Name: תגובה נבחרת ניטור ספקטרומטריית מסה לכימות חלבון מוחלט (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: למד כיצד לכמת חלבונים בדגימות ביולוגיות מורכבות באמצעות ניטור תגובה נבחרת (SRM) וכרומטוגרפיית נוזלים. שיטה זו מאפשרת ניתוח מרובה ומדויק של חלבוני מטרה במערכות ביולוגיות שונות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך על ידי תוכנית המחקר התוך-כיתתית של ה-NIH, המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות.

למחברים אין מה לחשוף.

כימות חלבון מוחלט חיוני למגוון מאוד רחב של יישומים ביו-רפואיים כגון אימות סמן ביולוגי ודוגמנות מסלול העברת אותות. לאחרונה, פרוטאומיקה ממוקדת באמצעות LC-SRM נהנתה משיפורים רבים בטכנולוגיות כולל הכנת פפטיד סטנדרטית, HPLC, QQQ-MS, וניתוח נתונים LC-SRM. כתוצאה מכך, היא הפכה חלופה רבת עוצמה לimmunoassays. Immunoassays יכול להיות מאוד רגיש ותפוקה גבוהה, אבל פיתוח immunoassay חזק יכול להיות מאוד מאתגר בגלל immunoassays יכול להיות פגיע לתגובה צולבת ו / או הפרעות, עולה בקנה אחד עם שיטות תמ...

