר קוטר 12 מ&quot;מ עגול coverslips זכוכית ידי טבילתם באתנול 70% לפחות 10 דקות, כאשר מדי פעם תסיסה על מנת להבטיח חשיפה כוללת של כל coverslips לאתנול. יוצקים coverslips הזכוכית ואתנול לתוך צלחת תרבית תאים סטריליים (או 6 סנטימטר או 10 סנטימטרים קוטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם זוג 5 מלקחיים עדינים סטריליים, להרים ולמקם את כל coverslip זכוכית בודד לתוך באר של צלחת גם אשכול 24. תשמור על מנת להבטיח שcoverslips אינו נוגע בצדי היטב והם בערך באמצע של הבאר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר את הצלחת גם אשכול 24 מכוסה האו&quot;ם עם coverslips זכוכית לייבוש בזרימת הממשלה. זה לוקח בערך 10 דקות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך תקופה זו, להכין את תערובת הציפוי על ידי דילול 10 מ&quot;ג / מיליליטר פיברונקטין אדם בפתרון של האנק מאוזן מלח (HBSS) 0.1 מ&quot;ג / מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר coverslips יבש, של פתרון ציפוי פיפטה 100 μl על כל שיתוף זכוכיתverslip כך הפתרון מכסה רק את הזכוכית ללא איגום סביב החלק החיצוני של הבאר. מניחים את הצלחת 24 גם אשכול המכוסה בתרבית תאי חממה לשעה לפחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רק לפני השימוש, להסיר את פתרון הציפוי. אותו פתרון הציפוי יכול להיות מועבר לצינור סטרילי ומשמש עד שלוש פעמים ללא הפסד גלוי של יעילות. </li></ol> 2. הכנת חד שכבתי תא האנדותל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי תרבות אנושיים כליליים אנדותל העורק (EC) במדיום על 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את התקשורת ותרבות ולשטוף monolayer EC עם 10 מיליליטר HBSS </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את HBSS ולהוסיף 2 מיליליטר 0.5% טריפסין, 0.2% פתרון EDTA. לדגור על RT עבור כ 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר ניתן וחילצה EC על ידי ברז לצד השני של הבקבוק, להוסיף 5 מיליליטר של מעכבי טריפסין סויה ועם פיפטה להשפריץ את פני השטח של הבקבוק כדי לסלק נוסף התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת תאים לתוך צינור 15 מיליליטר ו צנטריפוגות הצינורב XG 200 במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את supernatant ו resuspend גלולה בר ב5 מיליליטר של תקשורת. ספירת התאים עם haemocytometer ולהתאים את ריכוז התאים 50,000 EC לכל מיליליטר של תקשורת EC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר על 1 מיליליטר של ההשעיה התא לבאר כל הצלחת גם 24 המכילה coverslips זכוכית מצופה. דגירה תאי O / N בתרבית תאי החממה ב 37 מעלות צלזיוס בתוספת 5% פחמן דו חמצני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאים מוכנים לשימוש בניסויים כאשר monolayer ומחוברות נוצר, תוך 3 ימים. </li></ol> 3. הכנת מונוציטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את HL-60 תאים בתרבית שבRPMI בתוספת 10% עגל בסרום עוברי, כתרבות השעיה, לתוך צינור 15 מ&quot;ל. צנטריפוגה התאים ב XG 200 במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את תאי supernatant ו resuspend ב 5 מיליליטר תקשורת ולהתאים את ריכוז תאים עם תקשורת 2 מיליון תאים / מיליליטר. אם תיוג הקרינה של HL-60 הוא רצוי, resuspend תאי RPMI ללא סרום ויחסי הציבורoceed כאמור בסעיף 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.5 מיליליטר של HL-60 השעיה תא לבאר כל צלחת 24 גם אשכול המכילה monolayer EC דגירה הצלחת בתרבית תאי חממה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני לנבחרה לתקופה קצובה של זמן בין 1 ו -3 שעות. הבדל קטן הוא ציין בין שעה 1 ונקודת זמן 3 שעות, שבו רוויה מחייבת מושגת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היכונו לשטיפה / קצירת תא: מלא צינור 120 מיליליטר עם של HBSS 100 מיליליטר. לוותר על 1 מיליליטר של פורמלין לבאר כל צלחת גם טרי 24. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר תקופת הדגירה, להשתמש זוג מלקחיים חדים ולהרים את coverslip הזכוכית מהבאר והחזק את coverslip אנכי ומורחים את הקצה של coverslip על פיסת הרקמה על הספסל במשך 3 שניות, נזהר שלא לגעת ב משטח מכוסה תא של coverslip עם הרקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחזיק coverslip היטב עם זוג המלקחיים, להטביע את coverslip ובמתוך HBSS חמש פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דאנק החמישיבHBSS, מורח את הקצה של coverslip על הרקמה במשך 3 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על הנהלים הטובלים וספיגה מתואר ב3.6 ו -3.7, מה שהופך את הסכום כולל של שלושה סטים של 5 הטבעות אחרי טיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את coverslip לפורמלין 10% המכיל גם כדי לתקן את התאים ב RT. Coverslip מוכן לספירה, לאחסון לטווח ארוך או להיות נתון להליכים אחרים שיתוארו להלן. </li></ol> 4. תיוג של HL-60 תאים עם Tracker הנייד (לא חובה) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוזן ולהעביר כמות מתאימה של HL-60 תאים (למשל, 10 מ&#39;) לתוך צינור צנטריפוגות 15 מיליליטר. צנטריפוגה HL-60 תאים ב XG 200 במשך 5 דקות. הסר supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה גלולה תא במעקב סלולארי בתקשורת RPMI ללא סרום בריכוז של 1 מיליון תאים / מיליליטר. דגירה תאים בתרבית תאי חממה עבור שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי צנטריפוגה XG 200 במשך 5 דקות וזורקים supernatant. גלולה תא גלולה בתקשורת לריכוז של 2 מיליון ג/ אמות מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.5 מיליליטר של שכותרת Tracker הנייד HL-60 לכל תאי האנדותל המכילים גם גדלו על coverslip זכוכית. המשך על 3.3. </li></ol> 5. ספירת תאי האנדותל דבק <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר coverslips על שקופיות מיקרוסקופ עם נגדי כתם DAPI לזהות תאים בודדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מיקרוסקופ הפוכה עם מטרת 4X או 10X, לרכוש תמונות של כמה שדות (לדוגמא, 5 שדות) ולספור את המספר הגבוה ביותר של מונוציטים שמצטברים בתאי האנדותל בלתי מוקרן (זה צריך להיות בדרך כלל 3-5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע פעמיים מספר זה כסף של מונוציטים בתא האנדותל להיות שהוגדר כאשכול. אם נדרש, קריטריון שונה יכול לשמש להגדרת אשכול בהתאם לאופי של הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספור את מספר האשכולות ואת מספר תאי אנדותל בתחום. מחלקים את לשעבר ע&quot;י האחרון כדי להשיג את אחוז תאי האנדותל דבקים. ציוןשדות רבים כדי להשיג סטייה ממוצעת וסטנדרטית של הספירה. </li></ol> Counterstaining 6. עם נוגדנים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר assay ההידבקות והתאים על coverslip תוקנו בפורמלין 10% במשך 15 דקות ב RT, להכפיף את coverslips לimmunofluorescence באמצעות הליך סטנדרטי 10 ונוגדנים של בחירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספה והסרה של הפתרונות השונים מאוד בעדינות כדי למנוע פירוק מונוציטים שמחוברים לתאי אנדותל. </li></ol> 7. counterstaining לפעילות בטא-galactosidase הקשורים הזדקנות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר assay ההידבקות ותאים על coverslip תוקנו בפורמלין במשך 15 דקות, כתם לפעילות בטא galactosidase הקשורים הזדקנות כפי שמתואר בהוראות המלוות את ערכת הצביעה. הוספה והסרה של הפתרונות השונים מאוד בעדינות כדי למנוע פירוק מונוציטים שמחוברים לתאי אנדותל. </li></ol>

