Name: קביעת חומצות שומן החמצון וLipogenesis בעכבר העיקרי hepatocytes (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-27T15:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 11 s
Description: חקור מטבוליזם של חומצות שומן בפיטומים עכבריים ראשוניים באמצעות בידוד תאי כבד ותרבות על צלחות מצופות קולגן. שיטה זו מאפשרת כימות חמצון חומצות שומן וליפוגנזה לחקר הפרעות מטבוליות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

ברצוננו להודות לסוזן גריי ולאומדווי צ'לאסאני על עזרתם בהיבטים הטכניים של פרוטוקול בידוד הפטוציטים. עבודה זו נתמכה על ידי מענק NIDDK 5R01DK089185 (ל-M.P. Cooper) ותוכנית הפיילוט וההיתכנות של DERC ב-UMMS (ל-M.P. Cooper).

כל הניסויים בבעלי החיים צריכים להתבצע בהתאם לתקנות פדרליות ומקומיות ובאישור של ממשל IACUC ובטיחות קרינה מוסדי. 1. הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כמה ימים לפני assay, להפשיר את בקבוק 500 מיליליטר של כבד Digest בינוני (LDM) וrefreeze ~ 35 aliquots מיליליטר ב 50 מיליליטר צינורות חרוטי. חנות ב -20 ° C עד צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום אחד לפני assay, מראש לעקר כלים לנתיחה נקיים על ידי החיטוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום של assay, טיפול הסכום הדרוש של צלחות תרבות 24 גם עם קולגן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים חלק 1 של קולגן זנב חולדה / מיליליטר 3 מ&quot;ג עם 50 חלקים של PBS. להוסיף כ 500 μl היטב בכל צלחת 24 גם דגירה של 3-5 דקות בטמפרטורת חדר (RT). הסר את הקולגן ולאפשר צלחת לייבוש באוויר במכסת מנוע. חזור על לפחות פעם אחת נוספת. הערה: ציפוי קולגן יכול להתבצע עד שבוע במודעהאנס וצלחות מאוחסנים על 4 מעלות צלזיוס אטומות בניילון הנצמד. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן LDM עבור assay: LDM הפשירי וחמה עד 37 מעלות צלזיוס ולהתאים את ה- pH 7.4 באמצעות 1 N KOH. מסנן באמצעות מסנן מזרק 0.2 מיקרומטר ומקום באמבט מים 42 מעלות צלזיוס הסירקולציה המחודשת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 25 מיליליטר חם של כבד זלוף בינוני עד 42 מעלות צלזיוס באמבט מים הסירקולציה המחודשת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 90% סיליקה colloidal מצופים פתרון polyvinylpyrrolidone: הוסף 1 מיליליטר של 10x DPBS עד 9 מיליליטר של סיליקה colloidal מצופה polyvinylpyrrolidone. התאם ל- pH 7.4 באמצעות 0.1 N HCl. סנן עם מסנן מזרק 0.2 מיקרומטר סטרילי. אחסן בRT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינוני ציפוי חם עד 37 מעלות צלזיוס. </li></ol> 2. בידוד של יסודי העכבר hepatocytes <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את משאבת peristaltic, צינורות, ושולחן נתיחה: לעקר צינורות על ידי שטיפה עם אתנול 5 מיליליטר 70% במים מזוקקים, ואחריו 10 מיליליטר של מים סטריליים. מניחים צינורות בכבד זלוף בינוני ומשאבה לרוץ למלאלכל אורך צינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקריב עכבר בשיטה אושרה מוסדי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח פתוח חלל הבטן: ספריי בטן העכבר בנדיבות עם אתנול 70%. בעזרת מספריים קהה-סוף, לעשות חתך קו האמצע דרך העור באורך של הבטן ומשקפים רוחבי. לעשות חתך דומה בהצפק לחשוף את הקרביים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במכשיר קהה, בעדינות לעקור את המעיים כדי לחשוף את כלי הדם בבטן אתר את הווריד הנבוב הנחות הבטן (IVC) ומקום תפר מתחת לכלי הדם, דיסטלי לוריד הכליה </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דיסטלי לתפר, למקם את מחט וצנתר לתוך IVC, קידומה מעבר לרמה של התפר. עם המחט עדיין במקום, לקשור את התפר סביב קטטר להחזיק אותו במקום. מוציא בזהירות את המחט. אם נעשה בצורה נכונה, דם עם זרימה דרך קטטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות pipet, למלא את השטח שנותר בצנתר עם מדיום זלוף, הבטחהשאין אוויר הוא הווה. בזהירות רבה, לצרף את צינורות לקטטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח פתוח חלל הריאות: בעדינות משקף את האונה של הכבד מעולה לחשוף את הסרעפת. לנקב בזהירות הסרעפת במספריים קצה חד, אז לעשות חתך לרוחב כדי לחשוף את חלל פלאורלי, לטפל כדי למנוע כיס המרה וכלי דם פלאורלי. הנח מהדק בולדוג סביב הווריד הנבוב הנחות החזה רק הפרוקסימלי לווריד הכבד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את וריד השער ולהפעיל את המשאבה ב3 - 4 מיליליטר / דקה. Perfuse את הכבד עם כבד זלוף בינוני במשך 5 דקות באמצעות כ 20 מיליליטר של מדיום זלוף. הערה: הכבד צריך לשנות באופן מיידי מאדום לאפור / שיזוף. אם החלקים של הכבד יישארו אדומים, זה סביר מציין זלוף העני, ואת הסבירות של בידוד מוצלח היא פחת באופן משמעותי. במהלך זלוף, להיות זהיר כדי להבטיח בינוני לא נגמר ושאין בועות להיכנס לצינורות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדגירה 5 דקות, לעצורהמשאבה ולהעביר את צינורות לכבד Digest בינוני. הפעל מחדש את המשאבה ותנקב את הכבד לעוד 10 - 15 דקות (עד שהמדיום הוא מותש). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסופו של זלוף, לעצור את המשאבה. הכבד צריך להיות גוון ורדרד ומופיע מוגדל במקצת. בלו הכבד על ידי נתיחה זהירה. הסר את כיס המרה ולהעביר את הכבד לצלחת תרבית רקמת 10 סנטימטרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בארון בטיחות ביולוגית, להוסיף 10 מיליליטר של ציפוי בינוני (טבלה 1) בכבד. בעדינות לגרד את הכבד או באמצעות מלקחיים או אזמל כדי להסיר את hepatocytes. סנן את ההשעיה באמצעות מסננת תא 100 מיקרומטר ולהעביר צינור חרוטי 50 מיליליטר. לשטוף את הצלחת עם תוספת של 10 מיליליטר של ציפוי בינוני ובריכה בצינור חרוטי 50 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה התאים על ידי צנטריפוגה 5 דקות ב 350 XG, 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינוני לשאוב וגלול גלולים ב 10 מיליליטר של ציפוי בינוני ולהוסיף 10 מיליליטר של 90% סיליקה colloidal מצופה פוlyvinylpyrrolidone. מערבבים בעדינות וצנטריפוגה כמו בשלב 2.11. לאחר צנטריפוגה, שכבה של תאים מתים תהיה צף על גבי התערובת, בעוד התאים חי גלולה לתחתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב תאים מתים ובינוני. לשטוף 2 פעמים עם 20 מיליליטר של ציפוי בינוני, צנטריפוגות כמו ב2.11. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי Resuspend ב 10 מיליליטר של ציפוי בינוני. ספירת תאים עם hemocytometer ומקום 9 x 10 4 תאים / גם בתרבות מנות 24 גם טופל קולגן. דגירה בתרבית רקמת חממת 37 ° C עבור שעה 2. כל צלחת יכולה לשמש גם עבור assay חומצות שומן החמצון או assay Lipogenesis. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, לשנות את הבארות לתחזוקה בינונית (טבלה 1) ותרבות על 37 מעלות צלזיוס. תאים יכולים להיות מתורבת עבור 2 - 3 ימים מבלי להשפיע על תוצאות assay. </li></ol> 3. חומצות שומן החמצון Assay אזהרה: שימוש בקרינה רדיואקטיבית יכול להיות מסוכנת. כל הרכישה, האחסון, הטיפול, ודיsposal של חומר רדיואקטיבי צריכה להתבצע בהתאם למדינה, תקנות מוסדיות, ופדרליות והנחיות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 16 - 20 שעות לפני assay, לשטוף תאים 2 פעמים עם PBS החם. לשנות את התאים לסרום רעב בינוני סרום ללא (טבלת 1) עם 20 ננומטר גלוקגון ודגירת הלילה על 37 מעלות צלזיוס. הערה: מאחר בסרום שור עוברי מכיל ריכוז לא ידוע של הורמונים מטבוליים (למשל אינסולין, גלוקגון), סרום להרעיב את התאים כדי להסיר כל תופעות בלבול זה יכול להיות על assay. תאי קיימא בסרום רעב בינוני ל&gt; 24 שעות. טיפול גלוקגון משמש כדי לעורר חמצון של חומצות שומן בתאים הכבדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בבוקרו של assay, להכין טרום דגירה בינונית: Resuspend כמות מתאימה של נתרן Palmitate במי ultrapure לעשות פתרון 100 מ&quot;מ וחום עד 70 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. בינתיים, מכין את הסכום הנדרש (0.5 מיליליטר לכל גם צלחת 24 גם)של DMEM עם 25 HEPES מ&quot;מ, 1% V בר BSA, ו -20 ננומטר גלוקגון. חום עד 37 מעלות צלזיוס. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שsolubilized, להוסיף Palmitate לריכוז סופי של 250 מיקרומטר עד הבינוני. לשנות hepatocytes מראש דגירה בינונית ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 2. שומר כמה טרום דגירה בינונית על 37 מעלות צלזיוס לשימוש מאוחר יותר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך הדגירה, לייבש כמות מתאימה של 14 C-Palmitate (0.5 μCi / טוב) על ידי אידוי תחת גז חנקן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדוגמה, כדי למדוד 24 דגימות בצלחת 24 גם, להעביר 120 μl של 0.1 μCi / מיליליטר 14 C-Palmitate לצינור 1.5 מיליליטר. לאט להתאדות אתנול הממס על ידי פיצוץ גז חנקן על הפתרון ממרחק של 3-5 סנטימטר במנדף. הממס צריך להתאדות בכ 30 - 40 דקות, והשאיר 14 C-Palmitate היבש בחלק התחתון של הצינור. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כ -15 דקות לפני תום הדגירה, resuspend 14C-Palmitate ב 0.1 N NaOH (12.5 μl / μCi). לדגור על 70 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. להוסיף שלושה כרכים של חמה טרום דגירה בינונית ומערבבים על ידי pipetting למעלה ולמטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספייק כל טוב עם 25 μl של דילול 14 C-Palmitate. מערבבים בעדינות על ידי הנדנדה הצלחת ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 90 דקות. זהו פלייט Assay. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך הדגירה, להכין צלחת נייר סינון (איור 1). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המכסה מצלחת 24 גם סטרילי. הנח סנטימטר אחד 2 פיסת נייר סינון x 2 סנטימטר בחלק התחתון של כל אחד מהבארות. כיסוי הצלחת עם חתיכת 4 &quot;x 7&quot; parafilm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש באובייקט מלבני גדול, כגון תיבת קצה micropipettor, לשפשף את parafilm על הבארות ללנקב parafilm בפתחים היטב וליצור חותם על פני יתרת הצלחת. הסר את העיגולים המחוררים של parafilm עכשיו מכסים את הבארות. הצלחת צריכה עכשיו להיות מכוסה היטב עם parafilm בכל התחומים למעט o גםpenings. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10 דקות לפני סוף הדגירה, להוסיף 200 μl של 3 N NaOH היטב בכל צלחת נייר הסינון, כדי לוודא שנייר הסינון סופג את כל הנוזלים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין לפני ההקפאה, להעביר את המדיום לצלחת 24 גם טרי. לאחר שטיפת פעם עם PBS, lyse התאים שנותרו ב0.1 N HCl ולחשב את תכולת חלבון על ידי assay BCA. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסוף הדגירה, snap-להקפיא פלייט Assay בחנקן נוזלי. להיות זהיר כדי להבטיח היטב כל קפוא לחלוטין לפני שתמשיך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 70% חומצת perchloric 100 μl היטב בכל צלחת Assay. מייד לכסות עם צלחת נייר סינון. מקם את הצלחות בייקר מסלולית ורוק במהירות סיבובית של 80 סל&quot;ד ב RT עבור שעה 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדגירה, לעבד את הדגימות: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למדוד את חלק CO 2, להעביר את ריבועי נייר סינון 4 מיליליטר נוזל נצנץ נוזלי בנצנץבקבוקון ואות C מידת 14. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למדוד את החומר מסיס החומצה, להעביר 400 μl של מדיום לצינור 1.5 מיליליטר microfuge. צנטריפוגה במהירות המרבית למשך 10 דקות. להוסיף את supernatant וכתוצאה מכך 100 μl 500 μl של 2: 1 כלורופורם-מתנול (V / V), ובקצרה מערבולת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 250 μl של מים לתערובת, ומערבולת שוב. צנטריפוגה דגימות במשך 10 דקות ב 3000 x גרם. העברה 200 μl של השלב העליון עד 4 מיליליטר נוזל נצנץ נוזלי בבקבוקון נצנץ ולמדוד אות C 14. </li></ol></li></ol></li></ol> 4. Lipogenesis Assay <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערב לפני תחילת assay, לשטוף את התאים 2 פעמים עם PBS החם. לשנות את hepatocytes לסרום רעב בינוני עם 100 ננומטר אינסולין. דגירה הלילה בשעת 37 מעלות צלזיוס. הערה: מאחר בסרום שור עוברי מכיל ריכוז לא ידוע של הורמונים מטבוליים (למשל אינסולין, גלוקגון), סרום להרעיב את התאים כדי להסיר כל תופעות בלבול זה יכול להיות על assay. תאי קיימא בסרום רעב בינוני ל&gt; 24 שעות. אינסולין משמש בassay זה כדי לעורר lipogenesis. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך Lipogenesis בינוני: סרום רעב בינוני עם 100 ננומטר אינסולין, אצטט קר 10 מיקרומטר ו-0.5 μCi 3 H-אצטט בכל טוב. לשנות תאים לLipogenesis בינוני ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 2. כלול את כל תרכובות של עניין להיבדק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר תקופת הדגירה, לשטוף תאים 2 פעמים עם PBS. תאי Lyse על ידי גירוד ב120 μl של 0.1 N HCl. שמורת 10 μl עבור assay חלבון (להעריך על ידי assay BCA), והעברה לצינור 1.5 מיליליטר microfuge 100 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שומני תמצית על ידי תוספת של 500 μl של 2: 1 כלורופורם-מתנול (V / V). בקצרה מערבולת לדגור על RT במשך 5 דקות. הוסף 250 μl מים, מערבולת ולדגור על RT עבור 5 דקות נוספות. דגימות צנטריפוגה 10 דקות ב 3000 XG, RT. זהירותלהעביר שלב נמוך עד 4 מיליליטר נוזל נצנץ נוזלי בבקבוקון נצנץ ולמדוד 3 פעילות H. </li></ol>