ניסויי proteomic המשתמשים בספקטרומטר מסה (MS) יכולים להיות מתוכננים לשימוש או שאינם ממוקד (רובה) או שיטות ממוקדות. פרוטאומיקה גילוי בדרך כלל מסתמכת על הרובה מלמטה למעלה MS, או על ידי שימוש במצב רכישת הנתונים תלויים מסורתי, או על ידי שימוש באחת מטכניקות הנתונים עצמאיים שפותחו לאחרונה (למשל, MS E, רצועה) 1,2. פרוטאומיקה רובה היא כלי רב עוצמה לזיהוי פפטיד תפוקה גבוהה וכימות יחסי, אבל זה בדרך כלל אינו מתאים לכימות מוחלט או למיקוד קבוצות קטנות, מוגדרים (~ עשרות) של חלבונים. שיטת MS משמשת לרוב לפרוטאומיקה ממוקדת נבחרה תגובת ניטור (SRM) בגלל הרגישות גבוהה, המהירות, והטווח הדינמי שלה 3-5. חלופות לSRM כוללות ניטור תגובה מקביל, שמנצל ברזולוציה גבוהה, סריקה מלאה MS 6. SRM מבוצע בדרך כלל באמצעות ננו-זרימת reverכרומטוגרפיה SED-שלב ביצועים גבוהים נוזלי (ננו-RP-LC) מכשיר מצמידים את יינון ננו electrospray יון מקור (ננו &#39;חדשות ארכיאולוגיות) מחובר לספקטרומטר מסת quadrupole משולש (QQQ-MS). בניסוי טיפוסי, חלבוני מדגם proteolytically מתעכלים, ופפטידים וכתוצאה מכך chromatographically מופרדים, desorbed, ומיוננים. היונים מבשר וכתוצאה מכך הם מ &#39;/ z מסונן על ידי quadrupole הראשון (Q1) ומקוטע בquadrupole השני (Q2) על ידי התנגשותם עם גז התנגשות. יוני שבר כתוצאה הם מ &#39;/ בquadrupole השלישי (Q3) ולכמת ידי dynode-מסונן z. כל זוג מבשר ויון בר נקרא מעבר, וכל מעבר הוא פיקוח לתקופה קצובה בזמן (הזמן להתעכב, בדרך כלל 2-50 אלפיות שנייה). במהלך LC-SRM, מחזורי QQQ-MS באמצעות רשימה מוגדרת מראש של מעברים (מחזור העבודה היא בדרך כלל ≤3 שניות), וchromatogram של כל מעבר מיוצר. strateg האלטרנטיביies לכימות חלבון בדרך כלל להשתמש immunoassays כגון כתמי נקודה, כתמים מערביים, ELISAs, microarrays נוגדן, microarrays חלבון שלב הפוך, immunoassays microfluidic, ELISAs הדיגיטלי, וimmunoassays מבוסס microsphere 7. Immunoassays הטוב ביותר יכול להיות משמעותי יותר רגיש מאשר LC-SRM, ותפוקת מדגם של immunoassays יכולה להיות גבוהה באופן משמעותי מזה של LC-SRM 5. עם זאת, immunoassays פיתוח יכול להיות יקר ו / או זמן רב, וכתוצאה מכך יכולים להיות מבחני פגיעים לתגובה צולבת ו / או הפרעות, עולים בקנה אחד עם תא / תמוגה רקמה / שיטות הומוגניות, ו / או לא נוח לריבוב 5,8. חלק מבעיות אלה ניתן לטפל על ידי צימוד טכניקות antibody- ומבוסס MS. לדוגמא, ניתן להעשיר חלבוני היעד באמצעות immunoprecipitation לפני proteolysis וLC-SRM 9-12. לחלופין, טכניקת SISCAPA מעסיקה immunoprecipitation לאחר proteolysis בleve פפטידl 13,14. בנוסף לimmunoenrichment אסטרטגיות, immunodepletion של חלבוני שפע גבוהים יכול להיות מועסק על מנת להגביר את רגישות LC-SRM על ידי צמצום הפרעות על ידי coeluting analytes 15,16. כימות חלבון מבוסס MS יכול להיות מחולק לכימות יחסי ומוחלט, וגם לתיוג ויציב ללא תווית איזוטופ (למשל, תיוג חילוף חומרים, תיוג כימי, וחלבון שכותרתו כבד ופפטיד סטנדרטים פנימיים). טכניקות ללא תווית יכולות להיות שימושיות עבור כימות חלבון יחסית, אך אינן מתאימים לכימות מדויק מוחלט. לשם השוואה, בטכניקות תיוג צמצמו שגיאה הקשורות להכנת מדגם ושונות MS, ולעתים קרובות משמשות לכימות חלבון ביחס 17. לדוגמא, proteome איזוטופ היציבה שכותרת סטנדרטים (SILAP) מוכנים באמצעות שורת תאי אדם בתרבית אפשרה כימות יחסי של סמנים ביולוגיים פוטנציאליים באמצעות LC-SRM של סרום אנושי 18. כימות מדויק חלבון מוחלט על ידי MS דורש כי סטנדרטים פנימיים חלבון מטוהר, לכמת, isotopically כותרת או הפפטיד להיות ממוסמרים-לדגימות ביולוגיות לפני טרשת נפוצה. השילוב של סטנדרטים הפנימיים שכותרתו איזוטופ הכבד לעבודת LC-SRM מאפשר כימות מוחלטות שהוכחה להיות לשחזור והעברה בין מעבדות 16,19 מאוד. הסטנדרטים הפנימיים שכותרתו איזוטופ היציב לכימות חלבון מוחלט על ידי MS כוללים תקני פפטיד מוכנים באמצעות סינתזה מוצקה שלב 20, חלבונים מורכבים מתקני פפטיד בשרשור פרוטאז-cleavable 21, וסטנדרטים חלבון באורך מלא 22. יעד שינוי קוולנטיים חלבון והכנת מדגם חלקי (כלומר, תמוגה שלמה מדגם ולתפעול, וsolubilization חלבון שלם, denaturation, אלקילציה, וproteolysis) יכול לערער כימות מדויק. עמ &#39;הפנימיהסטנדרטים rotein הם הפחות סביר להיות מושפע מרוב הבעיות הפוטנציאליות אלה, אבל הם בדרך כלל הקשים ביותר להכנה. אלטרנטיבה היא לנתח כל חלבון מטרת שימוש בתקני פפטיד פנימיים רבים אשר נועדו כוללת שאריות ילידי איגוף amino- וcarboxy המסוף. לא משנה איזה סוג של התקן הפנימי מועסק, זה צריך להיות ממוסמר-לדגימות ביולוגיות כבתחילת שלב במהלך הכנת מדגם ככל האפשר. כמו כן, טכניקות מדגם מרובה הכנה (למשל, תנאי denaturation שונים) צריכים להיבדק. השימוש בטכניקות מרובות המאונכות ניסיוניות (אימות צולבת ניסיונית) הוא אסטרטגיה מעשית להתגברות על רוב כימות פוטנציאל אתגרי 23-25. כימות LC-SRM של חלבונים הוא טכניקה גמישה מאוד שכבר בשימוש במגוון רחב של יישומים. יש לציין, זה כבר נעשה שימוש כדי ללמוד סמנים ביולוגיים פפטיד וחלבונים בתוךדגימות קליניות כגון סרום, ביופסיות ליבה, וaspirates מחט הדק 5. LC-SRM שימש גם כדי למדוד את ההרכב של קומפלקסי חלבונים 5,26, כדי לזהות עצביים בוטולינום 27, לכמת דינמיקת זרחון החלבון בתוך מסלולי איתות 5, ולכמת שינויים בקונפורמציה חלבון 28. המעבדה שלנו היא באמצעות LC-SRM לכמת את חלבוני האיתות שלתווך chemotaxis מקרופאג כדי לתמוך בפיתוח של סימולציות מסלול chemotaxis. התכנית הכוללת של הפרוטוקול (איור 1) מתחילה בדירוג פפטידים היעד המהוסס. בהמשך לכך, סטנדרטים פפטיד חיצוניים גולמיים מסונתזים ומשמשים לפיתוח מבחני LC-SRM לניתוחים איכותיים של דגימות ביולוגיות. אם פפטיד היעד נגזר מדגם הביולוגי מזוהה, הסטנדרטים פפטיד מטוהרים שכותרתו כבדה פנימיים מוכנים לLC-SRM כמותיים. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי ACצורה מדויקת לכמת חלבונים ממגוון רחב של דגימות ביולוגיות, ולתמוך בחקירות במגוון רחב של יעדי חלבון.

