Name: נוהל Decellularization של כבדי עכברוש בהתקן זלוף נדנוד לחץ (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: למד שיטת דה-סלולריזציה הומוגנית לכבדי עכברוש באמצעות התקן זלוף עם לחץ נדנוד. השיטה משפרת תוצאות הנדסת רקמות ושתלים על ידי שימוש בזרימה עורקית תחת תנאי לחץ משתנים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות מקרב לב לסטפן ליפרט, חאליד אלייב, קורינה יורנס וקתרינה סטרוקר על עזרתם במהלך פרויקט זה.

בעלי חיים הוחזקו במתקן לרפואה ניסויית (FEM, Charité, ברלין, גרמניה), ואת כל פרוטוקולי הניסוי היו נבדקו ואושרו על ידי משרד המדינה לענייני בריאות ומקומי (LAGeSo, ברלין, גרמניה;. רג O מס &#39;0365 / 11). קציר 1. כבד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנה טרום ניתוחית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בצלחת פקק לקיבעון. שים וילון רפואי על הצלחת. באמצעות ארבע מחטים, לתקן מסכת משאיפת על צלחת הפקק להרדמת משאיפת במהלך ניתוח. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סידור מכוון של פורטל ורידי הצינורית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר צנתר ורידים היקפי (G-20) לברזלי שלוש-דרך. צנתר הוורידים יש לחתוך באלכסון, באורך של כ. 1.5 סנטימטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דה-אוויר למערכת באמצעות מזרק 10 מיליליטר מלא פתרון רינגר. זה מאוד חשוב לזהירות דה-האוויר כי תסחיף גז עלול להשפיע לרעה על decellularization זלוף. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סידור מכווןשל צינורית העורקים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש צינורית פרפר ולחתוך את המחט לאורך של 5 מ&quot;מ. להתאים צינור 5 סנטימטר (ID 0.58 מ&quot;מ; OD 0.96 מ&quot;מ) למחט 5 מ&quot;מ ולתקן את זה עם דבק מגע. הכנס צינור 2 ס&quot;מ ארוך (ID 0.28 מ&quot;מ; 0.61 מ&quot;מ OD) לתוך הצינור הגדול ולתקן את זה עם דבק מגע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחליק צינור אחר על בנייה זו כבסיס גשר ולתקן את זה עם דבק מגע. דה-אוויר צינורית העורקים עם מזרק 5 מיליליטר מלא פתרון רינגר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדמה ושיכוך כאבים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגרום להרדמה של החולדה בחדר האינדוקציה ההרדמה על ידי isoflurane 3.5% בחמצן בקצב זרימה של 1.5 ליטר / דקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להבטיח שיכוך כאבים בטוחים במהלך המבצע, להזריק metamizol (100 מ&quot;ג / קילוגרם מסת גוף) וקטמין במינון נמוך / medetomidine (10 מ&quot;ג / 0.1 מ&quot;ג לכל קילוגרם מסת גוף) intraperitoneally. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספק isoflurane 1.5% בחמצן / דקה 1 ליטר באמצעות מסכת משאיפת לתחזוקה הבאה של הרדמה כירורגית. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסדרים לפני ניתוח &lt;ol&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגלח את הבטן בנדיבות עם מכונה גז חשמלית. להרטיב את אתר החתך המגולח בבטן עם אתנול 70% לחיטוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את החיה במצב שכיבה על הצלחת מוכנה, להכניס את הראש לתוך מסכת משאיפת ולתקן את הגפיים עם קלטת רפואית וסיכות. הסר אתנול ופרווה עודפים עם תחבושות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערכת הרדמה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעריך את עומק ההרדמה על ידי צפייה בקצב הנשימה. כאשר ההרדמה נראית עמוקה מספיק (40-60 נשימות / דקה), לבדוק אם כאבים די בניסיון לעורר את רפלקס קמצוץ הבוהן באמצעות מלקחיים כירורגיים לצבוט את העור בין האצבעות של שני גפיים האחוריות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גישת בטן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות חתך החציוני בקיר בטן הזנב מעל שלפוחית ​​השתן. לחתוך מנקודה זו לשתי קשתות costal הרוחב באופן בצורת V. יש להיזהר שלא לחתוך לסרעפת. משוך את דופן הבטן לחתוך מעל החזה. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את xiphoid עם מהדק אוברהולט, למשוך אותו cranially ולתקן את זה עם גומייה. השתמש צמר גפן רטוב לפנות את המעי. לעטוף את המעי בתחבושת גזה רטובה. יתר על כן, לכסות את כל השוליים הבטן עם תחבושות רטובות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כבד הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את רצועת falciform. השתמש בתחבושת גזה רטובה כדי להחזיק את האונה של הכבד המדיאלי ועזבה cranially מתחת לכיפה של הסרעפת. לחשוף את רצועת hepatoduodenal ואונת כבד omental העליונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בשני microforceps ומספריים באביב כדי לנתח בזהירות את הרצועה הצמודה לאונה העליונה omental עד האונה היא ניידת. הזז את האונה באמצעות צמר גפן רטוב מתחת לתחבושות, מחזיק אונות המדיאלי והשאירו במקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הגיוס של אונת כבד omental העליונה, להעביר את הבטן בצד השמאל. תקן את הבטן עם מהדק ולנתח את omentum הקטין עם microforceps והמספריים באביב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגייס את omenta הנמוךl אונת כבד עד שהוא נייד ולאחר מכן להעביר את האונה אחורית לתוך החלל שלה. השתמש מהדק בקהאוס כדי לשמר את תריסריון. הזז את תריסריון לשמאל כדי למתוח ולחשוף את רצועת hepatoduodenal. להותיר את צינור מרה המשותף ברצועת hepatoduodenal המתוחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את צינור המרה מהשומן ורקמת לבלב. חותך את צינור המרה של 1.5 סנטימטר מהסתעפות צינור מרה. לנתח את וריד השער מרקמת השומן שמסביב. לחשוף את וריד gastroduodenal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקשור את וריד gastroduodenal פעמיים עם משי 6-0 ולחלק את הווריד בין 2 חיבורי האותיות. לנתח את תא מטען צליאק ועורק כבד הנפוץ מן הרקמה הסובבת עד שכל רמי העורקים מתגלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשחרר את עורק gastroduodenal מן הרקמה הסובבת. לקשור את עורק gastroduodenal פעמיים עם משי 6-0, עם הקשרים רחוקים אחד מהשני. לנתח את עורק gastroduodenal בין 2 חיבורי האותיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשחרר את עורק הטחולמהרקמה הסובבת. לקשור את עורק הטחול פעמיים עם משי 6-0, עם הקשרים רחוקים אחד מהשני. לנתח את עורק הטחול בין 2 חיבורי האותיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשחרר את עורק הקיבה שמאל מהרקמה הסובבת. לקשור את עורק הקיבה שמאל פעמיים עם משי 6-0, עם הקשרים רחוקים אחד מהשני. לנתח את העורק בין 2 חיבורי האותיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להותיר את וריד caval הנחות בין הכליה הימנית ואונת כבד לרוחב הנכונה. לנתח את הווריד מהחלל retroperitoneal. לחשוף את אב העורקים על ידי הבא לתא מטען צליאק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את רקמת שומן retroperitoneal. הזרק 1,000 הפרין IE מלוחים 1 מיליליטר לווריד הנבוב הנחות. לחזור הצינורית ולסגור את החתך עם צמר גפן. חכה 1-2 דקות להשפעה המערכתית של הפרין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להותיר את אב העורקים עם מלקחיים. לנתח את אב העורקים ולגרום לדימום מחודש החולדה. יתר על כן, לנתח את נחות הווריד הנבוב distally מהכליות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פורטל הוורידים Cannulation (השתמש בצינורית מוכנה בסעיף 1.2) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות חתך דגים-פה בוריד שער דיסטלי. פתח את החתך עם מלקחיים וcannulate וריד השער. לשטוף את הכבד עם 20 מיליליטר פתרון רינגר עד decolorizes הכבד ולתקן את הצינורית עם חיבורי אותיות (משי 6-0). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העורקים Cannulation (השתמש בצינורית מוכנה בסעיף 1.3) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את אב העורקים מעל תא מטען צליאק. לשחרר את קטע אב העורקים מהחלל retroperitoneal. חותך את קטע אב העורקים longitudinally ליצור תיקון אב העורקים. הכנס את הצינורית העצמית בנויות לבעל סטטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 2 מלקחיים כדי להחליק את תיקון אב העורקים על הצינורית. ולקשור את העורק הכבד עם משי 6-0 על הצינורית ולתקן את התיקון בירכה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Explantation כבד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את הסרעפת, לעשות חתך עגול ולנתח את הכבד מהמבנים הסמוכים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סטהמחדש את הכבד במכל 500 מיליליטר סטרילי המלא 350 מיליליטר פתרון רינגר עד לשימוש. </li></ol></li></ol> 2. פתרונות דטרגנט <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10% מניות פתרון Triton X-100 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו בקבוק 1,000 מיליליטר עם dest אקווה 900 מיליליטר. ולהוסיף 100 מיליליטר Triton X-100 (99,9%). השתמש בוחש לפזר את טריטון X-100. מלא את הבקבוק עם dest אקווה. עד נפח כולל של 1,000 מיליליטר הוא הגיע. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1% Triton X-100 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף את פתרון המניות 100 מיליליטר (10%) לבקבוק 1,000 מיליליטר. להוסיף 900 ​​dest אקווה מיליליטר. ולנער את הבקבוק פעמיים. סנן 1% דרך פילטר סטרילי פתרון Triton X-100. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10% SDS פתרון במלאי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו בקבוק 1,000 מיליליטר עם dest אקווה 900 מיליליטר. ולהוסיף SDS 66.99 גרם (99.9%, צפיפות 0.67). השתמש בוחש לפזר את SDS. מלא את הבקבוק עם dest אקווה. עד נפח כולל של 1,000 מיליליטר הוא הגיע. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1% SDS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף את פתרון המניות 100 מיליליטר (10%) לבוט 1,000 מיליליטרייתכנו. להוסיף 900 ​​dest אקווה מיליליטר. ולנער את הבקבוק פעמיים. סנן 1% SDS הפתרון דרך פילטר סטרילי. </li></ol></li></ol> 3. Decellularization <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרה של התקן זלוף <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53029/53029fig1.jpg" /></li></ol> איור 1:. תכנית של התקן זלוף לסלקטיבי עורקים וורידי הפורטל זלוף של כבדי עכברוש ארבעה תחת תנאי לחץ נדנוד (. שונה מן et al Struecker 14) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קישור לטמיון לברזלי שלוש-דרך והארכת Heidelberger להסדיר את רמת מילוי וממלא את הכור עם 500 מיליליטר 0,9% NaCl. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53029/53029fig2.jpg" /></li></ol> איור 2:. תכנית של הגדרת זלוף קישור תא זלוף (1,400 סנטימטר 3) (1) לקצה הדיסטלי (4) למלכודת הבועה (5) דרך גישת ורידי הפורטל (2) או באמצעות AC העורקיםסס (3). מלכודת הבועה (5) צריכה להיות מצוידת בחֲסִימָה (4) בקצה הדיסטלי ואוורור (6). חבר את מלכודת הבועה (5) להארכת Heidelberger (7). קישור הארכת Heidelberger למגזר המשאבה (8). יתר על כן, לחבר את קטע המשאבה (8) לעוד ארכה Heidelberger (9). הכנס את ההארכה האחרונה Heidelberger (9) לבקבוק של תמיסת ניקוי (10). חבר את הנשמה (11) לתא זלוף (או למפיץ הלחץ במקרה של זילופים מרובים). כדי לנקז את נוזלי הכור, לחבר את יצוא לבקבוק פסולת (12). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את קטע המשאבה למשאבה. התחל המשאבה כדי למלא את המחזור עם PBS, לסגור את הקצה הדיסטלי של מלכודת הבועה ולפתוח את פתח האוורור. כאשר החלק התחתון של הבועה מכוסה היטב עם PBS (2-3 סנטימטר), לסגור את פתח האוורור ולפתוח את הקצה הדיסטלי של מלכודת הבועה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התקנה כבד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קישור הסתום המשולש של צינורית וריד שער לגישת כור בנושא. גonnect צינורית העורקים לגישת העורקים. להיות זהיר כדי להבטיח שאף אוויר נכנס למערכות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יישום של תנאי לחץ נדנוד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש הנשמה בתדירות של 15 פעימות לדקה ומשרעת של 26 mbar (דקות. 4 mbar, מקסימום. 30 mbar). חבר את מכשיר ההנשמה לתא לחץ ההפצה ולחבר את התא לכור. התחל יישום לחץ. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פרוטוקול decellularization <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את השלבים זלוף עם קצב זרימה של 5 מיליליטר / דקה. התחל decellularization עם טפטוף של הכבד עם 1% Triton X-100 למשך 90 דקות. לאפשר הזרמת שפכים באמצעות יצוא של מכשיר זלוף ולהשאיר את הנוזל בתוך מתמיד תא זלוף ומעל כבד perfused. לאחר 90 דקות, לשנות את חומר הניקוי ל1% SDS. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53029/53029fig3.jpg" /> <img alt="טבלת 1" src="/files/ftp_upload/53029/53029table1.jpg" /></li></ol></li></ol> &lt;p&gt; איור 3: זלוף פרוטוקול לכל קבוצות הניסוי.