<ol><li>Ortega-Gomez, A., Perretti, M., Soehnlein, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+of+inflammation%3A+an+integrated+view%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Resolution of inflammation: an integrated view.</a> EMBO Mol Med. 5 (5), 661-674 (2013).</li>
<li>Libby, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+and+cardiovascular+disease+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Clin+Nutr%22%5BJournal%5D)">Inflammation and cardiovascular disease mechanisms.</a> Am J Clin Nutr. 83 (2), 456S-460S (2006).</li>
<li>Ikuta, S., Kirby, J. A., Shenton, B. K., Givan, A. L., Lennard, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+endothelial+cells%3A+effect+of+TNF-alpha+on+peripheral+blood+mononuclear+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Human endothelial cells: effect of TNF-alpha on peripheral blood mononuclear cell adhesion.</a> Immunology. 73 (1), 71-76 (1991).</li>
<li>Watson, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-6+acts+on+endothelial+cells+to+preferentially+increase+their+adherence+for+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">IL-6 acts on endothelial cells to preferentially increase their adherence for lymphocytes.</a> Clin Exp Immunol. 105 (1), 112-119 (1996).</li>
<li>Sans, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VCAM-1+and+ICAM-1+mediate+leukocyte-endothelial+cell+adhesion+in+rat+experimental+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">VCAM-1 and ICAM-1 mediate leukocyte-endothelial cell adhesion in rat experimental colitis.</a> Gastroenterology. 116 (4), 874-883 (1999).</li>
<li>Su, Y., Lei, X., Wu, L., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+endothelial+cell+adhesion+molecules+P-selectin%2C+E-selectin+and+intercellular+adhesion+molecule-1+in+leucocyte+recruitment+induced+by+exogenous+methylglyoxal%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">The role of endothelial cell adhesion molecules P-selectin, E-selectin and intercellular adhesion molecule-1 in leucocyte recruitment induced by exogenous methylglyoxal.</a> Immunology. 137 (1), 65-79 (2012).</li>
<li>Hallahan, D., Kuchibhotla, J., Wyble, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+adhesion+molecules+mediate+radiation-induced+leukocyte+adhesion+to+the+vascular+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Cell adhesion molecules mediate radiation-induced leukocyte adhesion to the vascular endothelium.</a> Cancer Res. 56 (22), 5150-5155 (1996).</li>
<li>Vaporciyan, A. A., Jones, M. L., Ward, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+analysis+of+leukocyte-endothelial+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid analysis of leukocyte-endothelial adhesion.</a> J Immunol Methods. 159 (1-2), 93-100 (1993).</li>
<li>Prabhakarpandian, B., Shen, M. C., Pant, K., Kiani, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+devices+for+modeling+cell-cell+and+particle-cell+interactions+in+the+microvasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc+Res%22%5BJournal%5D)">Microfluidic devices for modeling cell-cell and particle-cell interactions in the microvasculature.</a> Microvasc Res. 82, 210-220 (2011).</li>
<li>Lowe, D., Raj, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Premature+aging+induced+by+radiation+exhibits+pro-atherosclerotic+effects+mediated+by+epigenetic+activation+of+CD44+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Premature aging induced by radiation exhibits pro-atherosclerotic effects mediated by epigenetic activation of CD44 expression.</a> Aging Cell. 13 (5), 900-910 (2014).</li>
</ol>

יש המחברים אין לחשוף.