<table><tbody><tr><td>אצטוניטריל (ACN),</td> ערכת בדיקת חלבון <td>פישר</td><td>A955-1</td><td></td></tr><tr><td>BCA (חומצה ביסינכונינית)</td> בדרגת LC-MS <td>פישר</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>חרוזים להכאת חרוזים, זירקוניה-סיליקה, 0.1 מ"מ</td><td>BioSpec Products</td><td>11079101z</td><td></td></tr><tr><td>בסטטין הידרוכלוריד</td><td>סיגמא</td><td>B8385-10MG</td><td></td></tr><tr><td>תרבית תאים DMEM (עם גלוקוז, ללא L-גלוטמין)</td><td>Lonza</td><td>12-614F</td><td></td></tr><tr><td>תרבית תאים EDTA, 500 מ"מ, pH8</td><td>Gibco</td><td>15575</td><td></td></tr><tr><td>תרבית תאים סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11550</td><td></td></tr><tr><td>תרבית תאים L-גלוטמין</td><td>Sigma</td><td>G8540-25G</td><td></td></tr><tr><td>תרבית תאים פוספט חוצץ מלח (PBS) pH 7.4</td><td>Gibco</td><td>10010-049</td><td></td></tr><tr><td>תרבית תאים טריפן כחול כדאיות, 0.4% w/v</td><td>Lonza</td><td>17-942E</td><td></td></tr><tr><td>סלומטר אוטומטי T4 מונה תאים</td><td>Nexcelom Bioscience</td><td>Cellometer אוטומטי T4</td><td></td></tr><tr><td>סלומטר אוטומטי T4 תאי ספירה חד פעמיים</td><td>Nexcelom Bioscience</td><td>CHT4-SD100-014</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td> <td>Sigma</td><td>D5545-5G</td><td></td></tr><tr><td>חומצה פורמית, כיתה LC-MS, אמפולות</td><td>פישר</td><td>A117-10X1AMP</td><td></td></tr><tr><td>המוציטומטר, משופר נויבאואר, עומק 0.1 מ"מ</td><td>Marienfeld-Superior</td><td>0640030</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, 1 M, pH 7.2</td><td>Mediatech</td><td>25-060-CI</td><td></td></tr><tr><td>חומצה הידרוכלורית, 37% w/w</td><td>VWR</td><td>BDH3028-2.5LG</td><td></td></tr><tr><td>יודואצטמיד</td><td>Sigma</td><td>I1149-5G</td><td></td></tr><tr><td>מבוסס לייזר מושך מיקרופיפטות</td><td>Sutter Instrument Co.</td>נימי סיליקה מצופים <td>P-2000</td><td></td></tr><tr><td>LC, 50 ומיקרו; m id</td><td>Polymicro Technologies</td><td>1068150017</td><td></td></tr><tr><td>בקבוקון LC, דגימה אוטומטית, 12 מ"מ x 32 מ"מ פוליפרופילן</td><td>SUN SRI</td><td>200-268</td><td></td></tr><tr><td>מכסה בורג בקבוקון LC, דגימה אוטומטית, PTFE/סיליקון לפני חריץ</td><td>SUN SRI</td><td>500-061</td><td></td></tr><tr><td>לוציפראז, מ- Photinus pyralis</td><td>Sigma</td><td>L9506-1MG</td><td></td></tr><tr><td>פפסטאטין A</td><td>EMD Millipore</td><td>516481-25MG</td><td></td></tr><tr><td>רצועות pH colorpHast (pH 0.0-6.0)</td> <td>EMD Chemicals</td><td>9586-1</td><td></td></tr><tr><td>קוקטייל מעכב פוספטאז</td><td>PhosStop Roche</td><td>04906837001</td><td></td></tr><tr><td>RapiGest SF</td><td>Waters</td><td>186001861</td><td></td></tr><tr><td>Sep-Pak SPE, C18 1 מ"ל 100 מ"ג מחסנית</td><td>Waters</td><td>WAT023590</td><td></td></tr><tr><td>Sep-Pak SPE, סעפת מיצוי, 20 עמדות</td><td>Waters</td><td>WAT200609</td><td></td></tr><tr><td>Sep-Pak SPE, נורת גומי שטוחה</td><td>פישר</td><td>03-448-25</td><td></td></tr><tr><td>נתרן הידרוקסיד (NaOH)</td> <td>פישר</td><td>S318-500</td><td></td></tr><tr><td>רכז ואקום SpeedVac</td><td>פישר</td><td>SPD111V</td><td></td></tr><tr><td>חומצה טריפלואורואצטית (TFA), LC-MS</td><td>כיתה פישר</td><td>A116-50</td><td></td></tr><tr><td>טריפסין, דרגת רצף,</td> שונה <td>צינור Promega</td><td>V5113</td><td></td></tr><tr><td> מסיר לצינורות מיקרוניים</td><td>USA Scientific</td><td>1765-4000</td><td></td></tr><tr><td>צינורות, 2 מ"ל מיקרוצנטריפוגה, פקק בורג טבעת O,</td><td>סטרילי Sarstedt</td><td>72.694.006</td><td></td></tr><tr><td>אוריאה</td><td>סיגמא</td><td>U0631-500 גרם</td><td></td></tr><tr>מים, <td>פישר</td><td>W6-1</td><td></td> <td>בדרגת LC-MS</td></tr></tbody></table>

