Name: Readout גורף פשוט של דיגיטלי מבחני כימות חומצות גרעין (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 55 s
Description: למד שיטה פשוטה לכימות חומצות גרעין באמצעות מכשיר qPCR סטנדרטי ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית. השיטה מייצרת טיפות ננו-ליטריות ומודדת פלואורסצנציה גורפת לקבלת תוצאות מדויקות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים ל-Liyi Xu על אספקת ריאגנטים ופרוטוקולים של MDA. אנו מודים גם לדיוויד פלדמן ול-Navpreet Ranu על הדיונים הקשורים לעבודה זו. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי פרס הקריירה של Burroughs Wellcome בממשק המדעי ל-PCB.

<ol><li>Sykes, P. J., Neoh, S. H., Brisco, M. J., Hughes, E., Condon, J., Morley, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+targets+for+PCR+by+use+of+limiting+dilution%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Quantitation of targets for PCR by use of limiting dilution.</a> Biotechniques. 13 (3), 444-449 (1992).</li>
<li>Kalinina, O., Lebedeva, I., Brown, J., Silver, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoliter+scale+PCR+with+TaqMan+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Nanoliter scale PCR with TaqMan detection.</a> Nucleic Acids Res. 25 (10), 1999-2004 (1997).</li>
<li>Vogelstein, B., Kinzler, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A.%22%5BJournal%5D)">Digital PCR.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.. 96 (16), 9236-9241 (1999).</li>
<li>Day, E., Dear, P. H., McCaughan, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+PCR+strategies+in+the+development+and+analysis+of+molecular+biomarkers+for+personalized+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Digital PCR strategies in the development and analysis of molecular biomarkers for personalized medicine.</a> Methods. 59 (1), 101-107 (2013).</li>
<li>Tatusova, T., Ciufo, S., Fedorov, B., O'Neill, K., Tolstoy, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RefSeq+microbial+genomes+database%3A+new+representation+and+annotation+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">RefSeq microbial genomes database: new representation and annotation strategy.</a> Nucleic Acids Res. 42 (Database issue), D553-D559 (2014).</li>
<li>Blainey, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+future+is+now%3A+single-cell+genomics+of+bacteria+and+archaea%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">The future is now: single-cell genomics of bacteria and archaea.</a> FEMS Microbiol. Rev. 37 (3), 407-427 (2013).</li>
<li>Blainey, P. C., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+MDA+for+enumeration+of+total+nucleic+acid+contamination%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Digital MDA for enumeration of total nucleic acid contamination.</a> Nucleic Acids Res. 39 (4), e19(2011).</li>
<li>Blainey, P. C., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+genomic+diversity%2C+one+cell+at+a+time%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Dissecting genomic diversity, one cell at a time.</a> Nat. Methods. 11 (1), 19-21 (2014).</li>
<li>Binga, E. K., Lasken, R. S., Neufeld, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Something+from+%28almost%29+nothing%3A+the+impact+of+multiple+displacement+amplification+on+microbial+ecology%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Something from (almost) nothing: the impact of multiple displacement amplification on microbial ecology.</a> ISME J. 2 (3), 233-241 (2008).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+of+the+Year+2013%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Method of the Year 2013.</a> Nature Methods. 11 (1), 1(2014).</li>
<li>Ottesen, E. A., Hong, J. W., Quake, S. R., Leadbetter, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+digital+PCR+enables+multigene+analysis+of+individual+environmental+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Microfluidic digital PCR enables multigene analysis of individual environmental bacteria.</a> Science. 314 (5804), 1464-1467 (2006).</li>
<li>OpenArray Technology Overview. , Life Technologies. <a target="_blank" href="http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/pcr/real-time-pcr/real-time-openarray/open-array-technology.html">http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/pcr/real-time-pcr/real-time-openarray/open-array-technology.html</a> (2014).</li>
<li>Shen, F., Du, W., Kreutz, J. E., Fok, A., Ismagilov, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+PCR+on+a+SlipChip.%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Digital PCR on a SlipChip.</a> Lab Chip. 10 (20), 2666-2672 (2010).</li>
<li>Heyries, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Megapixel+digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Megapixel digital PCR.</a> Nat. Methods. 8 (8), 649-651 (2011).</li>
<li>Dressman, D., Yan, H., Traverso, G., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transforming+single+DNA+molecules+into+fluorescent+magnetic+particles+for+detection+and+enumeration+of+genetic+variations%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Transforming single DNA molecules into fluorescent magnetic particles for detection and enumeration of genetic variations.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (15), 8817-8822 (2003).</li>
<li>Kiss, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+quantitative+polymerase+chain+reaction+in+picoliter+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">High-throughput quantitative polymerase chain reaction in picoliter droplets.</a> Anal. Chem. 80 (23), 8975-8981 (2008).</li>
<li>Baker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+PCR+hits+its+stride%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Digital PCR hits its stride.</a> Nat. Methods. 9 (6), 3(2012).</li>
<li>Marcus, J. S., Anderson, W. F., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+picoliter+rt-PCR+assays+using+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Parallel picoliter rt-PCR assays using microfluidics.</a> Anal. Chem. 78 (3), 956-958 (2006).</li>
<li>Lee, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronized+reinjection+and+coalescence+of+droplets+in+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Synchronized reinjection and coalescence of droplets in microfluidics.</a> Lab Chip. 14 (3), 509-513 (2014).</li>
<li>Rhee, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pressure+stabilizer+for+reproducible+picoinjection+in+droplet+microfluidic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Pressure stabilizer for reproducible picoinjection in droplet microfluidic systems.</a> Lab Chip. 14 (23), 4533-4539 (2014).</li>
