מלכודת RC, תרגום ריבוזום זיקה טיהור מאוכלוסיות תאים נדירות של דרוזופילה עוברים

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד RNA המעורב בתרגום באופן ספציפי לתא בעוברי דרוזופילה. זה מושג על ידי איסוף עוברים מקו זבוב טרנסגני, המאפשר ביטוי ספציפי של תת-יחידה ריבוזומלית מתויגת GFP בסוג התא הממוקד, במקרה זה, תאי השריר הרפויים. השלב השני הוא יצירת ליזאט לקבלת תכשיר פוליזום המכיל תערובת של ריבוזומים מתויגים ולא מתויגים.

לאחר מכן, ריכוז החלבון בליזאט מוערך וטיהור הזיקה מבוצע עם חרוזים המחוברים לנוגדני GFP כדי ללכוד קומפלקסים של RNA ריבוזום מסוג התא המעניין. השלב האחרון מוקדש לטריול, RNA, מיצוי וטיהור. בסופו של דבר, הערכות איכות וספציפיות מבוצעות עם ביואנלייזר ו-R-T-Q-P-C-R בהתאמה.

לאחר מכן ניתן להשתמש ב-RNA לניתוח כמותי גלובלי על ידי ריצוף RNA או מיקרו-מערכים. היתרון העיקרי של טכניקה זו של השיטה הקיימת שלנו, כמו מיון VX, הוא שהיא אינה דורשת שלב labo של דיסוציאציה של תאים. ניתן לבצע אותו על הספסל.

זה מהיר ומאפשר זיהוי ישיר של RNA מתורגם באוכלוסייה קטנה מאוד של תאים, וזה יתרון מדד להבנת רכישת תכונות התא. גם אם שיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי מיוגנזה בעובר ג'וזפין, ניתן ליישם אותה גם על רקמות אחרות או אורגניזמים מודרניים, כגון צמח, זברה, דגים או עכבר, ויכולה גם לעזור בעקבות השפעת הטיפול על סינתזת החלבון במקרה של פתולוגיה. מי שידגים את ההליך יהיה בנג'מין ברטה, דוקטורנט מהמעבדה שלי לאחר הנדסה, שניהם קווים טרנסגניים על פי ההוראות בחלק הכתוב של הפרוטוקול וחצייה ליצירת קו טרנסגני כפול חוצה מלכודת, מגבירים את הקו על ידי הכנת שמונה כלובי אוכלוסייה גליליים גדולים המכילים כ-40 גרם זבובים צעירים לכלוב, מה שמתאים לכ-180,000 זבובים לכלוב.

הכינו צלחות פטרי בקוטר 11 ס"מ המכילות תערובת של אגר מוצק ומיץ ענבים כששליש מהמשטח מכוסה ברסק שמרים טרי, ואפשר לזבובים להטיל ביצים על צלחות אלה למשך שעה. חזור על תהליך זה על שתי קבוצות נוספות של צלחות מיץ ענבים טרי כדי לאפשר לזבובים לרוקן לחלוטין את ה-ucts שלהם. העוברים הטרנסגניים הכפולים הרצויים מהצלב יונחו על הצלחת הרביעית.

הוציאו את הצלחות המכילות את העוברים הרצויים מהכלובים ואפשרו להם לדגור לשלב ההתפתחותי הרצוי בטמפרטורת החדר. כאן משתמשים בדגירה של 13 שעות. לאחר מכן השעו מחדש את תכולת הצלחת בכ- 50 מיליליטר מים בעזרת מברשת.

הפרד את העוברים מהזבובים המתים על ידי העברת הנוזל דרך שלוש מסננות בקוטר 700, 355 ו -112 מיקרון. שוטפים את העוברים שנאספו במסננת בקוטר הקטן ביותר עם המים המיוננים. יש לצפות את העוברים באקונומיקה של 4.5% במים המיוננים למשך שתי דקות, ולאחר מכן לשטוף היטב במים המיוננים למשך 30 עד 60 שניות.

לדגור את העוברים ב-PBS 0.01%T בין 20 ל-100 מיקרוגרם למיליליטר. Cyclo heide במשך חמש עד 10 דקות בטמפרטורת החדר עם תסיסה. לאחר ייבוש העוברים על יריעות סופגות תאית, העבירו אותם לצינורות מיקרו צנטריפוגה, ואז שקלו את הצינורות והבזקו, הקפיאו את העוברים על ידי טבילה בחנקן נוזלי.

בשלב זה ניתן לאחסן את העוברים המיובשים במשך מספר חודשים בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס. מגמה להעביר 1.5 גרם מהעוברים המיובשים לצינורות מקוררים מראש של 15 מיליליטר, המכילים ארבעה מיליליטר של מיצוי פוליזום, בופר והומוגני. שימוש בפיפטה סרולוגית סטרילית של 10 מיליליטר.

