נוהל Decellularization של כבדי עכברוש בהתקן זלוף נדנוד לחץ

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להעריך את תפקידו של שורש הזלוף באופטימיזציה של ההומוגניות של דה-סלולריזציה של זלוף כבד חולדות. זה מושג על ידי קנולציה ראשונה, ורידי השער ועורקי הכבד של כבדי חולדות מבודדים טריים. כשלב שני, הכבדים מחוברים למכשיר זלוף לזלוף סלקטיבי של ורידי הפורטל או עורקי הכבד.

לאחר מכן, שינויי לחץ מתנודדים מופעלים על תא הזלוף כדי לחקות את שינויי הלחץ התוך בטני המתרחשים במהלך הנשימה. אופטימיזציה של מיקרו פרפוזיה בכבד, בסופו של דבר כבדים המוחדרים דרך עורק הכבד בתנאי לחץ מתנודדים מציגים דה-סלולריזציה הומוגנית ומהירה יותר כפי שהוערך על ידי תצפית מקרוסקופית וניתוח היסטולוגי וביוכימי. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו דה-סלולריזציה של זלוף ורידי פורטלי הוא שזלוף עורקי בתנאי לחץ מתנודדים מוביל לתוצאת דה-סלולריזציה הומוגנית יותר.

עם זאת, בזמן קצר יותר, שיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי טכניקות האטה. ניתן ליישם אותו גם על מערכות אחרות כגון ניסויי סולריזציה, מערכי זלוף חוץ-אוראליים ומודלים של איברים. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שהקציר והקנולציה העורקית של כבד אדום יכולים להיות מסובכים.

לפני קצירת הכבד, בצע חתך אלכסוני לקצה חתיכה של 1.5 סנטימטר של קטטר ורידי היקפי G 20. חבר את הקטטר לזין עצירה תלת-כיווני והשתמש במזרק של 10 מיליליטר מלא בתמיסת צלצול כדי לאוורר את המערכת. לאחר מכן, חתוך את המחט של צינורית פרפר לאורך של חמישה מילימטרים והשתמש בדבק סופר כדי לקבע צינור של חמישה סנטימטרים למחט.

הכנס צינור באורך שני סנטימטרים לתוך הצינור הגדול יותר, ותקן גם את הצינור הזה עם דבק סופר. החלק צינור נוסף מעל הקונסטרוקציה הזו והדבק אותו למקומו כדי ליצור תומך. לאחר מכן השתמש במזרק של חמישה מיליליטר מלא בתמיסת צלצול כדי לתקן את הצינורית העורקית החדשה שנבנתה כדי לתקן את הכבד לקציר.

התחל בשימוש בתחבושת סיבה רטובה כדי להחזיק את אונות הכבד המדיאליות והשמאליות של חולדה בוגרת מורדמת מתחת לכיפת הסרעפת. חשוף גם את הרצועה התריסריונית של הכבד ואת אונת הכבד העליונה בשלב זה. לאחר מכן, השתמש בשני מלקחיים מיקרו ומספריים קפיציים כדי לנתח בזהירות את הרצועה המחוברת לאונה האומנטלית העליונה עד שהאונה ניידת.

לאחר מכן החזק את האונות המדיאליות והשמאליות במקומן. השתמש בצמר גפן רטוב כדי להזיז את האונה מתחת לדחיסה של ה-GRE ואת הבטן משמאל לבעל החיים. תקן את הבטן בעזרת מהדק ונתח את המומנטום הקטן.

לאחר מכן נתחו את אונת הכבד התחתונה או המנטלית עד שהיא ניידת, והעבירו את האונה בחזרה לחלל שלה באמצעות מהדק אחורי כדי לשמור על התריסריון, הזיזו את התריסריון שמאלה כדי לחשוף את הרצועה התריסריונית של הרפה. תוחם את צינור המרה המשותף. לאחר מכן נתח את צינור המרה מרקמת השומן והלבלב, וחתך את הצינור 1.5 סנטימטרים מהתפצלות צינור המרה.