<li>Hatch, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((1-Million+droplet+array+with+wide-field+fluorescence+imaging+for+digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">1-Million droplet array with wide-field fluorescence imaging for digital PCR.</a> Lab Chip. 11 (22), 3838-3845 (2011).</li>
<li>Illumina. , Technology. <a target="_blank" href="http://www.illumina.com/technology.html">http://www.illumina.com/technology.html</a> (2014).</li>
<li>Droplet digital PCR applications guide. , Bio-Rad. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.bio-rad.com/en-us/category/digital-pcr">http://www.bio-rad.com/en-us/category/digital-pcr</a> (2014).</li>
<li>Hindson, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+droplet+digital+PCR+system+for+absolute+quantitation+of+DNA+copy+number%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number.</a> Anal. Chem. 83 (22), 8604-8610 (2011).</li>
<li>Guo, M. T., Rotem, A., Heyman, J. A., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+microfluidics+for+high-throughput+biological+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Droplet microfluidics for high-throughput biological assays.</a> Lab Chip. 12 (12), 2146-2155 (2012).</li>
<li>Lage, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+genome+analysis+of+genetic+alterations+in+small+DNA+samples+using+hyperbranched+strand+displacement+amplification+and+array-CGH%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Whole genome analysis of genetic alterations in small DNA samples using hyperbranched strand displacement amplification and array-CGH.</a> Genome Res. 13 (2), 294-307 (2003).</li>
<li>Dean, F. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+human+genome+amplification+using+multiple+displacement+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Comprehensive human genome amplification using multiple displacement amplification.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (8), 5261-5266 (2002).</li>
<li>Zong, C., Lu, S., Chapman, A. R., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+detection+of+single-nucleotide+and+copy-number+variations+of+a+single+human+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide detection of single-nucleotide and copy-number variations of a single human cell.</a> Science. 338 (6114), 1622-1626 (2012).</li>
<li>Mitos Dropix Systems. , Dolomite. <a target="_blank" href="http://www.dolomite-microfluidics.com/webshop/mitos_dropix_system">http://www.dolomite-microfluidics.com/webshop/mitos_dropix_system</a> (2014).</li>
<li>Abate, A. R., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syringe-vacuum+microfluidics%3A+A+portable+technique+to+create+monodisperse+emulsions%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Syringe-vacuum microfluidics: A portable technique to create monodisperse emulsions.</a> Biomicrofluidics. 5, 14107(2011).</li>
<li>Eyer, K., Kuhn, P., Stratz, S., Dittrich, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+chip+for+the+versatile+chemical+analysis+of+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A microfluidic chip for the versatile chemical analysis of single cells.</a> J Vis Exp. (80), e50618(2013).</li>
<li>Fainman, Y. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFainman%2C+Y+%22Optofluidics+%3A+fundamentals%2C+devices%2C+and+applications%22">Optofluidics : fundamentals, devices, and applications</a>. , McGraw-Hill. (2010).</li>
<li>Xia, Y. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G.M.+Softlithographie%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem%22%5BJournal%5D)">G.M. Softlithographie.</a> Angew Chem. 110 (5), 26(1998).</li>
<li>Woyke, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decontamination+of+MDA+reagents+for+single+cell+whole+genome+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Decontamination of MDA reagents for single cell whole genome amplification.</a> PLoS One. 6 (10), e26161(2011).</li>
<li>System for hot-start amplification via a multiple emulsion. US patent. , (2014).</li>
<li>Utada, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monodisperse+double+emulsions+generated+from+a+microcapillary+device%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Monodisperse double emulsions generated from a microcapillary device.</a> Science. 308 (5721), 537-541 (2005).</li>
<li>Eastburn, D. J., Sciambi, A., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Picoinjection+enables+digital+detection+of+RNA+with+droplet+rt-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Picoinjection enables digital detection of RNA with droplet rt-PCR.</a> PLoS One. 8 (4), e62961(2013).</li>
<li>Dube, S., Qin, J., Ramakrishnan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mathematical+analysis+of+copy+number+variation+in+a+DNA+sample+using+digital+PCR+on+a+nanofluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mathematical analysis of copy number variation in a DNA sample using digital PCR on a nanofluidic device.</a> PLoS One. 3 (8), e2876(2008).</li>
<li>Shen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+quantification+of+nucleic+acids+with+large+dynamic+range+using+multivolume+digital+RT-PCR+on+a+rotational+SlipChip+tested+with+HIV+and+hepatitis+C+viral+load%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Multiplexed quantification of nucleic acids with large dynamic range using multivolume digital RT-PCR on a rotational SlipChip tested with HIV and hepatitis C viral load.</a> J Am. Chem. Soc. 133 (44), 17705-17712 (2011).</li>
<li>Link, D. R., Anna, S. L., Weitz, D. A., Stone, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geometrically+mediated+breakup+of+drops+in+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Geometrically mediated breakup of drops in microfluidic devices.</a> Phys. Rev. Lett. 92 (5), 054503(2004).</li>
<li>Nisisako, T., Torii, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+large-scale+integration+on+a+chip+for+mass+production+of+monodisperse+droplets+and+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic large-scale integration on a chip for mass production of monodisperse droplets and particles.</a> Lab Chip. 8 (2), 287-293 (2008).</li>
<li>Romanowsky, M. B., Abate, A. R., Rotem, A., Holtze, C., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+production+of+single+core+double+emulsions+in+a+parallelized+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">High throughput production of single core double emulsions in a parallelized microfluidic device.</a> Lab Chip. 12 (4), 802-807 (2012).</li>
</ol>

