Name: qPCRTag ניתוח - תפוקה גבוהה, בזמן אמת PCR Assay עבור Genotyping Sc2.0 (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: למד שיטת qPCRTag לגנוטיפינג בזמן אמת של כרומוזומים סינתטיים בשמרים ללא צורך באלקטרופורזה. שיטה זו משפרת משמעותית את התפוקה ומקצרת את זמן הניתוח לכשעה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי הקרן הלאומית למדע גרנט MCB-0718846 וביטחון לפרויקטי מחקר מתקדם סוכנות חוזה N66001-12-C-4020 (לJDB). לאם מומנה על ידי מענק דוקטורט ממדעי הטבע והנדסת מועצת מחקר של קנדה. פרסומו של מאמר זה הוא בחסות רוש.

1. הכן את ה- DNA הגנומי שמרים (gDNA) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מלאי של שמרי תמוגה הצפת 9 המכיל 50 מ&quot;מ טריס pH 8.0, 100 מ&quot;מ NaCl, 1% SDS (w / v), 2% Triton X-100 (V / V), 1 mM EDTA pH 8.0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כהחל שימוש בחומרים ~ 2 x 10 6 תאים, אשר בדרך כלל מתאים ל~ 100 μl של תרבות רוויה למעבדת זנים של הרקע BY4741 10. תאים בתרבית צריכים להיות שנאספו על ידי צנטריפוגה XG ב 1000 במשך 3 דקות בטמפרטורת חדר בצינור 1.5 מיליליטר microfuge. לשאוב supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200 μl של שמרי תמוגה הצפת וresuspend התא גלולה על ידי pipetting. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף ~ 300 μl של החומצה שטפה חרוזי זכוכית כך שהרמה של חרוזים היא כ 1 מ&quot;מ מתחת לרמה של תרחיף התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במנדף להוסיף 200 μl של פנול / כלורופורם / isoamyl אלכוהול (25: 24: 1). שווי צינור microfuge ולהבטיח כי לא חרוזים תקועים בין הכובע והצינור כמו זה יגרום הדלפות במהלך רועד(שלב 1.6). הפוך 3 פעמים כדי לערבב ולאמת את הכובע אטום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנער את הצינור במשך 10 דקות בטמפרטורת חדר בעזרת מערבל benchtop כגון אפנדורף 5432. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 20,800 XG במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה 75 μl של השלב המימי לצינור microfuge חדש המכיל 1 מיליליטר של 100% אתנול. הפוך 10 פעמים כדי לערבב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה DNA על ידי צנטריפוגה ב20,800 XG במשך 20 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant ללא פירוק גלולה DNA. שטוף את הכדור עם 500 μl של 70% אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 20,800 XG במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant ללא פירוק גלולה DNA ואוויר יבש גלולה עם כובע microfuge הפתוח עד אתנול עודף התאדה, שהיא בדרך כלל סביב 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה DNA ב -75 μl של 10mm טריס pH 7.4 ו מערבולת לערבב. חנות המדגם ב -20 ° C ללא הגבלת זמן. למדוד את הריכוז של ה- DNA במדגם באמצעותbenchtop fluorimeter כגון קיוביט, אשר מבדיל את ה- DNA מRNA. ודא שהריכוז הסופי של gDNA הוא ~ 1-2 ng / μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן דילול 1:10 של הדנ&quot;א הגנומי שימוש במים ומערבולת לערבב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot 30 μl של gDNA המדולל לתוך הבאר המתאימה צלחת מקור שתואמת עם מתקן ננו אקוסטית נוזלי (שלב 3). אם באמצעות Labcyte אקו 550, השתמש בצלחת 384 גם פוליפרופילן (צלחת 384PP). הערה: כאשר אטום כראוי צלחת זה יכול להיות מאוחסן במשך חודש אחד לפחות ב -20 ° C. </li></ol> 2. הכן ולוותר qPCR מיקס מאסטר לצלחת multiwell 1,536 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 850 μl של תערובת אמן qPCR, כגון LightCycler 1,536 DNA ירוק הורים, בצינור 1.5 מיליליטר microfuge ומערבולת לערבב. צנטריפוגה תערובת אמן qPCR 2 דקות ב20,800 XG בטמפרטורת חדר כדי להסיר כל בועות. הרכיבים של מיקס מאסטר qPCR נדרש לצלחת multiwell אחת 1,536 הם כדלקמןS: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשלב 170 μl של תערובת אמן אנזים (Tube מאסטר הירוק 1, 5x מרוכז), 42.5 μl של SYBR (Tube מאסטר הירוק 4, 20x המרוכז), ו637.5 μl של מים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר 500 NL / גם לתוך צלחת multiwell 1,536 באמצעות מתקן נוזל בתפזורת כגון אמנות רובינס קוברה. (שים לב שצעדים 2.2.1-2.2.4 מתייחסים באופן ספציפי לקוברה.) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליצור תכנית מחלק עם ההגדרות הבאות: כיתת נוזל, מים; לשאוב נפח, 800 μl; לוותר נפח, NL 500; לשטוף זמן, 20 שניות. בהגדרות לוותר, לאמת את המהירות לוותר מוגדרת 49.6 מ&quot;מ / שנייה, לוותר על הקיזוז הוא 0.25 מ&quot;מ, ונוזל aspirated עודף להימכר חזרה למקור גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צינור microfuge המכיל תערובת אמן qPCR היטב A1 של בעל צינור microfuge, הנמצא בעמדת סיפון 1. חותך את הכובע של צינור microfuge או פשוט להשאיר את זה פתוח. הגדר את &#39;לשאוב גם&#39; לA1 על ידי עריכת Aspiratהגדרות דואר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע צעד לשטוף לפני ניפוק תערובת אמן qPCR על ידי צעדים לשאוב ולוותר בחירה-דה הראשונים של התכנית להקים בשלב 2.2.2 ואז להכות &quot;לרוץ&quot;. ברגע מלא, לבחור מחדש לשאוב ולוותר צעדים לפני הפעלת התכנית המלאה לוותר תערובת אמן qPCR. אם קוברה כבר יושב פעיל במשך פחות מ -10 דקות השלב לשטוף הראשוני, המשמשת לראש המערכת, הוא מיותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכה &#39;ריצה&#39; לוותר תערובת אמן qPCR היטב כל אחד. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את תערובת אמן qPCR בחלק התחתון של כל טוב על ידי צנטריפוגה הקצרה של 1,536 צלחת multiwell (סעיף 30 באמצעות טווה צלחת במהירות נמוכה PCR). </li></ol> 3. לוותר תבנית ה- DNA ויחל לצלחת multiwell 1,536 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר 5 NL של gDNA המדולל (שלב 1.3) לתוך הבארות הרצויות של צלחת multiwell 1,536 באמצעות מערכת העברת נוזל אקוסטית, כגון אקו 550. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ל&quot;איכסo 550, להשתמש בתוכנה לאתחל מחדש פלייט או לחלופין לספק גיליון אלקטרוני Excel מותאם אישית לתכנת את ההעברה. להבטיח המקור שנבחר גם לgDNA בתכנית תואמת את המקור טוב שליש לך לוותר פיזי gDNA (שלב 1.3). בחר את סוג צלחת המקור &#39;384PP_AQ_BP2&#39;, אשר מציין את הנוזל בצלחת 384PP הוא חיץ ללא חומרים פעילי שטח. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר 10 NL של פריימרים, מעורב מראש קדימה הפוך לריכוז סופי של 50 מיקרומטר כל, לתוך הבארות הרצויות של צלחת multiwell 1,536 באמצעות מערכת העברת נוזל אקוסטית, כגון אקו 550. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למערכת ההעברה הנוזלית, השתמש בתוכנה לאתחל מחדש פלייט או לחלופין לספק גיליון אלקטרוני Excel מותאם אישית לתכנת את ההעברה. הערה: כאן אפשר לוותר פריימרים כך שהפריסה על צלחת multiwell 1,536 תואמת את סדר כרומוזומליות של פריימרים כל כך קל לבדוק חזותי את תוצאות PCR בזמן אמתמאוחר יותר (שלב 6). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Premix פריימרים בצלחת שתואמת את מתקן הנוזל אקוסטית. לאקו 550, השתמש בצלחת Labcyte 384LDV (נפח מת נמוך) ולבחור את סוג צלחת המקור &#39;384LDV_AQ_B&#39; בעת תכנות אקו כדי לציין את הנוזל הוא חיץ פשוט ללא חלבונים. </li></ol></li></ol> 4. חותם וצנטריפוגה צלחת multiwell 1,536 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במערכת אוטם microplate כגון אוטם microplate התרמי Plateloc, לאטום מייד את צלחת multiwell 1,536 באמצעות חותם ברור אופטי שתואם למכשיר אוטם חום. אל תגעה בשטח החותם כדי למנוע סימני מריחה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם באמצעות microplate אוטם התרמי Plateloc, להשתמש בהגדרות הבאות: לאטום זמן 2.0 שניות, טמפרטורת חותם 162 מעלות צלזיוס, לחץ אוויר 82 psi. מכשיר זה לוקח ~ 5 דקות להתחמם וכך צריך להיות מופעל מראש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם משתמש באוטם microplate התרמי Plateloc, adapter יש להשתמש כדי להעלות את גובה צלחת multiwell 1,536 על הבמה של המכשיר כדי לוודא איטום טוב. הערה: למרות שזה עדיף לרכוש צלחת שלב לאוטם microplate התרמי Plateloc, פתרון חלופי הוא להכניס ארבעה ~ 2 מ&quot;מ מכונות כביסה סטנדרטית עבה זמינה בכל חנות לחומרי בניין בפינות להעלות את הגובה של צלחת multiwell 1,536. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד צנטריפוגות צלחת 1,536 multiwell אטומה XG ב 2000 במשך 3 דקות בטמפרטורת חדר כדי לאסוף את כל חומרים כימיים בחלק התחתון של כל טוב. </li></ol> 5. Real Time PCR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תכנית מכשיר 1,536 qPCR, כגון 1,536 LightCycler, עם פרוטוקול הגברה שני שלבים אחרי ניתוח עקום להמיס. שימוש בתוכנת LightCycler 1,536 להגדיר תכנית כדלקמן: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום דגירה: 95 מעלות צלזיוס, אחיזת 1 דקות, שיעור רמפה 4.8 מעלות צלזיוס / sec, אין רכישה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שני שלב הגברה: 30 מחזורים של [95 ° C, אין לו אחיזה,רמפה 4.8 מעלות צלזיוס / sec שיעור, אין רכישה; 64 מעלות צלזיוס, אחיזת 30 שניות, קצב רמפה 2.5 מעלות צלזיוס / sec, רכישה אחת]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עקום להמס: 95 ° C, 10 שניות, קצב רמפה 4.8 מעלות צלזיוס / sec, אין רכישה; 60 מעלות צלזיוס, 1 דקות, שיעור רמפה 2.5 מעלות צלזיוס / sec, אין רכישה; 97 מעלות צלזיוס, קצב רמפה 0.1 מעלות צלזיוס / sec, 5 רכישות / ° C (הרציף). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגניב: 40 מעלות צלזיוס, 30 שניות, קצב רמפה 2.5 מעלות צלזיוס / sec, אין רכישה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את פורמט איתור ל&#39;גרין דיי intercalating &#39;בכרטיסיית הגדרת הפעלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את שליטת pipetting ל&#39;מאסטר בקרה &#39;בכרטיסיית הגדרת הפעלה. תכונה זו משמשת כבקרה פנימית ומזהה את הנוכחות של תערובת אמן qPCR בכל טוב של צלחת multiwell 1,536, אשר היא שימושי כדי לזהות שליליים שווא משוער. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את צלחת multiwell 1,536 הוכנה בשלבי 2-4 למכשיר qPCR 1,536 ולהפעיל את התכנית. </li></ol> ניתוח 6. נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PerfORM בדיקה ויזואלית של נתונים בתוך תוכנת qPCR. הערה: תוכנת 1,536 מאפשרת הדמיה של שתי ההגברה ולהמס עקומות, כמו גם מפת חום מציגה את השיחה (N / חיובי, שלילי, לא חוקי,; איור 2), ערך נקודת מעבר (הזזה בקנה מידה צבע לחיובי או אפור לשלילי; איור 3), או ערך הקרינה נקודות קצה (EPF) (הזזה בקנה מידה צבע). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתוני יצוא מהתוכנה 1,536 בצורת קובץ txt (טבלת תוצאות) או קובץ XML עם או נתונים הגולמיים או נתונים מחושבים לעיבוד מחובר מהמכשיר. הערה: נקודת הקניינית האוטומטית מעבר אלגוריתם קורא (CP) שנבנתה לתוך תוכנת 1,536 לוקחת בחשבון את הצורה ושיפוע העקום ההגברה תוך קביעת שיחות חיוביות / שליליות וCp ערך עם ביטחון גבוה, בהיקפים נמוכים תת תגובת microliter עם נמוך יחסית ערכי הקרינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם LightCycler DNA הירוק מאסטר היה שימושד לqPCR, לוודא שכל הבארות עברו &#39;בקרת ההורים&#39;. Fail מציין גם לא קיבלו תערובת אמן qPCR ונקודת נתונים החסרה, צריכה להיחשב שלילית כוזב פוטנציאלית. ודא שכל הבארות עברו &#39;בקרת ההורים&#39;. Fail מציין גם לא קיבל mastermix DNA ולשקול את נקודת הנתונים החסרה שלילי כוזב פוטנציאלית. </li></ol>