תגובה נבחרת ניטור ספקטרומטריית מסה לכימות חלבון מוחלט

Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification

כימות מוחלט של חלבוני מטרה בתוך דגימות ביולוגיות מורכבות הוא קריטי למגוון רחב של מחקר ויישומים קליניים. פרוטוקול זה מספק הוראות שלב אחר שלב לפיתוח ויישום של בדיקות כמותיות באמצעות ספקטרומטריית מסה (MS) של ניטור תגובה נבחרת (SRM). ראשית, פפטידי מטרה קוונטוטיפיים סבירים מזוהים על סמך קריטריונים רבים. זה כולל זיהוי פפטידים פרוטאוטיפיים, הימנעות מאתרים של שינוי לאחר תרגום וניתוח הייחודיות של פפטיד המטרה לחלבון המטרה. לאחר מכן, תקני פפטידים חיצוניים גולמיים מסונתזים ומשמשים לפיתוח מבחני SRM, והבדיקות המתקבלות משמשות לביצוע ניתוחים איכותיים של הדגימות הביולוגיות. לבסוף, מוכנים תקני פפטידים פנימיים מטוהרים, מכומתים וכבדים עם תווית איזוטופים ומשמשים לביצוע מבחני SRM מסדרת דילול איזוטופים. מוצג ניתוח של כל נתוני הטרשת הנפוצה המתקבלים. פרוטוקול זה שימש כדי לבחון במדויק את השפע המוחלט של חלבונים במסלול האיתות הכימוטקסיס בתוך תאי RAW 264.7 (קו תאי מונוציטים/מקרופאגים של עכבר). הכימות של Gi2 (תת-יחידה α חלבון G הטרוטרימרי) מתואר בפירוט.

