Name: מלכודת RC, תרגום ריבוזום זיקה טיהור מאוכלוסיות תאים נדירות של דרוזופילה עוברים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: למד את שיטת TRAP לבידוד mRNA מאוכלוסיות תאים נדירות בעוברי דרוזופילה. הפרוטוקול משתמש בזיקה ל-GFP ללכידת ריבוזומים מתאי שריר סלאוץ' ומאפשר ניתוח תרגום ספציפי לסוג תאים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

המחברים מודים לניקולס אלגרה, מוד פייני וז'אן-פיליפ דה פונטה על עזרתם הטכנית המצוינת. עבודה זו נתמכה על ידי הסוכנות הלאומית למחקר (ANR-JC-CARDIAC-SPE), מענק התחלתי של INSERM, מענק ANR ID-CELL-SPE, Equipe FRM ומענק AFM 15845.

1. דור קו Fly <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור שני מבנים שונים. במבנה הראשון, RpL10A cDNA (מקטע חלבון ריבוזומלי L10a) הוא משובט במורד הזרם של ה- GFP לפלסמיד pUASP-PL-GFP-Nter (שונה מגרסה 32). השימוש בתאי מין אמרגן מאפשר שימוש רב ערכי יותר של הקו המהונדס. הערה: קבל המבנה השני על ידי שיבוט רצף הרגולציה נהיגה ביטוי רקמות הספציפיות של גן נמושה במעלה הזרם של GAL4 (TF) באמצעות פלסמיד pPTGAL4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק פלסמידים בנפרד לw 1,118 זבובים והכניסו בונה לתוך הגנום הזבוב על ידי החדרת P-יסוד (על פי נוהל סטנדרטי) 33. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> transformants בחר כדי לשחזר קווים לטוס עם בונה על שני כרומוזומים שונים. קו המלכודת הסופי נוצר על ידי שילוב של שתי שורות אלה (צלבים גנטיים) על מנת לקבל קו יציב כפול מהונדס אחד. F0: להתראות, ביל; ארגון נוער קתולי, כטב&quot;מ EGFP :: RpL10A; MKRS / TM6Bx להתראות, ביל; ארגון הנוער הקתולי / scu; נמושה Gal4 / TM6B. F1: להתראות, ביל; ארגון נוער קתולי, כטב&quot;מ EGFP :: RpL10A; נמושה Gal4 / TM6B. מסיבי להגביר את הקו הזה ולאסוף את העוברים הרצויים-מבוימים. </li></ol> אוסף 2. העובר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 8 כלובי אוכלוסייה גלילית גדולים המכילים כ -40 גרם של זבובים צעירים לכלוב (סביב 180,000 זבובים / כלוב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להמשיך עם מה שנקרא מראש Lays-המאפשר זבובים כדי לנקות עוברים מתפתחים מoviducts. לשם כך, להניח את הזבובים לשעה 1 בשני מנות 11 סנטימטר פטרי בקוטר המכילות תערובת של מיץ הענבים ואגרו הקרושה ולכסות ⅓ של פני השטח עם שמרים להדביק טרי מתוצרת. לאחר 3 חילופי ענבי צלחות מיץ לאסוף את העוברים האמיתיים על צלחות טריות דומות. הערה: זמן דגירה משתנה בהתאם לזמן-חלון התפתחותית למד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר צלחות מכלובים ולהשאיר אותם באותה הטמפרטורה לזמן הדרוש כדי להשיג שלב ההתפתחותי נכון (לדוגמא, 3 שעות של הטלת ביצים + 10 שעות של addit<html> הדגירה ional נותנת עוברים משלב 10-13 שעות לאחר הטלת ביצים (AEL)). Resuspend תוכן הצלחת (עוברים, שמרי רסק, זבובים מתים) עם 50 מיליליטר של מים בעזרת מברשת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור סדרה של מסננות (700 מיקרומטר, 355 מיקרומטר, 112 מיקרומטר) כדי להפריד בין עוברים מזבובים מתים וחלקי גוף שנותרו ולאסוף עובר שמר על המסננת קטנה יותר בקוטר, ולאחר מכן לשטוף במים ללא יונים בקצרה. אין להשתמש יותר מ 18 צלחות לאוסף כפי שהוא יכול לסתום את מסננים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עובר dechorionate באקונומיקת 4.5% במים ללא יונים למשך 2 דקות ולשטוף היטב במים ללא יונים במשך 30-60 שניות. דגירה עובר בPBS Tween 0.01% 20, 100 מיקרוגרם / מיליליטר cycloheximide, למשך 5-10 דקות ב RT תחת תסיסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עוברים יבשים על גיליונות סופגים תאית ולהעביר אותם לצינורות microcentrifuge. לשקול את הצינורות ופלאש להקפיא את העוברים על ידי טבילה בחנקן נוזלי. בשלב זה, ניתן לאחסן את העוברים המיובשים במשך כמה חודשים ב -80 ° C. </li></ol>class = &quot;jove_title&quot;&gt; 3. הכנת חרוזים מגנטיים מצמידים את ה- GFP הנוגדן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביסודיות resuspend החלבון G חרוזים מגנטיים בבקבוק המקורי על ידי תסיסה עדינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה 90 μl של חרוזים לצינור RNase ללא ולאסוף אותם על מגנט (30-60 שניות). 90 μl של חרוזים יש צורך לבצע immunoprecipitation (IP) עם 1 מיליליטר של lysate המכיל 60-80 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​חלבונים. מכבד את היחסים כדי למנוע הרוויה חרוז. השתמש בכמה צינורות פי כמות חלבון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף חרוזים עם 1 × PBS 0.01% Tween (μl 500) 20 ולאסוף חרוזים על המגנט ללהשליך supernatant. הוסף 30 מיקרוגרם של נוגדן ה- GFP ב350 μl של PBS Tween 0.01% 20 לחרוזים ודגירה עם הסוף איטי לעומת סוף הערבוב במשך 30 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף חרוזים על המגנט (30-60 שניות), להשליך supernatant ולשטוף ב500 μl של חיץ חילוץ polysome (Hepes 10 150 מ&quot;מ, MgCl 2 5 מ&quot;מ, 0.5 מ&quot;מ DTT, טריטון 1%, cycloheximide 100 מיקרוגרם / מיליליטר מ&quot;מ, KCl , Protease מעכב 1 ×, מעכב RNase 100 U). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף חרוזים על המגנט ולהוסיף 500 μl של חיץ חסימה (BSA 0.1 מיקרוגרם / μl, שמרי tRNA 0.1 מיקרוגרם / μl, גליקוגן 0.1 מיקרוגרם / μl במאגר חילוץ polysome). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של 30 דקות ב RT וחזור על שלב זה פעם אחת עם חיץ חסימה טרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף חרוזים על המגנט ולשטוף ב500 μl של חיץ חילוץ polysome, אז להיזכר חרוזים ולהמשיך מייד לשלב immunopurification (סעיף 6). </li></ol> 4. הכנת lysate <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני שמתחיל, להגדיר את התכנית במטחנת חרוזים מהירות מהירה רב כיוונית: 2 × 10 שניות ב 5000 סל&quot;ד, הפסקה 15 שניות. העברת עוברים מיובשים (1.5 גר &#39;) ל- 15 מיליליטר צינורות prechilled על קרח המכיל מאגר מיצוי polysome, וhomogenize מייד. Homogenize 1.5 גרם של עוברים ב 4 מיליליטר של חיץ חילוץ polysome. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עוברי התפשטות הומוגני בשתי prechilled 2 צינורות מ&quot;ל ולטחון את אמברימערכת הפעלה על-ידי הפעלת תכנית homogenizer. העבר את lysate לתוך צינורות microcentrifuge prechilled טריים על קרח ולהכין supernatant פוסט-גרעינית ידי צנטריפוגה על 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ב 2000 g. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת supernatant לצינור microcentrifuge prechilled טרי על קרח, להוסיף 1/100 נפח דגימה של 10% Nonidet P-40 לsupernatant (הריכוז סופי = 0.1%), ולערבב אותו בעדינות על ידי צינור היפוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דופק צנטריפוגות המדגם בminifuge לאסוף את הנוזל בחלק התחתון של הצינור, להוסיף 1/9 נפח דגימה של (ריכוז סופי 300 מ&quot;מ 1,2-Diheptanoyl-SN-Glycero-3-Phosphocholine (DHPC) = 30 מ&quot;מ ), לערבב אותו בעדינות על ידי צינור היפוך, ודגירה את התערובת על קרח למשך 5 דקות (תערובת על ידי היפוך מספר פעמים במהלך דגירה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את supernatant לאחר המיטוכונדריה על ידי צנטריפוגה על 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ב 20,000 ז. למדוד ריכוז חלבון בשיטה ברדפורד: הריכוז בlysate צריך להיות בין 60-80 מ&quot;ג / מיליליטר. Tמתקין supernatant לצינור microcentrifuge טרי חדש prechilled ולהמשיך מייד לשלב טרום הקליטה (סעיף 5). </li></ol> 5. טרום קליטה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביסודיות resuspend חרוזים המגנטיים על ידי תסיסה עדינה ולהעביר 30 μl של חרוזים לתוך צינור microcentrifuge ב RT (30 μl של חרוזים / 1 מיליליטר lysate העוברי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף חרוזים על המגנט, פיפטה את supernatant, וresuspend חרוזים במאגר polysome חילוץ (500 μl). לאסוף חרוזים על המגנט, להוסיף lysate העוברי, ודגירה עבור שעה 1 ב 4 ° C על הכתף. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר חרוזים ולשמור supernatant על קרח לצעד immunopurification. לפני immunopurification, לשמור של supernatant 100 μl (קלט) כדי להשוות מדגם RNA העולמי עם מדגם RNA שנאסף לאחר immunopurification, על ידי RT-qPCR למשל. </li></ol></li></ol> 6. Immunopurification <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מיליליטר (המקביל ל 60-80 מ&quot;ג / מיליליטר חלבון) שלטרום נקלט lysate לצינור RNase ללא מכיל 90 μl של חרוזים חסומים מצמידים את נוגדן ה- GFP. דגירה הדגימות ב 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 2 עם ערבוב הסוף-על-סוף עדין במסובב צינור. לחלופין, לבצע O הדגירה / N ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה, לאסוף חרוזים על המגנט. השתמש בminifuge לספין למטה חרוזים, אז resuspend אותם 500 μl של חיץ לשטוף (Hepes 10mm, 350mm KCl, MgCl 2 5 מ&quot;מ, Nonidet P-40 1%, DTT 0.5 מ&quot;מ, cycloheximide 100 מיקרוגרם / מיליליטר, RNase מעכב 100 U ) ולאסוף אותם על המגנט. חזור על פעולה זו עוד פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשנות את חרוזים לצינור RNase ללא prechilled חדש ולשטוף פעמיים. לאסוף חרוזים על מגנט ולהמשיך למיצוי RNA על ידי הוספת 1 מיליליטר Trizol ישירות לחרוזים ולעקוב אחר הוראות היצרן. </li></ol> 7. RNA ניקוי והערכת איכות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בערכת RNeasy מיקרו לפי הוראות היצרן. בסיום, elutRNA דואר עם (x) μl מים RNase חינם. חם למשך 2 דקות ב 60 ° C, וחנות snap-קפוא דגימות ב -80 ° C. לבדוק את איכות RNA באמצעות bioanalyzer (אחרי הוראות היצרן). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבדוק את הספציפיות של RNA TRAPed, לבצע שעתוק לאחור על 3 ננוגרם של RNA המטוהר (קלט ו- IP) על פי הוראות היצרן (עילי III). השתמש בcDNA שהתקבל עבור qPCR באמצעות ערכות פריימר גן ספציפי. </li></ol>