<ol><li>Annaluru, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+synthesis+of+a+functional+designer+eukaryotic+chromosome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Total synthesis of a functional designer eukaryotic chromosome.</a> Science. 344 (6179), 55-58 (2014).</li>
<li>Dymond, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+chromosome+arms+function+in+yeast+and+generate+phenotypic+diversity+by+design%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Synthetic chromosome arms function in yeast and generate phenotypic diversity by design.</a> Nature. 477 (7365), 471-476 (2011).</li>
<li>Goffeau, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+with+6000+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Life with 6000 genes.</a> Science. 274 (5287), 546-547 (1996).</li>
<li>Dymond, J., Boeke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Saccharomyces+cerevisiae+SCRaMbLE+system+and+genome+minimization%5BTitle%5D)+AND+%22Bioeng+Bugs%22%5BJournal%5D)">The Saccharomyces cerevisiae SCRaMbLE system and genome minimization.</a> Bioeng Bugs. 3 (3), 168-171 (2012).</li>
<li>Richardson, S. M., Nunley, P. W., Yarrington, R. M., Boeke, J. D., Bader, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GeneDesign+3.0+is+an+updated+synthetic+biology+toolkit%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">GeneDesign 3.0 is an updated synthetic biology toolkit.</a> Nucleic Acids Res. 38 (8), 2603-2606 (2010).</li>
<li>Richardson, S. M., Liu, S., Boeke, J. D., Bader, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design-A-Gene+with+GeneDesign%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Design-A-Gene with GeneDesign.</a> Methods Mol Biol. 852, 235-247 (2012).</li>
<li>Lajoie, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+limits+of+genetic+recoding+in+essential+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Probing the limits of genetic recoding in essential genes.</a> Science. 342 (6156), 361-363 (2013).</li>
<li>Jovicevic, D., Blount, B. A., Ellis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+synthesis+of+a+eukaryotic+chromosome%3A+Redesigning+and+SCRaMbLE-ing+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Total synthesis of a eukaryotic chromosome: Redesigning and SCRaMbLE-ing yeast.</a> Bioessays. 36 (9), 855-860 (2014).</li>
<li>Dymond, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+genomic+DNA+from+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Preparation of genomic DNA from Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods Enzymol. 529, 153-160 (2013).</li>
<li>Brachmann, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designer+deletion+strains+derived+from+Saccharomyces+cerevisiae+S288C%3A+a+useful+set+of+strains+and+plasmids+for+PCR-mediated+gene+disruption+and+other+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications.</a> Yeast. 14 (2), 115-132 (1998).</li>
</ol>

יש לאם, NAP, JAM וJDB מה למסור. RC וAL מועסקים על ידי חברת רוש מדעי חיים, בארה&quot;ב ועבדו על פיתוח היישום עם אם כחלק מהוכחה של ניסוי עיקרון.

התאגדות של זיהוי PCR בזמן אמת לassay genotyping PCRTag היא התפתחות חשובה עבור פרויקט Sc2.0 שכן הוא מאפשר תפוקה גבוהה יותר באופן משמעותי. העבודה הקודמת שצוינה 2.5 תגובות μl ב384 צלחות גם PCR, זמן 1.5 שעות ריצת רכיבה תרמית, ג&#39;ל אלקטרופורזה agarose, וביאור במדריך של ג&#39;ל. העבודה שהוצגה כאן, נקראת ניתוח qPCRTag, מתגברת על כמה צווארי בקבוק גדולים. ראשית, ריצת qPCRTag מתעבה 4 x 384 צלחות גם לניסוי יחיד שיכול להיות מעובד, כדי להתחיל לסיים (צלחת להגדיר בתוספת זמן ריצה), כבשעה. זה משמעותי לציין כי העלות מגיב לכל גם לניתוח qPCRTag היא באחידות עם הגישה מבוססת ג&#39;ל הנמוך תפוקת agarose. עם זאת, על ידי עקיפת ג&#39;ל אלקטרופורזה וביאור ספר, העבודה qPCRTag מאפשרת חיסכון משמעותי בזמן ובעבודה, המהווים את היתרונות הגדולים. חשוב לציין את העבודה qPCRTag היא entirely תואם עם אוטומציה. חשש עיקרי בשימוש בזיהוי בזמן אמת כפלט של assay PCRTag הוא השיעור של תוצאות חיוביות שגויות ותשלילי שווא. מאז פריימרים PCRTag לא נועדו במקור לשימוש בזמן אמת PCR, צפוי כי לא כל זוגות פריימר יהיו מתאימים לשימוש עם פלט זה. לשם כך חשוב לאמת את הפונקציה וספציפיות של כל זוגות פריימר PCRTag להוציא משנה שלא עובד בassay מבוסס זמן אמת מלפנים. לדוגמא, תוצאות חיוביות שגויות כרומוזום 3 PCRTag ותשלילים הם על ידי-ו-גדול לשחזור בזמן אמת נתונים PCR (איורים 2 ו -3) וניתן לשלול אלה מניתוח נוסף. יתר על כן, זוגות פריימר הידועים להיכשל (הוערך על ידי ג&#39;ל אלקטרופורזה ומוצגים בS6 דמויות וS7 של Annaluru et al. 1) יכול גם להיות שלילי. מטרה זו מושגת בקלות פשוט excluדינג זוגות פריימר הפגומים בעת הגדרת פרוטוקול ההעברה אקוסטית. כמו רוב מבחני תפוקה גבוהה, בכוונתנו להשתמש בזיהוי PCRTag זמן אמת כמסך עיקרי לזהות transformants שיזכה אימות נוספת במורד הזרם. בהמשך לכך, תקן הזהב להקרנה משנית יישאר ניתוח PCRTag עם ג&#39;ל אלקטרופורזה כקריאת הנתונים. מעבר ליישום של ניתוח PCRTag לSc2.0, שילוב מערכות טיפול נוזל ננו המדינה של האמנות עם טכנולוגית ה- PCR בזמן אמת תפוקה גבוהה מאפשר ניתוח מהיר ואוטומטי ויש לו פוטנציאל להשפיע בתחומים רבים. לדוגמא, זרימת עבודה זו יכולה להיות מיושמת על הקרנת תפוקה גבוהה ספרייה, אבחון מחלות זיהומיות, ניתוח Microbiome, ועריכת הגנום חדשני גישות מנסה לשנות לוקוסים מרובים בו זמנית.

