מלכודת RC, תרגום ריבוזום זיקה טיהור מאוכלוסיות תאים נדירות של

המטרה הכללית של נוהל זה היא לבודד RNA המעורב בתרגום באופן ספציפי לסוג תא בעוברים של דרוזופילה. דבר זה מושג תחילה על ידי איסוף עוברים מקו זבובים טרנסגני, המאפשר ביטוי ספציפי של תת-יחידה ריבוזומלית המסומנת ב-GFP בסוג התא המיועד, ובמקרה זה, בתאי שריר ה-slouch. השלב השני הוא יצירת ליזט להפקת תכשיר פוליסומים המכיל תערובת של ריבוזומים מסומנים ולא מסומנים.

בשלב הבא, מוערך ריכוז החלבון בליזט (lysate) ומבוצע ניקוי אפיניות באמצעות חרו지를 המצומדים לנוגדני GFP כדי ללכוד קומפלקסים של RNA ריבוסומלי מסוג התא הרצוי. השלב הסופי מוקדש למיצוי וניקוי של RNA טוטאלי. לבסוף, מבוצעות הערכות איכות וספציפיות באמצעות bioanalyzer ו-R-T-Q-P-C-R בהתאמה.

ניתן להשתמש ב-RNA לאחר מכן לניתוח כמותי גלובלי באמצעות ריצוף RNA או מערכי מיקרו (microarrays). היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני השיטה הקיימת שלנו, בדומה למיון VX, הוא שאינה דורשת שלב מעבדתי של דיסוציאציה של תאים. ניתן לבצע אותה על שולחן העבודה.

השיטה מהירה ומאפשרת זיהוי ישיר של RNA מתורגם באוכלוסיות תאים קטנות מאוד, דבר המהווה יתרון משמעותי להבנת רכישת תכונות של תאים. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי מיוגנזה בעוברים של Josephine, ניתן להחיל אותה גם על רקמות אחרות או אורגניזמים מודרניים, כגון צמחים, דגי זברה או עכברים, והיא עשויה לסייע גם במעקב אחר השפעת טיפול על סינתזת חלבונים במקרה של פתולוגיה. את הפרוצדורה ידגים Benjamin Berta, סטודנט לדוקטורט מהמעבדה שלי. לאחר הנדסת שני קווי התורשן בהתאם להוראות בחלק הכתוב של הפרוטוקול והכלאה ליצירת קו תורשן כפול של trap, הגדילו את הקו על ידי הכנת שמונה כלובים גליליים גדולים לאוכלוסיות, המכילים כ-40 גרם זבובים צעירים לכל כלוב, מה שמתבטא בכ-180,000 זבובים לכל כלוב.

הכינו צלחות פטרי בקוטר 11 סנטימטר המכילות תערובת של אגר מוצק ומיץ ענבים, כאשר שליש מהשטח מכוסה במשחת שמרים שהוכנה טרי, ואפשרו לזבובים להטיל ביצים על צלחות אלו למשך שעה אחת. חזרו על תהליך זה בשתי סדרות נוספות של צלחות מיץ ענבים טריות כדי לאפשר לזבובים לרוקן לחלוטין את תעלותיהן. העוברים הדו-טרנסגניים הרצויים מההכלאה יוטלו על הצלחת הרביעית.

הוציאו מהכלובים את הצלחות המכילות את העובריים הרצויים והניחו להם להדגר עד לשלב ההתפתחות הרצוי בטמפרטורת החדר. במקרה זה נעשה שימוש בהדגרה של 13 שעות. לאחר מכן, השעיו מחדש את תוכן הצלחת בכ-50 milliliters של מים באמצעות מברשת.

הפרידו את העוברים מהזבובים המתים על ידי העברת הנוזל דרך שלושה נמסים בקטרים של 700, 355 ו-112 מיקרון. שטפו את העוברים שנאספו בנמס בעל הקוטר הקטן ביותר במים מיוננים. השריגו את העוברים ב-4.5% bleach במים מיוננים למשך שתי דקות, ולאחר מכן שטפו ביסודיות במים מיוננים למשך 30 עד 60 שניות.

דגרו את העוברים ב-PBS 0.01%T בריכוז של בין 20 ל-100 micrograms per milliliter Cyclo heide למשך חמש עד 10 דקות בטמפרטורת החדר עם ערבול. לאחר ייבוש העוברים על דפי סלולוז סופגים, העבירו אותם לנבובות מיקרו-צנטריפוגה, לאחר מכן שקלו את הנבובות ובצעו הקפאה מהירה (flash freeze) של העוברים על ידי טבילה בחנקן נוזלי.

בשלב זה, ניתן לאחסן את העוברים המיובשים למשך מספר חודשים בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס. העבירו 1.5 גרם של העוברים המיובשים למבחנות של 15 מיליליטר שקוללו מראש, המכילות ארבעה מיליליטר של באפר למיצוי פוליסומים, והומוגניזו באמצעות פפטה סרולוגית סטרילית של 10 מיליליטר.

לאחר מכן, פזרו את העוברים ההומוגניזים לשתי מבחנות של 2 ml שקוללו מראש, וגרסו את העוברים בטחנת חרוצים (bead grinder) במהירות גבוהה ובכיוונים מרובים. הגדירו שתי הרצות של 10 שניות ב-5,000 RPM, עם הפסקה של 15 שניות בין מחזור למחזור. לאחר 10 דקות של סנטריפוגציה ב-2000 G, העבירו את הליזאט למבחנת מיקרו-סנטריפוגה נקייה וקרירה על קרח.