Assay הידבקות מונוציטים שתואר לעיל שימש בהצלחה בניסויים שנועדו לחקור את ההשפעות הביולוגיות של קרינה מייננת על monolayers אנדותל 10. אמנם זה לא השיטה היחידה העומדת לרשות להעריך את הדביקות של monolayer האנדותל, היא השיטה היחידה המאפשרת כימות של החלק או אחוז תאי אנדותל בmonolayer כי הוא דבק. זו הבחנה חשובה כמו שינוי הכמותי עולמי בהידבקות של מונוציטים, כפי שנמדד על ידי שיטות אחרות ניתן לייחס גם לעלייה כללית בדביקות של כל התאים של monolayer האנדותל או לדביקות הגידול של תת-אוכלוסייה של תאי האנדותל בתוך monolayer, כפי שמוצג בדוגמא לעיל. הערך שיש במידע זה בא לידי ביטוי בעובדה שהיכולת לכמת אחוז תאי האנדותל שהציגו דביקות משופרת לאחר ההקרנה הובילה לאינסמסוגל מסקנה שהשפעה זו אינה נובעת ממוטציה הגנטית של גן מסוים כאחוז התאים שהיו דבקים היתה מאוד מעל (מעל 1,000 פעמים יותר) שבו ניתן היו לצפות מן המוטציה של גן אקראי על ידי X-קרינה במינון ש . הגורם המאפשר שחזור טוב של התוצאות הוא משטר הכביסה. כנוהל השטיפה כרוך הטבילה של coverslip הזכוכית לחיץ לשטוף אחריו מספיגה על רקמה, השתנות במערבולת החיץ שמתעוררת באופן בלתי נמנע מהשיטה של ​​pipetting של החיץ לשטוף לתוך באר הישנה הוא נמנע. ואכן זה היה התצפית של השתנות מוגזמות בין משכפל שהושג באמצעות שיטת pipetting שאלצה אותנו לתכנן הליך כביסה שהסיר את האלמנט השונות מהשלב הכביסה. אמנם, המגבלות של שקר assay זה בצורך לבצע ספירה ידנית של אשכולות מונוציטים, שעושה not לאפשר לו להיות מותאם לתפוקה גבוהה מנתח. שנית, ההחלטה על אופן מונוציטים רבים מהווים אשכול יש שתיקבע באופן שרירותי וחצי הרמה ניתן להגדיר גבוהה מדי ולגרום להרחקה של כמה אשכולות אמיתיים. יכול גם להיות שנצפה החוסר בכוח גזירה בשיטה זו כהגבלה בניסויים שבהם דביקות משופרת גס של תאי האנדותל מושרה (למשל, + TNFα). במצבים אחרים לעומת זאת, החוסר בכוח הגזירה הוא יתרון שכן היא מאפשרת זיהוי של הגדלת פחות מוגזמת של דביקות. עלייה צנועה בדביקות מונוציטים יכולה להיות חשובה ורלוונטית במיוחד. בvivo, מונוציטים לא (בזמן ניסוי טיפוסי) צפוי לצרף במספרים גדולים לתאי אנדותל עם עלייה צנועה בדביקות, במידה רבה בשל הגזירה כוח. בזמן עם זאת, כמה מונוציטים כנראה הייתם, וזה סביר יותר מייצג את הסביבה של דלקת כרונית. כמו,העדר כוח גזירה יכול להיות יתרון כפי שהוא מספק הזדמנות לעליות קטנות בדביקות תא האנדותל להתגלות במסגרות זמן ניסיוניות שהן בדרך כלל קצרים ואולי גם חולפים כדי לאפשר גידול צנוע בדביקות שנצפה תחת מאמץ גזירה. היכולת להכפיף את התאים לאחר assay זה לניתוחים אחרים כגון assay הזדקנות ומכתים immunofluorescence מגדילה את התועלת של שיטה זו שכן היא מאפשרת את הקשר של דביקות של תאי האנדותל ספציפיים לחלבונים תאיים מסוימים או מדינות סלולריות כפי שהודגם לעיל, תכונה ש אינו זמין עם מבחני הידבקות המבוגרים. שיטה זו נעשתה שימוש בתאים-הונצח est2 אדם כלילית אנדותל ותוצאות דומות התקבלו גם בתאים ראשוניים אדם כלילית אנדותל 10, מדגים שזה לא ספציפי רק קו תא מסוים. כמו כן, ADOption של שיטה זו של מנסה לאמוד דביקות של תאי האנדותל אינו מונע העמדת אותם תאים לassay ההידבקות הסטנדרטי שמודד הקרינה של immunocytes שכותרת. יחד, דוח זה מוכיח כי שיטה זו היא תכליתית, כוללת ומספקת הרבה יותר מידע מאשר assay ההידבקות הסטנדרטי.