<ol><li>Struecker, B., Raschzok, N., Sauer, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+support+strategies%3A+cutting-edge+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Liver support strategies: cutting-edge technologies.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 11, 166-176 (2014).</li>
<li>Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+tissue+and+whole+organ+decellularization+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">An overview of tissue and whole organ decellularization processes.</a> Biomaterials. 32, 3233-3243 (2011).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+liver+scaffolds+effectively+support+the+proliferation+and+differentiation+of+mouse+fetal+hepatic+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+A%22%5BJournal%5D)">Decellularized liver scaffolds effectively support the proliferation and differentiation of mouse fetal hepatic progenitors.</a> J Biomed Mater Res A. , (2013).</li>
<li>Uygun, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+reengineering+through+development+of+a+transplantable+recellularized+liver+graft+using+decellularized+liver+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix.</a> Nat Med. 16, 814-820 (2010).</li>
<li>Shupe, T., Williams, M., Brown, A., Willenberg, B., Petersen, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+the+decellularization+of+intact+rat+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Organogenesis%22%5BJournal%5D)">Method for the decellularization of intact rat liver.</a> Organogenesis. 6, 134-136 (2010).</li>
<li>Bao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+a+portal+implantable+functional+tissue-engineered+liver+using+perfusion-decellularized+matrix+and+hepatocytes+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+transplantation%22%5BJournal%5D)">Construction of a portal implantable functional tissue-engineered liver using perfusion-decellularized matrix and hepatocytes in rats.</a> Cell transplantation. 20, 753-766 (2011).</li>
<li>Baptista, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+whole+organ+decellularization+for+the+generation+of+a+vascularized+liver+organoid%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">The use of whole organ decellularization for the generation of a vascularized liver organoid.</a> Hepatology. 53, 604-617 (2011).</li>
<li>Soto-Gutierrez, A., Wertheim, J. A., Ott, H. C., Gilbert, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspectives+on+whole-organ+assembly%3A+moving+toward+transplantation+on+demand%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Perspectives on whole-organ assembly: moving toward transplantation on demand.</a> J Clin Invest. 122, 3817-3823 (2012).</li>
<li>Soto-Gutierrez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+whole-organ+regenerative+medicine+approach+for+liver+replacement%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+engineering.+Part+C%2C+Methods%22%5BJournal%5D)">A whole-organ regenerative medicine approach for liver replacement.</a> Tissue engineering. Part C, Methods. 17, 677-686 (2011).</li>
<li>De Kock, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+quick+method+for+whole-liver+decellularization%3A+a+novel+in+vitro+three-dimensional+bioengineering+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+toxicology%22%5BJournal%5D)">Simple and quick method for whole-liver decellularization: a novel in vitro three-dimensional bioengineering tool.</a> Archives of toxicology. 85, 607-612 (2011).</li>
<li>Park, K. M., Woo, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+decellularization+for+multi-organ+scaffolds+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation+proceedings%22%5BJournal%5D)">Systemic decellularization for multi-organ scaffolds in rats.</a> Transplantation proceedings. 44, 1151-1154 (2012).</li>
<li>Shirakigawa, N., Ijima, H., Takei, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+liver+as+a+practical+scaffold+with+a+vascular+network+template+for+liver+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biosci+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Decellularized liver as a practical scaffold with a vascular network template for liver tissue engineering.</a> J Biosci Bioeng. , (2012).</li>
<li>Ren, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+two+decellularization+methods+in+the+development+of+a+whole-organ+decellularized+rat+liver+scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22Liver+Int%22%5BJournal%5D)">Evaluation of two decellularization methods in the development of a whole-organ decellularized rat liver scaffold.</a> Liver Int. 33, 448-458 (2013).</li>
<li>Struecker, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+rat+liver+decellularization+by+arterial+perfusion+under+oscillating+pressure+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Eng+Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Improved rat liver decellularization by arterial perfusion under oscillating pressure conditions.</a> J Tissue Eng Regen Med. , (2014).</li>
<li>Struecker, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porcine+Liver+Decellularization+Under+Oscillating+Pressure+Conditions%3A+A+Technical+Refinement+to+Improve+the+Homogeneity+of+the+Decellularization+Process%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+engineering.+Part+C%2C+Methods%22%5BJournal%5D)">Porcine Liver Decellularization Under Oscillating Pressure Conditions: A Technical Refinement to Improve the Homogeneity of the Decellularization Process.</a> Tissue engineering. Part C, Methods. , (2014).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