<ol><li>Clark, J. M., Brancati, F. L., Diehl, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prevalence+and+etiology+of+elevated+aminotransferase+levels+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+gastroenterology%22%5BJournal%5D)">The prevalence and etiology of elevated aminotransferase levels in the United States.</a> The American journal of gastroenterology. 98, 960-967 (2003).</li>
<li>Lazo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+of+nonalcoholic+Fatty+liver+disease+in+the+United+States%3A+the+third+national+health+and+nutrition+examination+survey%2C+1988-1994%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+epidemiology%22%5BJournal%5D)">Prevalence of nonalcoholic Fatty liver disease in the United States: the third national health and nutrition examination survey, 1988-1994.</a> American journal of epidemiology. 178, 38-45 (2013).</li>
<li>Angulo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonalcoholic+fatty+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+journal+of+medicine%22%5BJournal%5D)">Nonalcoholic fatty liver disease.</a> The New England journal of medicine. 346, 1221-1231 (2002).</li>
<li>Adams, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+natural+history+of+nonalcoholic+fatty+liver+disease%3A+a+population-based+cohort+study%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">The natural history of nonalcoholic fatty liver disease: a population-based cohort study.</a> Gastroenterology. 129, 113-121 (2005).</li>
<li>Feldstein, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocyte+apoptosis+and+fas+expression+are+prominent+features+of+human+nonalcoholic+steatohepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Hepatocyte apoptosis and fas expression are prominent features of human nonalcoholic steatohepatitis.</a> Gastroenterology. 125, 437-443 (2003).</li>
<li>Day, C. P., James, O. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Steatohepatitis%3A+a+tale+of+two+%27hits%27%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Steatohepatitis: a tale of two 'hits'.</a> Gastroenterology. 114, 842-845 (1998).</li>
<li>Donnelly, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sources+of+fatty+acids+stored+in+liver+and+secreted+via+lipoproteins+in+patients+with+nonalcoholic+fatty+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">Sources of fatty acids stored in liver and secreted via lipoproteins in patients with nonalcoholic fatty liver disease.</a> The Journal of clinical investigation. 115, 1343-1351 (2005).</li>
<li>Lambert, J. E., Ramos-Roman, M. A., Browning, J. D., Parks, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+de+novo+lipogenesis+is+a+distinct+characteristic+of+individuals+with+nonalcoholic+fatty+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Increased de novo lipogenesis is a distinct characteristic of individuals with nonalcoholic fatty liver disease.</a> Gastroenterology. 146, 726-735 (2014).</li>
<li>Parks, E. J., Hellerstein, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thematic+review+series%3A+patient-oriented+research.+Recent+advances+in+liver+triacylglycerol+and+fatty+acid+metabolism+using+stable+isotope+labeling+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+lipid+research%22%5BJournal%5D)">Thematic review series: patient-oriented research. Recent advances in liver triacylglycerol and fatty acid metabolism using stable isotope labeling techniques.</a> Journal of lipid research. 47, 1651-1660 (2006).</li>
<li>Befroy, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+assessment+of+hepatic+mitochondrial+oxidative+and+anaplerotic+fluxes+in+humans+using+dynamic+13C+magnetic+resonance+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Direct assessment of hepatic mitochondrial oxidative and anaplerotic fluxes in humans using dynamic 13C magnetic resonance spectroscopy.</a> Nature medicine. 20, 98-102 (2014).</li>
<li>Goncalves, L. A., Vigario, A. M., Penha-Goncalves, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+isolation+of+murine+hepatocytes+for+in+vitro+malaria+liver+stage+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Malaria+journal%22%5BJournal%5D)">Improved isolation of murine hepatocytes for in vitro malaria liver stage studies.</a> Malaria journal. 6, 169(2007).</li>
</ol>