<html> הסתננות של תאים חיסוניים כגון מונוציטים פני שכבת תאי האנדותל המרפדים את כלי דם היא צעד חשוב בתהליך של דלקת 1. זה מאפשר הביות של תאי מערכת חיסון (immunocytes) לאתר של פציעה. במקרים אחרים ובמקומות כגון עורקים הכליליים ועורק הראשי, חדירה של מונוציטים דרך שכבת האנדותל יכולה להוביל למגורים לטווח ארוך רצויים של תאים אלה בקיר של העורק, שעלול להוביל להיווצרות הפלאק 2. בכל המקרים של חדירת immunocyte, הצעד הראשון כרוך בהפעלתם של תאי האנדותל באזור מקומי של כלי הדם. תאי האנדותל מופעלים על ידי ציטוקינים פרו-דלקתיים כגון TNF-α ו- IL-6 להגדיל ביטוי של חלבונים בתא שטח כגון VCAM, ICAM ו- E-selectin המאפשרים הגיוס וקשר של immunocytes על פני השטח של תאי אנדותל 3 6. = &quot;Jove_content&quot; ילדה&gt; בתחילה, מדידה של הידבקות תא אנדותל בוצעה על ידי ספירת מונוציטים שדבקו אנדותל monolayer 7. מגבלותיה של שיטה זו במונחים של דיוק הובילו לשימוש בהלימפוציטים שכותרתו ברדיו או במונוציטים, ואחריו כימות של חומר רדיואקטיבי אשר תואם לימפוציטים או מונוציטים הידבקות 4. שיטה זו הוחלפה סופו של דבר על ידי שיטת הקרינה מבוססת, לפיה immunocytes עניין תויגה עם צבע פלואורסצנטי וכפוף לאותו ההליך כאמור לעיל עם ההבדל הוא הקרינה שבמקום רדיואקטיביות נמדדה 8. כיום שיטה זו התגלתה כנוחה ביותר ונמכר בצורת ערכה על ידי מספר ספקים מסחריים. בעוד assay זה יכול למדוד את הרמות יחסי של דביקות בין בקרות ודגימות ניסוי, זה לא לגלות אם שינוי בקרינה נובע משינוי אחיד בדביקות על פני כל הדואראוכלוסיית תא ndothelial או אם השינוי נובע מהבדל של דביקות בתת-אוכלוסייה של תאים. זה ניכר גם שהחומרה של שטיפה מפעילה השפעה עמוקה על התוצאה, ויותר חשוב מכך, את האחידות של שטיפה את מונוציטים מאוגד בין monolayers תא אנדותל שונה תשפיע במידה רבה על הקרבה של תוצאות ממשכפל והשחזור של התוצאות בין דגימות . לאחרונה, מספר מערכות שלשאוב מונוציטים בתקשורת ברחבי monolayer תא האנדותל שמשו כדי לטפל בבעיה זו 9. בנוסף, זרימת מערכות אלה גם לשחזר את האפקט של כוח גזירה על תאי האנדותל. למרות היתרונות של מערכות כאלה הם ברורים ומאוד אטרקטיביים, זה גם חשוב להבין כי בעוד דביקות תא האנדותל יכולה להיות מוגברת באופן משמעותי, כמו במקרה של דלקת חריפה ב, על ידי גורמים כגון TNFα, כמה מפעילים אחרים, כגון קרינה מייננת 10 לעורר שינויים לאכובע אינו מזוהה בקלות בתוך מבחנה מסגרות זמן ניסיונית על ידי מערכות מאוד מחמירות אלה. בעוד כגון שינויים של הרגע של דביקות תא האנדותל הם החמיצו או פוטרו במבחנה בקלות, זה לא פיר בהכרח in vivo, שבו שינויים קטנים כאמור בתוך זמן חיים, שהוא אופייני לדלקת כרונית, יכולים להפעיל תוצאות מאוד משמעותיות. לפיכך שיטה חזקה, עדיין רגישה, וספציפית כדי לזהות ולמדוד נחוצה דביקות תא האנדותל. כאן, אנו מדווחים על שיטה למדידת דביקות של תאי האנדותל ישירות. שיטה זו אינה מסתמכת על מדידת הקרינה כאינדיקטור פונדקאית עקיף של דביקות תא האנדותל. הוא מגלה אם שינויים בדביקות הם עקב שינוי אחיד על פני כל התאים או מרותק לתת-אוכלוסייה. יתר על כן, היא מאפשרת שיתוף צביעת תאי אנדותל עם סמנים כמו בטא galactosidase הקשורים הזדקנות, מר כדאיות תאker, Calcien בבוקר ונוגדנים נגד פני תא וחלבונים תאיים, המאפשרים לעמותה של תאי האנדותל דבקים פרט למדינות תא מסוימים או ביטוי של חלבונים ספציפיים.

<table><tbody><tr><td>תמיסת מלח חוצצת Hepes (HBSS)</td><td>Sigma</td><td>H6648</td><td></td></tr><tr><td>כיסויי זכוכית עגולים בקוטר 12 מ"מ</td><td>Menzel-Glaser</td><td>CB00120RA1</td><td></td></tr><tr><td>צלחת אשכול 24 בארות</td><td>Costar</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>Meso-Endo Cell</td><td>Media Cell Applications</td><td>212-500</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Sigma</td><td>T4174</td><td></td></tr><tr><td>פולי סויה מעכב טריפסין</td><td>Life Technologies</td><td>17075-029</td><td></td></tr><tr><td>Cell Tracker Green</td><td>Life Technologies</td><td>C7025</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Sigma</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>עגל עוברי סרום</td><td>Life Technologies</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>ערכת בדיקת בטא גלאסקטוזידאז&nbsp; &nbsp;</td><td>CellSignaling</td><td>9860</td><td></td></tr><tr><td>פיברונקטין</td><td>סיגמא</td><td>F0895</td><td></td></tr></tbody></table>

כימות של דביקות תא האנדותל<em&gt; במבחנה</em

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

אחד התהליכים העיקריים של דלקת היא החדירה של תאי מערכת חיסון מלומן של כלי הדם לרקמות שמסביב. מצב זה מתרחש כאשר תאי אנדותל, אשר מרפדים את כלי דם, הפכו לדבק במחזור תאים חיסוניים כגון מונוציטים. מדידה במבחנה של הדביקות הזאת עד עכשיו נעשתה על ידי כימות המספר הכולל של מונוציטים שלדבוק שכבת האנדותל או כספירה ישירה או על ידי מדידה עקיפה של הקרינה של מונוציטים חסיד. בעוד מדידות כאלה לעשות לציין הדביקות הממוצעת של אוכלוסיית תאי אנדותל, הם מבולבל על ידי מספר הגורמים, כגון מספר תאים, ולא לחשוף את חלקם של תאי האנדותל, כי הם דבקים למעשה. כאן אנו מתארים ומדגימים שיטה המאפשרת הספירה של תאים מודבקים בתוך אוכלוסייה שנבדקה של monolayer האנדותל. תאי האנדותל גדלים על coverslips הזכוכית והבא רצוייםטיפול מאותגרים עם מונוציטים (שעשוי להיות שכותרתו fluorescently). לאחר הדגירה, הליך שטיפה, מעורבת סבבים רבים של טבילה וניקוז, התאים הם קבועים. תאי האנדותל דבקים, אשר מוקפים במונוציטים בקלות מזוהים ומנויים, נותנים מדד הידבקות החושף את החלק הממשי של תאי האנדותל באוכלוסייה שהם דבקים.