למרות שהטכניקה שהוצגה לקציר כבד החולדה וdecellularization היא לשחזור בקלות, ישנם צעדים קריטיים מסוימים לשקול: במהלך הכנה לקציר כבד, חשוב להימנע מדימום חמור משום שהיא תפעיל קרישת דם ועלולה לגרום להיווצרות קריש דם בתוך הכבד. לדעתנו, זה יתרון לחתוך אב העורקים בבטן ישירות לפני cannulation של וריד השער, כדי למנוע זרימת דם דרך העורק הכבד במהלך זלוף דרך וריד הפורטל. ברגע שהכבד cannulated וperfused ברור, היווצרות קריש דם...

Decellularization וrecellularization עשוי לאפשר את הדור של איברים פונקציונליים, השתלה במבחנה 1. על ידי תאי הסרת וחומר אנטיגני (למשל., DNA, epitopes אלפא-גל) מאיבר, ניתן להשיג את המטריצה ​​הלא פחות או-חיסונית תאית (ECM). מטריצה ​​זו חוסכת microanatomy תלת ממדי של איברים ויכולה לשמש כbiomatrix האידיאלי לאכלוס עם תאים ממוצא שונה, ואולי xenogeneic 2. כך, מטריצת כבד חולדה decellularized יכולה להיות אוכלס מחדש עם תאי כבד אנושיים. מיקרו-כבד אנושי זה יכול לשמש כמודל vivo לשעבר למחקר על מחלות (למשל., מחלות מטבוליות מולדות, מחלות ויראליות או ממאירות) או לבדיקת תרופות פרה 3. כמה פרוטוקולים שונים לdecellularization זלוף כבד חולדה כבר פורסמו 4-13. בכל הפרוטוקולים, decellularלמען האזרוח הושג על ידי טפטוף של חומרי ניקוי יוניים או שאינם יוניים בסיסיים דרך וריד פורטל cannulated. למיטב ידיעתנו, היינו הקבוצה הראשונה לדווח decellularization כבד חולדה על ידי זלוף סלקטיבית דרך וריד הפורטל ו / או עכברוש העורק כבד 14. מאפשר זלוף סלקטיבית של מערכות כלי דם השונות בכבד עשוי לאפשר תוצאות decellularization טובות יותר ו, יתר על כן, עשוי לשחק תפקיד חשוב באכלוס סלולארי. במחקר המפורט כאן, כבדים היו perfused במכשיר זלוף קניינית מותאם אישית, המאפשרים זלוף בתנאי לחץ נדנוד. תנאי לחץ אלה מחקים את זלוף נשימה תלויה הפיזיולוגי של הכבד: באתר, הכבד נתקע מתחת לאוגד של הסרעפת, תנועה שבנשימה יש השפעה ישירה על זלוף כבד. השראה במיוחד מובילה להורדת של הסרעפת ולסחוט של הכבד, אופטימיזציהיצוא hepato-ורידים, ואילו פקיעה מובילה להעלאה של הכבד והורדה של לחץ intraabdominal כדי לייעל יבוא פורטל-ורידים 15. המטרה שלנו הייתה להעריך אם יש להם תנאי לחץ נדנוד השפעה על ההומוגניות של decellularization זלוף כבד חולדה על ידי חיקוי תנאי intraabdominal vivo לשעבר. ההומוגניות של תהליך decellularization עשויה להיות גורם לזלזל בdecellularization זלוף. כל הסוכנים הידועים המשמשים לשינויי סיבת decellularization הכבד לECM. תאים באזורי perfused גרוע יישארו בECM, ואילו באזורים אחרים כבר decellularized לחלוטין. לפזר את התאים הנותרים, משך זלוף או לחץ חייב להיות מורם, גורם ליותר שינויים באזורי perfused היטב. לפיכך, חומרי ניקוי לdecellularization צריך להיות מופץ homogenously בתוך האיבר.