<html> Sc2.0, או פרויקט הגנום סינטטי שמרים <a href="http://www.syntheticyeast.org" target="_blank">(www.syntheticyeast.org),</a> יש להגדיר את המטרה של תכנון ובניית הגנום סינטטי אוקריוטים לחלוטין. באמצעות רצף הגנום אצר ביותר של cerevisiae Saccharomyces 3 כנקודת התחלה, כל אחד מהכרומוזומים יניארי שש עשרה כבר מחדש נועד לענות סט של עקרונות עיצוב שיציינו שמירה על כושר תא, שיפור יציבות הגנום, והגדלת גמישות גנטית. לדוגמא, אלמנטים כגון חוסר יציבות חוזר נמחקים מהכרומוזומים Sc2.0. כל המופעים של קודונים תחנת TAG מחדש מקודדים לTAA ל&#39;לפנות &#39;קודון במתח הסופי לכניסתה של חומצת אמינו שאינו מקודדת גנטי. בנוסף מערכת מושרה אבולוציה, מירוץ, מופעלת על ידי מערכת Cre-לקס, מאפשרת יכולת חסרת תקדים ליצירת הגנום נגזר עם מבני רומן 4. &quot;Jove_content&quot;&gt; אלמנט עיצוב מרכזי נוסף בגנום Sc2.0 הוא המבוא של PCRTags, המשמש כסימני מי DNA כדי לאפשר מעקב של ה- DNA הסינתטי והפראי הסוג. PCRTags הם מגזרים בORFs על כרומוזומים סינטטיים קצרים, בקידוד מחדש; בעוד רצפי PCRTag שונים ברמת ה- DNA בין כרומוזומים סינטטיים ופראיים סוג, החלבונים המקודדים זהים ברצף חומצות אמינו ולכן, ככל הנראה, תפקיד. רצפי PCRTag נועדו במיוחד כאתרי קישור פריימר כדי להקל על הגברה סלקטיבית (איור 1 א). עיצוב PCRTag מתבצע באמצעות האלגוריתם &quot;רוב שונה&quot; בGeneDesign 5,6, מניב recoded רצפים סינטטיים שהם בדרך כלל ~ 60% שונים מרצפי ילידים (33% מינימום) עם טמפרטורות התכה בין 58 ° C ו 60 ° C ו amplicon אורכים בין 200-500 זוגות בסיסים 2. Recoding אינו מותר בכל ORF 100 נ&quot;ב הראשון, כאזורים אלה ידועיםיש העדפות מיוחדות במונחים של שימוש קודון 7. יחד, כללי עיצוב אלה מעדיפים ביצועים גבוהים של כמעט כל PCRTags תחת קבוצה אחת של תנאי PCR לפי זוגות פריימר PCRTag הסוג סינטטיים ופראיים באופן בלעדי לאגד ולהגביר DNA הסינתטי וילידים, בהתאמה (איור 1). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52941/52941fig1.jpg" /> איור 1:. סכמטי PCRTag PCRTags () מחדש מקודד רצפים בתוך מסגרות פתוחות קריאה (ORF) של גנים על כרומוזומים Sc2.0. סינטטי (ב) (SYN) ופריימרים PCRTag סוג בר (WT) באופן בלעדי לאגד ולהגביר הדנ&quot;א הגנומי סוג סינטטי ופראי (gDNA), בהתאמה. מוצג כאן הוא ניתוח של קטע KB ~ 30 של הזרוע השמאלית של כרומוזום שש, בודק שלוש עשרה זוגות פריימר PCRTag או באמצעות WT או חצי synVIL2 gDNA כתבנית. במקרים רבים ORF אחד מקודד P יותר מאחדCRTag. נוכחות / היעדר amplicons PCRTag נבחנים באמצעות ג&#39;ל אלקטרופורזה agarose. amplicons PCRTag הטווח בגודל מ 200 נ&quot;ב ל -500 נ&quot;ב. המינים הנודדים מהר יותר בחלק התחתון של הפנלים הם הדימרים פריימר. ניתוח PCRTag הוכיח להיות כלי חשוב בהרכבה של כרומוזומים Sc2.0. בניסוי 30-50 קילו טיפוסי של ה- DNA הסינתטי, קידוד 20-30 PCRTags, הופך לתאי שמרים להחליף את הסוג בר המקביל DNA 1,2,8. ניתוח PCRTag לאחר מכן נעשה שימוש כדי לזהות transformants שלקודד PCRTags הסוג סינטטי אבל לא פראי פורש קטע זה של ה- DNA, או מה שנקרא &quot;מנצחים&quot;. זה בדרך כלל צורך לבדוק transformants מרובה כדי לזהות זוכי &quot;, כך תפוקה ועלות של ניתוח PCRTag הן שיקולים חשובים. נכון לעכשיו שני כרומוזומים Sc2.0 הושלמו (synIII 1 וsynIXR 2), המייצגים פחות מ -10% מהגנום Sc2.0, altהאף יותר ממחצית הכרומוזומים שנותרו כעת בתהליך סינתזה והרכבה. הסולם של ניתוח PCRTag הנדרש לפרויקט זה outpacing מהר את היכולת להפעיל ג&#39;לי וידני להבקיע את נוכחותו של ה- DNA והעדר DNA סוג בר סינטטיים. על מנת לשפר את התפוקה של assay PCRTag פיתחנו זרימת עבודה באמצעות PCR בזמן אמת לעקוף את השימוש בג&#39;ל אלקטרופורזה agarose. העבודה עושה שימוש במתקן נוזל בכמות גדולה להפצת mastermix qPCR לבאר כל צלחת multiwell 1,536, מנפק נוזל אקוסטית ננו להעביר תבנית ה- DNA ופריימרים, וCycler תרמית 1,536 qPCR, ומאפשרת לנו למזער תגובות 500 NL ו למקסם את התפוקה. יכול להיות אוטומטי ניתוח יתר על כן. סוג זה של פרוטוקול genotyping תפוקה גבוהה צריכה להיות להכליל לכל פרויקט הדורש ניתוח של שיבוטים רבים בלוקוסים מרובים.