מכון ברוד רשאי להגיש בקשת פטנט הכוללת היבטים של עבודה זו.

מבחני דיגיטליים הם שיטות חזקות המאפשרות זיהוי של תאים נדירים וספירה של פרט של מולקולות חומצות גרעין. עם זאת, מבחני דיגיטליים עדיין לא מיושמים באופן שיגרתי במעבדות אנליטיות, נובעים בחלקו את העלות של ציוד מיוחד הקשורים לשיטות זמינות מסחרי. כאן אנו מתארים assay דיגיטלי נקודות קצה לכימות חומצות גרעין עם קריאת נתונים אנלוגיים פשוטה באמצעות מכונה PCR כמו סטנדרטית בזמן אמת. שיטה זו היא מהירה להגדרה, וקריאת נתונים היא הרבה יותר פשוט מאשר שיטות ספירת טיפה. <p class="jove_content" style...

מבחני דיגיטליים לכימות חומצות גרעין (PCR הדיגיטלי) 1-4 ובסיס הזמנה (רצף) הם מאוד משפיעים על מדעי החיים ורפואה. מבחני דיגיטליים מספקים כימות של ספירה מולקולרית בקנה מידה מוחלט (לא ביחס לשליטה), מתן רגישות גבוהה, המאפשרת השוואות שטחיות על פני ניסויים, ומכריע, המאפשר הבנייה של מסדי נתונים גדולים המכילים נתונים דומים 5 (טבלה 1). במהלך 15 השנים האחרונות, ההגברה הגנום כולו (WGA) יצאה לצד PCR ככלי כללי להגברת חומצות גרעין. כמו PCR, WGA היא שימושית עבור יישומים אנליטיים וpreparative על ידי הגברת אלמנטי מדגם דקות עד לרמה שניתן לאתר או המשמש לניתוחים שלאחר מכן כמו רצף בסיס בקלות. שלא כמו ה- PCR, WGA היא לא ספציפית למוקד ה- DNA מסוים, ולא מאפשרת הגברה של כל הרצפים במדגם, כוללים רצפים ידועים.הבדל מהותי זה בין PCR וWGA הופך את השיטות משלימות זו לזו ויוצר אתגרים שונים ביישומם. התשואה הגבוהה של תגובות WGA 6 מאפשרת הגברה שגרתית של הדנ&quot;א הגנומי ממולקולות בודדות 7, 8 תאים בודדים ודגימות נמוכות ביומסה אחרות 9 לכימות או ניתוח נוסף. האתגרים המרכזיים הקשורים לכימית WGA הם רגישותו הקיצונית למזהמים וההגברה אחידה על פני מולקולות תבנית בודדות 6. פופולריות עם זאת, WGA צובר כרצף תא בודד התפתחה כ&quot; יישום הרוצח &quot;של WGA טכנולוגיה 10, וכימות תבנית על ידי WGA הוא חשוב בתחומים רבים של יישום 7. מכשור לכימות חומצות גרעין דיגיטלית תואר בעבר במגוון Valved ופורם microfluidic valvelessTS 11-14, כולל מבחני מבוססי אגל 15,16 (טבלה 2). עם זאת, מערכות מייקרו-נוזליות מסחריות לניתוח דיגיטלי דורשות ציוד מיוחד להתקנת תגובה וזיהוי מוצר 17. מיקרופלואידיקה מותאמת אישית valved גמישה, אך דורשת microfabrication דיוק ומערכות בקרה פנאומטי 18. אמנם זה יחסית פשוט לעשות מיקרו-טיפות monodisperse למבחנים דיגיטליים מבוסס תחליב 19,20, צג דיגיטלי הוא מבחינה טכנית מעיק, הדורש גם הדמיה רחב בתחום בקנה מידה גדולה (בדומה לטכנולוגיות רצף של הדור הבא פופולריות) 21,22 או במהירות גבוהה זרימה מבוססת זיהוי אגל 23-25. באופן אידיאלי, assay דיגיטלי יהיה פשוט מהגדרה לreadout, הקטנת צורך המכשור מורכב ומאפשר למספר גדול של דגימות כדי