<table><tbody><tr><td colspan="4">צינורית עורקים בבנייה עצמית</td></tr><tr><td>&nbsp; צינורות פוליאתן לא סטריליים Portex</td><td>SIMS Portex</td><td>REF 800/110/100</td><td>0.28 מ"מ קוטר פנימי 0.61 מ"מ OD</td></tr><tr><td>&nbsp; פורטקס צינורות פוליאתן לא</td><td>סטריליים SIMS Portex</td><td>REF 800/110/200</td><td>0.58 מ"מ קוטר פנימי 0.96 מ"מ OD</td></tr><tr><td>Venodrop צנתר פרפר בטוח</td><td>Fresenius Kabi</td><td>3275851</td><td>21 G</td></tr><tr><td colspan="4">צינורית וריד פורטל</td></tr> קטטר <tr><td>ורידים היקפי</td><td>BD</td><td>393224</td><td>BD Venflon Pro 20G</td></tr><tr><td>תלת כיווני פקק</td><td>סמית'ס רפואי</td><td>888-101RE</td><td></td></tr><<tr>td colspan="4"></td></tr><tr><td>ניתוח מקלות כותנה</td><td>Hecht-Assistent</td><td>4302</td><td></td></tr><tr><td>רפידות כותנה&nbsp;</td><td>Shaoxing Zhengde חבישה כירורגית</td><td>13H118-03</td><td></td></tr><tr><td>תחבושת גזה</td><td>Hubei Haige&nbsp; מכשור רפואי</td><td>14388</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Ringer Solution</td><td>Fresenius Kabi</td><td>13 HKP022</td><td>1000 מ"ל</td></tr><tr><td>10 מ"ל מזרק</td><td>בראון</td><td>4606108V</td><td>10 מ"ל / Luer Solo</td></tr><tr><td>5 מ"ל מזרק</td><td>בראון</td><td>4606061V</td><td>5 מ"ל / תפר Luer Solo</td></tr><tr><td>(משי 6/0)</td> <td>Resorba</td><td>H1F</td><td>LOT 105001.81</td></tr><tr><td>וילון רפואי</td><td>Shaoxing Zhengde חבישה כירורגית</td><td>D0613011</td><td></td></tr><tr><td colspan="4" > כירורגי </td></tr><tr><td>מכשירים מחזיק מחט</td><td>Geuder</td><td>17570</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו מלקחיים</td><td>Inox-Electronic</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו-מספריים</td><td>מרטין</td><td>11-740-11</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו-מלקחיים</td><td>S& T&nbsp;</td><td></td><td></td>112314</tr><tr><td>מהדק</td><td>Aesculap</td><td>BH111R</td><td></td></tr><tr><td>מספריים</td><td>F S T&nbsp;</td><td>14501-14</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים כירורגיים</td><td>Aesculap</td><td>BD 557</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Decellularization</td></tr><tr><td></td><td>Respirator Resmed</td><td>14.24.11.0004</td><td>SmartAIR</td></tr><tr><td>ST Perfusion Device</td><td>Charite, מעבדת הנדסה רפואית</td><td>מכשיר דה-סלולריזציה</td><td>בהתאמה אישית</td> מכשיר</tr><tr><td>משאבה פריסטלטית ismatec reglo ICC</td><td>IDEX</td><td>ISM4408&nbsp;</td><td>4 ערוצים</td></tr><tr><td>הרחבת היידלברגר 75 ס"מ&nbsp;</td><td>Fresenius Kabi</td><td>2873</td><td>75 ס"מ</td></tr><tr><td>MS/CA מקטע משאבה</td><td>IDEX</td><td>IS 3510&nbsp;</td><td>MS/CA/click'n'go/POM-C</td></tr><tr><td>צינור CA 2 פקק</td> מלכודת בועות <td>חמושה</td><td>BPT NSF-51</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td> פריט <td></td><td>בהתאמה אישית</td></tr><tr><td>Luer Lock מחבר צינור</td><td>Neolab</td><td>מס' 02-1887</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">חומרי ניקוי כדורי</td></tr><tr><td>SDS</td><td>קארל רוט&nbsp;</td><td>CN30.4&nbsp;</td><td>2.5 ק"ג</td></tr><tr><td>טריטון X-100</td><td>קארל רות'&nbsp;</td><td>3051.1&nbsp;</td><td>10 ליטר</td></tr><tr><td>PBS&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td>DPBS</td></tr><tr><td colspan="4">מכתים</td></tr><tr><td>איוזין 1%</td><td>מורפיסטו</td><td>10177</td><td></td></tr><tr><td>מאייר המטוקסילין</td><td>AppliChem</td><td>A4840</td><td></td></tr><tr><td>גומורי מכתים</td><td>מורפיסטו</td><td>11104</td><td></td></tr><tr><td>אלקיין צביעת Blue-PAS</td><td>מורפיסטו</td><td>11388</td><td></td></tr><tr><td>אדום ישיר 80&nbsp;</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>365548</td><td></td></tr></tbody></table>

נוהל decellularization של כבדי עכברוש בהתקן זלוף נדנוד לחץ

Procedure for Decellularization of Rat Livers in an Oscillating-pressure Perfusion Device

דה-סלולריזציה ורה-סלולריזציה של איברים פרנכימליים עשויים לאפשר יצירת איברים פונקציונליים במבחנה, ומספר פרוטוקולים לדה-סלולריזציה של כבד מכרסמים כבר פורסמו. מטרתנו הייתה לשפר את תהליך הדה-סלולריזציה על ידי בניית מכשיר זלוף קנייני המאפשר זלוף סלקטיבי דרך וריד הפורטל ו/או עורק הכבד. יתר על כן, ביקשנו לבצע זלוף בתנאי לחץ מסביב מתנודדים כדי לשפר את ההומוגניות של דה-סלולריזציה. ההומוגניות של דה-סלולריזציה של פרפוזיה הייתה גורם לא מוערך עד כה. במהלך דה-סלולריזציה, אזורים בתוך האיבר שחדרו בצורה גרועה עשויים עדיין להכיל תאים, בעוד שהמטריצה החוץ-תאית (ECM) באזורים עם חדירה טובה עשויה כבר להיות מושפעת מחומרי ניקוי אלקליין. שינויי לחץ מתנודדים יכולים לחקות את שינויי הלחץ התוך בטני המתרחשים במהלך הנשימה כדי לייעל את המיקרו-פרפוזיה בתוך הכבד. במחקר המוצג כאן, מטריצות כבד חולדות נטולות תאים נותחו על ידי צביעה היסטולוגית, ניתוח תכולת DNA ויציקת קורוזיה. זלוף דרך עורק הכבד הראה תוצאות הומוגניות יותר מאשר זלוף ורידי פורטלי. היישום של תנאי לחץ מתנודדים שיפר את היעילות של דה-סלולריזציה של פרפוזיה. כבדים שהוחדרו דרך עורק הכבד ובתנאי לחץ מתנודדים הראו את התוצאות הטובות ביותר. הטכניקות המוצגות לקצירת כבד, קנולציה וזלוף באמצעות המכשיר הקנייני שלנו מאפשרות מערכי זלוף מתוחכמים לשיפור ניסויי דה-סלולריזציה ורסלולריזציה בכבד של חולדות.