<table><tbody><tr><td colspan="4">שמרים gDNA הכנת</td></tr><tr><td>שמרים gDNA</td> תבנית <td>מותאמת אישית</td><td></td><td>בזמן אמת PCR</td></tr><tr><td>חרוזי זכוכית שטופים בחומצה (0.5 מ"מ)</td> <td>Sigma</td><td>G8772</td><td>ליזה של תאי שמרים</td></tr><tr><td>פנול אולטרה-טהור פנול: כלורופורם: אלכוהול איזואמיל (25: 24: 1, v/v)</td> <td>Invitrogen</td><td>15593-031</td><td>ליזה של תאי שמרים</td></tr><tr><td>5432 מיקסר</td><td>Eppendorf</td><td>5432</td><td>ליזה של תאי שמרים</td></tr><tr><td>מיקרוצנטריפוגה 5417R</td><td>Eppendorf</td><td>22621807</td><td>ליזיס תאי שמרים</td></tr><tr><td>Qubit 3.0 Fluorometer</td><td>Life Technologies</td><td>Q33216</td><td>gDNA כימות Qubit</td></tr><tr><td>dsDNA BR ערכת בדיקה</td> Life <td>Technologies</td><td>Q32850</td><td>gDNA כימות</td></tr><tr><td>Labcyte 384PP צלחת</td><td>Labcyte</td><td>P-05525</td><td>gDNA צלחת מקור</td></tr> <tr><td colspan="4">DNA ירוק מאסטרמיקס הכנה ו חלוקת</td></tr><tr><td>LightCycler 1536 DNA ירוק</td><td>רוש</td><td>5573092001</td><td>בזמן אמת PCR mastermix</td></tr><tr><td>1.5 מ"ל מיקרופוג צינור מחזיק</td><td>ARI</td><td>EST BD060314-1</td><td>מיקרופוג צינור מחזיק לסיפון של קוברה</td></tr><tr><td>LightCycler 1536 Multiwell צלחת</td><td>רוש</td><td>5358639001</td><td></td></tr><tr><td>קוברה מערכת טיפול נוזלי</td><td>אמנות רובינס מכשירים</td><td>630-1000-10</td><td>לחלק qPCR מאסטר לערבב לתוך 1536 צלחת</td></tr><tr><td>PCR צלחת ספינר</td><td>VWR</td><td>89184-608</td><td>צנזורה, של 1536 צלחת</td></tr><tr><td colspan="4">תבנית ופריימר מחלק</td></tr><tr><td>פריימרים PCRTag</td><td>IDT</td><td>מותאמים אישית</td><td>מעורבבים מראש קדימה ואחורה, 50 &mu; M כל</td></tr><tr><td>רדיד איטום מנוקב של TempPlate, סטרילי</td><td>USA Scientific</td><td>2923-0110</td><td>חותם זמני עבור לוחות פריימר PCRTag</td></tr><tr><td>Labcyte LDV 384 צלחת באר</td><td>Labcyte</td><td>LP-0200</td><td>צלחת מקור פריימר מעורבת מראש</td></tr><tr><td>Echo 550 Liquid Handler</td><td>Labcyte</td><td></td><td>העברת 2.5 nl טיפות של פריימר ותבנית DNA לתוך צלחת 1536</td></tr><tr><td>Plateloc Thermal Microplate Sealer</td><td>Agilent</td><td>חותם חום G5402-90001</td><td>לצלחת 1536 לפני הפעלת LC1536</td></tr><tr><td>חותם קבוע ברור</td><td>Agilent</td><td>24212-001</td><td>אטם חום ברור אופטית לצלחת מרובת בארות LC1536</td></tr><tr><td>PlateLoc Roche / LightCycler 1536 שלב צלחת</td><td>Agilent</td><td>G5402-20008</td><td>יכול להחליף דסקיות בעובי ~ 2 מ"מ</td></tr><tr><td>Sorvall Legend XTR</td><td>Thermo Scientfic</td><td>75-004-521</td><td>צנטריפוגה אטומה בחום צלחת</td></tr> <tr><td>1536מדחס אוויר תעשייתי</td><td>Jun Air</td><td>1795011</td><td>להפעלת אוטם</td></tr><tr> ההד והחום<td colspan="4">בזמן אמת PCR</td></tr><tr><td>LightCycler 1536</td><td>Roche</td><td></td><td>דורש שקע 220 וולט</td></tr></tbody></table>

qpcrtag ניתוח - תפוקה גבוהה, בזמן אמת pcr assay עבור genotyping sc2.0

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

פרויקט הגנום סינטטי השמרים (Sc2.0) שמטרתו לבנות 16 שמרי הכרומוזומים מעצב ולשלב אותם לתוך שמרי תא בודד. עד כה כרומוזום אחד סינטטי, 1 synIII, וזרוע כרומוזום סינתטית אחד, synIXR 2, נבנה ותפקודם בvivo תוקף בהעדר כרומוזומים מהסוג בר המקביל. תכונת עיצוב חשובה של כרומוזומים Sc2.0 היא המבוא של PCRTags, שהם רצפים בתוך מסגרות פתוחות קריאה (ORFs) המאפשרות בידול של כרומוזומים סינטטיים מעמיתי הסוג הברים קצרים, בקידוד מחדש. PCRTag פריימרים לחשל סלקטיבי לשני כרומוזומים מסוג סינטטיים או פראיים ונוכחות / היעדרות של כל סוג של DNA ניתן לבדוק באמצעות assay PCR פשוט. את ההודעה סטנדרטית של assay PCRTag הוא להעריך נוכחות / היעדר amplicons ידי ג&#39;ל אלקטרופורזה agarose. עם זאת, עם צפיפות amplicon PCRTag ממוצעת של אחת ל1.5 kb וAGenome גודל ~ 12 Mb, הגנום Sc2.0 הושלם יהיה לקודד כ -8,000 PCRTags. כדי לשפר את התפוקה, פיתחנו assay זיהוי מבוסס PCR בזמן אמת עבור genotyping PCRTag שאנו מכנים ניתוח qPCRTag. העבודה מציינת 500 תגובות NL בצלחת multiwell 1,536, ומאפשר לנו לבדוק עד 768 PCRTags עם שני זוגות פריימר הסוג סינטטיים ופראיים בניסוי יחיד.

