Readout גורף פשוט של דיגיטלי מבחני כימות חומצות גרעין

המטרה הכללית של הליך זה היא לפשט את קריאת תוצאות בדיקות טיפות דיגיטליות (digital droplet assays) באמצעות מכשיר PCR בזמן אמת סטנדרטי, למדידת הפלואורסצנציה הכוללת של הבדיקה. דבר זה מושג תחילה על ידי הכנת תגובות הגברה של הדגימות הרלוונטיות ושני סטנדרטים, ויצירת טיפות כדי לחלק כל אחת מהן לאלפי ריאקטורים בגודל ננוליטר. השלב השני הוא דגירה של הטיפות כדי להגביר את חומצות הגרעין בתוך כל טיפה.

בשלב הבא, נמדד הפלואורסצנציה הכוללת (bulk fluorescence) של כל דגימה או סטנדרט באמצעות QPC סטנדרטי או תרמוסייקלר. השלב האחרון הוא חיזוי חלקן של טיפות הפלואורסצנטיות בדגימות הנבדקות, תוך שימוש בעקום סטנדרטי שהופק מהדגימות הסטנדרטיות. כדי לאמת את ביצועי שיטה זו, ניתן להשתמש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית להערכה עצמאית של ביצועי הכימות של בדיקת הפלואורסצנציה הכוללת.

היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון ספירת טיפות, הוא שאינה דורשת ציוד ייעודי. לפני תחילת בדיקה זו, נדרשים כל הריאגנטים הדרושים כפי שמתואר בטקסט של הפרוטוקול, וכן שני סטנדרטים: ראשון, בקרת חסר תבנית (no template control), כגון מים נטולי נוקלאז, ושני, ריכוז תבנית גבוה, כגון lambda DNA. יש לדנטור את 3.3 µL מכל סטנדרט עם 3.3 µL של באפר דנטורציה בתוך מבחנת qPCR.

דגרו את הדגימה בטמפרטורת החדר למשך שלוש דקות. בצעו השבתה (Quench) לכל דגימה באמצעות 3.3 µL של בופר נטרול. באופן דומה, דנטורו 3.3 µL של התבנית המבוקשת באמצעות 3.3 µL של בופר דנטורציה בדגירה בטמפרטורת החדר למשך שלוש דקות.

בצע השבתה (Quench) באמצעות 3.3 µL של בופר ניטרול. הכן 11 µL של תערובת מאסטר (master mixture) לכל דגימה כדי להפחית תוצאות חיוביות שגויות. חשוף את תערובת המאסטר לאור UV לפני יצירת הטיפות.

ראשית, הכין 10 µL של תערובת premix לכל דגימה בתוך מבחנה שקופה של 0.5 mL או 1.5 mL על קרח. תערובת ה-premix מורכבת מ-randomized oligo, B-S-A-D-N-A polymerase reaction buffer, dn, NTPs ומים נקיים מנוקלאז. הנח את המבחנה במים על קרח וחשף אותה לאור UV לאחר החשיפה ל-UV.

הוסף צבע קישור ל-dsDNA ותזונה רפרנסית לתערובת הפרה-מיקס. הוסף את ה-PHI 29 DNA polymerase אחרון כדי להבטיח שהפולימראז לא ייחשף לרמות pH גבוהות או נמוכות באופן משמעותי מ-7.5. ערבב היטב, שלב 10 µL של תבנית דנטורית או סטנדרט ו-10 µL של תערובת המאסטר, וערבב היטב.

מאחר שטיפות יכולות להיות רגישות מאוד לחשמל סטטי ולמאמצי גזירה, על הנסיין להסיר בגדים שעלולים לגרום לחשמל סטטי ולהבטיח הארקה של עצמו לפני יצירת הטיפות. ההתקן המיקרופלואידי ששימש להדגמה זו יוצר במעבדה וכולל כניסת שמן ושתי כניסות מימיות עם צומת מיקוד זרימה (flow focusing junction) ליצירת טיפות. השתמשו בשתי משאבות מזרק כדי לשלוט בקצבי הזרימה של 55 µL שמן עם חומר פעיל שטח ו-20 µL תערובת תגובה דרך השבב המיקרופלואידי.

כדי להפיק טיפות בנפח של 20,001 nanoliter, אחד השלבים המורכבים ביותר הוא איסוף הטיפות מבלי להפריע לאמולסיה. חשוב להעביר את הנוזל בפיפט באיטיות, ורצוי להשתמש בטיפ רחב.