הומוגניות ובכך את האפקטיביות של פרוטוקולי decellularization שונים הוערכו על ידי התבוננות מקרוסקופית, ניתוח היסטולוגית, וניתוח של תוכן ה- DNA שנותר בתוך מטריצות כבד decellularized. יתר על כן, ליהוק קורוזיה בוצע לדמיין microanatomy שלם של כבדים לאחר decellularization. Macroscopy במהלך decellularization, הכבדים הפכו לוסנט, המציינים את הסרת התוכן סל...

הטכניקות המוצגות לקצירת כבד, קנולציה וזלוף באמצעות המכשיר הקנייני שלנו מאפשרות מערכי זלוף מתוחכמים לשיפור ניסויי דה-סלולריזציה ורה-סלולריזציה בכבד של חולדות.

נוהל Decellularization של כבדי עכברוש בהתקן זלוף נדנוד לחץ

Decellularization and recellularization of parenchymal organs may enable the generation of functional organs in vitro, and several protocols for rodent ...

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להעריך את תפקידו של שורש הפרפוזיה בייעול ההומוגניות של דסלולריזציה באמצעות פרפוזיה של כבד חולדה. דבר זה מושג תחילה על ידי קנולציה של הוורידים הפורטליים והעורקים הכבדיים של כבדי חולדה שבודדו טרי. כשלב שני, הכבדים מחוברים למכשיר פרפוזיה לצורך פרפוזיה סלקטיבית של הוורידים הפורטליים או של העורקים הכבדיים.בשלב הבא, מופעלים שינויי לחץ תנודתיים בתא הפרפוזיה כדי לחקות את שינויי הלחץ התוך-בטניים המתרחשים במהלך הנשימה. אופטימיזציה של מיקרו-פרפוזיית הכבד מובילה בסופו של דבר לכך שכבדים שעברו פרפוזיה דרך העורק הכבדי תחת תנאי לחץ תנודתיים מראים דסלולריזציה הומוגנית ומהירה יותר, כפי שהוערכה באמצעות תצפית מאקרוסקופית וניתוח היסטולוגי וביוכימי. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון דסלולריזציה באמצעות פרפוזיה של הווריד הפורטלי, הוא שפרפוזיה עורקית תחת תנאי לחץ תנודתיים מובילה לתוצאת דסלולריזציה הומוגנית יותר.עם זאת, בפרק זמן קצר יותר, שיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי טכניקות של האטה. ניתן ליישמה גם במערכות אחרות, כגון ניסויי סולריזציה של שרירים, מערכי פרפוזיה חוץ-פית, ומודלים של איברים. באופן כללי, אנשים שאינם בקיאים בשיטה זו יתקלו בקושי, כיוון שההשגה והקנולציה העורקית של כבדים אדומים עלולות להיות מורכבות.לפני קצירת הכבד, בצעו חיתוך אלכסוני לקצה של קטע בא

procedure-for-decellularization-rat-livers-an-oscillating-pressure

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

Decellularization זלוף היא שיטה חדשנית לייצור פיגומים כבד כל כך שומרת על הרכב תאי מטריקס של איברים ארכיטקטורה. בזאת, השיטה של ​​הכנת פיגומים איבר שלם באמצעות decellularization זלוף ואכלוס הבאים עם hepatocytes מתואר. שתלי כבד פונקציונליים להשתלה ניתן להפיק באמצעות טכניקה זו.

Decellularization ו Recellularization של כבדים שלמים

הטכניקה לבידוד fibroblasts פורטל מהכבד עכברוש מתואר. הם כבדי perfused ו...

