ויזואליזציה של הכונדרוציטים עיבור וכיוונית למניעת הפצת נשק באמצעות ניתוח תא משובט Zebrabow בסחוס של העוברית מקל

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא להדמיות של התארגנות והתרחבות של כונדרוציטים באמצעות אנליזה קלונלית של תאים בשיטת zebra bow. זאת מושג על ידי יצירת קו עכברים מסוג SOX 10 ERT two Cree zebra bow M כדי להשיג רקומבינציה ספציפית לרקמה בסחוס הקרניו-פציאלי בעוברים לצורך אנליזה קלונלית. לאחר מכן, העוברים מקבלים פולס של tamoxifen בשלב 10 so mite למשך שלוש שעות כדי להשרות את תהליך הרקומבינציה.

לאחר מכן, נבחרים עוברים המראים ביטוי של פעילות CRE וביטוי חזק של פלואורסצנציה אדומה או RFP, והעוברים מורכבים לצורך דימוי של סחוס קרניו-פציאלי C. התוצאות מראות ניתוח תאים רב-ספקטרלי של כונדרוציטים קרניו-פציאליים המבוסס על דימוי קונפוקאלי. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כגון צביעת S בכחול או קווים טרנסגניים כגון so ו-GFP או SOX ו-kde, הוא ש-zebra bow מאפשר לנו לצפות באופן ספציפי ולעקוב אחר אוכלוסיות תאים קלונאליות המעורבות ביצירת איבר.

כדי להתכונן לאיסוף עוברים ביום הראשון, הציבו מספר זוגות של זכרים ונקבות של דגי זברה טרנסגניים מסוג sox, 10 ERT two Cree zebra bow במיכלי המרבעה מחולקים בין השעות 17:00 ל-18:00. למחרת, לאחר אימות תחת מיקרוסקופ אור שסימני העוברים הגיעו לשלב ה-10 cellulite, השתמשו במיקרוסקופ פלואורסצנטי עם פילטר RFP. בודדו את העוברים האדומים הבהירים והעבירו אותם לצלחת פטרי חדשה עם מצע E3 טרי כדי להשרות rekombinasiya של Cree. הוסיפו לצלחת הפטרי תמיסת hydroxy tamoxifen בריכוז 10 µM והדגירו את העוברים בטמפרטורה של 28.5 °C למשך שלוש שעות.

לאחר מכן, שפכו את תמיסת ה-Tamoxifen למכל פסולת ביולוגית והשתמשו ב-E three כדי לשטוף את העוברים מספר פעמים. לאחר הדגרת העוברים למשך לילה עד לשלב 28 עד 29 somite, העבירו את העוברים לתמיסת E three PTU והחזירו אותם לאינקובטור. כדי להדגים את מבני הפנים והגולגולת המפותחים במלואם, בחרו עוברים בגיל 4 DPF עם אות אדום עז וביטוי yellow Cree ברשתית. לאחר הרדמת עובר ב-Trica, בהתאם לפרוטוקול הטקסט, העבירו אותו לצלוחית פטרי המכילה טיפה של Methylcellulose על סלייד קונפוקאלי נקי.

הנח טיפה של Methylcellulose טרי והשתמש בקצה של micro loader כדי להרכיב את העובר במנח גבי (dorsal), תוך הקפדה לא לגעת בו ישירות, עם זכוכית כיסוי של 25 על 25. כסה את העובר והשתמש בזכוכית הכיסוי כדי להזיז את העובר במידת הצורך. לצילום של העובר, השתמש בעדשה יבשה עם הגדלה של 20x.

כדי למקד את הדגימה, לחצו על כפתור L 100 במיקרוסקופ, ולאחר מכן בחרו בכפתור הגדרות הקונפוקלי (confocal setup). לחצו על auto ובחרו ב-CFP עבור ערוץ אחד, ב-GFP עבור ערוץ שני, וב-RFP או M cherry עבור ערוץ שלושה. לאחר מכן סגרו את החלון.

הפעלו את ערוצים שתיים ושלוש לפני הלחיצה על כפתור ביטול הנעילה (remove interlock). לאחר מכן, לחצו על play כדי להתחיל בסריקה. לאחר התאמת ההגדרות, צלמו את התמונות הרצויות ושמרו אותן בפורמט של תוכנת הקונפוקאל וכן בפורמט TIF לצורך עיבוד תמונות לפי ערוץ.

לביצוע דימוי CFP, כבו את ערוצים שתיים ושלוש והדליקו את ערוץ אחת מבלי לשנות את אזור המיקוד. כווננו מחדש את הגדרות הסריקה לפני לכידת התמונות, שמרו את התמונות כפי שתואר לעיל, ובצעו עיבוד תמונות כפי שתיארו pan ועמיתיו כפי שמוצג כאן. ויזואליזציה מסורתית של סחוס באמצעות צביעת Alcian blue של דגימה שלמה (whole mount) הייתה בעלת ערך רב בתצפית על סחוס המקל (mekel cartilage) המתפתח, ומשמשת בדרך כלל לוויזואליזציה של הארגון התאי הסופי כדי לנתח בהמשך את הכונדרוציטים המתפתחים לאורך זמן באמצעות מעקב שושלת (lineage tracing).

שימוש בקווי תרנסגניים של SOX 10 kda שימש לחקר נדידת תאים והתכנסות והתרחבות (convergence and extension) בעוברים חיים באמצעות דימוי חי של קו התרנסגני zebra bow m. מחקר נוסף של ארגון הכונדרוציטים במבנה השלד הקרניו-פציאלי (craniofacial) של C חושף את תהליך השזירה (intercalation) וההארכה של הכונדרוציטים, המתווך את ההתרחבות והצמיחה של סחוס מקל (meckel's cartilage). איור זה מציג את הלסת התחתונה מעוברים תרנסגניים מסוג UI zebra bow M Sox 10 ERT two Cree, בין 3D PF ל-5 ימים לאחר ההפריה.

את הלסת התחתונה מומלץ לצלם מהמבט הוונטרלי כדי לאפשר תצפית ברורה על ארגון התאים בסחוס המלס (meles cartilage) כפי שמוצג כאן. הצבעים, שנשמרים ויורשים באופן יציב, מאפשרים מעקב קל אחר שושלות תאים ומיפוי גורל של תאי רב-עצביים של הרכס הקרניאלי. נראה כי תא כחול בודד נודד ומשתלב עם התאים השכנים לו, ולאחר מכן מתארך לאורך הציר האנטריורי-פוסטריורי כדי ליצור אתר כונדרה (chondra) בעל צורה אחידה, ובכך שומר על הצורה הגלובלית של סחוס המלס בעודו מתפשט קדימה.

טכניקה זו סוללת את הדרך עבור חוקרים בתחום התפתחות הסחוס לבחון chondro ביצירתו של השלד בדגי zebrafish.