בדקנו כרומוזום סינטטי ופראי סוג 3 זוגות פריימר PCRTag 1 עם DNA הגנומי שמרים (gDNA) המופק מארבעה זנים שונים. יש כרומוזום 3 186 זוגות PCRTag פריימר כי היקף אורכו של כרומוזום (synIII הוא ~ 270 KB וכרומוזום מסוג בר 3 הוא ~ 315 KB). כדי לבדוק כל אחד מהזנים ארבעה עם שני הסטים של פריימרים, חילקנו את צלחת multiwell לארבעה רבעים, אחד לכל סוג של gDNA, הקצאת פריימרים PCRTag סינטטיים למחצית העליונה של כל רבע והסוג בר למחצית התחתונה. הדנ&quot;א הגנומי הופק מזני השמרים, שניים מהם לקודד סוג בר כרומוזום 3 (סוג בר, synIXR 2), ואילו כרומוזום נותר שני לקודד הסינתטי 3 (1 synIII, synIII synIXR). תערובת אמן qPCR הייתה לוותר לבאר כל צלחת multiwell 1,536 באמצעות מתקן נוזל בכמות גדולה, ואחריו פריימרים gDNA וPCRTag באמצעות אקו 550. Primers היו ערוכים באופן זהה בכל רבע של צלחת multiwell להשוואה ויזואלית קלה. צלחת multiwell אז חום אטום עם חותם ברור אופטי ונתונים לניתוח PCR בזמן אמת. בניסוי זה אנו qPCRTag נצפו, לחלק, ההגברה ביותר כצפוי, לפי פריימרים סינטטיים באופן בלעדי מוגברים DNA סינטטי ולהיפך (איורים 2 ו -3). עם זאת, אנחנו גם נצפו מספר חריגות מהתבנית הצפויה, מה שמרמז שליליים שווא וחיובי שגויים בבסיס הנתונים. בניסוי זה, יחידת הבקרה התגלתה בבארות 100%, המצביעה על מתקן נוזל בכמות גדולה לוותר בהצלחה mastermix לכל גם על הצלחת (מידע לא מוצג). זה פוסל את המקור פוטנציאלי אחד נגטיבים שווא. בנוסף, חלק 3 PCRTags כרומוזום ידוע להיכשל (מוצג בS6 דמויות וS7 של Annaluru et al. 1), ובם לפחות 2 SYN ו1 WTזוגות פריימר; כך ניתן להתעלם מן הבארות אלה בכל רבע. שליליים שווא אמיתי יכול לנבוע ממחסור בהעברת gDNA תבנית או פריימרים, אולם בחוויה שלנו, בהתחשב בכיול הנכון של אקו 550, כמו גם הכנת gDNA ופריימרים כפי שתואר, זה לא היה מקור עיקרי לשגיאה. בסך הכל בניסוי זה השיעור השלילי הכוזב היה נמוך מאוד לפריימרים WT עם תבנית WT (~ 2%) אם כי מעט גבוה יותר עבור פריימרים SYN SYN עם DNA (~ 8%). תוצאות חיוביות שגויות, זיהוי של אות בבארות בי פריימרים SYN מעורבבים עם WT gDNA (ולהיפך), יכול לנבוע מהגברת צלב או הדימרים פריימר. ואכן, הדימרים פריימר הם לעתים קרובות גלויים על ידי ג&#39;ל אלקטרופורזה (איור 1) ומהווים מקור סביר של טעות. ליישום של qPCR, הבדיקה של עקומות להמיס יכולה להיות שימושית כדי לקבוע אם מינים שונים, כגון הדימרים פריימר, עשויים לתרום לאות. יתר על כן, Performing ניסוי שליטה בי פריימרים מנופקים בהעדר תבנית ה- DNA עשוי לסייע בזיהוי פריימרים עם נטייה לdimerize. הגברה צלב ניתן להבחין על ידי ג&#39;ל אלקטרופורזה, בפרט אם מחזורי PCR יותר מדי מבוצעים או אם טמפרטורת חישול נמוכה מדי. יש לנו ניסיתי לצמצם את מספר התוצאות החיוביות שגויות בגלל ההגברה צלב על ידי אופטימיזציה של שני פרמטרים אלה לפרוטוקול qPCRTag. לבסוף, בוחן את ערכי נקודת מעבר (CP) לכל אחד גם יכול לסייע בזיהוי צבעי יסוד שאינם מתאימים לאיתור מבוסס זמן אמת (איור 3, למשל, Bb22, Fb22, Bb46, Fb46). בסך הכל בניסוי זה השיעור החיובי הכוזב היה נמוך לפריימרים SYN עם תבנית WT (~ 5%) וגבוה יותר לפריימרים WT עם תבנית SYN (~ 10%). <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52941/52941fig2.jpg" /> איור 2: מפת חום פלייט בו מוצגות נוכחות / abשיחת היגיון לניסוי qPCRTag. ארבעה סוגים שונים של DNA גנומי (רביעים מופרדים על ידי קווים לבנים מוצקים) היו נתונים לניתוח PCRTag באמצעות סינטטי (SYN) וסוג בר כרומוזום 3 פריימרים PCRTag (WT) (קווים מקווקווים לבנים להפריד SYN (למעלה ) וWT (למטה) בכל רבע). WT וsynIXR gDNA לקודד כרומוזום מהסוג בר 3, מניב הגברה עם פריימרים WT PCRTag. SynIII וsynIII synIXR gDNA לקודד כרומוזום סינטטי 3, מניב הגברה עם פריימרים SYN PCRTag. Primers הם ערוכים בהתאם למיצוב כרומוזומליות מהשמאל לימין ואת מיקומו באופן זהה בארבעת רביעים להשוואה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52941/52941fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52941/52941fig3.jpg" /> איור 3: חום פלייטמפת מוצגות מעבר ערך (CP) לניסוי qPCRTag. זהה אותו בסיס הנתונים כמו באיור 2 ופריסת הצלחת לכן זהה. N / מתייחס ל&#39;לא הגברה &#39;. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52941/52941fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

ניתן להבחין בין ניתן להבחין בין כרומוזומי מעצבים של פרויקט גנום השמרים הסינתטיים, Sc2.0, לבין עמיתיהם המקוריים באמצעות בדיקת גנוטיפ מבוססת PCR הנקראת PCRTagging, שיש לה נקודת קצה של נוכחות/היעדרות. כאן אנו מתארים שיטת זיהוי PCR בזמן אמת בתפוקה גבוהה עבור גנוטיפ PCRTag.