הבידוד של Fibroblasts פורטל עכברוש ידי<em&gt; באתרו</em&gt; כבד זלוף

Hepatocytes ראשיים מספקים כלי רב ערך כדי להעריך ביוכימיים, פונקציות מולקולרית, ואת חילוף החומרים במערכת ניסיונית רלוונטי מבחינה פיזיולוגית. אנו מתארים פרוטוקול אמין עכברוש זלוף הכבד באתרו, אשר באופן עקבי יוצר hepatocytes קיימא עד to1.0 ×...

בידוד תרבות ראשונית של תאים בכבד עכברוש

שתלי שוליים, כגון כבד שומני, שתלי מתורמים מבוגרים, או כבדים הוחזרו לאחר מוות לבבי (DCD) לסבול אחסון קונבנציונלי, קר סטטי רק בצורה גרועה. פיתחנו מודל חדשני של vivo לשעבר זלוף כבד subnormothermic לשימור, הערכה, ותיקון של שתלי כבד שוליים לפני ההשתלה.

טכניקה של Subnormothermic<em&gt; Ex Vivo</em&gt; הכבד זלוף לאחסון, ההערכה, ותיקון שתלי כבד שולי

שיש מחסור משמעותי לתורם כבד, הקריטריונים עבור התורמים הכבד שהורחבו. Normothermic ex-vivo הכבד זלוף (NEVLP) פותחה כדי להעריך ולשנות את תפקוד האיבר. מחקר זה מדגים מודל עכברוש של NEVLP, בדיקות היכולת של pegylated-קטלאז, להקל על פגיעה בכבד שימור.

מודל בעלי חיים קטנים של זלוף הכבד Normothermic Vivo לשעבר

אנו להקים טכניקה כירורגית חדשניים עבור מודל זלוף יחיד בכבד באונה ויוו בשנת החולדה כתנאי נוספת ללמוד ויוו הכבד חלקית הנדסה בעתיד.

טכניקה כירורגית הרומן כבסיס In Vivo חלקי הכבד הנדסה בעכברוש

פרוטוקול זה מפרט את השימוש בצנתר תוך ורידי מיוחד, צינורות חד פעמיים סטריליים סטנדרטיים, בקרת טמפרטורה בתוספת ניטור בזמן אמת, ומערכת אזעקה להליך זלוף קולגןאז דו-שלבי כדי לשפר את העקביות בכדאיות, בתפוקה ובפונקציונליות של הפטוציטים של חולדה ראשונית מבודדת.

בידוד של הפטוציטים ראשוניים של חולדות עם בקרת זלוף רב-פרמטרית

הפרוטוקול מתאר את הרכש הכירורגי ולאחר מכן דה-סלוליזציה של דשי חזיר וסקולריים על ידי זלוף של דטרגנט נתרן דודציל סולפט דרך כלי הדם של הדש בביוריאקטור פרפוזיה מותאם אישית.

רכש ופרפוזיה-דה-סלוליזציה של דשים וסקולריים חזיריים בביוריאקטור פרפוזיה מותאם אישית

אנו מתארים את הטכניקה הכירורגית ואת תהליך הדה-סלוליזציה של חולדות מרוכבות. דה-סלוליזציה מתבצעת באמצעות נתרן דודציל סולפט בריכוז נמוך באמצעות מערכת פרפוזיה של מכונת ex vivo.

רכש ודה-סלוליזציה של חולדות אחוריות באמצעות ביוריאקטור מבוסס ex vivo perfusion עבור allotransplantation מרוכב וסקולרי

מערכת זילוח כבד נורמותרמית ex vivo (NEVLP) נוצרה עבור כבדי עכברים. מערכת זו דורשת ניסיון במיקרו-כירורגיה אך מאפשרת תוצאות זילוח הניתנות לשחזור. היכולת להשתמש בכבדים של עכברים מאפשרת לחקור מסלולים מולקולריים לזיהוי תוספי פרבוסט חדשים ומאפשרת ביצוע ניסויים המתמקדים בתיקון איברים.

זילוח מכונת כבד Normothermic Ex Vivo בעכבר

פרוטוקול זה מציג טכניקת זילוח כבד אופטימלית של collagenase בשני שלבים במודל חולדה ומראה את השימוש בהפטוציטים מבודדים עבור תרבית ארוכת טווח במבחנה של אורגנואידים תלת-ממדיים.

זילוח כבד חולדה ובידוד הפטוציטים ראשוני: הליך ישן חיוני לתרבית אורגנואידים תלת-ממדית חדשנית

למד שיטת דה-סלולריזציה הומוגנית לכבדי עכברוש באמצעות התקן זלוף עם לחץ נדנוד. השיטה משפרת תוצאות הנדסת רקמות ושתלים על ידי שימוש בזרימה עורקית תחת תנאי לחץ משתנים.

נוהל Decellularization של כבדי עכברוש בהתקן זלוף נדנוד לחץ

גלה סרטונים נוספים