המחברים מציינים שאין להם ניגודי אינטרסים.

הזמן מהקרבה לזלוף צריך להיות פחות מ 3 דקות לזלוף אידיאלי ועיכול collagenase של הכבד. ברגע שזלוף עם זלוף בינוני הוא יזם, הכבד צריך לשנות באופן מיידי את מראה למאדום לחיוורים. לאחר כ 10 דקות של דגירה עם LDM, הכבד יופיע נפוח ורודה. במקרה שזלוף אינו מספיק, בכבד לא יכול להציג שינויים אלה, וזה בדרך כלל יגרום לתשואה hepatocyte נמוכה יותר. בעקבות צעדי השטיפה, ניתן לאחסן hepatocytes המבודד במשך כמה שעות בהשעיה על קרח לפני ...

מחלת כבד שומני שאינה אלכוהולית היא אחד הגורמים המובילים למחלות כבד בתרביות מערביות1,2. הצטברות שומנים בכבד קשורה למוות תאי, פיברוזיס ואי ספיקת כבד באמצעות מנגנונים3-6 שעדיין לא ידועים. במחלת כבד שומני, חמצון חומצות שומן β בתיווך הפטוציטים וליפוגנזה דה נובו הם גורמים חשובים להצטברות שומנים נטו7,8. לכן מאמר זה יתמקד בבידוד הפטוציטים, ואחריו כימות של חמצון חומצות שומן β וליפוגנזה דה נובו.
פותחו מתודולוגיות רבות לחקירת חילוף החומרים של שומנים בהפטוציטים. למרות שניתן למדוד את חילוף החומרים של שומן in vivo באמצעות איזוטופים יציבים9,10, שיטות אלה יקרות ודורשות מספר רב של בעלי חיים. בנוסף, היכולת לחקור את ההשפעה של כימיקלים אקסוגניים מוגבלת בשל אופי הניסויים in vivo. לעומת זאת, בידוד הפטוציטים ראשוניים מכבד העכבר מספק דרך משתלמת לרדוף אחר11. יתר על כן, חקר הפטוציטים בתרבית מאפשר לחוקרים לחקור את ההשפעות של כימיקלים שונים על עיבוד השומנים תוך עקיפת הקשיים של ניסויים in vivo. לבסוף, הפטוציטים מבודדים נמנעים מכל בלבול מגנטיקה משתנה מכיוון שהם נגזרים מהכבד של בעל חיים בודד.
כאן אנו מבודדים ומתרבבים של הפטוציטים, ואנו מודדים חמצון של חומצות שומן β וליפוגנזה דה נובו, באמצעות תווית רדיו של פלמיטט. הפרוטוקול המפורט להלן הוא ישיר, יעיל וניתן לשחזור.