לאחר מכן מורחים את העוברים ההומוגניים לשני צינורות טרום צינון, שני מיליליטר וטוחנים את העוברים במטחנת חרוזים מהירה רב-כיוונית. הגדר לפעול פעמיים למשך 10 שניות ב-5,000 סל"ד עם הפסקה של 15 שניות בין כל מחזור. לאחר 10 דקות של צנטריפוגה ב -2000 גרם, העבירו את הליזט לצינור מיקרו צנטריפוגה מקורר מראש על קרח.

הוסף 10%non P 40 לסופרנטנט S לריכוז סופי של 0.1% וערבב בעדינות על ידי היפוך הצינורית. הוסף 300 מיקרומולר של DHPC לריכוז סופי של 30 מילימולר וערבב בעדינות על ידי היפוך הצינור. דוגרים את התערובת על קרח למשך חמש דקות, מערבבים בהיפוך מספר פעמים במהלך הדגירה.

בעקבות הדגירה בקרח. הכן את הפוסט מיטוכונדריאלי על ידי צנטריפוגה בארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ב -20, 000 גרם.לאחר מדידת ריכוז החלבון בשיטת ברדפורד והשגת ריכוז חלבון בין 60 ל -80 מיליגרם למיליליטר, העבירו את ה- SNAT לצינור מיקרו צנטריפוגה מקורר מראש והמשיכו מיד לשלב הספיגה המוקדמת. השעו מחדש את החרוזים המגנטיים בתסיסה עדינה ולאחר מכן העבירו 30 מיקרוליטר חרוזים לכל מיליליטר ליזאט לצינור מיקרו צנטריפוגה.

אסוף את החרוזים על המגנט, פיפטה מהחטט והשהה מחדש את החרוזים ו-500 מיקרוליטר של מאגר מיצוי פוליזום. לאחר מכן, אספו את החרוזים על המגנט. שוב, מוסיפים עוברי, ליזאט ודוגרים למשך שעה בארבע מעלות צלזיוס על מסובב.

הסר את החרוזים והניח את חומר השכיבה על קרח עד לשלב הטיהור החיסוני. שמירת 100 מיקרוליטר של הסופינט כדגימת ה-RNA העולמית להשוואה עם הדגימה שנאספה לאחר טיהור חיסוני לטיהור חיסוני של הדגימה, הוסף מיליליטר אחד של ליזאט שנספג מראש לצינור נטול RNA המכיל 90 מיקרוליטר של חרוזים חסומים המחוברים לנוגדני GFP. דגרו את הדגימה בארבע מעלות צלזיוס למשך שעתיים או למשך הלילה עם ערבוב עדין מקצה לקצה במסובב צינור לאחר הדגירה.

שוטפים את החרוזים על ידי סיבוב החרוזים הנותרים תחילה בצנטריפוגה מיני. לאחר מכן אוספים על מגנט משעים מחדש 500 מיקרוליטר כביסה, חוצצים ודוגרים שוב ושוב. מסיימים את הערבוב 10 דקות בחדר הקירור ושוב, אוספים את החרוזים על המגנט.

העבירו את החרוזים לצינור טרי ללא רנ"א ושטפו פעמיים נוספות. לבסוף, לאחר איסוף החרוזים על המגנט, המשך למיצוי RNA על ידי הוספת מיליליטר אחד של TRIOL לחרוזים וביצוע מיצוי לפי הוראות היצרן. עקוב אחר זה על ידי ניקוי RNA, באמצעות ערכת מיקרו RNEZ בהתאם להוראות היצרן.

כדי לבדוק את הספציפיות של ה-RNA הכלוא, בצע שעתוק הפוך על שלושה ננוגרם של RNA מטוהר חיסוני וקלט על פי נהלים סטנדרטיים. לאחר מכן השתמש ב-CDNA שהושג עבור QPCR עם ערכות פריימר ספציפיות לגנים. תמונה קונפוקלית זו של עובר שלב 16 מציגה ביטוי RPL 10 A-E-G-F-P, במיוחד בששת תאי השריר הרפויים בכל מקטע HEMI, נצפתה קולוקליזציה של RPL 10 A-E-G-F-P עם סמן השריר הכללי בטא שלוש טובולין.

RNA לכוד הופעל על ביואנלייזר למטרות בקרת איכות. שימו לב לשלמות המושלמת של RNA ריבוזומלי אחד שמונה ושני שמונה שניות. איור זה מציג את התוצאות של ניתוח RT QPCR על שלושה שכפולים ביולוגיים של עוברים בשלב 16, ומדגים את הספציפיות הגבוהה של mRNA מבודד במלכודת.

שינוי FO חושב בהשוואה לקלט ונורמל כנגד הגן RPL 32 מת'. שני תעתיקים הקיימים בכל שושלות השרירים מועשרים פי 2.3 בהשוואה לקלט, בעוד שתעתיקי רפיון מוגבלים יותר מועשרים פי 5.6 תאים עצביים המבטאים פרוספרו וגרביים וגנים מתרוקנים פי 2.2 ופי 5.5 בהתאמה לאחר התפתחותו. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים, במיוחד בתחום הביולוגיה ההתפתחותית, לחקור מחויבות לעזרה עצמית ורכישת תכונות תאים במהלך התמיינות של עוברי דוף.