לקרוא במהירות. כאן אנו מתארים שיטה פשוטה לקריאת נתונים של מבחני אגל דיגיטליים המשתמשת בזמן אמת קונבנציונלי PCR אניnstrument למדוד הקרינה בתפזורת של מבחני דיגיטליים מבוסס טיפה. בעוד הגישה החדשה ניתן ליישם מבחני PCR דיגיטליים, זה יתרון במיוחד עבור מבחני WGA דיגיטליים לאנלוגיים שמבחני הגברה בזמן אמת (שנותנים תוצאות מצוינות לPCR) הם בעייתיים. WGA מיושם בדרך כלל לדגימות עם מולקולות תבנית שהטרוגנית ברצף, אורך, ותוכן בסיס. מולקולות תבנית שונות אלה מוגברים בשיעורים שונים 6, המחייבות את השימוש בהתייחסות (&quot;סטנדרטי&quot;) מדגם עם מאפייני התאמה. לעתים קרובות, לא סטנדרטי כגון זמין, או המאפיינים של הדגימות הנכנסות אינם ידועים. ההטרוגניות של חומר ההזנה ורכוש אורך תלוי של chemistries WGA 26 גם לסבך את הפרשנות של תוצאות על ידי יצירת עמימות במה שלכמת - מסת הקלט, קלט מספר המולקולות, שילוב של השניים, או לא. Finally, רצף שאינו ספציפי הופך הגברה עקירה מרובה כמותית (מד&quot;א) רגישה יותר לזיהום מאשר PCR כמו מאז מולקולות מזהמים של כל רצף יש פוטנציאל להפריע. מבחני דיגיטליים microfluidic לטפל זיהום על ידי הפרדת מולקולות תבנית וצמצום נפחי תגובה כזאת שפחות מזהם נדגמים. כאן אנו משתמשים בשיטה פופולרית בידוד תרמי WGA, 27 מד&quot;א. ראוי לציין, כמה chemistries WGA אחר כולל PicoPlex וMALBAC 28 תלוי באופן מכריע על צעדי עקירת גדיל בידוד תרמי ראשוניים. צעדי Isothermal להחמיר את האתגר של יישום מבחני אנלוגיים בזמן אמת לWGA כמותיים. WGA אינו יכול למנוע לחלוטין במהלך התקנה, שמוביל להגברה מראש משתנה לא רצויה, ולא discretized (&quot;רכב על אופניו&quot;) באופן שבו שכפול של מולקולות הטרוגנית יכול להיות מונע להשלמה ועצר לפני המחזור הבא כמו 11 PCR </sup&gt; (איור 1). פורמט assay דיגיטלי לWGA מסתגל נהלי התקנת תגובה אופייניים בשל ההפרדה של כל מולקולה לספירה בנקודת סיום assay (כך מראש הגברה אינה משפיעה על התוצאות) פירוש קריאת נתונים מקוריים דיוק יהיה בלתי תלוי בעיקר שינוי ביעילות הגברה. Assay תלוי בטיפי שמן שהופקו בעם כמויות אחידות, כאות לרמת טיפה בנקודת סיום assay תהיה תלוי בטיפת הנפח, ואנחנו לא רוצים את העקביות של תוצאות תלויות בממוצע על פני חלוקת גדלי אגל. מה שהופך את טיפות monodisperse הוא כעת הליך סטנדרטי (כ -3,500 מסמכי אגל monodisperse פורסמו מאז 2013), אבל דורש מכשור microfluidic 25. למעשה, יותר משש חברות פיתחו מוצרים מסחריים עצמאיים המסתמכים על ייצור של טיפות כגון, ושבבי מייקרו-נוזליים קבלת אגל הםזמינים מסחרי 23,29. במחקר זה, השתמשנו מכשירי microfluidic מותאם אישית מיוצרים בבית (ראה פרוטוקול). מזרק משאבות לנהוג זרימה דרך המכשירים זמינים גם באופן מסחרי, אך לחלופין, ניתן להחליף עם מזרק חד פעמי יחיד לזרימה מונע ואקום כדי להפחית את העלויות 30.