<ol><li>Sousa Abreu, R., Penalva, L. O., Marcotte, E. M., Vogel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+signatures+of+protein+and+mRNA+expression+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+bioSystems%22%5BJournal%5D)">Global signatures of protein and mRNA expression levels.</a> Molecular bioSystems. 5, 1512-1526 (2009).</li>
<li>Maier, T., Guell, M., Serrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+of+mRNA+and+protein+in+complex+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+letters%22%5BJournal%5D)">Correlation of mRNA and protein in complex biological samples.</a> FEBS letters. 583, 3966-3973 (2009).</li>
<li>Schwanhausser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473, 337-342 (1038).</li>
<li>Junion, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+view+of+cell+fate+specification%3A+ladybird+acts+at+multiple+levels+during+diversification+of+muscle+and+heart+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%22%5BJournal%5D)">Genome-wide view of cell fate specification: ladybird acts at multiple levels during diversification of muscle and heart precursors.</a> Genes. 21, 3163-3180 (2007).</li>
<li>Jakobsen, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+ChIP-on-chip+reveals+Biniou+as+a+universal+regulator+of+the+visceral+muscle+transcriptional+network%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%22%5BJournal%5D)">Temporal ChIP-on-chip reveals Biniou as a universal regulator of the visceral muscle transcriptional network.</a> Genes. 21, 2448-2460 (2007).</li>
<li>Cunha, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+binding+leads+to+diverse+regulatory+responses%3A+Lmd+is+a+tissue-specific+modulator+of+Mef2+activity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+genetics%22%5BJournal%5D)">Combinatorial binding leads to diverse regulatory responses: Lmd is a tissue-specific modulator of Mef2 activity.</a> PLoS genetics. 6, e1001014(2010).</li>
<li>Sandmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+core+transcriptional+network+for+early+mesoderm+development+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%2C+%26+development%22%5BJournal%5D)">A core transcriptional network for early mesoderm development in Drosophila melanogaster.</a> Genes, & development. 21, 436-449 (2007).</li>
<li>Kvon, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+functional+characterization+of+Drosophila+developmental+enhancers+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome-scale functional characterization of Drosophila developmental enhancers in vivo.</a> Nature. 512, 91-95 (2014).</li>
<li>Pfeiffer, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tools+for+neuroanatomy+and+neurogenetics+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 9715-9720 (2008).</li>
<li>Gallo, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((REDfly+v3.0%3A+toward+a+comprehensive+database+of+transcriptional+regulatory+elements+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">REDfly v3.0: toward a comprehensive database of transcriptional regulatory elements in Drosophila.</a> Nucleic acids research. 39, D118-D123 (2011).</li>
<li>Gandin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysome+fractionation+and+analysis+of+mammalian+translatomes+on+a+genome-wide+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2014).</li>
<li>Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ribosome+profiling+strategy+for+monitoring+translation+in+vivo+by+deep+sequencing+of+ribosome-protected+mRNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments.</a> Nature protocols. 7, 1534-1550 (2012).</li>
<li>Heiman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+translational+profiling+approach+for+the+molecular+characterization+of+CNS+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A translational profiling approach for the molecular characterization of CNS cell types.</a> Cell. 135, 738-748 (2008).</li>
<li>Doyle, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+a+translational+profiling+approach+for+the+comparative+analysis+of+CNS+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Application of a translational profiling approach for the comparative analysis of CNS cell types.</a> Cell. 135, 749-762 (2008).</li>
<li>Dougherty, J. D., Schmidt, E. F., Nakajima, M., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+approaches+to+RNA+profiling+data+for+the+identification+of+genes+enriched+in+specific+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">Analytical approaches to RNA profiling data for the identification of genes enriched in specific cells.</a> Nucleic acids research. 38, 4218-4230 (1093).</li>
<li>Fomchenko, E. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruited+cells+can+become+transformed+and+overtake+PDGF-induced+murine+gliomas+in+vivo+during+tumor+progression%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Recruited cells can become transformed and overtake PDGF-induced murine gliomas in vivo during tumor progression.</a> PloS one. 6, e20605(2011).</li>
<li>Helmy, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+global+alteration+of+translational+regulation+glioma+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Identification of global alteration of translational regulation glioma in vivo.</a> PloS one. 7, e46965(2012).</li>
<li>Zhou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interrogating+translational+efficiency+and+lineage-specific+transcriptomes+using+ribosome+affinity+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Interrogating translational efficiency and lineage-specific transcriptomes using ribosome affinity purification.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 15395-15400 (2013).</li>
<li>Drane, L., Ainsley, J. A., Mayford, M. R., Reijmers, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transgenic+mouse+line+for+collecting+ribosome-bound+mRNA+using+the+tetracycline+transactivator+system%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+molecular+neuroscience%22%5BJournal%5D)">A transgenic mouse line for collecting ribosome-bound mRNA using the tetracycline transactivator system.</a> Frontiers in molecular neuroscience. 7, 82(2014).</li>
<li>Yoon, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+translation+of+extranuclear+lamin+B+promotes+axon+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Local translation of extranuclear lamin B promotes axon maintenance.</a> Cell. 148, 752-764 (2012).</li>
<li>Watson, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+translational+profiling+in+the+Xenopus+laevis+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+dynamics+%3A+an+official+publication+of+the+American+Association+of+Anatomists%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific translational profiling in the Xenopus laevis retina.</a> Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 241, 1960-1972 (2012).</li>
<li>Fang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+profiling+of+cardiomyocytes+identifies+an+early+Jak1%2FStat3+injury+response+required+for+zebrafish+heart+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Translational profiling of cardiomyocytes identifies an early Jak1/Stat3 injury response required for zebrafish heart regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 13416-13421 (2013).</li>
<li>Tryon, R. C., Pisat, N., Johnson, S. L., Dougherty, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+translating+ribosome+affinity+purification+for+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Development of translating ribosome affinity purification for zebrafish.</a> Genesis. 51, 187-192 (2013).</li>
<li>Jiao, Y., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-type+specific+analysis+of+translating+RNAs+in+developing+flowers+reveals+new+levels+of+control%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+systems+biology%22%5BJournal%5D)">Cell-type specific analysis of translating RNAs in developing flowers reveals new levels of control.</a> Molecular systems biology. 6, 419(2010).</li>
<li>Thomas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+method+for+cell-specific+profiling+of+translated+mRNAs+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">A versatile method for cell-specific profiling of translated mRNAs in Drosophila.</a> PloS one. 7, e40276(2012).</li>
<li>Huang, Y., Ng, F. S., Jackson, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Larval+and+Adult+Drosophila+Astrocytes+Reveals+Stage-Specific+Gene+Expression+Profiles%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">Comparison of Larval and Adult Drosophila Astrocytes Reveals Stage-Specific Gene Expression Profiles.</a> G3. , (2015).</li>
<li>Steiner, F. A., Talbert, P. B., Kasinathan, S., Deal, R. B., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-type-specific+nuclei+purification+from+whole+animals+for+genome-wide+expression+and+chromatin+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Cell-type-specific nuclei purification from whole animals for genome-wide expression and chromatin profiling.</a> Genome Res. 22, 766-777 (2012).</li>
<li>Henry, G. L., Davis, F. P., Picard, S., Eddy, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+genomics+of+Drosophila+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific genomics of Drosophila neurons.</a> Nucleic acids research. 40, 9691-9704 (2012).</li>
<li>Dobi, K. C., Halfon, M. S., Baylies, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-genome+analysis+of+muscle+founder+cells+implicates+the+chromatin+regulator+Sin3A+in+muscle+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+reports%22%5BJournal%5D)">Whole-genome analysis of muscle founder cells implicates the chromatin regulator Sin3A in muscle identity.</a> Cell reports. 8, 858-870 (2014).</li>
<li>Salmand, P. A., Iche-Torres, M., Perrin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+cell+sorting+from+Drosophila+embryos%3A+application+to+gene+expression+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Fly%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific cell sorting from Drosophila embryos: application to gene expression analysis.</a> Fly. 5, 261-265 (2011).</li>
<li>Busser, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanism+underlying+the+regulatory+specificity+of+a+Drosophila+homeodomain+protein+that+specifies+myoblast+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanism underlying the regulatory specificity of a Drosophila homeodomain protein that specifies myoblast identity.</a> Development. 139, 1164-1174 (2012).</li>
<li>Rorth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gal4+in+the+Drosophila+female+germline%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+development%22%5BJournal%5D)">Gal4 in the Drosophila female germline.</a> Mechanisms of development. 78, 113-118 (1998).</li>
<li>Rubin, G. M., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+transformation+of+Drosophila+with+transposable+element+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors.</a> Science. 218, 348-353 (1982).</li>
<li>Ingolia, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+profiling+reveals+pervasive+translation+outside+of+annotated+protein-coding+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+reports%22%5BJournal%5D)">Ribosome profiling reveals pervasive translation outside of annotated protein-coding genes.</a> Cell reports. 8, 1365-1379 (2014).</li>
</ol>