<table><tbody><tr><td>Liver Perfusion Medium</td><td>Life Technologies</td><td>17701038</td><td></td></tr><tr><td>Liver Digest Medium</td><td>Life Technologies</td><td>17703034</td><td>Aliquot ומאחסנים ב-20 מעלות; C</td></tr><tr><td>PBS</td><td>קורנינג</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>10X DPBS</td><td>קורנינג</td><td>46-013-CM</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>קורנינג</td><td>10-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life Technologies</td><td>26140079&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>קולגן</td><td>לייף טכנולוגיות</td><td>A1048301&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>סיליקה קולואידית מצופה פוליוויניל פירולידון</td><td>GE Life Sciences</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פירובט</td><td>Cellgro</td><td>25-000-CI</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין / סטרפטומיצין</td><td>Cellgro</td><td>30-001-CI</td><td></td></tr><tr><td>אינסולין</td><td>סיגמא</td><td>I0516-5ML</td><td></td></tr><tr><td>דקסמתזון</td><td>סיגמא</td><td>D2915-100MG</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין (BSA), Fraction V</td><td>MP Biomedicals</td><td>103703</td><td></td></tr><tr><td>צלחת תרבית 24 בארות</td><td>קורנינג פלקון</td><td>353047&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>צינורות Tygon S3&nbsp;</td><td>Cole Parmer</td><td>06460-34</td><td></td></tr><tr><td>זכר Leur Lock ל-200 Barb מחברים</td><td>Cole Parmer</td><td>45518-00</td><td></td></tr><tr><td>24 G x 3/4 אינץ' קטטר</td><td>SurFlo</td><td>SROX2419CA</td><td></td></tr><tr><td>תפר משי פרמה-יד</td><td>Ethicon</td><td>683G</td><td></td></tr><tr><td>מסננת תאים</td><td>קורנינג פלקון</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>IsoTemp 3013HD פישר</td><td></td> <td>אמבט מים מחזורי13-874-3</td><td></td></tr><tr><td>MasterFlex C/L משאבה פריסטלטית</td><td>MasterFlex</td><td>HV-77122-24</td><td></td></tr><tr><td>Microclamp</td><td></td><td>Roboz RS-7438</td><td>עיקור מראש בחיטוי</td></tr><tr><td>5 אינץ' מספריים הפעלה ישרים, קהים-קהים</td><td>Roboz</td><td>RS-6810</td><td>עיקור מראש בחיטוי</td></tr><tr><td>24 מ"מ להב ישר, מספריים מיקרו-חיתוך חד</td><td>Roboz</td><td>RS-5912</td><td>עיקור מראש בחיטוי</td></tr><tr><td>4 אינץ' 0.8 מ"מ קצה מיקרו-חיתוך מלקחיים</td><td>Roboz</td><td>RS-5130</td><td>עיקור מראש בחיטוי</td></tr><tr><td>4 אינץ' 0.8 מ"מ קצה עקומה מלאה מיקרו-חיתוך מלקחיים</td><td>Roboz</td><td>RS-5137</td><td>עיקור מראש באוטוקלאב</td></tr><tr><td>60 מ"ל מזרק</td><td>בקטון דיקינסון</td><td>309653</td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל צינורות חרוטיים</td><td>קורנינג פלקון</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>BCA בדיקת חלבון</td><td>תרמו סיינטיפיק</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>ארון</td><td></td><td></td><td></td>בטיחות ביולוגית</tr><tr><td>CO2 אינקובטור</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>סרולוגי פיפטס</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,000, 200, 20 ו-mu; l פיפט וטיפים</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

קביעת חומצות שומן החמצון וlipogenesis בעכבר העיקרי hepatocytes

Determination of Fatty Acid Oxidation and Lipogenesis in Mouse Primary Hepatocytes