<table><tbody><tr><td>Evagreen Dye</td><td>Biotium</td><td>31000</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין סרום בקר</td><td>ניו אינגלנד ביוטכנולוגיות</td><td>B9000S</td><td></td></tr><tr><td>Phi29 DNA פולימראז מאגר תגובה</td> ניו <td>אינגלנד ביוטכנולוגיות</td><td>B0269S</td><td>מערבולת מעת לעת עד שהאגרגט מתמוסס</td></tr><tr><td>Lambda DNA</td><td>ניו אינגלנד ביוטכנולוגיות</td><td>N3011S</td><td>מחומם ל-50 oC ומרווה קרח לפני דילול</td></tr><tr><td>אוליגוס MDA אקראי</td><td>טכנולוגיות DNA משולבות</td><td></td><td>5'-NNNNN*N-3'PCR</td></tr> <tr><td>פריימרים</td><td>טכנולוגיות DNA משולבות</td><td></td><td>5'-CGGCAAACGGGAATGAAACGCC-3' ו-5'-TGCGGCAAAGACAGCAACGG-3'</td></tr><tr><td>מים נטולי נוקלאז UltraPure</td><td>Life Technologies</td><td>10977-015</td><td>מטופלים ב-UV למשך 30 דקות ב-Stratalinker 2400 לפני השימוש (אופציונלי)</td></tr> <tr><td>צבע ייחוס ROX</td><td>Life Technologies</td><td>12223-012</td><td></td></tr><tr><td>PCR מכסי רצועות אופטיות</td><td>Life Technologies</td><td>4323032</td><td></td></tr><tr><td>צינורות PCR</td><td>Agilent Technologies</td><td></td> 401428-dNTP <td></td></tr><tr><td>(25 מיקרומולר כל אחד)</td> <td>Agilent טכנולוגיות</td><td>200415</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler - מערכת Mx3000P qPCR Agilent</td><td>Technologies</td><td>401403</td><td></td></tr><tr><td>קצות פיפטה מחסום</td><td>VWR</td><td>89003-046</td><td></td></tr><tr><td>שמן ביו-ראד ל-evagreen</td><td>Bio-rad</td><td>186-4005</td><td></td></tr><tr><td>JumpStart Taq ReadyMix</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2893-100RXN</td><td></td></tr></tbody></table>

readout גורף פשוט של דיגיטלי מבחני כימות חומצות גרעין

Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays

מבחני דיגיטליים הם שיטות חזקות המאפשרות זיהוי של תאים וספירה של מולקולות חומצות גרעין בודדות נדירים. עם זאת, מבחני דיגיטליים עדיין לא מיושמים באופן שיגרתי, בשל העלות והציוד ספציפי הקשורות לשיטות זמינות מסחרי. כאן אנו מציגים שיטה פשוטה לקריאת נתונים של מבחני אגל דיגיטליים באמצעות מכשיר PCR בזמן אמת קונבנציונלי למדוד הקרינה בתפזורת של מבחני דיגיטליים מבוסס טיפה. אנו מאפיינים את הביצועים של assay קריאת הנתונים בתפזורת באמצעות תערובות אגל סינתטיות וassay אגל דיגיטלי הגברה עקירה מרובה (מד&quot;א). מד&quot;א כמותי יתרונות במיוחד מפורמט דיגיטלי תגובה, אבל השיטה החדשה שלנו חלה על כל assay דיגיטלי. לפרוטוקולי assay דיגיטליים הוקמו כגון PCR הדיגיטלי, בשיטה זו משמשת כדי לזרז ולפשט קריאת נתוני assay. המתודולוגיה קריאת הנתונים בתפזורת שלנו מביאה את היתרונות של partitioneמבחני ד ללא הצורך במכשור מיוחד קריאת נתונים. המגבלות העיקריות של המתודולוגיה קריאת נתונים בתפזורת מופחתות טווח דינמי בהשוואה לפלטפורמות אגל-ספירה ואת הצורך במדגם סטנדרטי, למרות שהדרישות לתקן זה הן פחות תובעניות מאשר לניסוי קונבנציונלי בזמן אמת. ההגברה הגנום כולו כמותי (WGA) משמשת לבדיקת מזהמים בתגובות WGA והיא הדרך הכי רגישה כדי לזהות הנוכחות של שברי DNA עם רצפים ידועים, נותנת הבטחה הגדולה השיטה בתחומי יישומים שונים, כולל בקרת איכות תרופות ואסטרוביולוגיה.

בעוד קריאות בתפזורת קונבנציונלית / בזמן אמת יכולות לשמש לPCR כמו מבחני כמותיים WGA (איור 1), מבחני כמותיים דיגיטליים מספקים יתרונות (טבלה 1). בשיטה המתוארת, אנו קוראים את מבחני דיגיטליים בפורמט מיקרו טיפה עם מדידה פשוטה בתפזורת נקודות קצה (איור 2). למרות ששיטה זו היא רחב ישימה, אנו מתמקדים בWGA כמותית (מד&quot;א), כי שיטה זו מציבה אתגרים מיוחדים למבחנים מקובלים בזמן אמת. <p class="jove_content" style=";text-align:right;directi...

אנו מתארים בדיקה דיגיטלית של נקודת קצה לכימות חומצות גרעין עם קריאה פשוטה (אנלוגית). אנו מודדים פלואורסצנטיות בתפזורת של בדיקות דיגיטליות מבוססות טיפות באמצעות מכונת qPCR סטנדרטית במקום מכשור מיוחד ומאשרים את התוצאות שלנו במיקרוסקופיה.