הפיתוח של מודלים חישוביים חזוי של מסלולי העברת אותות הוא אחת ממטרות היסוד של ביולוגיה מערכות 53. למרבה הצער, גם למסלולי איתות שנחקרו רב ויש לו משמעות קלינית גבוהה, זה עדיין בדרך כלל לא ניתן לחזות התנהגות כמותית מסלול בתגובה להפרעות (למשל, זה נכון לMAPK ERK המסלול / 54). לאחרונה, בחקירה מועסק פרוטאומיקה ממוקדת, transcriptomics, ומודלים חישוביים וסימולציה ללמוד chemotaxis מקרופאג עכבר מסלול איתות 56. מוקד החקירה היה chemotaxis תיווך sphingos...

פרוטוקול זה מתאר כיצד לבצע בדיקות כימות מוחלטות של חלבוני מטרה בתוך דגימות ביולוגיות מורכבות באמצעות ניטור תגובה נבחר. הוא שימש לכימות מדויק של חלבונים של מסלול האיתות הכימוטקסיס של מקרופאגים בעכבר. בחירת פפטיד יעד, פיתוח בדיקה ובדיקות איכותיות וכמותיות מתוארים בפירוט.

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא להשתמש במיצוי נוזלי עם ניטור תגובות נבחרות, או L-C-S-R-M, כדי לכמת את השפע המוחלט של חלבוני מטרה בתוך דגימות ביולוגיות מורכבות. לאחר בחירת פפטידי המטרה, מסנתזים סטנדרטים חיצוניים של פפטידים גולמיים ומשתמשים בהם לפיתוח בדיקות SRM באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית, ספקטרומטריית מסות, או LCM ms. הבדיקות המתקבלות משמשות לביצוע ניתוח lc, SRM איכותני של דגימות ביולוגיות שהוכנו.אם מזוהה הפפטיד מטרה המופק מהדגימה הביולוגית, הדגימות הביולוגיות מנותחות באמצעות בדיקות lc SRM כמותיות על ידי הוספת סדרת דילול של איזוטופים יציבים של סטנדרטים פפטידיים פנימיים. בסופו של דבר, ניתן להשתמש ב-lc SRM כדי לכמת במדויק חלבונים ממגוון רחב של דגימות ביולוגיות וכדי לתמוך בחקירות של מגוון רחב של חלבונים מטרה. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו בדיקות אימונו-ספציפיות (immunoassays) הוא שפיתוח הבדיקה הוא מהיר וזול יחסית, והבדיקות המתקבלות מתאימות למולטיפלקס (multiplexing) ואינן פגיעות לתגובת-אלב תגובת-צלב של נוגדנים.כדי להתחיל, הכין סטנדרטים של פפטידים ליאופיליים כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, הוסף 100 µL של תמיסת חומצה פורמית ואצטוניטריל לכל M של סטנדרט פפטידי ליאופילי כדי להגיע לריכוז פפטיד של 10 µM. ערבב את הדגימות במכשיר וורטקס למשך שתי דקות ובמקלחת.בצע סוניקציה למשך חמש דקות כדי להבטיח שהמסת הפפטידים הושלמה. השב את הפפטידים המומסים ורכז את התערובת שהתקבלה בריכז vacuum concentrator לנפח סופי של 80 microliters. הוסף 20 microliters של acetyl nitrile כדי להמיס כל פפטיד ששקע.המדגם מכיל כעת 10 µM מכל פפטיד, וכן 20% (נפח לנפח) אצטוניטריל, וניתן להשתמש בו להכנת סטנדרטים פנימיים וחיצוניים של פפטידים. יש לנתח את תערובות הסטנדרטים החיצוניים של הפפטידים בריכוז של כ-1 עד 10 pmol של כל פפטיד להזרקה באמצעות ספקטרומטריית מסות מסוג shotgun, תוך שימוש במערכת nano flow HPLC המחוברת לספקטרומטר מסות טריפל קוואדרופול. כפי שפורט בפרוטוקול הכתוב, יש לוודא שכל הרצה של LCMS כוללת גרדיאנט ליניארי של 60 דקות, שלב רגנרציה של העמודה ושלב איזון מחדש של העמודה. יש לנתח את נתוני ה-shotgun שהתקבלו באמצעות חיפוש במאגרי נתונים מול הרצפים של הסטנדרטים החיצוניים של הפפטידים.בצעו סקירה ידנית של כל זיהויי הפפטידים כדי להבטיח שכולם חד-משמעיים, והסילו כל זיהוי פפטידי מעומעם. השתמשו בזיהויי הפפטידים משיטת ה-shotgun MS כדי לבנות ספריית ספקטרום באמצעות תוכנה כגון Skyline. הכינו רשימת מעברים ל-lc SRM המבוססת על שלושת עד עשרת המעברים העוצמתיים ביותר לכל יון קדם (precursor ion).