אספו את כל הטיפות למבחנות PCR עבור כל דגימה. העבירו aliquot של 30 µL שמן למבחנות PCR חדשות עם מכסים אופטיים באמצעות טיפ רחב (wide bore tip) ופיפטור איטי מאוד. העבירו 20 µL של טיפות מעל השמן.

נפחים עקביים מבטיחים שהבדיקה תהיה מדויקת ככל האפשר. סגרו את מכסי המבחנות היטב, שכן מכסים רפויים יאפשרו לשמן להתאדות. החזיקו את מבחנות האמולסיה בחלק העליון של המבחנה, רחוק ככל האפשר מהאמולסיה. ניתן להשתמש במכשיר PCR thermocycler, במכשיר A-Q-P-C-R thermocycler או בפלטה מחממת (hot plate) לצורך הגברה איזותרמית.

בהדגמה זו נעשה שימוש במכשיר thermocycler מדגם A-Q-P-C-R. דגרו את הדגימות למשך שבע שעות בטמפרטורה של 30 °C ובצעו אינאקטיבציה למשך דקה אחת בטמפרטורה של 75 °C. פעולה זו תתבצע מיד לאחר התגובה וההפעלה.

מדדו את רמות הפלואורסצנציה עבור כל הדגימות באמצעות ה-QPCR thermocycler. עבור כל דגימה, חלקו את עוצמת הפלואורסצנציה של צבע ה-dsDNA binding dye בעוצמת הפלואורסצנציה של צבע הייחוס.

חסרו את פלואורסצנציית הרקע או את הפלואורסצנציה הנורמלית של בקרת ה-no template מכל הדגימות. צרו עקומת סטנדרט ליניארית באמצעות מדידות הפלואורסצנציה המתוקנות של הסטנדרטים. סטנדרט בקרת ה-no template מייצג את הפלואורסצנציה עבור דגימה עם 0% טיפות פלואורסצנטיות והריכוז הגבוה של התבנית.

מדידת פלואורסצנציה היא הפלואורסצנציה הצפויה עבור דגימה עם 100% טיפות פלואורסצנטיות תוך שימוש בעקום הסטנדרטי המתאים. חזה את היחסים הביניים של טיפות חיוביות ושליליות על סמך הפלואורסצנציה הכוללת שלהן. שיטה זו משתמשת במכשיר real-time PCR קונבנציונלי למדידת פלואורסצנציה כוללת של בדיקות דיגיטליות מבוססות טיפות.

טיפות פלואורסצנטיות וטיפות שאינן פלואורסצנטיות עורבבו מראש ביחסים שונים, ונערכה השוואה בין הפלואורסצנציה הכוללת (bulk fluorescence) לבין חלקן של הטיפות החיוביות. כצפוי, הפלואורסצנציה הכוללת ומספר הטיפות החיוביות עולים באופן ליניארי עם חלקן של הטיפות הפלואורסצנטיות שהוכנסו. היחסים החזויים על בסיס התקנים הושוו לחלקי הפלואורסצנציה הצפויים שהוכנסו.

הקו מציין את הערך הצפוי בהינתן קשר ליניארי. התוצאות מראות ביצועים טובים בכימות יחס טיפות על פני שני סדרי גודל של טווח דינמי. כדי לבחון שיטה זו במערך כמותי ממשי של הגברה של הגנום השלם, רמות פלואורסצנציה וחלקים של טיפות חיוביות של טיפה דיגיטלית.

נמדדה בדיקת MDA עם ריכוזים עולים של תבנית Lambda DNA. הקו מציין את חלק הפלואורסצנציה הצפוי תוך שימוש בהתפלגות פואסון למידול נתוני הניסוי. מוצגות תמונות פלואורסצנציה מייצגות של הטיפות; הן הפלואורסצנציה הכוללת (bulk) והן חלק הטיפות החיוביות מדגימות MDA דיגיטלי שמשתנים כמצופה בהתאם לממוצע התבניות לטיפה, מה שמעיד על כך שהקריאה הכוללת יכולה לשקף נאמנה את תוצאות של בדיקה דיגיטלית.

שיטה זו עשויה להועיל לבדיקות דיגיטליות אחרות, כגון digital PCR, על ידי הגברת המהירות, ביצוע במקביל ופישוט של קריאת תוצאות הבדיקה.