חילוף החומרים של השומנים בכבד הוא מורכב. בנוסף לייבוא וייצוא שומנים באמצעות ליפופרוטאינים, הפטוציטים יכולים לחמצן שומנים באמצעות חמצון חומצות שומן, או לחילופין, לסנתז שומנים חדשים באמצעות ליפוגנזה דה נובו. הסכום הנקי של מסלולים אלה מוכתב על ידי מספר גורמים, אשר במצבי מחלה מסוימים מובילים למחלת כבד שומני. הצטברות עודפת של שומנים בכבד קשורה לתנגודת לאינסולין בכל הגוף ולמחלת לב כלילית. כלים לחקר חילוף החומרים של שומנים בהפטוציטים שימושיים להבנת תפקיד חילוף החומרים של שומנים בכבד בהפרעות מטבוליות מסוימות.
בכבד, הפטוציטים מווסתים את הפירוק והסינתזה של חומצות שומן באמצעות חמצון שומני β וליפוגנזה דה נובו, בהתאמה. כימות חילוף החומרים במסלולים אלה מספק תובנה לגבי טיפול בשומנים בכבד. בניגוד לכימות במבחנה, באמצעות הפטוציטים ראשוניים, ביצוע מדידות in vivo הוא מאתגר מבחינה טכנית ועתיר משאבים. לפיכך, כימות חמצון חומצות שומן β וליפוגנזה דה נובו בהפטוציטים של עכברים מתורבתים מספק שיטה ישירה להערכת טיפול בשומנים בהפטוציטים. 
כאן אנו מתארים שיטה לבידוד הפטוציטים ראשוניים של עכברים, ואנו מדגימים כימות של חמצון חומצות שומן β וליפוגנזה דה נובו, באמצעות מצעים מסומנים ברדיו.

בידודי Hepatocyte בדרך כלל לגרום 1 - 3 x 10 7 תאים כולל. לאחר דגירה הלילה, התאים יופיעו משושה, שרבים מהם יהיה binucleated (איור 2). תאים בריאים צריכים להיות נטולי granulations או שלפוחיות, אשר מעידים על המוות של תאים. באופן כללי, assay חומצות שומן החמצון מנוהל בשלושה עד ארבעה חזרות למתחם בדיקה. ספירה לCO 2 הדגימות כחמישית מאלה הנגזרים מהחומר מסיס החומצה. אנחנו בדרך כלל לחשב ...

lipogenesis נובו דה וחמצון חומצת β-השומן מהווים מסלולי מפתח חילוף חומרים בhepatocyte, מסלולים המוטרדים בכמה הפרעות מטבוליות, כוללים מחלת כבד שומני. כאן אנו מדגימים בידוד של hepatocytes העיקרי עכבר ולתאר כימות של חמצון חומצת β-השומן וlipogenesis.

קביעת חומצות שומן החמצון וLipogenesis בעכבר העיקרי hepatocytes

Lipid metabolism in liver is complex. In addition to importing and exporting lipid via lipoproteins, hepatocytes can oxidize lipid via fatty acid ...

המטרה הכללית של הליך זה היא להעריך את חילוף חומצות השומן בכבדי עכברים ראשוניים. זאת משיגים תחילה על ידי ביצוע פרפוזיה לכבד של עכבר באמצעות תמיסת עיכול, הוצאת הכבד ולאחר מכן בידוד ההפטוציטים. השלב השני הוא גידול של ההפטוציטים על פלטות מצופות קולגן.בשלב הבא, התאי הכבדיים (hepatocytes) מטופלים בהתערבויות הניסיוניות לבדיקה. השלב הסופי הוא דגירה של התאים בנוכחות תסס (substrate) מסומן רדיואקטיבית. לבסוף, נעשה שימוש בניתוח שנילציה נוזלית (liquid scintillation analysis) כדי להראות את ההשפעות של התערבויות פרמקולוגיות או גנטיות שונות על חמצון חומצות שומן או על ליפוגנזה בתאי כבד ראשוניים.שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה למספר שאלות מפתח בתחומי המטבוליזם והסוכרת, כולל השפעתן של התערבויות פרמקולוגיות וגנטיות ספציפיות על הביולוגיה של ההפטוציטים. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית משתי סיבות: ראשית, קשה להשיג תנאי פרפוזיה ספציפיים המשפיעים על בריאות ההפטוציטים, ושנית, בגין הכמתת פליטת הפחמן הדו-חמצני.גזים אינם אינטואיטיביים. את הפרוצדורה זו יעמיד טום אקיי, סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלי. הגדירו את משאבת הפריסטאלטיקה על ידי הנחת קצה אחד של צינור סטרילי בתוך תמיסת פרפוזיה לכבד שחוממה מראש, ואת הקצה השני בתוך מיכל פסולת.הפעל את המשאבה עד שכל אורך הפ stipulating הצינור יתמלא במצע. לאחר הקרבת העכבר הרלוונט

determination-fatty-acid-oxidation-lipogenesis-mouse-primary

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

כאן מתוארות שיטות מותאמות ליצירת מודלים in vivo ו-in vitro של סטיאטוזיס בכבד ולניתוח הפנוטיפים הסטאטוטיים והפרמטרים הפיזיולוגיים הקשורים.