שיטה זו מאפשרת זיהוי של תאי האנדותל דבקים בודדים בתוך אוכלוסייה. לדוגמא, בעוד monolayer של תאי האנדותל מוקרן האו&quot;ם שמר כמה HL-60 מונוציטים סדירים הבאים דגירה וכביסה, monolayer האנדותל ב -7 ימים שלאחר הקרנת 10Gy לפני דגירה עם מונוציטים היו קשורים במונוציטים באשכולות סביב תאי האנדותל בודדים ( איור 1). למרות שתופעה זו היא לצפות בקלות תחת מיקרוסקופ לעומת שלב, מיקרוסקופ פלואורסצנטי מגלה תמונה ברורה אף יותר של אשכולות מונוציטים. לאחר ביצוע assay ההידבקות תאר, אפשר להמשיך למכתימים את התאים לממברנה, cytoplasmic או גרעיני (איור 2) חלבונים באמצעות נוגדנים מתאימים עם שיטות immunofluorescence סטנדרטיים. יתר על כן, assay אנזים מבוסס כגון בטא-galactosidase הקשורים הזדקנות (איור 3) יכול להיות גם PErformed. מאז כל אשכול מונוציטים מתאים לתא האנדותל בודד, ספירה של האשכולות תחשוף את המספר האמיתי של תאי האנדותל דבקים בתוך monolayer (איור 4), ולכן אחוז תאי האנדותל דבקים באוכלוסייה (הטבלה 1, איור 6) . זוהי השיטה היחידה עד כה שמאפשר כגון כימות של דביקות תא האנדותל. ראוי לציין כי תאי האנדותל המשמשים בניסויים הנה-עכבות קשר ולא להגדיל במספר לאחר שהשיג נקודת המפגש. זה מבטל את מורכבות פוטנציאל טמונה במספר תא האנדותל עלה בנקודות זמן מאוחר יותר. אם תרצה, מונוציטים המצורפים לmonolayers אנדותל ניתן וחילצה ב -0.5% פתרון EDTA טריפסין-0.2% (במקום 3.9 קיבעון ב) והקרינה שלהם נמדדו באמצעות קורא צלחת, כמו במקרה של בשיטות עכשוויות (איור 5). </p&gt; <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52924/52924fig1.jpg" /> הידבקות באיור 1. של מונוציטים על monolayer של תאי האנדותל. בתאי האנדותל בלתי מוקרן, מונוציטים דבקו כתאים בודדים באופן סדיר ואקראי (משמאל לוחות) ובאשכולות על תאי האנדותל בודדים של 7 ימים לאחר 10 Gy המוקרנים monolayer (לוחות מימין). לוחות נמוכים הם תמונות הקרינה של הפנלים העליונים, המאשרים כי התאים כדוריים הקטנים ובהירים הגלויים תחת ניגוד שלב אכן מונוציטים שמראש שכותרתו עם התא-Tracker ירוק. חלק מאשכולות מונוציטים מסומנים על ידי חצים לבנים. תמונות צולמו באמצעות מטרת 10X. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52924/52924fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <html><img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52924/52924fig2.jpg" /> מכתים איור 2. תאי אנדותל עבור assay חלבונים לאחר הידבקות. לאחר ביצוע assay ההידבקות תאר, תאים על coverslips הזכוכית היו נתונים לimmunofluorescence לגילוי (א) חלבון קרום (CD44), ב) חלבון cytoplasmic (טובולין) או ג) חלבון גרעיני (γ-H2AX). לוחות שמאל של (א) ו- (ב) (ראה עם מטרת 20X) מונוציטים מופע שכותרתו מראש עם תא Tracker הירוק ותמונה דומה על הלוחות תקין לחשוף CD44 וmicrotubules (אדום) וגרעינים צבעוניים DAPI (כחול). חצים לבנים בצבע על גרעין תא אנדותל המוקרן שהוכתמו נוגדנים נגד γ-H2AX (C). גרעיני מונוציטים שהם מוכתמים בהירים כחולים על ידי DAPI בקלות להבחין בין הגרעינים הסגלגלים בצורה של תאי האנדותל. תמונות צולמו עם מטרת 20X.<html> &quot;Target =&quot; _ jove.com/files/ftp_upload/52924/52924fig2large.jpg blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52924/52924fig3.jpg" /> איור 3. מכתים בטא galactosidase הקשורים הזדקנות של תאי האנדותל. לאחר assay ההידבקות, תאים על coverslips היו נתונים לצביעה לבטאו galactosidase הקשורים הזדקנות שגורם lysosomes של תאים מזדקנים להכחיל, כפי שעולים בתא אנדותל ש הוא חייב באופן סלקטיבי על ידי מספר רב של מונוציטים, אשר מזוהים בקלות בשל גודלם הקטן וצורה כדורית. תמונה נראית דרך אובייקטיבי 20X. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52924/52924fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> 2,924 / 52924fig4.jpg &quot;/&gt; ספירת 4. איור של אשכולות מונוציטים על תאי האנדותל בודדים. לאחר assay ההידבקות, תמונות של התאים נלקחו מכמה עמדות שונות ואשכולות מונוציטים המזוהים והקיפה (בירוק). אשכול הוגדר כמסכת של 10 או יותר מונוציטים בתא האנדותל. מספר אשכולות מונוציטים ומספר 12 ימי תאי האנדותל לאחר מוקרן (המנוקד באדום) בתמונה נספר ואחוז תאי אנדותל חסיד מחושבים כפי שמוצג בטבלה 1. תמונה שצולמה באמצעות אובייקטיבי 10X. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52924/52924fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/52924/52924fig5.jpg" /> איור 5. כימות הקרינה של מונוציטים חסיד. adhe הבא<html> assay שיאון, תאים על coverslips זכוכית trypsinised והקרינה של מונוציטים שכותרתו מראש עם CellTracker הירוק נמדדה, באמצעות קורא צלחת הקרינה, כאינדיקציה עקיפה של הדביקות של monolayer האנדותל. תוצאות ממדידות כאלה בימים האמורים שלאחר הקרנה-התקבלו וקלוע בגרף לעיל. <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/52924/52924fig6.jpg" /> ייצוג איור 6. ציוני assay הידבקות מהטבלה 1. תאי האנדותל דבקים בחמישה מקומות שונים בשלושה coverslips זכוכית הובקעו כמתואר באיור 4 והתוצאות נספר מעל הוכחה כי 12 ימים לאחר 10 הקרנת Gy, 8 עד 10 אחוזים ממוקרנים תאי האנדותל הפכו דבק. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td>3 &quot;&gt; אחוז דבק תאי האנדותל </td></tr><tr><td></td><td> דיסק 1 </td><td> דיסק 2 </td><td> דיסק 3 </td></tr><tr><td> שדה 1 </td><td> 8.65 </td><td> 8.29 </td><td> 8.21 </td></tr><tr><td> שדה 2 </td><td> 10.44 </td><td> 7.27 </td><td> 7.21 </td></tr><tr><td> שדה 3 </td><td> 9.63 </td><td> 9.05 </td><td> 8.33 </td></tr><tr><td> שדה 4 </td><td> 11.11 </td><td> 7.09 </td><td> 8.41 </td></tr><tr><td> שדה 5 </td><td> 10.55 </td><td> 9.4 </td><td> 11.61 </td></tr><tr><td> ממוצע </td><td> 10.07 </td><td> 8.22 </td><td> 8.75 </td></tr></tbody></table> עשרות assay 1. הידבקות שולחן. תאי האנדותל דבקים בחמישה מקומות שונים בשלושה coverslips זכוכית הובקעו כמתואר בFigure 4 והתוצאות נספר מעל הוכחה כי 12 ימים לאחר 10 הקרנת Gy, 8 עד 10 אחוזים מתאי האנדותל המוקרנים הפכו דבק.