יש המחברים אין לחשוף.

מאמר זה מתאר פרוטוקול שונה של תרגום ריבוזום זיקה טיהור (המכונה &quot;מלכודת-RC &#39;) מוקדש למחקר של אוכלוסיות תאים נדירות בעוברי תסיסנית. מידע מסופק על השלבים העיקריים לבידוד מוצלח של RNA הספציפי עם תשואה המתאימה לmicroarray או ניתוח RNA-seq, כלומר כמות, 1) של חומר ביולוגי הנדרש והליך מותאם לתמוגה עובר וחילוץ polysome; 2) חרוזים / נוגדן לlysate יחסים לimmunoprecipitation האופטימלי; 3) על שלבים המאפשרים הפחתה של רקע כולל הרכב חיץ לשטוף כדי להריץ ניסויי מלכודת RC עם סגוליות גבוהות ורגישות. פרוטוקול זה מניב נתונים לשחזור שהופכים אותו בקלות מיושם על כל סוגי תאים אחרים. טכניקה זו מאפשרת לנתח ביטוי גני ההפרש ברמה של mRNA באופן פעיל-תרגום ובכך לסלול את הדרך להבנת ביטוי חלבון במפרט<html> סוג תא ific בחלון זמן מסוים. שים לב, עם זאת, שפע חלבון יהיה תלוי בקצב של תהליכי התרגום והשפלה. מגבלה עיקרית של שיטת המלכודת היא חוסר יכולתה למדוד את תכולת חלבון באופן כמותי מדויק או לזהות שינוי שלאחר translational. שיפור הכימות על ידי מדידת צפיפות הריבוזום לאורך גוף mRNA ו, בכך, באופן תאים מסוג ספציפי יכול לעשות TRAP בשילוב עם הריבוזום footprinting כלי רב עוצמה. במאמר האחרון 34, השילוב הזה בוצע בכליות 293 תאים עובריים אנושיים. המחברים רצו footprinting nuclease אחרי טיהור זיקה של טופס biotinylated מושרה של RpL10A באמצעות חרוזים streptavidin. זוהי הוכחה של עיקרון כי ניתן לבצע footprinting הריבוזום בהאורגניזם כולו תוך מיקוד סוג תא מסוים, ההגבלה להיות כמות החומר ביולוגי הנדרש לצורך. &quot;&gt; ביצוע ניסויי TRAP במקביל לניתוחי transcriptomic הגלובליים יאפשר לעקוב אחר פרופורציות בין חדש-עיבד וactively- תרגום RNA. זה יהיה מאוד אינפורמטיבי של המנגנונים שלאחר התעתיק הפוטנציאליים מתקיימים בהקשרים התפתחותיים ספציפיים או אוכלוסיות תאים ספציפיות מיקרו-רנ&quot;א -by למשל. לסיכום, TRAP הוא שיטה יעילה ביותר, ספציפית ורגישה לזיהוי RNAs חייב ריבוזומים פעילים-תרגום באופן ספציפי בתא. בשיטה זו ניתן להשתמש במגוון רחב של יצורים וסוגי רקמות. פרוטוקול מלכודת RC החדש שתואר כאן היה מותאם לאוכלוסיות נדירות של תאים (פחות מ -1% ממספר כולל של תאים) ולכמות חומר סופי מספיקה לניתוחים שלאחר מכן ברמה כל-הגנום. מגבלה אפשרית של שיטה זו היא הדרישה של נהג חזק כדי לייצר ריבוזומים מתויגים בכמות מספקת לcompete עם לא מתויגים אלה אנדוגני בסוג התא הממוקד. במחקר שנערך לאחרונה 25, מחברים מוערך 10-30% היחס מתויג לעומת הריבוזומים לא מתויגים. כדי להתגבר על בעיה זו הגדלת מספר עותק-EGFP כטב&quot;מ-RpL10A צריך לשפר באופן משמעותי את האיזון הזה. לחלופין, הוספה לרקע הגנטי תאר transgene כטב&quot;מ-GAL4 תגביר את הייצור של חלבון GAL4 ובעקיפין להגדיל ביטוי של RpL10A-EGFP. זה צריך להעדיף התפוסה טובה יותר של ריבוזומים מתויגים על mRNA. שים לב שגישה יעילה כבר זה יכול להתבצע אפילו יותר חזק על ידי התאמת שיטות משלימות להביא היבט הכמותי יותר או לגלות ולפענח מנגנונים מולקולריים שהם חיוניים לשליטת ביטוי גנים.

