קביעת חומצות שומן החמצון וLipogenesis בעכבר העיקרי hepatocytes

המטרה הכללית של הליך זה היא להעריך את חילוף חומצות השומן בכבדי עכברים ראשוניים. זאת משיגים תחילה על ידי ביצוע פרפוזיה לכבד של עכבר באמצעות תמיסת עיכול, הוצאת הכבד ולאחר מכן בידוד ההפטוציטים. השלב השני הוא גידול של ההפטוציטים על פלטות מצופות קולגן.

בשלב הבא, התאי הכבדיים (hepatocytes) מטופלים בהתערבויות הניסיוניות לבדיקה. השלב הסופי הוא דגירה של התאים בנוכחות תסס (substrate) מסומן רדיואקטיבית. לבסוף, נעשה שימוש בניתוח שנילציה נוזלית (liquid scintillation analysis) כדי להראות את ההשפעות של התערבויות פרמקולוגיות או גנטיות שונות על חמצון חומצות שומן או על ליפוגנזה בתאי כבד ראשוניים.

שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה למספר שאלות מפתח בתחומי המטבוליזם והסוכרת, כולל השפעתן של התערבויות פרמקולוגיות וגנטיות ספציפיות על הביולוגיה של ההפטוציטים. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית משתי סיבות: ראשית, קשה להשיג תנאי פרפוזיה ספציפיים המשפיעים על בריאות ההפטוציטים, ושנית, בגין הכמתת פליטת הפחמן הדו-חמצני.

גזים אינם אינטואיטיביים. את הפרוצדורה זו יעמיד טום אקיי, סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלי. הגדירו את משאבת הפריסטאלטיקה על ידי הנחת קצה אחד של צינור סטרילי בתוך תמיסת פרפוזיה לכבד שחוממה מראש, ואת הקצה השני בתוך מיכל פסולת.

הפעל את המשאבה עד שכל אורך הפ stipulating הצינור יתמלא במצע. לאחר הקרבת העכבר הרלוונטי, רסס בנדיבות את בטן העכבר ב-70% ethanol. לאחר מכן, השתמש במספריים בעלי קצה קהה כדי לבצע חתך בקו האמצע דרך הדרמיס, לאורך הבטן, וקפל את העור לצדדים.

בצעו חתך דומה בפריטוניאום (peritoneum) כדי לחשוף את האיברים הפנימיים. בעזרת מכשיר קהה, הזיזו בעדינות את המעיים. כדי לחשוף את כלי הדם הבטניים, אתרו את הווריד הנבוב התחתון הבטני (abdominal inferior vena cava) והניחו תפר מתחת לכלי הדם, דיסטלית לווריד הכליתי, דיסטלית לתפר.

החדר מחט וקתטר אל תוך הונה הקאווה התחתונה (inferior vena cava) והעבר אותם מעבר לתפר. כאשר המחט עדיין במקומה, קשור את התפר סביב הקתטר כדי לקבע אותו, ולאחר מכן הוצא בזהירות את המחט. במידה והתהליך בוצע נכון, דם יזרום דרך הקתטר באמצעות פיפטה.

מלאו את השטח הנותר בקטטר בתמיסות פרפוזיה וודאו שאין בתוכו בועות אוויר. לאחר מכן, בזהירות רבה, חברו את הצינור לקטטר. בשלב הבא, נקבו בזהירות את הסרעפת באמצעות מספריים בעלי קצה חד ובצעו חתך צדי כדי לחשוף את חלל הפלאורה.

תוך הקפדה להימנע מנזק לכיס המרה ולכלי הדם הפלאורליים, מקמו תפס בולדוג (bulldog clamp) סביב הווריד הנבוב התחתון בחזה, ממש פרוקסימלית לווריד הכבדי. לאחר מכן, חתכו את וריד השער והפעילו את המשאבה בקצב של 3 עד 4 milliliters לדקה. בצעו פרפוזיה לכבד באמצעות תמיסת פרפוזיה לכבד למשך חמש דקות, תוך שימוש בכ-20 milliliters של תמיסת הפרפוזיה.

במהלך זמן זה, עקבו אחר שינוי הצבע המיידי של הכבד מאדום לצבע חום-אפור. אם חלקים מהכבד נותרים אדומים, הדבר מעיד על פרפוזיה לקויה והסיכוי לבידוד מוצלח פוחת משמעותית. לאחר חמש דקות של פרפוזיה, עצרו את המשאבה והעבירו את הצינורות לתווך עיכול כבד.