אנו מדווחים על שיטה במבחנה המאפשרת לכמת את המספר האמיתי של תאי דבק בתוך חד-שכבת תא אנדותל.

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This ...

המטרה הכללית של הליך זה היא לכמת את יכולת ההיצמדות של תאי אנדותל באופן in vitro. זאת על ידי הכנה ראשונית של כיסויי זכוכית מצופים בפיברונקטין בתוך פלטת 24 בארות. לאחר מכן, תאי אנדותל של עורק כלילי אנושי מוספים לכיסויי הזכוכית ומושאיים לדגירה עד להיווצרות שכבה אחת רציפה (confluent monolayer) של תאי אנדותל.לאחר מתן הטיפול הרצוי לתאי האנדותל, מתווספים מונוציטים המסומנים פלואורסצנטית לכיסויי הזכוכית (cover slips) ומודגרים יחד עם השכבה החד-שכבתית של תאי האנדותל. השלב הסופי הוא הסרת מונוציטים שאינם קשורים מהשכבה האנדותליאלית באמצעות הליך דקדקני של טבילה ושטיפה של כיסויי הזכוכית. בסופו של דבר, שיטה זו מאפשרת כימות של אחוז אוכלוסיית תאי האנדותל בעלת יכולת היצמדות לאחר טיפול מסוים.היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מודדת את המספר הממשי או את אחוז התאים האנדותליאליים הדביקים, בניגוד לדביקות הכללית של שכבה אנדותליאלית אחת (monolayer), כפי שנמדד בכל השיטות הנוכחיות. הרעיון לשיטה זו עלה כאשר ניסינו למדוד ADIs של תאים אנדותליאליים באמצעות השיטות הזמינות כיום, ונתקלנו בשונות גדולה ובלתי קבילה בתוצאות עקב אתגרים טכניים המובנים בשיטות אלו. עיקרו למסכי זכוכית עגולים בקוטר 12 מילימטר על ידי השריה ב-70% ethanol למשך 10 דקות לפחות, עם ערבוב מדי פעם כדי להבטיח חשיפה מלאה של כל מסכי הזכוכית לאתנול.לאחר מכן, העבירו את כל כיסויי הזכוכית והאתנול לכלי תרבית תאים סטרילי באמצעות זוג פינצטות 5B עדינות וסטריליות. העבירו כל כיסוי זכוכית בודד לבאר בלוח 24-בארים (24 well cluster plate). הקפידו לוודא שכיסויי הזכוכית אינם נוגעים בדפנות הבאר ונמצאים בקירוב במרכזה. השאירו את לוח ה-24-בארים עם כיסויי הזכוכית להתייבש בתוך קבִינט זרימה למינרית.תהליך זה אורך כ-10 דקות. כאשר כיסויי הזכוכית יבשים, אני מטפטף 100 µL של תמיסת ציפוי על כל כיסוי זכוכית, כך שהתמיסה תכסה רק את הזכוכית מבלי להיגלש לדפנות הבאר. מקבלים את פלטת ה-24 בארין המכוסה בתוך אינקובטור לתרביות תאים למשך שעה אחת לפחות.תרבתו תאי אנדותל מעורקי כלי דם כליליים אנושיים במצע בטמפרטורה של 37 °C ו-5% carbon dioxide. שאבו את מצע התרבית ושטפו את השכבה החד-שכבתיות של תאי האנדותל עם 10 milliliters של תמיסת מלחים מאוזנת של הנקס (Hank's balance salt solution) או HBSS. לאחר מכן, שאבו את ה-HBSS והוסיפו 2 milliliters של תמיסת 0.5% trips ב-0.2% EDTA, ודגרו בטמפרטורת החדר למשך כחמש דקות, עד שניתן יהיה לנתק את תאי האנדותל באמצעות הקשה לצד הבקבוק. הוסיפו 5 milliliters של מעכב טריפסין מסויה (soybean trypsin inhibitor) על פני השטח של הבקבוק. כדי לנתק את התאים באופן מלא יותר, העבירו את התאים למבחנה של 15 milliliters וסבבו את המבחנה בצנטריפוגה במהירות של 200 ×g למשך חמש דקות. שאבו את העליון (supinate) והשעיקו מחדש את משקע תאי האנדותל ב-5 milliliters של מצע.ספרו את התאים באמצעות המוציטומטר (hemo cytometer) והתאימו את ריכוז התאים ל-50,000 תאים אנדותליאליים למיליליטר מצע גידול. העבירו מיליליטר אחד של תלית התאים לכל באר בלוח 24 באערים המכיל כיסויי זכוכית מצופים. דגרו את התאים למשך לילה באינקובטור לתרביות תאים בטמפרטורה של 37 °C וב-5% carbon dioxide. התאים מוכנים לטיפול הרצוי.כאשר נוצרת שכבה חד-שכבתית (monolayer) סבבה תוך שלושה ימים, העבירו תאי HL 60 המגודלים ב-RPMI מועשר ב-10% fetal calf serum לשפופרת של 15 מיליליטר וסובבו את התאים בצנטריפוגה ב-200 ×g למשך חמש דקות. לאחר מכן, הסירו את העלייה (supernatant) ותלו את התאים מחדש ב-5 מיליליטר מדיה ללא סרום לצורך סימון פלואורסצנטי של תאי HL 60. ספרו והעבירו את כמות התאים המתאימה לשפופרת צנטריפוגה של 15 מיליליטר.סבב את התאים בצנטריפוגה במהירות של 200 ×g למשך חמש דקות. לאחר הסרת הנוזל העליון (supinate), השהה מחדש את משקע התאים ב-cell tracker במצע PMI ללא סרום. בריכוז של 1 מיליון תאים למילליטר, הדגר את התאים באינקובטור לתרביות תאים למשך שעה אחת. לאחר ההדגרה, סבב את התאים בצנטריפוגה במהירות של 200 ×g למשך חמש דקות והסר את הנוזל העליון.