ההבנה כיצד תאי רכישת נכסים ספציפיים במהלך הפיתוח היא חיונית על מנת להעריך את המורכבות של איברים והתפתחות הפוטנציאל שלהם כלפי מצבים פתולוגיים. יש דחיפת מחקר גדולה לפענח את רשתות הרגולציה הגן שנמצאות בבסיס מפרט תא והתמיינות של פרופילי ביטוי גנים הגלובליים גילו דבר, מעמד מחייב פול השני, תפוסת תמלול בגורם על רצפים רגולטוריים או לאחר translational שינויים של ההיסטונים. כדי להעריך ביטוי גנים בmicroarrays רמה הגלובלי וגישות RNA-seq משמשות. Microarrays יאפשר לזהות שפע mRNA, ואילו RNA-seq הוא טוב יותר מותאם להלשנה על הסוגים השונים של RNAs כוללים קידוד וnoncoding RNAs כמו מיקרו-רנ&quot;א, lncRNAs או snRNAs. עם זאת, טכניקות אלה לא יכולים להבדיל באופן פעיל-עיבד, מצב יציב mRNA, פעיל-תרגום mRNA, וmRNA כניסה לתהליך הפירוק. מדידה יציבה-st<html> אכלתי רמות ה- mRNA ידוע להיות הערכה לקויה של הרכב proteome 1-3. בניגוד, זיהוי באופן פעיל-תרגום mRNA נותן תמונה מדויקת יותר של ייצור חלבון. עם זאת, מחקרי transcriptomic היו בעיקר הובילו ברמה כל-אורגניזם על ידי השוואת רווח או הפסד של פונקציה של גורם ספציפי למצב בר-סוג 4-7 או על רקמה גזור, מה שהופך את פרופילי ביטוי גנים קשים לפרש. התקדמות בכלי תא מיקוד, טיהור זיקה ושיפורי רגישות מאפשרת כעת לבצע הגנום מנתח באוכלוסיות קטנות של תאים או תאים בודדים אפילו באורגניזם חי. בדרוזופילה, אוספים גדולים של קווים מהונדסים יאפשר מיקוד של זמן ומרחב ספציפי של רקמות שונות ותת-אוכלוסיות תאים באמצעות מערכת GAL4 / כטב&quot;מ 8-10 מניב כימות מדויק יותר של המנגנונים המולקולריים הנדרשים לתפקוד תא. התחת = &quot;jove_content&quot;&gt; בין גישות חדשות שפותח על ידי חלוקה polysome פרופיל תואר כדרך כדי ללכוד באופן פעיל-תרגום 11 RNA. שיטה זו מבוססת על צנטריפוגה שיפוע סוכרוז מאפשרת הבחירה של חלק polysome ונחישות של mRNA מתורגמת הגנום כאשר ניתחו עם microarrays או רצף עמוק. Polysome בידוד יכול להיות בשילוב עם מערכת עיכול nuclease לזהות עקבות ריבוזומלי המתאימות לברי RNA מוגנים על ידי הריבוזומים במהלך תהליך התרגום 12. footprinting ריבוזומלי מגדיל את הדיוק של כימות תרגום RNA ורזולוציה ברמת רצף RNA ומיצוב הריבוזום, מאפשר למדוד שיעור של תרגום. עם זאת, עד היום לא הוחלו על בידוד תא ספציפי של translatomes, בעיקר כתוצאה מהירידה החזקה בתשואת RNA המתקבלת בסופו של תהליך footprinting הריבוזום. בהתחשב בכך שבחירת הגודל של RNA עשויה ליצור שקר-p פוטנציאלositives מRNPs שונה שיכולים להיות גם הגנת RNA באופן דומה, יש צורך בהתפתחויות נוספות כדי לשפר את footprinting ריבוזומלי ולהתאים אותה לגישות תא ספציפי. אחת שיטות כגון, נקרא תרגם ריבוזום הזיקה הטיהור (TRAP) תוארה בשנת 2008 על ידי היימן ואח &#39;. ומיושם לבודד את translatome מקבוצת משנה של תאי עצב בעכברים. על ידי epitope תיוג חלבון ריבוזומלי באופן תאים מסוג ספציפי, polysomes יכול להיות מטוהר באופן סלקטיבי ללא צעד מייגע של ניתוק תא ומיון. במקרה זה, בשנתי ה -60 חלבון ריבוזומלי L10a על פני השטח של הריבוזום הייתה מתויגת עם 13 eGFP. מאז 2008, מספר מחקרים השתמשו בשיטה זו במינים שונים, מעכברי 14-19 לX. laevis 20,21, 22,23 דג הזברה וארבידופסיס thaliana 24. שיטת המלכודת גם הותאמה למודל תסיסנית ומשמשת לפוריםתאים מהסוג ספציפי פ.י. mRNAs מהתאים עצביים 25 והאסטרוציטים 26. מערכת GAL4 / כטב&quot;מ בינארי צדדי שימשה להביע RpL10A GFP מתויג באופן רקמות ספציפיות. ראשי הזבובים בוגרים נותחו לבצע בחירת polysome מהתאים עצביים (ממוקדים על ידי נהג Elav-Gal4 פאן-עצבי) וRNAs המבודד היו רצף. המספר הגדול של גנים מוסדרים עד תואם לאלה ידועים להתבטא במערכת העצבים, המצביע על כך שיש הגישה ספציפיות טוב וגרם לנו להתאים אותו לאוכלוסיות תאים נדירות (פחות מ -1% של תאים) נוכחי בפיתוח עובר תסיסנית . בתוך מודל דרוזופילה, השלב העוברי הוא מודל של בחירה לחקר תהליכים התפתחותיים, כשחקנים המולקולריים ותנועות המוךפו&quot;גנטי נשמרים אבולוציונית. גישות transcriptomic רקמות ספציפיות בלבד שנערכו עד כה במודל זה בוצעו באמצעות סלולארי או גרעיני כךrting והיה מסוגל ללמוד transcriptome מצב יציב 27-31 בלבד, יצירת צורך בשיטות מוקדשת לרקמה / פרופיל translatome תא ספציפי בעובר הזבוב. כאן אנו מדווחים פרוטוקול המלכודת הראשון מוקדש לעוברי תסיסנית. בשיטה זו, העוסק ב-התרגום mRNA באוכלוסיית תא מוגבל מאוד של כ -100 תאי שריר לכל עובר היה מבודד בהצלחה עם איכות וסגוליות גבוהים. GAL4 / כטב&quot;מ המערכת בינארי משמשת לנהוג הביטוי של RpL10A מתויג GFP בתת-אוכלוסייה של שרירים ללא כל רעילות, אין פנוטיפים לכאורה או עיכוב התפתחותי, כפי שמוצגים בעבר 25. עובר תסיסנית יש 30 שרירים לhemisegment שיהיה להצמיח השרירים של הזחל. על ידי שימוש באזור רגולטורים גילו בסביבה של גן זהות נמושה, 6 מתוך 30 השרירים רב-הגרעיניות ממוקדים. ב assay זה, הריבוזומים הם משותקים על mRNA באמצעות התארכות התרגוםמעכב cycloheximide. תמציות cytosolic משמשות לאחר מכן לטיהור זיקה עם חרוזים מגנטיים מצופים נוגדן ה- GFP. איכות של RNA מטוהר קבלה תוקף באמצעות bioanalyzer. שעתוק לאחור PCR (RT-qPCR) שימש כדי לקבוע את הספציפיות ורגישות של בידוד mRNA והוכיח כי הפרוטוקול מותאם שלנו הוא יעיל ביותר.

<table><tbody><tr><td>HEPES</td><td>סיגמא&nbsp;</td><td>H4034-1006</td><td></td></tr><tr><td>1,2-דיהפטנואיל-SN-גליצרו-3-פוספוכולין&nbsp;</td><td>שומנים קוטביים Avanti</td><td>850306P</td><td></td></tr><tr><td>גליקוגן</td><td>תרמו מדעי&nbsp;</td><td>R0561</td><td></td></tr><tr><td>מטוהר BSA 100X&nbsp;</td><td>Biolabs</td><td>B9001</td><td></td></tr><tr><td>שמרים tRNA&nbsp;</td><td>סיגמא</td><td>R5636</td><td></td></tr><tr><td>סופר RNase ב &nbsp;</td><td>אמביון</td><td>AM2694</td><td></td></tr><tr><td>נוגדנים GFP שיבוט N86/38</td><td>UC DAVIS/NIH נוירומאב סגל נוגדנים משולבים</td><td>75-132&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P40&nbsp;</td><td>Roche</td><td>11754595001</td><td></td></tr><tr><td>Precellys 24 Lysis הומוגניזציה&nbsp;</td><td>Bertin Technology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מים ללא נוקלאז&nbsp;</td><td>Nalgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads ProteinG</td><td>Invitrogen</td><td>10004D</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן כלורי (KCl)</td><td>ביו-סיסטם יישומי&nbsp;</td><td></td><td></td>AM96406</tr><tr><td>מגנזיום כלוריד (MgCl2)&nbsp;</td><td>יישומי ביוסיסטם&nbsp;</td><td></td><td></td>AM95306</tr><tr><td>תאית וודין לא מולבן&nbsp;</td><td>VWR</td><td>115-2597&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>מסננות 112, 355, 710 um&nbsp;</td><td>רטש</td><td></td><td></td></tr><tr><td>טריזול&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td></td></tr><tr><td>MagRack 6</td><td>GE HealthCare&nbsp;</td><td></td><td></td>28948964</tr><tr><td>טיפים למסנן כריכה נמוכה&nbsp;</td>שפופרת ללא רנז <td>קליר ליין</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 מ"ל&nbsp;</td><td>ClearLine</td><td>390689DD</td><td></td></tr><tr><td>בגילאי 20&nbsp;</td><td>פישר ביו-ריאגנט&nbsp;</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>ציקלוהקסימיד&nbsp;</td><td>סיגמא&nbsp;</td><td>C1985</td><td></td></tr><tr><td>טבליות מעכבי פרוטאז, Mini-Complete, ללא EDTA&nbsp;</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td></td></tr></tbody></table>

מלכודת rc, תרגום ריבוזום זיקה טיהור מאוכלוסיות תאים נדירות של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עוברים

TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification from Rare Cell Populations of Drosophila Embryos