qPCRTag ניתוח - תפוקה גבוהה, בזמן אמת PCR Assay עבור Genotyping Sc2.0

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

המטרה הכללית של אנליזת QPCR TAG היא לשפר את התפוקה של בדיקת תביית ה-PCR TAG של פרויקט הגנום הסינתטי של השמרים, באמצעות הטמעת מערכת זיהוי המבוססת על PCR בזמן אמת ותגובות ממוזערות. דבר זה מושג תחילה על ידי שימוש במפיץ נוזלים בכמות גדולה (bulk liquid dispenser) כדי לחלק את תערובת ה-QPCR master mix לכל באער של פלטה רב-באירית בעלת 1536 באערים. לאחר מכן, רובוט להזרקת טיפות אקוסטית בננו-קנה מידה מעביר את ה-DNA התבנית והפריימרים לבאערים של הפלטה הרב-באירית.לאחר מכן אוטמים את הפלטה ומריצים את התגובות במכשיר thermocycler מדגם A-Q-P-C-R. לבסוף, נתוני ה-realtime PCR מנותחים כדי לקבוע את נוכחותם או היעדרם של תגי PCR סינטטיים או מסוג wild type בכל לוקוס. בסופו של דבר, תהליך העבודה של תגי QPCR משפר את התפוקה.היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני בדיקת ה-PCR TAG הנוכחית הוא שהיא מאפשרת לנו להימנע משימוש באלקטרופורזה של ג'ל ומסימון ידני של ג'לים אלו. הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה כאשר הבנו עד כמה תיוג PCR בכרומוזומים ארוכים יותר עומד להיות גוזל זמן ועתיר עבודה. לאחר גידול וקציר של כ-2 מיליון תאי שמרים, יש להוסיף 200 µL של באפר ליזיס לשמרים ולערבב באמצעות פיפטה כדי להשעות מחדש.אל המשקע יש להוסיף 300 µL של חרוזי זכוכית שטופים בחומצה עד לגובה של כמילימטר אחד מתחת למפלס התאים. לאחר מכן, בתוך מ常用的מסננת (מנדף), יש להוסיף 200 µL של phenol chloroform, isoamyl alcohol, להפוך את המבחנה שלוש פעמים כדי לערבב ולוודא שהפקק אטום. לאחר מכן, באמצעות מערבל שולחני, יש לנער את המבחנה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר; לאחר סבב צנטריפוגה, יש להעביר 75 µL מהפאזה המימית למבחנת מיקרו-צנטריפוגה חדשה המכילה 1 mL של 100% ethanol.הפוך את המבחנה 10 פעמים כדי לערבב לאחר סבב צנטריפוגה נוסף, שאב את העלייה (supernatant) מבלי להזיז את המשקע והשתמש ב-500 microliters של 70% ethanol כדי לשטוף את המשקע. לאחר הסרת העלייה, השתמש ב-75 microliters של 10 millimolar tris pH 7.4 כדי להמיס מחדש (resuspend) את המשקע וערבב באמצעות וורטקס. לאחר דילול ה-DNA ביחס של 1:10, העבר מנבוב (aliquot) של 30 microliters של GDNA מדולל אל הבאר המתאימה בלוח המקור עבור דיספנסרינג אקוסטי ננו-סקאלי של נוזלים.הכינו מראש 850 µL של תערובת מאסטר ל-QPCR במבחנה למיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 mL וערבבו באמצעות וורטקס. לאחר מכן, צנטריפוגו את התמיסה במהירות של 20,800 G ובטמפרטורת החדר למשך שתי דקות כדי להסיר בועות אוויר. לאחר מכן, באמצעות מפזר רב-חורי (bulk dispenser), חלקו 500 nL לכל באר בתוך פלטה רב-בארים של 1536.יש לרכז את תערובת ה-QPCR בתחתית כל באער על ידי סבב קצר של הפלטה בצנטריפוגה. לאחר מכן, באמצעות מערכת העברת נוזלים אקוסטית ובהתאם לפירוט המופיע בפרוטוקול הכתוב, יש להעביר חמישה nanoliters של GDNA מדולל ו-10 nanoliters של פריימרים קדמיים ואחוריים מומסים מראש בריכוז 50 micromolar לבאערים הרצויים בפלטה הרב-באערית. טכנולוגיית טיפות אקוסטית משתמשת בגלי קול כדי להעביר נפחים קטנים של נוזל באופן אנכי מפלטת מקור לפלטת יעד הפוכה.כאן, תבנית, DNA ופריימרים מועברים בטיפות של כפולות של 2.5 nanoliter לבארות של פלטת 1536 עם מספר רב של בארות, וזאת כדי להכין את תגובות ה-QPCR tag. לאחר מכן, השתמשו באיטום שקוף אופטית ובמערכת איטום למיקרופלטות כדי לאטום מיד את פלטת ה-1536.סובב מיד את הפלטה האטומה בצנטריפוגה ב-2000 G בטמפרטורת החדר למשך שלוש דקות כדי לרכז את כל הריאגנטים בתחתית הבאר לצורך ביצוע תוכנית real-time PCR במכשיר ה-QPCR, בהתאם להנחיות בפרוטוקול הכתוב, ולחץ על run עם סיום ההגדרות. ודא שכל הבארות עברו את בקרת המאסטר, המעידה על כך ש-QPCR master mix זוהה בבאר. כל באר שלא תעבור את הבקרה מייצגת נקודת נתון פוטנציאלית של שלילי שגוי.כדי לנתח את הנתונים, בצעו בדיקה ויזואלית בתוך התוכנה של ה-QPCR ו/או ייצאו את הנתונים מהמכשיר לעיבוד במחשב חיצוני. בניסוי זה, נבחנו זוגות של פריימרים לתיוג PCR עבור כרומוזום 3 מסוג בר (wild type) וכרומוזום 3 סינתטי, באמצעות GDNA של שמרים שהופק מארבעה זנים שונים: שניים בעלי כרומוזום 3 מסוג בר ושניים המקודדים לכרומוזום סינתטי.שלושה פריימרים סינתטיים, כצפוי, הגבירו באופן כללי DNA סינתטי ולא DNA מסוג בר (wild type). באופן דומה, פריימרים מסוג בר הפיקו אמפליקונים באופן בלעדי מ-DNA מסוג בר. הופעתם של מספר קטן של תוצאות חיוביות ושליליות שגויות היא צפויה, ומקורות אפשריים לשגיאות אלו מתוארים בפרוטוקול הטקסט הנלווה.ברגע שהטכניקה תשלט, ניתן להשלימה בתוך כשעה מההתחלה ועד הסוף. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.

qpcrtag-analysis-high-throughput-real-time-pcr-assay-for-sc20

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

כאן אנו מתארים זמנית אופטימיזציה הפוך transcriptase PCR כמותי (qRT-PCR) פרוטוקול בשילוב עם פלטפורמת microfluidic ככלי העלות והזמן תפוקה גבוהה יעיל ההקרנה microRNA (מירנה) רמות הביטוי, במיוחד כאשר עובדים עם כמויות מוגבלות של המדגם.