שעלו את תרחיף התאים במצע לריכוז של 2 מיליון תאים למילליליטר. הוסיפו מיליליטר אחד של תרחיף תאי HL 60 מסומנים ב-cell tracker לכל באר בפלטת cluster בעלת 24 בארות המכילה שכבה אחת (monolayer) של תאי אנדותל, והדגירו את הפלטה באינקובטור לתרביות תאים בטמפרטורה של 37 °C ו-5% carbon dioxide למשך פרק זמן קבוע שנבחר בין שעה לשלוש שעות. לאחר תקופת ההדגירה, השתמשו בזוג פינצטות דקיקות מסוג five B והרימו את כיסוי הזכוכית (cover slip) מהבאר, תוך תפיסת הקצה החיצוני בלבד של כיסוי הזכוכית; ייבשו את קצה הכיסוי.הניחו זכוכית כיסוי על פיסת נייר סופג על השולחן למשך שלוש שניות. תוך כדי זהירות לא לגעת במשטח המכוסה בתאים, החזיקו את זכוכית הכיסוי בחוזקה באמצעות פינצטה. טבלו את זכוכית הכיסוי בתוך ה-HBSS והוציאו אותה חמש פעמים; לאחר הטבילה החמישית.ספגו את קצה המכסה עם HBSS. החליקו את הרקמה למשך שלוש שניות. חזרו על הליאות וספיגות למשך שלושה סבבים של חמש טבילות בכל פעם, ולאחריהן ספיגה.לאחר מכן, העבירו את לביש הפס (cover slip) לתוך באר המכילה תמיסת קיבוע כדי לקבע את התאים בטמפרטורת החדר. לביש הפס מוכן לספירה, לאחסון לטווח ארוך, או להכתבה נוגדת עבור נוגדנים או פעילות beta-galactosidase הקשורה להזדקנות (senescence), כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. כדי לספור את התאי האנדותל הדבקים, הצמידו את לבישי הפס לשמורות מיקרוסקופ עם הכתבה נוגדת של DPI כדי לזהות תאים בודדים באמצעות מיקרוסקופ הפוך עם עדשה של 4x או 10x. רכשו תמונות של מספר שדות וספרו את המספר הגבוה ביותר של מונוציטים המצטברים על תאי אנדותל שלא קרינו.במידת הצורך, הגדירו את כמות זו כפליים כסף המינימום של מונוציטים על תא אנדותל כדי שייחשב כצבר (cluster). ניתן להשתמש בקריטריון שונה להגדרת צבר, בהתאם לאופי הניסוי. ספרו את מספר הצברים ואת מספר תאי האנדותל בשדה הראייה.חלק את הטופס בערך האחרון כדי לקבל את אחוז התאים האנדותליאליים הדבקים. ספור שדות רבים כדי לקבל ממוצע וסטיית תקן של הספירות. מונושכבות אנדותליאליות שבעה ימים לאחר הקרנה של קרני גמא, לפני הדגרה עם מונוציטים, נקשרו על ידי מונוציטים בצבדים סביב תאים אנדותליאליים בודדים.אף שתופעה זו ניתנת לצפייה בקלות תחת מיקרוסקופיה בניגודיות פאזה (phase contrast), מיקרוסקופיה פלואורסצנטית חושפת תמונה ברורה אף יותר של צבירי המונוציטים. לאחר ביצוע בדיקת ה-ADI המתוארת, ניתן להמשיך לצביעת התאים עבור חלבונים ממברנתיים, ציטופלזמיים או גרעיניים באמצעות נוגדנים מתאימים. בשימוש בשיטות אימונופלואורסצנציה סטנדרטיות, יש להיזהר בשלבי השטיפה, שכן כוח מופעל יתר עלול לעקור את המונוציטים.בנוסף, ניתן לבצע בדיקות המבוססות על אנזימים, כגון בדיקת senescence associated beta-galactosidase. בדיקה זו גורמת לליזוזומים של תאים מזוקנים להפוך לכחולים, כפי שניכר בתא אנדותליאלי שנקשר באופן סלקטיבי למספר רב של מונוציטים, המזוהים בשל גודלם הקטן וצורתם הכדורית. מכיוון שכל צבר מונוציטים תואם לתא אנדותליאלי בודד, ספירת הצברים חושפת את המספר הממשי של תאים אנדותליאליים דבקים בתוך השכבה החד-שכבתיות (monolayer), ומכך את אחוז התאים האנדותליאליים הדבקים בתוך האוכלוסייה.זוהי השיטה היחידה עד היום המאפשרת כימות של דביקות תאי אנדותל במידת הצורך. מונוציטים שנצמדו לשכבות מונו-תאיים של אנדותל ניתן להסיר באמצעות תמיסת trypsin EDTA, ואת הפלואורסצנציה ניתן למדוד באמצעות קורא פלטות, כפי שנעשה בשיטות עכשוויות. לאחר שליטה בטכניקה, ניתן להשלים אותה בארבע שעות עם זמן עבודה מעשי מועט מאוד. חשוב לזכור כי את כל שלבי השטיפה והטבילה יש לבצע באופן זהה ובמספר חזרות שווה בין כל הדגימות בעקבות הליך זה.ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון אימונופלורסצנציה ובדיקות בטא-גלקטוסידאז הקשורות להזדקנות תאית (senescence associated beta galacto), כדי לענות על שאלות מחקריות כגון מהם המאפיינים של תאים אנדותליאליים בעלי כושר היצמדות בהשוואה לאלו שאינם בעלי כושר היצמדות.

quantitation-of-endothelial-cell-adhesiveness-in-vitro

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

פרוטוקול זה הוא פשוט assay הידבקות חיידקים המורכב לספור את המספרים של המושבה חיידקי הקמת יחידות כי הם דבקו על תאים בתרבית. Assay היא חזקה, עצמאית של adhesin למד, וכן וריאציות רבות משמשים ברוב המעבדות עובדים על הפתוגנזה חיידקי.