מדידת רמות mRNA בתהליך התרגום בתאים בודדים מספקת מידע על החלבונים המעורבים בתפקודי התא בנקודת זמן נתונה. הפרוטוקול המכונה Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) מסוגל ללכוד את תהליך תרגום ה-mRNA הזה בצורה ספציפית לסוג התא. בהתבסס על טיהור הזיקה של פוליזומים הנושאים תת-יחידה ריבוזומלית מתויגת, ניתן ליישם TRAP על ניתוחי טרנסלטום בתאים בודדים, מה שמאפשר להשוות סוגי תאים במהלך תהליכי התפתחות או לעקוב אחר התקדמות התפתחות המחלה וההשפעה של טיפולים פוטנציאליים ברמה המולקולרית. כאן אנו מדווחים על גרסה אופטימלית של פרוטוקול TRAP, הנקראת TRAP-rc (תאים נדירים), המוקדשת לזיהוי RNA מעורב בתרגום מאוכלוסיות תאים נדירות. TRAP-rc אומת באמצעות מערכת המיקוד Gal4/UAS באוכלוסייה מוגבלת של תאי שריר בעוברי דרוזופילה. פרוטוקול חדשני זה מאפשר שחזור של RNA ספציפי לסוג התא בכמויות מספיקות לניתוח ביטוי גנים גלובלי כגון מיקרו-מערכים או RNA-seq. החוסן של הפרוטוקול והאוספים הגדולים של דוחפי Gal4 הופכים את TRAP-rc לגישה רב-תכליתית ביותר עם יישומים פוטנציאליים במחקרים כלל-גנומיים ספציפיים לתא.

המערכת הגופנית עוברי תסיסנית השריר מורכבת של 30 שרירים לhemisegment, ויש לו כל שריר קבוצה מסוימת של מאפיינים: קוד של גני הזהות, עמדה, מספר אירועי היתוך, אתרים מצורפים ועצבוב. זיהוי mRNA המתורגם בתת-קבוצת שרירים ספציפית ייתן מידע על החלבונים הדרושים ליצירת מאפייני שרירים הספציפיים אלה. שימוש בשיטה מבוססת המלכודת, RNA מתת-אוכלוסייה של שרירים המבטאים את גן נמושה זהות הייתה מטוהר (1A-B איור). דאגה עיקרית של גישה זו היא באיכות והספציפיות של RNA הבודד. הפרוטוקול מותאם דיווח כאן אפשר התאוששות שיטתית של RNA באיכות גבוהה העריך עם ניתוח bioanalyzer. מופעי הפרופיל הושגו שום השפלה של RNA (איור 1 ג). במחקרים אחרים התפתחו סביב שיטת המלכודת, הועלו שאלות על הספציפיות של נתונים. כאן אנוmprove השיטה לדכא רקע קשור לאינם ספציפי מחייב של RNA לחרוזים או הצינורות ועל ידי אופטימיזציה של החיץ לשטוף. על מנת להעריך את רמת הרקע ויעילות של בידוד תאים לבטא-נמושה, שהובלנו ניסויי RT-qPCR על 3 חזרות של אותו השלב עוברי. מקפלים-מוספים של 4 גנים שונים (mef2, נמושה, פרוספרו, soxNeuro) חושבו בהשוואה לקלט ומנורמל נגד גן RpL32 (1D איור). תוצאות אלו הראו העשרת 2.3-פי של mef2 גן פאן-שרירי והעשרת 5.6-פי של גן נמושה. לעומת זאת, שני גנים המתבטאים במערכת העצבית היו מדולדלים בהשוואה לקלט. ערכי שינוי קיפול מאוד דומים נצפו על 3 משכפל ביולוגי, הוכחה כי הפרוטוקול הוא איתן. עם נהג נמושה-Gal4 ומתחיל עם 1.5 גר &#39;, סביב 1.5x10 ^ 6 עוברים התקבלו המכילים 100 תאי GFP / עובר (כוללת של 150 × 10 ^ 6 חיובייםתאים). לאחר הפעלת ניסוי המלכודת, התשואה היא סביב 25-45 ננוגרם של RNA המסוים תלוי בשלב של עניין. חומר זה הוא מספיק כדי להפעיל ניתוח microarray או RNA-seq באמצעות פרוטוקול הגברה לבנות ספריית RNA-seq. יעילות תהיה תלויה במידה רבה בכוחו של הנהג נהג להביע RpL10A-EGFP. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52985/52985fig1.jpg" /> איור 1. איכות והערכה ספציפי של RNA-מבודד מלכודת מנמושה-GAL4&gt; עוברי UASRpL10A-EGFP. (AB) תמונות Confocal של עובר בשלב 16 מראה ביטוי RpL10A-EGFP במיוחד בששת תאי שריר נמושה לhemisegment (). שיתוף לוקליזציה של RpL10A-EGFP עם Beta3tubulin סמן שרירים הכללי הוא ציין בתמונת מיזוג (B). בקרת איכות של TRAPed RNA ע&quot;ר (C)n על bioanalyzer מראה יושרה מושלמת של 18S rRNA ו -28. ניתוח (ד) RT-qPCR מראה סגוליות גבוהה של ניסויי mRNA-מבודד TRAP על 3 משכפל ביולוגי של שלב-16 עובר. מקפלים שינוי מחושב בהשוואה לקלט ומנורמל נגד גן RpL32. תמלילי Mef2 נוכחים בכל שושלות השריר הם מועשרים-2.3-פי השוואה לקלט ואילו תמלילי נמושה מוגבלים יותר הם 5.6-מועשר פי. תאים עצביים להביע פרוספרו וגני soxN מתרוקנים 2.2 פי 5.5 ופי בהתאמה. ברים שגיאה מייצגים סטיית תקן (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52985/52985fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) מסוגל ללכוד תרגום ספציפי לסוג התא של mRNA. כאן אנו מדווחים על פרוטוקול TRAP הראשון המוקדש לבידוד mRNA באוכלוסיות תאים נדירות של עוברי דרוזופילה.

מלכודת RC, תרגום ריבוזום זיקה טיהור מאוכלוסיות תאים נדירות של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עוברים

Measuring levels of mRNAs in the process of translation in individual cells provides information on the proteins involved in cellular functions at a given ...