Readout גורף פשוט של דיגיטלי מבחני כימות חומצות גרעין

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are ...

המטרה הכללית של הליך זה היא לפשט את קריאת תוצאות בדיקות טיפות דיגיטליות (digital droplet assays) באמצעות מכשיר PCR בזמן אמת סטנדרטי, למדידת הפלואורסצנציה הכוללת של הבדיקה. דבר זה מושג תחילה על ידי הכנת תגובות הגברה של הדגימות הרלוונטיות ושני סטנדרטים, ויצירת טיפות כדי לחלק כל אחת מהן לאלפי ריאקטורים בגודל ננוליטר. השלב השני הוא דגירה של הטיפות כדי להגביר את חומצות הגרעין בתוך כל טיפה.בשלב הבא, נמדד הפלואורסצנציה הכוללת (bulk fluorescence) של כל דגימה או סטנדרט באמצעות QPC סטנדרטי או תרמוסייקלר. השלב האחרון הוא חיזוי חלקן של טיפות הפלואורסצנטיות בדגימות הנבדקות, תוך שימוש בעקום סטנדרטי שהופק מהדגימות הסטנדרטיות. כדי לאמת את ביצועי שיטה זו, ניתן להשתמש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית להערכה עצמאית של ביצועי הכימות של בדיקת הפלואורסצנציה הכוללת.היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון ספירת טיפות, הוא שאינה דורשת ציוד ייעודי. לפני תחילת בדיקה זו, נדרשים כל הריאגנטים הדרושים כפי שמתואר בטקסט של הפרוטוקול, וכן שני סטנדרטים: ראשון, בקרת חסר תבנית (no template control), כגון מים נטולי נוקלאז, ושני, ריכוז תבנית גבוה, כגון lambda DNA. יש לדנטור את 3.3 µL מכל סטנדרט עם 3.3 µL של באפר דנטורציה בתוך מבחנת qPCR.דגרו את הדגימה בטמפרטורת החדר למשך שלוש דקות. בצעו השבתה (Quench) לכל דגימה באמצעות 3.3 µL של בופר נטרול. באופן דומה, דנטורו 3.3 µL של התבנית המבוקשת באמצעות 3.3 µL של בופר דנטורציה בדגירה בטמפרטורת החדר למשך שלוש דקות.בצע השבתה (Quench) באמצעות 3.3 µL של בופר ניטרול. הכן 11 µL של תערובת מאסטר (master mixture) לכל דגימה כדי להפחית תוצאות חיוביות שגויות. חשוף את תערובת המאסטר לאור UV לפני יצירת הטיפות.ראשית, הכין 10 µL של תערובת premix לכל דגימה בתוך מבחנה שקופה של 0.5 mL או 1.5 mL על קרח. תערובת ה-premix מורכבת מ-randomized oligo, B-S-A-D-N-A polymerase reaction buffer, dn, NTPs ומים נקיים מנוקלאז. הנח את המבחנה במים על קרח וחשף אותה לאור UV לאחר החשיפה ל-UV.הוסף צבע קישור ל-dsDNA ותזונה רפרנסית לתערובת הפרה-מיקס. הוסף את ה-PHI 29 DNA polymerase אחרון כדי להבטיח שהפולימראז לא ייחשף לרמות pH גבוהות או נמוכות באופן משמעותי מ-7.5. ערבב היטב, שלב 10 µL של תבנית דנטורית או סטנדרט ו-10 µL של תערובת המאסטר, וערבב היטב.מאחר שטיפות יכולות להיות רגישות מאוד לחשמל סטטי ולמאמצי גזירה, על הנסיין להסיר בגדים שעלולים לגרום לחשמל סטטי ולהבטיח הארקה של עצמו לפני יצירת הטיפות. ההתקן המיקרופלואידי ששימש להדגמה זו יוצר במעבדה וכולל כניסת שמן ושתי כניסות מימיות עם צומת מיקוד זרימה (flow focusing junction) ליצירת טיפות. השתמשו בשתי משאבות מזרק כדי לשלוט בקצבי הזרימה של 55 µL שמן עם חומר פעיל שטח ו-20 µL תערובת תגובה דרך השבב המיקרופלואידי.