ניתוח אופטימלי של<em&gt; In vivo</em&gt; ו<em&gt; במבחנה</em&gt; כבדית steatosis

כאן, אנו מציגים עבור בידודו של העכבר הראשי בריא ופונקציונליים hepatocytes פרוטוקול. הוראות לגילוי סינתזה של חלבון nascent הכבד על ידי המצע תיוג לא רדיואקטיבי נמסרו כדי לעזור להבין את המנגנונים שבבסיס סינתזת החלבון בהקשר של הומאוסטזיס אנרגיה-מטבוליזם בכבד.

בידוד של העכבר הראשי Hepatocytes לניתוח סינתזת חלבון Nascent בשיטה תיוג L שאינו רדיואקטיבי-azidohomoalanine

הפטוציטים ראשוניים הם כלי רב ערך לחקר תגובת הכבד ומטבוליזם במבחנה. תוך שימוש בריאגנטים הזמינים באופן מסחרי, פותח פרוטוקול משופר ויעיל בזמן ובעבודה לבידוד הפטוציטים ראשוני של עכברים.

פרוטוקול יעיל יותר בזמן ובעבודה לבידוד הפטוציטים ראשוני של עכברים

מאמר זה מספק שלוש גישות קלות ונגישות להערכת חילוף החומרים של השומנים בעכברים.

הערכת יכולת טיפול בליפידים בכל הגוף בעכברים

פרוטוקול זה נועד להיות כלי לחקר סטאטוזיס ואת השינויים המולקולריים, הביוכימיים, התאיים המיוצרים על ידי חשיפה יתר של hepatocytes שומנים במבחנה.

מודל של סטאטוזיס ניסיוני במבחנה: תרבית תאי הפטוציט במדיום מותנה בעומס יתר של שומנים

חמצון β חומצות שומן הוא מסלול מטבולי חיוני האחראי על הפקת אנרגיה בסוגי תאים רבים ושונים, כולל הפטוציטים. כאן אנו מתארים שיטה למדידת חמצון-β חומצות שומן בהפטוציטים ראשוניים שזה עתה בודדו באמצעות 14חומצה פלמיטית המסומנת כ-C.

מדידה של חומצת שומן β-חמצון בהשעיה של הפטוציטים עכברים מבודדים טריים

טריגליצרידים ליפוליזה באדיפוציטים היא תהליך מטבולי חשוב המביא לשחרור חומצות שומן חופשיות וגליצרול. כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט למדידת ליפוליזה בסיסית ומגורה באדיפוציטים וברקמת שומן ex vivo מעכברים.

מדידת שיעור הליפוליזה ברקמת השומן Ex Vivo Murine ובפראדיפוציטים ראשוניים מובחנים במבחנה

מאמר זה מתאר את השימוש בתאי HepG2 הנגרמים על ידי חומצה אולאית כמודל למחלת כבד סטאטוטית הקשורה לתפקוד מטבולי.

מידול חוץ גופי של שקיעת שומן במחלת כבד סטאטוטית הקשורה לתפקוד מטבולי

תיאור של הליך זירחון כמותי באמצעות cryolysis, solubilziation אוריאה, חלוקה HILIC והעשרה iMac של פפטידים פוספורילציה.

Phosphoproteomics כמותיים חומצת שומן מגורה Saccharomyces cerevisiae</em

במודלים של בעלי חיים orthotopic של סרטן השחלות לשכפל טוב יותר מחלות אנושיות, ולכן לשפר את ההבנה שלנו של התקדמות סרטן תגובת הגידול לטיפול. מודל העכבר מקבל זריקה intrabursal של בלוציפראז-להביע תאים סרטניים בשחלות. טיפול מנוהל באמצעות gavage הפה. הגידול מנוטרת על...

בשנת vivo ההדמיה לטיפולים במודל עכבר orthotopic של סרטן השחלות

חקור מטבוליזם של חומצות שומן בפיטומים עכבריים ראשוניים באמצעות בידוד תאי כבד ותרבות על צלחות מצופות קולגן. שיטה זו מאפשרת כימות חמצון חומצות שומן וליפוגנזה לחקר הפרעות מטבוליות.

קביעת חומצות שומן החמצון וLipogenesis בעכבר העיקרי hepatocytes

גלה סרטונים נוספים