ב Assay חוץ גופית של הידבקות חיידקים על תאים אפיתל היונקים

תדירות הדבקה assay למדידת קולטן ליגנד קינטיקה אינטראקציה כאשר הן מולקולות מעוגנים על פני השטח של התאים אינטראקציה מתוארת. Assay זה מכני מבוסס מודגמת באמצעות micropipette-בלחץ דם אנושי תא אדום כמו חיישן הידבקות integrin αLβ2 ו מולקולה-1 הדבקה אינטר כמו אינטראקציה קולטנים ligands.

תדירות הדבקה Assay עבור באתרו קינטיקס ניתוח חוצה Junctional אינטראקציות מולקולריות על ממשק Cell-Cell

בסרטון זה אנו מדגימים בדיקה המשתמשת במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לזהות הידבקות של תאים סרטניים למלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים (NET). בבארות הבדיקה ניכרת עלייה ניכרת במספר התאים הסרטניים המסומנים באופן פלואורסצנטי הנצמדים ל-NETs, בעוד שבבארות שטופלו ב-DNase נרשמה היצמדות מופחתת של תאים סרטניים ל-NETs.

בדיקת הידבקות חוץ גופית לאיתור היצמדות של תאים סרטניים למלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים

דבקות נויטרופילים לאנדותל מופעל באתרים של זיהום היא מרכיב בלתי נפרד של התגובה הדלקתית של המארח. שתואר בדוח זה הוא assay מחייב נויטרופילים...

כמותי<em&gt; במבחנה</em&gt; Assay כדי למדוד הידבקות נויטרופילים לתאים מופעלים עיקריים אדם אנדותל כלי הדם בתנאים סטטיים

גיוס יקוציט אל הכבד מתרחש בתוך הערוצים מיוחדים של sinusoids הכבד שקירותיו מכוסים על ידי תאי אנדותל סינוסי כבד ייחודיים. מיקרוסקופ לעומת השלב של גיוס יקוציט פני האנדותל סינוסי בכבד אדם בתנאים של לחץ גזירה פיסיולוגי יכול להקל על הבהרת המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס תהליך זה.

תזרים הידבקות Assay ללמוד יקוציט גיוס לבדית אדם סינוסי תנאי האנדותל של מתח שאר

שיטה של ​​quantitating הידבקות נויטרופילים היא מדווחת. שיטה זו יוצרת זרימת סביבה דינמית דומה לזו שנתקלה בה בכלי דם. זה מאפשר החקירה של הידבקות נויטרופילים לשתי מולקולות מטוהרים הידבקות (ליגנד) או מצע תא אנדותל (HUVEC) בהקשר דומה לסביבת in vivo עם לחץ העצום.

אדם נויטרופילים תזרים לשכת הידבקות Assay

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לכמת ברציפות תהליכי הידבקות התא ודה-הידבקות עם רזולוציה גבוהה זמנית באופן בלתי פולשני על ידי עכבת תא-מצע והדמיה תא חי ניתוחים. גישות אלה חושפות את הדינמיקה של תהליכי הדבקת תא / דה-הידבקות מופעלים על ידי שינוי מטריצה ​​והיחסים הזמני שלהם לאירועי איתות הידבקות תלויה.

שימוש בעכבת Cell-מצע והדמיה של תא חי כדי למדוד שינויים בזמן אמת בסלולרית הידבקות ודה-הידבקות הנגרמים על ידי מטריקס שינוי

assay הידבקות זרימה זו מספק מודל השפעה פשוט, גבוה של אינטראקציות תא אפיתל T. משאבת מזרק משמש להפקת מאמץ הגזירה, וכן במיקרוסקופ confocal לוכדת תמונות כימות. מטרת המחקרים אלה היא לכמת הידבקות תא T ביעילות באמצעות תנאי זרימה.

Assay הדבקה תחת מאמץ גזירה לחקר T לימפוציטים-הדבקה אינטראקציות מולקולה

אנדותל כלי הדם שולט בחוזקה ליקוציט גיוס. ליקוציט לקוי extravasation תורם למחלות דלקתיות. לכן, בחיפוש אחר הרומן יסודות ההפעלה אנדותל תקינה יש צורך לעצב משופרת טיפולים עבור הפרעות דלקתיות. כאן, אנו מתארים מתודולוגיה מקיפה לאפיון הרומן הרגולטורים אנדותל היכולות לשנות ליקוציט סחר בעת דלקת.

הקרנת מבחני לאפיין הרגולטורים אנדותל הרומן מעורבים בתגובה דלקתית

אדהזיה דינמי של תאים חיסוניים לקיר כלי הוא תנאי הכרחי בטן יונת. כאן, אנו מציגים את פרוטוקול עבור assay פונקציונלי במבחנה לניתוח ההשפעה של נוגדנים אנטי-אינטגרין, נוגדנים או גורמים אחרים על הדבקה תא דינמי של תאים אנושיים באמצעות addressin מצופים נימים.

אדהזיה דינמי Assay לניתוח פונקציונלי של טיפולים למניעת הידבקות במחלות מעי דלקתיות

במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול, שיטת תרבית תאי אנדותל מורחבת (EECM), המאפשרת התמיינות של תאי גזע פלוריפוטנטיים לתאים דמויי תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים במוח (BMEC). תאים אלה מראים ביטוי של מולקולות היצמדות תאי אנדותל ולכן הם מודל מחסום דם-מוח אנושי המתאים לחקר אינטראקציות תאי מערכת החיסון במבחנה.

התמיינות של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם לתאים דמויי תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים במוח עם פנוטיפ חיסוני בוגר

למדו שיטה לכימות דביקות תאי אנדותל במבחנה באמצעות כיסוי פיברונקטין ומונוציטים מסומנים בפלואורסצנציה. טכניקה זו מספקת מדידה מדויקת של אחוז התאים הדביקים לאחר טיפולים שונים.

כימות של דביקות תא האנדותל

גלה סרטונים נוספים