השתמש ברשימות המעברים שהתקבלו כדי לבצע אנליזת lc SRM של תערובות סטנדרטים של פפטידים חיצוניים. עיין באופן ידני בנתוני ה-L-C-S-R-M שהתקבלו ומחק כל בדיקה שביצועיה אינם מספקים. להכנת הדגימות הביולוגיות.ראשית, קצרו את התאים כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט. הוסיפו 400 µL של תמיסת Urea lysis buffer שהוכנה טרי, וערבבו כל דגימה באמצעות פיפוט עדין. העבירו כל דגימה לשפופרת של 2 mL בעלת מכסה הברגה עם O-ring המכילה כ-100 µL של חרוזי Zirconia silica בגודל 0.1 mm, ובצעו ליזה של התאים על ידי vortexing של הדגימות למשך חמש דקות במהירות מקסימלית.בצעו סוניקציה לדגימות למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר כדי לסייע בהומוגניזציה ובדנטורציה של החלבונים. לאחר מכן, בצעו בדיקת ריכוז חלבון של הליזטים, כגון בדיקת BCA לניתוח איכותי. הכינו אליקוטים של 200 µg של ליזאט תאים עבור סדרת דילול של איזוטופים יציבים.הוסיפו לדגימות את סדרת הדילול של האיזוטופים היציבים מהתערובת המולרית של פפטידי התקן הפנימיים. רדו את שאריות הציסטאין בחלבון על ידי הוספת 0.7 µL של DTT בריכוז 1 M לכל דגימה, ודגירה של הדגימות בטמפרטורה של 60 °C למשך 30 דקות. בצעו אלקילציה של הציסטינים בחלבון על ידי הוספת 7 µL של iodoacetamide בבופר לכל דגימה ודגירה של הדגימות בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות בחשיכה.עבור כל אחת מהדגימות, הוסף 482 µL של hees 100 mM שהותאם עם סודיום הידרוקסיד כך שריכוז העוריאה הסופי יהיה 1 M. לאחר מכן, בצע עיכול של החלבונים לפפטידים בשלישויות. הוסף 8 µL של trypsin בדרגת רצף בריכוז 0.5 µg/µL לכל דגימה המכילה ליזאט של תאים.לאחר מכן, דגרו את הדגימה בטמפרטורה של 37 °C למשך 18 שעות. לאחר הדגירה, הוסיפו 440 µL של חומצה פורמית בריכוז 2% v/v וסובבו את כל הדגימות בצנטריפוגה במהירות של 21,000 G למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר כדי לשקע משקעים שעלולים לסתום עמודת C 18 SPE. חלצו כל אחד מנוזלי העל (supernatants) באמצעות עמודת C 18 SPE חד-פעמית.הרטיבו את העמודה על ידי הוספת 1 ml של באפר B והשילו אותה על ידי הוספת 1 ml של באפר A פעמיים. דחפו את הפאזות הניידות דרך מחסנית C 18 SPE באמצעות משטח שטוח, נורית גומי ומניפולטור להפקה. הוסיפו את הדגימה ולאחר מכן שטפו את המחסנית עם 1 ml של באפר A פעמיים; אלוטו את הפפטידים על ידי הוספת 1 ml של באפר B. רכזו לאט כל תסנין במרכז ריכוז ואקום לנפח סופי של 100 µL כדי לאדות את ה-acetyl nitrile.לאחר מכן, הוסיפו שני מיקרוליטרים של חומצה פורמית בריכוז 5% (נפח לנפח) באצטוניטריל לכל דגימה. נתחו את הדגימות באמצעות L-C-S-R-M איכותית כפי שבוצע קודם לכן. לצורך ניתוח L-C-S-R-M כמותי, הריצו את סדרת דילול האיזוטופים של כל דגימה ביולוגית; נעשה שימוש בשיטת שוטגאן למספקטרומטריית מסות כדי לנתח את סטנדרטי הפפטיד החיצוניים.עשרה המעברים בעלי העוצמה הגבוהה ביותר לכל פרקורסור נבחרו עבור L-C-S-R-M. לאחר מכן נעשה שימוש ב-L-C-S-R-M כדי לנתח את תקני הפפטידים החיצוניים. זיהויי הפפטידים שהתקבלו צריכים להיות חד-משמעיים.ניתוח L-C-S-R-M איכותי של הדגימות הביולוגיות הוביל בדרך כלל ליותר רעש רקע, אך רוב יעדי הפפטידים זוהו בוודאות. ניתוח L-C-S-R-M כמותי בוצע באמצעות סטנדרטים פפטידיים פנימיים שהוחדרו לדגימות הביולוגיות. ערכי שכיחות החלבון שהתקבלו היו עקביים בין החזרות הביולוגיות ובין שני הפפטידים המטרות עבור כל חלבון מטרה.לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעבירים להבנה טובה של אופן הפיתוח והביצוע של בדיקות L-C-S-R-M לצורך כימות השפעות המוחלטת של חלבוני מטרה בתוך דגימות ביולוגיות מורכבות.