המטרה הכללית של נוהל זה היא לבודד RNA המעורב בתרגום באופן ספציפי לסוג תא בעוברים של דרוזופילה. דבר זה מושג תחילה על ידי איסוף עוברים מקו זבובים טרנסגני, המאפשר ביטוי ספציפי של תת-יחידה ריבוזומלית המסומנת ב-GFP בסוג התא המיועד, ובמקרה זה, בתאי שריר ה-slouch. השלב השני הוא יצירת ליזט להפקת תכשיר פוליסומים המכיל תערובת של ריבוזומים מסומנים ולא מסומנים.בשלב הבא, מוערך ריכוז החלבון בליזט (lysate) ומבוצע ניקוי אפיניות באמצעות חרו지를 המצומדים לנוגדני GFP כדי ללכוד קומפלקסים של RNA ריבוסומלי מסוג התא הרצוי. השלב הסופי מוקדש למיצוי וניקוי של RNA טוטאלי. לבסוף, מבוצעות הערכות איכות וספציפיות באמצעות bioanalyzer ו-R-T-Q-P-C-R בהתאמה.ניתן להשתמש ב-RNA לאחר מכן לניתוח כמותי גלובלי באמצעות ריצוף RNA או מערכי מיקרו (microarrays). היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני השיטה הקיימת שלנו, בדומה למיון VX, הוא שאינה דורשת שלב מעבדתי של דיסוציאציה של תאים. ניתן לבצע אותה על שולחן העבודה.השיטה מהירה ומאפשרת זיהוי ישיר של RNA מתורגם באוכלוסיות תאים קטנות מאוד, דבר המהווה יתרון משמעותי להבנת רכישת תכונות של תאים. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי מיוגנזה בעוברים של Josephine, ניתן להחיל אותה גם על רקמות אחרות או אורגניזמים מודרניים, כגון צמחים, דגי זברה או עכברים, והיא עשויה לסייע גם במעקב אחר השפעת טיפול על סינתזת חלבונים במקרה של פתולוגיה. את הפרוצדורה ידגים Benjamin Berta, סטודנט לדוקטורט מהמעבדה שלי. לאחר הנדסת שני קווי התורשן בהתאם להוראות בחלק הכתוב של הפרוטוקול והכלאה ליצירת קו תורשן כפול של trap, הגדילו את הקו על ידי הכנת שמונה כלובים גליליים גדולים לאוכלוסיות, המכילים כ-40 גרם זבובים צעירים לכל כלוב, מה שמתבטא בכ-180,000 זבובים לכל כלוב.הכינו צלחות פטרי בקוטר 11 סנטימטר המכילות תערובת של אגר מוצק ומיץ ענבים, כאשר שליש מהשטח מכוסה במשחת שמרים שהוכנה טרי, ואפשרו לזבובים להטיל ביצים על צלחות אלו למשך שעה אחת. חזרו על תהליך זה בשתי סדרות נוספות של צלחות מיץ ענבים טריות כדי לאפשר לזבובים לרוקן לחלוטין את תעלותיהן. העוברים הדו-טרנסגניים הרצויים מההכלאה יוטלו על הצלחת הרביעית.הוציאו מהכלובים את הצלחות המכילות את העובריים הרצויים והניחו להם להדגר עד לשלב ההתפתחות הרצוי בטמפרטורת החדר. במקרה זה נעשה שימוש בהדגרה של 13 שעות. לאחר מכן, השעיו מחדש את תוכן הצלחת בכ-50 milliliters של מים באמצעות מברשת.הפרידו את העוברים מהזבובים המתים על ידי העברת הנוזל דרך שלושה נמסים בקטרים של 700, 355 ו-112 מיקרון. שטפו את העוברים שנאספו בנמס בעל הקוטר הקטן ביותר במים מיוננים. השריגו את העוברים ב-4.5% bleach במים מיוננים למשך שתי דקות, ולאחר מכן שטפו ביסודיות במים מיוננים למשך 30 עד 60 שניות.דגרו את העוברים ב-PBS 0.01%T בריכוז של בין 20 ל-100 micrograms per milliliter Cyclo heide למשך חמש עד 10 דקות בטמפרטורת החדר עם ערבול. לאחר ייבוש העוברים על דפי סלולוז סופגים, העבירו אותם לנבובות מיקרו-צנטריפוגה, לאחר מכן שקלו את הנבובות ובצעו הקפאה מהירה (flash freeze) של העוברים על ידי טבילה בחנקן נוזלי.בשלב זה, ניתן לאחסן את העוברים המיובשים למשך מספר חודשים בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס. העבירו 1.5 גרם של העוברים המיובשים למבחנות של 15 מיליליטר שקוללו מראש, המכילות ארבעה מיליליטר של באפר למיצוי פוליסומים, והומוגניזו באמצעות פפטה סרולוגית סטרילית של 10 מיליליטר.לאחר מכן, פזרו את העוברים ההומוגניזים לשתי מבחנות של 2 ml שקוללו מראש, וגרסו את העוברים בטחנת חרוצים (bead grinder) במהירות גבוהה ובכיוונים מרובים. הגדירו שתי הרצות של 10 שניות ב-5,000 RPM, עם הפסקה של 15 שניות בין מחזור למחזור. לאחר 10 דקות של סנטריפוגציה ב-2000 G, העבירו את הליזאט למבחנת מיקרו-סנטריפוגה נקייה וקרירה על קרח.הוסף NP-40 בריכוז 10% לסופרנאט S עד לריכוז סופי של 0.1% וערבב בעדינות על ידי הפיכת המבחנה. הוסף 300 micromolar של DHPC עד לריכוז סופי של 30 millimolar וערבב בעדינות על ידי הפיכת המבחנה. הדגר את התערובת על קרח למשך חמש דקות, תוך ערבוב על ידי הפיכה מספר פעמים במהלך ההדגרה.לאחר הדגרה בקרח, הכין את העלייה הפוסט-מיטוכונדריאלית באמצעות סבב צנטריפוגה בטמפרטורה של 4 °C למשך 10 דקות ב-20,000 G. לאחר מדידת ריכוז החלבון בשיטת Bradford והשגת ריכוז חלבון שבין 60 ל-80 mg/mL, העבר את ה-SNAT לשפופרת מיקרו-צנטריפוגה נקייה ומקוררת מראש, ועבור מיד לשלב הספיחה המוקדמת (pre-absorption). השהה מחדש את החרוזיים המגנטיים באמצעות ערבוב עדין, ולאחר מכן העבר 30 µL של חרוזיים עבור כל mL של ליזט לשפופרת מיקרו-צנטריפוגה.אספו את החרוצים באמצעות המגנט, שאבו החוצה את הנוזל העליון ותלו את החרוצים ב-500 microliters של בופר למיצוי פוליסומים. לאחר מכן, אספו את החרוצים באמצעות המגנט. שוב, הוסיפו ליזט עוברי והדגירו למשך שעה אחת בטמפרטורה של ארבע degrees Celsius על רשש (rotator).הסר את החרוזיים והנח את העלייה (supernatant) על קרח עד לשלב הניקוי האימונולוגי. שמור 100 µL מהעלייה כמדגם RNA גלובלי להשוואה עם המדגם שייאסף לאחר הניקוי האימונולוגי. כדי לבצע ניקוי אימונולוגי למדגם, הוסף 1 mL של ליזאט שנספג מראש למבחנה נטולת RNA המכילה 90 µL של חרוזיים חסומים המצומדים לנוגדן GFP. דגור את המדגם בטמפרטורה של 4 °C למשך שעתיים או למשך הלילה, תוך ערבוב עדין מסוג end-over-end באמצעות מסובב מבחנות (tube rotator) לאחר הדגירה.שטפו את החרוצים תחילה על ידי סבוב של החרוצים הנותרים בצנטריפוגה מיני. לאחר מכן, אספו אותם באמצעות מגנט, השעיו אותם מחדש ב-500 microliters של בופר שטיפה והדגירו אותם תוך ערבוב במשך 10 דקות בחדר הקירור, ולאחר מכן אספו שוב את החרוצים באמצעות המגנט.העבר את החרו지를 למבחנה נקייה וחופשית מ-RNases, ושטוף פעמיים נוספות. לבסוף, לאחר איסוף החרוזים על המגנט, בצע מיצוי RNA על ידי הוספת 1 ml של TRIOL לחרוזים וביצוע המיצוי בהתאם להוראות היצרן. לאחר מכן, בצע ניקוי RNA באמצעות ערכת RNEZ micro בהתאם להוראות היצרן.כדי לבחון את הספציפיות של ה-RNA שנלכד, בצעו תעתוק הפוך של שלושה ננוגרמים של RNA שעבר טיהור אימונולוגי ושל RNA קלט (input RNA) בהתאם לנהלים הסטנדרטיים. לאחר מכן, השתמשו ב-CDNA שהתקבל לביצוע QPCR באמצעות סטים של פריימרים ספציפיים לגנים. תמונת קונפוקאל זו של עובר בשלב 16 מראה ביטוי של RPL 10 A-E-G-F-P, באופן ספציפי בשש תאי שריר ה-slouch בכל מקטע HEMI; ניתן להבחין בקו-לוקליזציה של RPL 10 A-E-G-F-P עם סמן השריר הכללי beta three tubulin.RNA שנלכד הועבר לאנליזה ב-bioanalyzer לצורכי בקרת איכות. שימו לב לשלמות המושלמת של ה-18S וה-28S ribosomal RNAs. איור זה מציג את תוצאות ניתוח RT QPCR של שלושה שכפולים ביולוגיים של עוברים בשלב 16, ומדגים את הספציפיות הגבוהה של mRNA שהבודד בשיטת trap.השינוי ב-FO חושב בהשוואה לקלט ונורמל אל מול מתילציה של הגן RPL 32. שני תמלילים הנמצאים בכל שושלות השריר הועשרו פי 2.3 בהשוואה לקלט, בעוד שתמלילי slouch מוגבלים יותר הועשרו פי 5.6; תאי עצב המבטאים את prospero ו-socks וגנים הועשרו במידה שלילית (depleted) פי 2.2 ופי 5.5 בהתאמה לאחר התפתחותם. טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים, במיוחד בתחום הביולוגיה ההתפתחותית, לחקור מחויבות עצמית ורכישת תכונות תא במהלך התמיינות של עוברי doof.