כדי להפיק טיפות בנפח של 20,001 nanoliter, אחד השלבים המורכבים ביותר הוא איסוף הטיפות מבלי להפריע לאמולסיה. חשוב להעביר את הנוזל בפיפט באיטיות, ורצוי להשתמש בטיפ רחב.אספו את כל הטיפות למבחנות PCR עבור כל דגימה. העבירו aliquot של 30 µL שמן למבחנות PCR חדשות עם מכסים אופטיים באמצעות טיפ רחב (wide bore tip) ופיפטור איטי מאוד. העבירו 20 µL של טיפות מעל השמן.נפחים עקביים מבטיחים שהבדיקה תהיה מדויקת ככל האפשר. סגרו את מכסי המבחנות היטב, שכן מכסים רפויים יאפשרו לשמן להתאדות. החזיקו את מבחנות האמולסיה בחלק העליון של המבחנה, רחוק ככל האפשר מהאמולסיה. ניתן להשתמש במכשיר PCR thermocycler, במכשיר A-Q-P-C-R thermocycler או בפלטה מחממת (hot plate) לצורך הגברה איזותרמית.בהדגמה זו נעשה שימוש במכשיר thermocycler מדגם A-Q-P-C-R. דגרו את הדגימות למשך שבע שעות בטמפרטורה של 30 °C ובצעו אינאקטיבציה למשך דקה אחת בטמפרטורה של 75 °C. פעולה זו תתבצע מיד לאחר התגובה וההפעלה.מדדו את רמות הפלואורסצנציה עבור כל הדגימות באמצעות ה-QPCR thermocycler. עבור כל דגימה, חלקו את עוצמת הפלואורסצנציה של צבע ה-dsDNA binding dye בעוצמת הפלואורסצנציה של צבע הייחוס.חסרו את פלואורסצנציית הרקע או את הפלואורסצנציה הנורמלית של בקרת ה-no template מכל הדגימות. צרו עקומת סטנדרט ליניארית באמצעות מדידות הפלואורסצנציה המתוקנות של הסטנדרטים. סטנדרט בקרת ה-no template מייצג את הפלואורסצנציה עבור דגימה עם 0% טיפות פלואורסצנטיות והריכוז הגבוה של התבנית.מדידת פלואורסצנציה היא הפלואורסצנציה הצפויה עבור דגימה עם 100% טיפות פלואורסצנטיות תוך שימוש בעקום הסטנדרטי המתאים. חזה את היחסים הביניים של טיפות חיוביות ושליליות על סמך הפלואורסצנציה הכוללת שלהן. שיטה זו משתמשת במכשיר real-time PCR קונבנציונלי למדידת פלואורסצנציה כוללת של בדיקות דיגיטליות מבוססות טיפות.טיפות פלואורסצנטיות וטיפות שאינן פלואורסצנטיות עורבבו מראש ביחסים שונים, ונערכה השוואה בין הפלואורסצנציה הכוללת (bulk fluorescence) לבין חלקן של הטיפות החיוביות. כצפוי, הפלואורסצנציה הכוללת ומספר הטיפות החיוביות עולים באופן ליניארי עם חלקן של הטיפות הפלואורסצנטיות שהוכנסו. היחסים החזויים על בסיס התקנים הושוו לחלקי הפלואורסצנציה הצפויים שהוכנסו.הקו מציין את הערך הצפוי בהינתן קשר ליניארי. התוצאות מראות ביצועים טובים בכימות יחס טיפות על פני שני סדרי גודל של טווח דינמי. כדי לבחון שיטה זו במערך כמותי ממשי של הגברה של הגנום השלם, רמות פלואורסצנציה וחלקים של טיפות חיוביות של טיפה דיגיטלית.נמדדה בדיקת MDA עם ריכוזים עולים של תבנית Lambda DNA. הקו מציין את חלק הפלואורסצנציה הצפוי תוך שימוש בהתפלגות פואסון למידול נתוני הניסוי. מוצגות תמונות פלואורסצנציה מייצגות של הטיפות; הן הפלואורסצנציה הכוללת (bulk) והן חלק הטיפות החיוביות מדגימות MDA דיגיטלי שמשתנים כמצופה בהתאם לממוצע התבניות לטיפה, מה שמעיד על כך שהקריאה הכוללת יכולה לשקף נאמנה את תוצאות של בדיקה דיגיטלית.שיטה זו עשויה להועיל לבדיקות דיגיטליות אחרות, כגון digital PCR, על ידי הגברת המהירות, ביצוע במקביל ופישוט של קריאת תוצאות הבדיקה.