selected-reaction-monitoring-mass-spectrometry-for-absolute-protein

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

תקנים איזוטופ יציב ו ללכוד על ידי Anti-פפטיד נוגדנים (SISCAPA) זוגות להעשרת הזיקה של פפטידים עם איזוטופ יציב דילול ספקטרומטריית מסה (MRM-MS) כדי לספק מדידה כמותית של פפטידים כתחליפי עבור חלבונים, בהתאמה. כאן אנו מתארים את פרוטוקול באמצעות חלקיקים מגנטיים בפורמט אוטומטיות חלקית.

כימות של חלבונים באמצעות העשרה Immunoaffinity פפטיד יחד עם ספקטרומטריית מסה

אנו מציגים פרוטוקול לזיהוי וכימות הרכיבים בתערובות של מינים בעלי חלבונים דומים. ספקטרומטריית מסה מזהה פפטידים לזיהוי, ונותנת כימות יחסי לפי יחסים של אזורי שיא. ככלי לזיהוי הונאה, השיטה יכולה לזהות 1% סוס בבשר בקר.

נחישות כימות המינים בשנת תערובות שימוש ספקטרומטריית מסה MRM של פפטידים יישומית כדי אימות בשר

כאן, אנו מתארים assay כרומטוגרפי בשילוב עם ההפרדה ניידות יון של פפטיד מבשרי ואחריו ברזולוציה גבוהה (~ 30,000) MS-הזיהוי של פפטיד קטעים על כימות של פפטיד מחודדים הסטנדרטים של נוגדן חד שבטי תקציר.

וזמינותו HS-MRM עבור כימות של התא המארח חלבונים בחלבון ביופרמצבטיקה באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית יון ניידות QTOF ספקטרומטר מסה

פרוטוקול מיצוי מקיף של שומנים, מטבוליטים חלבונים מ רקמות ביולוגיות באמצעות מדגם אחד מוצג.