תפוקה גבוהה פרופיל MicroRNA: Multiplex אופטימליים qRT-PCR בקנה מידה Nanoliter על IFCs דינמי Fluidigm ArrayTM

בסרטון זה, אנו מתארים טכניקת PCR התכה ברזולוציה גבוהה כדי לקבוע את פולימורפיזם האורך של מקטעי DNA באורכי רצף משתנים, בהתבסס על ניתוח טמפרטורת התכה.

PCR נמס ברזולוציה גבוהה לקביעת וריאציות רצף ברצפי DNA מוטנטיים

סרטון זה מדגים את התועלת של PCR דיגיטלי בפורמט שבב בצינור לזיהוי וריאציות נוקלאוטידים בודדים בדגימות DNA. תגובת PCR יחידה מחולקת לחדרים הפועלים כתגובות PCR עצמאיות, וזיהוי אותות פלואורסצנטיים מהמטרות המוגברות בתאים משמש לחישוב תדירות האלל המשתנה בדגימה.

PCR דיגיטלי מבוסס שבב בצינור לכימות גרסאות נוקלאוטידים בודדים

כאן, אנו מתארים שיטה לכימות סימולטני של מעגלי כריתת קולטני תאי T (TRECs) ומעגלי כריתת רקומבינציה של מחיקת K (KRECs). בדיקת TREC/KREC יכולה לשמש כסמן של תפוקת בלוטת התימוס ומח העצם.

כימות סימולטני של מעגלי קולטן כריתת T-Cell (TRECs) ומעגלי K-מחיקת רקומבינציה כריתה (KRECs) על ידי בזמן אמת PCR

מסופק הוא פרוטוקול לפיתוח בדיקת הגברת פולימראז רקומבינאז בזמן אמת כדי לכמת את הריכוז הראשוני של דגימות DNA באמצעות מחזורי תרמי או מיקרוסקופ ומחמם במה. כמו כן מתואר פיתוח של בקרה חיובית פנימית. סקריפטים מסופקים לעיבוד נתוני פלואורסצנטיות גולמיים בזמן אמת.

פיתוח של כמותי recombinase פולימראז ההגברה Assay עם בקרה פנימית חיובית

כתב יד זה מתאר את הליך הניסוי וניתוח תוכנה עבור assay דו כיווני האתר אינטגרציה שיכולה בו זמנית לנתח במעלה הזרם ו-במורד הזרם ווקטור צומת ה- DNA. ניתן להשתמש במוצרי PCR דו-כיווניים עבור כל פלטפורמה של רצף דונסטרים. הנתונים שהתקבלו שימושיים עבור השוואה גבוהה, השוואה כמותית של מטרות DNA משולב.

דו כיווני Retroviral אינטגרציה אתר PCR מתודולוגיה וניתוח נתונים כמותיים זרימת עבודה

זיהוי מהיר ומדויק של פתוגנים באתר, במיוחד קרקע בתפו פתוגנים צמח, הוא חיוני כדי למנוע התפשטות של מחלות בתחום עיצוב והפקת inoculum. השיטה שפותחה כאן באמצעות מערכת זיהוי PCR נייד בזמן אמת מאפשר האבחון באתר בתנאי שדה.

זיהוי מולקולרי באתר של קרקע בתפו Phytopathogens באמצעות מערכת ה-PCR נייד בזמן אמת

תגובת שרשרת של פולימראז דיגיטלי (PCR) הוא כלי שימושי עבור גילוי רגישות גבוהה של נוקלאוטיד יחיד גרסאות ו- DNA עותק מספר גרסאות. . הנה, נדגים שיקולים מרכזיים למדידת גרסאות נדיר הגנום האנושי באמצעות PCR דיגיטלי עם התבנית שבב-ב--שפופרת.

פולימראז דיגיטלי Assay תגובת שרשרת עבור הווריאציה גנטי לחולה סדיר פוליפוזיס באמצעות התבנית שבב-ב--שפופרת

מאמר זה מפרט את השימוש ברשת מעוגנת מערכת התגובה המבוססת על תגובת שרשרת של הספרייה ואחריו ברצף הדור הבא כדי להעריך את fusions גן אונגניים בדגימות הגידול הקליני מוצק. מתוארים שלבי הספסל הרטוב וניתוח הנתונים.

היתוך גנים אונגניים באמצעות שרשרת מעוגנת התגובה השרשרת מעוגן ואחריו רצף הדור הבא

עבודה זו מסכמת שלבים לפיתוח בדיקות שונות לזיהוי SARS-CoV-2 באמצעות מערכת ddPCR בשני צבעים. השלבים מפורטים ונכללו הערות כיצד לשפר את הבדיקות ואת ביצועי הניסוי. ניתן להשתמש בבדיקות אלה עבור יישומי SARS-CoV-2 RT-ddPCR מרובים.

פרוטוקולי PCR דיגיטליים טיפתיים דו-שלביים של תמלול לאחור לזיהוי וכימות SARS-CoV-2

פרוטוקול זה מספק שיטה למדידת תדרי הצלבה והתפלגות במהלך מיוזה ב- Caenorhabditis elegans. גנוטיפ פולימורפיזם חד-נוקלאוטידי עם PCR בזמן אמת שימש לקביעת מקור הכרומוזומים. מיפוי 4 הנקודות איפשר לקבוע את התפלגות ההצלבה של אזורי הזרוע השמאלית, המרכז והימנית של כל כרומוזום. ...

תדירות והתפלגות של הצלבות במיוזה Caenorhabditis elegans על ידי גנוטיפ SNP באמצעות PCR בזמן אמת

למד שיטת qPCRTag לגנוטיפינג בזמן אמת של כרומוזומים סינתטיים בשמרים ללא צורך באלקטרופורזה. שיטה זו משפרת משמעותית את התפוקה ומקצרת את זמן הניתוח לכשעה.

qPCRTag ניתוח - תפוקה גבוהה, בזמן אמת PCR Assay עבור Genotyping Sc2.0

גלה סרטונים נוספים