הפעל מחדש את המשאבה ובצע פרפוזיה לכבד למשך 10 עד 15 דקות נוספות. בקצב של שלושה עד ארבעה מיליליטרים לדקה עד למיצוי התווך. בסיום הפרפוזיה, עצור את המשאבה.

הכבד אמור להיות בעל גוון ורדר and להיראות מוגדל מעט. בשלב זה, הוצא את הכבד באמצעות דיסקציה זהירה. העבר אותו לכלי תרבית רקמות של 10 סנטימטר והסר את כיס המרה.

בשלב הבא, הוסיפו 10 milliliters של מצע זריעה לכבד, והתחילו לגרד בעדינות את הכבד באמצעות סקאלפל. כדי להפיק את ההפטוציטים, סננו את התוךית באמצעות מסנן תאים של 100 micron והעבירו אותה למבחנה קונית של 50 milliliter. שטפו את הצלחת עם 10 milliliters נוספים של מצע זריעה והעבירו את הנוזל למבחנה הקונית של 50 milliliter.

לאחר מכן, השקיעו את התאים בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס באמצעות סרכזפוגה למשך חמש דקות ב-350 Gs, שאבו את המצע והשעיו שוב את משקע התאים ב-10 milliliters של מצע זריעה. לאחר מכן, הוסיפו 10 milliliters של 90% colloidal silica מצופה ב-polyvinyl perone, ערבבו בעדינות, והשקיעו שוב את התאים כפי שבוצע קודם לכן. לאחר הסרכזפוגה, שאבו את שכבת התאים המתים הצפה בחלקו העליון של התערובת.

לאחר מכן, שטפו פעמיים את משקע התאים החיים עם 20 milliliters של מצע זריעה. השביו את משקע התאים הסופי ב-10 milliliters של מצע זריעה וספרו את התאים באמצעות המוציטומטר. הניחו 90,000 תאים לבאר בצלחות תרבית של 24 בארות מצופות קולגן. דגרו את הצלחות בטמפרטורה של 37 °C וב-5% carbon dioxide למשך שעתיים, 16 עד 20 שעות לפני תחילת הבדיקה.

שטוף את התאים פעמיים ב-PBS חמים והעבר את התאים לתווך הרעבת סרום נטול סרום עם 20 nanomoles של glucagon. הדגר את התאים למשך לילה בטמפרטורה של 37 degrees Celsius ו-5% carbon dioxide בבוקר הבדיקה.

הכינו מצע דגירה מקדימה ולאחר מכן החליפו למצע להרעבת סרום. מצע עבור מצע הדגירה המקדימה. דגרו את התאים בתערובת זו בטמפרטורה של 37 °C ו-5% carbon dioxide למשך שעתיים במהלך הדגירה.

ייבשו 0.5 micro curies לבאר של C 14 palmitate על ידי אידוי ממס האתנול תחת חנקן כ-15 דקות לפני סיום הדגירה. השביבו מחדש את ה-C 14 palmitate בריכוז של 12.5 microliters ל-micro curie ב-0.1 Normal sodium hydroxide. דגרו את התערובת בטמפרטורה של 70 degrees Celsius למשך 10 דקות. לאחר מכן, הוסיפו שלושה נפחים של מצע דגירה מקדימה חם, ועזבו על ידי שאיבה והזרקה חוזרת (pipetting up and down).

הוסיפו לכל באער 25 µL של תערובת C 14 palmitate מדוללת על ידי ניעור עדין של הפלטה, והדגירו בטמפרטורה של 37 °C למשך 90 דקות. זוהי פלטת הבדיקה. במהלך הדגירה, הסירו את המכסה מפלטה סטרילית בעלת 24 באערים והניחו בכל אחד מהבאערים פיסת נייר סינון בגודל 2 ס"מ על 2 ס"מ בתחתית. לאחר מכן, כסו את הפלטה בפיסת פאראפילם במידות של 4 אינץ' על 7 אינץ' בעזרת חפץ מלבני גדול, כגון קופסת טיפים של מיקרופיפטה.

שפשפו את הפראפורם על הבארות כדי לנקב את הפראפורם בפתחי הבארות וליצור אטימה על שאר הפלטה. לאחר מכן, הסירו את עיגולי הפראפורם הניקובים. כעת, 10 דקות לפני סיום הדגירה, הוסיפו 200 µL של נתרן הידרוקסיד בריכוז 3N לכל בארה בפלטת נייר המסנן, תוך וידוא שנייר המסנן סופג את כל הנוזל.

בסיום הדגירה, הקפיאו במהירות את פלטת הבדיקה בחנקן נוזלי. לאחר מכן, הוסיפו 100 microliters של 70% perchloric acid לכל באר בפלטת הבדיקה. כסו מיד בנייר סינון והניחו את הפלטות על מנער אורביטלי.