שיטה פשוטה הפיצול מופץ לניתוח מקיף של מטבוליטים, שומנים וחלבונים מדגם יחיד

אנו מציגים פרוטוקול מדויק quantitate חלבונים עם תוויות isobaric, fractionation נרחב, ושפור צעדים בקרת איכות בשילוב עם כרומטוגרפיה נוזלית לממשק כדי בספקטרומטר ברזולוציה גבוהה.

פרוטאום עמוק פרופיל על ידי תיוג Isobaric, מקיף כרומטוגרפיה נוזלית, ספקטרומטר מסה תוכנה בסיוע כמת

כאן, אנו מציגים פרוטוקול יציב כדי לכמת 40 תרכובות מעורב מטבוליזם פחמן מרכזי ואנרגיה בתגובות סינתזה של חלבון-ללא תא. תערובת הסינתזה התאית היא ללעג עם אנילין להפרדה אפקטיבית באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בשלב היפוך, ולאחר מכן כימות על-ידי ספקטרומטר מסה באמצעות מisotopically מתויג בתקנים פנימיים.

קוונפיקציה מוחלטת של מטבוליזם החלבון ללא שימוש בפרוטאין על-ידי היפוך-שלב נוזלי כרומטוגרפיה המסה-ספקטרומטריה

הפרוטוקול המתואר מספק ניתוח פרוטאומי כמותי ממוטב של דגימות רקמה באמצעות שתי גישות: כמות מבוססת תווית וללא תווית. לגישות מבוססות תוויות יש יתרון של כמות מדויקת יותר של חלבונים, בעוד שגישה נטולת תוויות חסכונית יותר ומשמשת לניתוח מאות דגימות של קבוצה.

זרימת עבודה מקיפה של פרוטאומיקת רובה ציד מבוססת ספקטרומטריה של דגימות רקמה

הפרוטוקול נועד להציג את השימוש בספקטרומטר מסה מרובע משולש לניטור תגובה מרובה (MRM) של חלבונים מדגימות קליניות. סיפקנו זרימת עבודה שיטתית החל מהכנת מדגם לניתוח נתונים עבור דגימות קליניות עם כל אמצעי הזהירות הדרושים שיש לנקוט.

זרימת עבודה של פרוטאומיה כמותית באמצעות זיהוי מבוסס ניטור תגובה מרובה של חלבונים מרקמת המוח האנושית

ארגינין חלבון (R)-מתילציה הוא שינוי פוסט-תרגומי נרחב המווסת מסלולים ביולוגיים מרובים. ספקטרומטריית מסות היא הטכנולוגיה הטובה ביותר ליצירת פרופיל עולמי של R-מתיל-פרוטאום, כאשר היא משולבת לגישות ביוכימיות להעשרת פפטידים מותאמים. תהליך העבודה המיועד לזיהוי בביטחון גבוה של מתילציה גלובלית של R בתאים אנושיים מתואר כאן.

גישה פרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריית מסות לניתוח R-מתילציה של חלבונים גלובליים ובביטחון גבוה

מוצג פרוטוקול לקביעת סמנים ביולוגיים בשפע נמוך מדגימות סרום מיובשות שהודגמו עם הסמן הביולוגי פפטיד משחרר פרוגסטרין (ProGRP). חרוזים מגנטיים מצופים נוגדנים משמשים לניקוי והעשרה סלקטיביים של פפטיד ProGRP פרוטאוטיפי. הפפטיד שנלכד מנותח לאחר מכן על ידי ספקטרומטריית מסה כרומטוגרפית נוזלית-טנדם.

מיקרו-דגימה בניתוח חלבונים ממוקד מבוסס ספקטרומטריית מסה של חלבונים בעלי שפע נמוך

למד כיצד לכמת חלבונים בדגימות ביולוגיות מורכבות באמצעות ניטור תגובה נבחרת (SRM) וכרומטוגרפיית נוזלים. שיטה זו מאפשרת ניתוח מרובה ומדויק של חלבוני מטרה במערכות ביולוגיות שונות.

תגובה נבחרת ניטור ספקטרומטריית מסה לכימות חלבון מוחלט

גלה סרטונים נוספים