ויזואליזציה של הכונדרוציטים עיבור וכיוונית למניעת הפצת נשק באמצעות ניתוח תא משובט Zebrabow בסחוס של העוברית מקל

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לדמיין איסוף והרחבה של כונדרוציטים באמצעות ניתוח תאים משובטים של קשת זברה. זה מושג על ידי יצירת קו SOX 10 ERT שני Cree zebra Bow M כדי להשיג רקומבינציה ספציפית לרקמה בסחוס הפנים הגולגולתי ובעוברים לניתוח משובט. לאחר מכן, העוברים פועמים עם טמוקסיפן בשלב 10, כלומר קרדית למשך שלוש שעות על מנת לגרום לתהליך הרקומבינציה.

לאחר מכן נבחרים עוברים לביטוי פעילות CRE וביטוי פלואורסצנטי אדום חזק או RFP, והעוברים מותקנים להדמיה של סחוס גולגולת C. התוצאות מראות ניתוח תאים מולטי-ספקטרלי של כונדרוציטים של פנים הגולגולת על סמך הדמיה קונפוקלית. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו S בצביעה כחולה או קווים טרנסגניים כמו so ו-GFP או SOX ו-kde, הוא שקשת הזברה מאפשרת לנו להתבונן ולעקוב באופן ספציפי אחר אוכלוסיות תאים משובטים המעורבים בהיווצרות איברים.

כדי להתכונן לאיסוף העוברים ביום הראשון, הקימו מספר זוגות זכרים ונקבות של סוקס, 10 ERT שני דגי זברה זברה קרי M במכלי הזדווגות מחולקים בין חמש ל-6:00 בערב למחרת לאחר שווידאתם במיקרוסקופ אור שהעוברים הגיעו לשלב 10 צלוליט תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם מסנן RFP. בודדו את העוברים האדומים הבהירים והעבירו אותם לצלחת פטרי חדשה עם מדיום E 3 טרי כדי לגרום לרקומבינציה של קרי. הוסף 10 תמיסת טמוקסיפן הידרוקסי מיקרומולרית לצלחת פטרי ודגירה על העוברים בטמפרטורה של 28.5 מעלות צלזיוס למשך שלוש שעות.

לאחר מכן שפכו את תמיסת הטמוקסיפן למיכל פסולת ביולוגית והשתמשו ב-E שלוש כדי לשטוף את העוברים מספר פעמים לאחר הדגירה של העוברים למשך הלילה עד לשלב 28 עד 29, אז קרדית, העבירו את העוברים לתמיסת E 3 PTU והחזירו אותם לאינקובטור. כדי לדמיין את מבני הגולגולת המפותחים במלואם, בחר עוברים בארבעה DPF עם אות אדום עז וביטוי קרי צהוב ברשתית. לאחר הרדמת עובר בטריקה, על פי פרוטוקול הטקסט, העבירו אותו לצלחת פטרי המכילה טיפה של מתיל צלולוז על מגלשה קונפוקלית נקייה.

הניחו טיפה של מתיל צלולוז טרי והשתמשו בקצה מעמיס מיקרו כדי להרכיב את העובר הממוקם בגב תוך הקפדה לא לגעת בו ישירות עם החלקת כיסוי בגודל 25 על 25. כסו את העובר והשתמשו בתלוש הכיסוי כדי לתפעל את העובר במידת הצורך. כדי לצלם את העובר, השתמש באובייקט עדשה יבשה פי 20.

כדי להתמקד בנושא, לחץ על כפתור L 100 במיקרוסקופ, ולאחר מכן בחר בלחצן ההגדרה הקונפוקלית. לחץ על אוטומטי ובחר CFP לערוץ ראשון, GFP לערוץ שני ו- RFP או M דובדבן לערוץ שלוש. לאחר מכן סגור את החלון.

הפעל את הערוצים שתיים ושלוש לפני לחיצה על כפתור הסרת המנעול. לאחר מכן לחץ על הפעל כדי להתחיל בסריקה. לאחר התאמת ההגדרות, צלם את התמונות הרצויות ושמור בפורמט התוכנה הקונפוקלי וכן בפורמט TIF לעיבוד תמונה לפי ערוץ.

כדי לבצע הדמיית CFP, כבה את הערוצים 2 ו-3 והפעל את הערוץ הראשון מבלי לשנות את אזור המיקוד. התאם מחדש את הגדרות הסריקה לפני לכידת תמונות, שמור תמונות כפי שתוארו זה עתה ובצע עיבוד תמונה כפי שמתואר על-ידי פאן ועמיתיו כפי שמוצג כאן. הדמיית סחוס מסורתית על ידי צביעה כחולה של הר סיאן הייתה בעלת ערך רב בהתבוננות בסחוס המקל המתפתח ושימשה בדרך כלל להמחשת הארגון התאי הסופי כדי לנתח עוד יותר את הכונדרוציטים המתפתחים לאורך זמן מעקב אחר שושלת.

שימוש בקווים טרנסגניים SOX 10 kda שימש לחקר נדידת תאים והתכנסות והרחבה בעוברים חיים באמצעות הדמיה חיה של הקו הטרנסגני של קשת הזברה. כדי לחקור עוד יותר את ארגון הכונדרוציטים במבנה השלד הגולגולתי C חושף את תהליך האיסוף וההתארכות של כונדרוציטים המתווך את הארכת וצמיחת הסחוס של מקל. איור זה מציג את הלסת התחתונה מקשת זברה UI M Sox 10 ERT שני עוברים טרנסגניים של Cree בין 3D PF לחמישה ימים לאחר ההפריה.

הלסת התחתונה מצולמת בצורה הטובה ביותר בגחון כדי לאפשר תצוגות ברורות של ארגון התאים בסחוס המלס כפי שמוצג כאן. הצבעים המתוחזקים והתורשתיים מאפשרים מעקב קל אחר שושלת ומיפוי גורל תאי הפסגה העצבית של הגולגולת. נראה כי התא הכחול הבודד נודד ומתערב עם התאים השכנים שלו, ואז מתארך לאורך הציר האחורי הקדמי ליצירת אתר כונדרה בעל צורה אחידה, ובכך שומר על הצורה הגלובלית של סחוס המלס כשהוא משתרע מלפנים.

טכניקה זו סוללת את הדרך לחוקרים בתחום התפתחות החתולים לבחון את הצ'ונדרו בהיווצרות השלד של דג הזברה.