נער את הפלטות במהירות מסלולית של 80 RPM בטמפרטורת החדר למשך שעתיים. לאחר מכן, מדוד את חלקו של הפחמן הדו-חמצני על ידי העברת ריבועי נייר המסנן לתוך 4 mL של נוזל סינלציה בבקבוקוני סינלציה, ומדוד את אות ה-C 14 במונה סינלציה כדי למדוד את החומר המסיס בחומצה. העבר 400 µL של מצע לשפופרת מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 mL, צנטריפוגה במהירות מרבית למשך 10 דקות, ולאחר מכן הוסף 100 µL מהעל-נוזל שהתקבל ל-500 µL של תערובת של כלורופורם ומתנול ביחס של שניים לאחד.

ערבבו את התערובת במיקסר וורטקס (Vortex) לזמן קצר, ולאחר מכן הוסיפו לתערובת 250 µL של מים וערבבו שוב בוורטקס. שוב, סנטריפיגו את הדגימות למשך 10 דקות ב-1000 ×g. לאחר מכן, העבירו 200 µL מהפאזה העליונה לתוך 4 mL של נוזל סינטילציה נזיל בתוך מבחורת סינטילציה, ומדדו את אות ה-C 14 לאחר הרעבת סרום של התאים. העבירו את התאים למצע ליפוגנזה.

הוסיפו כל תרכובת רצויה לבדיקה, ולאחר מכן דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 °C וב-5% carbon dioxide למשך שעתיים לאחר תקופת הדגירה. שטפו את התאים פעמיים עם PBS לפני ליזיס התאים על ידי הוספה של 120 µL של חומצה כלורית 0.1 N. בכל באר, גרדו את התכולה כדי לשחרר את הליזאט, ולאחר מכן העבירו באמצעות פיפט 100 µL מהליזאט למבחנת מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 mL.

בשלב הבא, הוסיפו 500 µL של תערובת ביחס של שניים לאחד של כלורופורם ומתנול לכל מבחנה. ערבבו קצרות במערבל Vortex, ולאחר מכן דגרו בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. לאחר הדגירה, הוסיפו 250 µL של מים, ערבבו במערבל Vortex, ולאחר מכן דגרו את הדגימה למשך חמש דקות נוספות בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, סבבו את הדגימות בצנטריפוגה למשך 10 דקות ב-3000 Gs. העבירו בזהירות את הפאזה התחתונה של הנוזל המופרד אל תוך 4 milliliters של נוזל סינטילציה בבקבוק סינטילציה (scintillation vial), ומדדו את פעילות הטריטיום באמצעות מונה סינטילציה. הליך זה מביא בדרך כלל לבידוד של 10 עד 30 מיליון הפטוציטים לכל עכבר. לאחר דגירה למשך לילה, תאים בריאים ייראו משושים, ורבים מהם יהיו בעלי גרעין.

תרביות שאינן בריאות מכילות לעיתים גרנולציות או שלפוחיות (blebs), המעידות על מוות תאי. תוצאות של בדיקת חמצון חומצות שומן מוצגות כאן, כאשר השפעתם של F-C-C-P-A, מעודד נשימה תאית, ושל oligomycin, מעכב נשימה, הושוו לקבוצת ביקורת (vehicle control) כדי למדוד חמצון מלא. היחס בין פחמן דו-חמצני לחומר מסיס בחומצה מחושב.

חומרים המעודדים נשימה תאית, כגון FCCP, יעבירו יחס זה לכיוון הפחמן הדו-חמצני, מה שיעיד על חמצון רב יותר דרך מעגל ה-TCA. מעכבים של שרשרת הנשימה יפחיתו את החמצון באופן כללי בעת המדידה. עבור תרכובים המשפיעים על פעילות הליפואסיד (lipo activity), חומרים המגבירים חמצון של חומצות שומן, כגון FCCP, או חומרים המפחיתים סינתזה של ATP, כגון oligomycin, יפחיתו את פעילות הליפואסיד בהפטוציטים בתרבית בהשוואה לבקרי הרכב (vehicle controls). בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב להבטיח שהפרפוזיה תתבצע באופן מלא ובזמן קצר לאחר הקרבת בעל החיים.

בנוסף, במהלך בדיקת חמצון חומצות השומן, הקפאה מלאה של המצע היא קריטית לקבלת מדידות הדירות של גז פחמן דו-חמצני. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן בידודם של הפטוציטים ראשוניים, וכן כיצד להשתמש בתאים אלו כדי לנתח חמצון חומצות שומן וליפוגנזה in vitro.