הוסף NP-40 בריכוז 10% לסופרנאט S עד לריכוז סופי של 0.1% וערבב בעדינות על ידי הפיכת המבחנה. הוסף 300 micromolar של DHPC עד לריכוז סופי של 30 millimolar וערבב בעדינות על ידי הפיכת המבחנה. הדגר את התערובת על קרח למשך חמש דקות, תוך ערבוב על ידי הפיכה מספר פעמים במהלך ההדגרה.

לאחר הדגרה בקרח, הכין את העלייה הפוסט-מיטוכונדריאלית באמצעות סבב צנטריפוגה בטמפרטורה של 4 °C למשך 10 דקות ב-20,000 G. לאחר מדידת ריכוז החלבון בשיטת Bradford והשגת ריכוז חלבון שבין 60 ל-80 mg/mL, העבר את ה-SNAT לשפופרת מיקרו-צנטריפוגה נקייה ומקוררת מראש, ועבור מיד לשלב הספיחה המוקדמת (pre-absorption). השהה מחדש את החרוזיים המגנטיים באמצעות ערבוב עדין, ולאחר מכן העבר 30 µL של חרוזיים עבור כל mL של ליזט לשפופרת מיקרו-צנטריפוגה.

אספו את החרוצים באמצעות המגנט, שאבו החוצה את הנוזל העליון ותלו את החרוצים ב-500 microliters של בופר למיצוי פוליסומים. לאחר מכן, אספו את החרוצים באמצעות המגנט. שוב, הוסיפו ליזט עוברי והדגירו למשך שעה אחת בטמפרטורה של ארבע degrees Celsius על רשש (rotator).

הסר את החרוזיים והנח את העלייה (supernatant) על קרח עד לשלב הניקוי האימונולוגי. שמור 100 µL מהעלייה כמדגם RNA גלובלי להשוואה עם המדגם שייאסף לאחר הניקוי האימונולוגי. כדי לבצע ניקוי אימונולוגי למדגם, הוסף 1 mL של ליזאט שנספג מראש למבחנה נטולת RNA המכילה 90 µL של חרוזיים חסומים המצומדים לנוגדן GFP. דגור את המדגם בטמפרטורה של 4 °C למשך שעתיים או למשך הלילה, תוך ערבוב עדין מסוג end-over-end באמצעות מסובב מבחנות (tube rotator) לאחר הדגירה.

שטפו את החרוצים תחילה על ידי סבוב של החרוצים הנותרים בצנטריפוגה מיני. לאחר מכן, אספו אותם באמצעות מגנט, השעיו אותם מחדש ב-500 microliters של בופר שטיפה והדגירו אותם תוך ערבוב במשך 10 דקות בחדר הקירור, ולאחר מכן אספו שוב את החרוצים באמצעות המגנט.

העבר את החרו지를 למבחנה נקייה וחופשית מ-RNases, ושטוף פעמיים נוספות. לבסוף, לאחר איסוף החרוזים על המגנט, בצע מיצוי RNA על ידי הוספת 1 ml של TRIOL לחרוזים וביצוע המיצוי בהתאם להוראות היצרן. לאחר מכן, בצע ניקוי RNA באמצעות ערכת RNEZ micro בהתאם להוראות היצרן.

כדי לבחון את הספציפיות של ה-RNA שנלכד, בצעו תעתוק הפוך של שלושה ננוגרמים של RNA שעבר טיהור אימונולוגי ושל RNA קלט (input RNA) בהתאם לנהלים הסטנדרטיים. לאחר מכן, השתמשו ב-CDNA שהתקבל לביצוע QPCR באמצעות סטים של פריימרים ספציפיים לגנים. תמונת קונפוקאל זו של עובר בשלב 16 מראה ביטוי של RPL 10 A-E-G-F-P, באופן ספציפי בשש תאי שריר ה-slouch בכל מקטע HEMI; ניתן להבחין בקו-לוקליזציה של RPL 10 A-E-G-F-P עם סמן השריר הכללי beta three tubulin.

RNA שנלכד הועבר לאנליזה ב-bioanalyzer לצורכי בקרת איכות. שימו לב לשלמות המושלמת של ה-18S וה-28S ribosomal RNAs. איור זה מציג את תוצאות ניתוח RT QPCR של שלושה שכפולים ביולוגיים של עוברים בשלב 16, ומדגים את הספציפיות הגבוהה של mRNA שהבודד בשיטת trap.

השינוי ב-FO חושב בהשוואה לקלט ונורמל אל מול מתילציה של הגן RPL 32. שני תמלילים הנמצאים בכל שושלות השריר הועשרו פי 2.3 בהשוואה לקלט, בעוד שתמלילי slouch מוגבלים יותר הועשרו פי 5.6; תאי עצב המבטאים את prospero ו-socks וגנים הועשרו במידה שלילית (depleted) פי 2.2 ופי 5.5 בהתאמה לאחר התפתחותם. טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים, במיוחד בתחום הביולוגיה ההתפתחותית, לחקור מחויבות עצמית ורכישת תכונות תא במהלך התמיינות של עוברי doof.