trap-rc-translating-ribosome-affinity-purification-from-rare-cell

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

מכשול משמעותי מנתח ביוכימיים של הריבוזומים המכיל המתהווה peptidyl-tRNAs כבר נוכחות של הריבוזומים אחרים דגימות אותו, ריבוזומים לא מעורב בתרגום של רצף ה-mRNA ספציפי להיות מנותח. פיתחנו מתודולוגיה פשוטה כדי לטהר, בלעדי, את הריבוזומים המכיל את המתהווה peptidyl-tRNA של עניין.

בידוד של הריבוזומים תרגום המכילים Peptidyl-tRNAs עבור ניתוח פונקציונלי מבנית

כאן אנו מתארים שלם הר...

הר כולו RNA פלורסנט<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עוברים

מטרת פרוטוקול זה היא לספק גישה פשוטה וזולה לאיסוף עוברים תסיסנית בקנה מידה בינוני (0.5-1 גרם) והכנת תמציות חלבון שניתן להשתמש ביישומים proteomic במורד הזרם, כגון זיקה טיהור ספקטרומטריית מסה (AP-MS ).

הכנה בינונית של<em&gt; תסיסנית</em&gt; עוברי תמציות עבור ניסויים פרוטאומיים

אנו מציגים גישה כדי לטהר את הריבוכמה מאוגד-mRNA מתאי כלי הדם (ECs) ישירות במוח העכבר, הריאות ורקמות הלב באמצעות התגית הגנטית ספציפית EC של חלבון פלואורסצנטית ירוק משופר (EGFP) ב ריבוזומים בשילוב עם טיהור RNA .

תרגום הריבוכמה אהדה לטיהור (מלכודת) לבידוד רנ א מתאי האנדותל בvivo

מתרגם הריבוכמה אהדה (מלכודת) מציעה את האפשרות לנתח תוכניות התפתחותיות עם עיבוד מינימלי של איברים ורקמות. הפרוטוקול מניב RNA באיכות גבוהה מתאים המיועדים עם חלבון פלורסנט ירוק (GFP)-יחידת משנה ריבוזומבית. כלים לניתוח במורד הזרם, כגון רביעיית-PCR או RNA-seq, חושפים פרופילי ביטויים ספציפיים לסוג תאים.

מתרגם הריבוכמה אהדה לטיהור (מלכודת) כדי לחקור את התפתחות השורש של הספר הבסיסי בקנה מידה ספציפי לסוג תא

כאן, אנו מתארים את immunoprecipitation של ריבוזומים ו-RNA הקשורים מאוכלוסיות לבחור של בוגרים זכר תאים הנבט באמצעות מערכת ריבוtag. הרבייה אסטרטגי ולimmunoprecipitation התוצאה הנקייה, התוצאות להתרבות להודיע על תא הנבט translatome ולספק תובנה לתוך מנגנונים של פנוטיפים מוטנטים.

ריבותג Immunoprecipitation בתאי הנבט של העכבר הגברי

כאן, אנו מתארים פרוטוקול לגילוי ולוקליזציה של חלבון עובר Drosophila ו- RNA מאוסף להטבעה והטבעה מראש, אימונוסטיור ו- mRNA בהכלאה במקום .

פרוטוקול לאימונוהיסטוכימיה והפצת RNA In-situ בתוך עובר דרוזופילה מוקדם

אינטראקציות של תרגום משותף ממלאות תפקיד מכריע בשינויים בשרשרת המתהווה, במיקוד, בקיפול ובמסלולי הרכבה. כאן, אנו מתארים פרופיל ריבוזום סלקטיבי, שיטה לניתוח ישיר של in vivo, של אינטראקציות אלה במודל eukaryote Saccharomyces cerevisiae.

זיהוי גלובלי של רשתות אינטראקציה בין תרגומים משותפים על ידי פרופיל ריבוזום סלקטיבי

פרוטוקול זה נועד לבודד mRNA ריבוזומלי ספציפי לסוג התא באמצעות מודל העכבר NuTRAP.

לבודד רנ"א ספציפיים לסוג תא מדגימות רקמות הטרוגניות קפואות ללא מיון תאים

ALIBi (ALIBi) היא שיטה חדשה שמופעלת אופטוגנטית שפותחה לתיוג וטיהור אוכלוסיות תת-תאיות של ריבוזומים לצורך ריצוף וניתוח פרוטאומי במורד הזרם וניתוח פרוטאומי.

בידוד תת-אוכלוסיות ריבוזום תת-תאיות בהתבסס על ביוטינילציה מוגברת במיקום ספציפי לתג פפטיד רקומביננטי - תאורה מוגבלת -

כאן אנו מספקים פרטים כיצד להכין ליזטים ולבצע תרגום חוץ גופי באמצעות עוברי דרוזופילה .

תרגום mRNA ללא תאים במבחנה בליזטים של דרוזופילה

למד את שיטת TRAP לבידוד mRNA מאוכלוסיות תאים נדירות בעוברי דרוזופילה. הפרוטוקול משתמש בזיקה ל-GFP ללכידת ריבוזומים מתאי שריר סלאוץ' ומאפשר ניתוח תרגום ספציפי לסוג תאים.

מלכודת RC, תרגום ריבוזום זיקה טיהור מאוכלוסיות תאים נדירות של

גלה סרטונים נוספים