simple-bulk-readout-of-digital-nucleic-acid-quantification-assays

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

השימוש במערכות NanoDrop microvolume כחלופות מעשי ויעיל המסורתית מתודולוגיה חומצות גרעין quantitation מתוארת באמצעות הדגמה של שני פרוטוקולים microvolume quantitation חומצת גרעין.

NanoDrop Microvolume quantitation של חומצות גרעין

תקשורת זה מובאים נתונים על דיוק ועל שחזור של ספקטרופוטומטר UV-VIS BioSpec ננו עבור dsDNA ו quantitation חלבון. אפילו עם כמויות קטנות במיוחד (1 עד 2 ליטר), שחזור מצוין, בעוד פונקציה מנגב אוטומטי משפר את התפוקה ואת התוצאות שריד מינימלי תוצאות מדויקות יותר.

קביעת ריכוז חומצות גרעין וחלבונים שימוש Micro בנפח Bio-spec ספקטרופוטומטר Nano

בסרטון זה, אנו מדגימים את טכניקת ה-PCR הדיגיטלי הדו-צדדי (ddPCR) – שינוי של טכניקת ה-PCR המסורתית השימושית בזיהוי שני סמנים גנטיים שונים בו זמנית. תגובת PCR יחידה מחולקת לטיפות מתחלבות בגודל ננוליטר המועצמות באופן עצמאי, וזיהוי אותות הגברה פלואורסצנטיים בצבעים שונים מחלק הטיפות משמש לחישוב הריכוז ההתחלתי של רצפי המטרה.

PCR דיגיטלי דופלקס לכימות סימולטני של סמנים גנטיים כפולים

סרטון זה מדגים את התועלת של PCR דיגיטלי בפורמט שבב בצינור לזיהוי וריאציות נוקלאוטידים בודדים בדגימות DNA. תגובת PCR יחידה מחולקת לחדרים הפועלים כתגובות PCR עצמאיות, וזיהוי אותות פלואורסצנטיים מהמטרות המוגברות בתאים משמש לחישוב תדירות האלל המשתנה בדגימה.

PCR דיגיטלי מבוסס שבב בצינור לכימות גרסאות נוקלאוטידים בודדים

חבילה של מבחני colorimetric מתוארת לחלבון במהירות הבחנה, רנ"א, דנ"א, וסוכרים מחדש ducing בדגימות biomolecular פוטנציאלי הטרוגניות.

מבחני colorimetric מהירים לאופן איכותי להבחין RNA ו-DNA בדגימות biomolecular

מתוארת מערכת משולבת לריצוף ממוקד של הדור הבא של דגימות אונקולוגיות. מערכת חוצת פלטפורמות זו מותאמת לביופסיות גידול באיכות נמוכה ובכמות נמוכה, מתאימה לתשומות DNA נמוכות, כוללת בקרות מרובות וריאנטים מאופיינות היטב, וכוללת מתקשר וריאנט חדש המבוסס על אמצעי בקרת איכות כמותיים טרום-אנליטיים.

אינטגרציה של Wet ותהליכי ספסל יבשים מבצעת אופטימיזציה ממוקד רצף הדור הבא של איכות נמוכה וביופסיות גידול נמוכה כמות

מתוארת שיטה רגישה ומדויקת לכימות מיקרו-רנ"א נטול תאים באמצעות כימיה מבוססת צבע וטכנולוגיית PCR דיגיטלית טיפות.

במחזור כימות MicroRNA שימוש DNA מחייבת כימיה דיי PCR דיגיטלי אגל

רצף proviral בודדים באורך מלא (היפוך) מספקת שיטה יעילה, תפוקה גבוהה עבור הגברה רצף של יחיד, ליד באורך מלא (שלמים ולא פגומה) HIV-1 הפרו-וירוס והיא מאפשרת קביעה של הפוטנציאל שלהם שכפול-כשירות. סלטות מתגבר על המגבלות של מבחני הקודם שנועדה רצף המאגר HIV-1 סמויה.

הגברה של יד באורך מלא הפרו-וירוס HIV-1 עבור הדור הבא רצפי

כימות מדויק של עותקים גנומיים וקטוריים הקשורים לנגיף אדנו (AAV) הוא קריטי, אך פרוטוקול סטנדרטי טרם נקבע. פרוטוקול זה מתאר שיטה מתוקפת להכנת דגימות AAV מטוהרות וביצוע תגובת שרשרת פולימראז טיפתית דיגיטלית (dd_PCR) כדי לכמת באופן אמין את טיטר הגנום הנגיפי.

כימות גנומים נגיפיים הקשורים באדנו בדגימות וקטוריות מטוהרות על ידי תגובת שרשרת של פולימראז טיפתי דיגיטלי

פרוטוקול זה עבר אופטימיזציה לריצוף עמוק ממוקד של 18 אזורים עמידים לתרופות ב-Mycobacterium tuberculosis באמצעות פלטפורמת ריצוף לקריאה ארוכה, ואחריה ניתוח עם צינור ביואינפורמטיקה ספציפי לשחפת המיועד לנתונים לקריאה ארוכה.

ריצוף Amplicon באמצעות טכנולוגיות ריצוף לקריאה ארוכה

פרוטוקול זה מתאר את התכנון של בדיקות הכלאה מפוצלות תוך שימוש באפטמר מואר פלואורסצנטי DAP-10-42 כמדווח אותות ויישומם לזיהוי חומצות גרעין והבחנה בין מטרות עם החלפות נוקלאוטידים בודדים.

בדיקת הכלאה מפוצלת המשתמשת באפטמר אור פלואורסצנטי של DNA כמדווח אותות לניתוח חומצות גרעין ספציפיות לרצף

למד שיטה פשוטה לכימות חומצות גרעין באמצעות מכשיר qPCR סטנדרטי ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית. השיטה מייצרת טיפות ננו-ליטריות ומודדת פלואורסצנציה גורפת לקבלת תוצאות מדויקות.

Readout גורף פשוט של דיגיטלי מבחני כימות חומצות גרעין

גלה סרטונים נוספים