נתח את וריד הסאל מרקמת השומן שמסביב, וחשוף את וריד התריסריון. לאחר מכן קשרו את וריד התריסריון פעמיים עם שישה תפרים אפס וחלקו את הווריד בין שני הקשרים. נתח את תא המטען של הצליאק ואת עורק הכבד המשותף מהרקמה שמסביב עד שכל הרמיה העורקית נחשפת.

לאחר ניתוח כל העורקים, הקיפו את וריד החלל התחתון בין הכליה הימנית לאונה הכבד הצדדית הימנית ונתחו את הווריד מהחלל הרטרופריטונאלי. עקוב אחר גזע הצליאק כדי לחשוף את אבי העורקים. לאחר מכן נתח את רקמת השומן הרטרופריטונאלית והקיף את אבי העורקים מעל תא המטען של הצליאק.

כעת הזרקו 1000 יחידות הפרין במיליליטר אחד של מי מלח לתוך מערת הווריד הנבוב התחתון. מכסים את החתך בכרית כותנה ומחכים דקה עד שתי דקות עד שההפרין ייכנס לתוקף. לאחר מכן הקיפו את אבי העורקים במלקחיים ונתחו את אבי העורקים ואת מערת הווריד הנבוב התחתון באופן דיסטלי מהכליה.

כדי למקם את הצינורית הוורידית של הפורטל, בצע חתך בפה הדג בווריד הפורטל הדיסטלי ופתח את החתך בעזרת מלקחיים. לאחר מכן קנול את וריד הפורטל ושטוף את הכבד עם 20 מיליליטר תמיסת רינגר עד שהכבד הופך לבלתי אנושי באמצעות משי שש קשירה אפס כדי לקבע את הצינורית במקומה. כדי למקם את הצינורית העורקית, נתחו את אבי העורקים מעל תא המטען של הצליאק עד שניתן יהיה לשחרר את קטע אבי העורקים מהחלל הרטרופריטוניאלי.

חותכים את מקטע אבי העורקים לאורך כדי ליצור תיקון אבי העורקים והכנס את הצינורית שנבנתה בעצמה למחזיק סטטי. לאחר מכן השתמש בשני מלקחיים כדי להחליק את כתם אבי העורקים מעל הצינורית ולקשור את עורק הכבד עם תפר משי שש אפס מעל הצינורית. קיבוע התיקון בתמיכה לביצוע הדה-סלולריזציה: קשר את תא העצירה התלת-כיווני בצינורית וריד הפורטל לגישה לכור הקשור וחבר את צינורית העורקים לגישה העורקית, תוך הקפדה שלא ייכנס אוויר למערכות.

לאחר מכן, חבר את מכונת ההנשמה לתא חלוקת הלחץ וחבר את החדר לכור. התחל את יישום הלחץ. ואז להתחיל את הדסלולריזציה.

מזגים את הכבד עם 1% טריטון X 100 בקצב של חמישה מיליליטר לדקה. אפשר לשפכי הפסולת דרך היציאה של מכשיר הזלוף כדי לשמור על מפלס הנוזל בתוך תא הזלוף קבוע ומעל הכבד המוחדר. לאחר 90 דקות, החלף את חומר הניקוי לכבד 1% SDS המוחדר דרך וריד הכוח מציג בהבהרה הומוגנית המצביעה על דה-סלולריזציה עם תאים שנותרו הנראים באופן מקרוסקופי במהלך התהליך ולאחריו, בעוד כבדים המוחדרים דרך עורק הכבד, מדגימים מהלך דה-סלולריזציה הומוגני יותר עם תאים שנותרו פחות גלויים.

אם הכבד היה מלא בהפעלת תנאי לחץ מתנודדים, לא נראו תאים שנותרו. ללא קשר לזילוף. הערכה היסטולוגית שורשית של מטריצות הכבד הנטולות תאים תומכת בממצאים המקרוסקופיים אכן בכבד המוחדר דרך עורק הכבד.

לא נצפו תאים שנותרו, בין אם הם הוחדרו בתנאי לחץ מתנודד ובין אם לאו, כבדים מוחדרים דרך הווריד הפורטלי, עם זאת, מציגים אזורים של תאים שנותרו, גם אם הם מועברים בתנאי לחץ מתנודד, אם כי תנאים אלה מפחיתים את מסת התאים הנותרת בכבדים אלה, שימו לב, שימור המטריצות החוץ-תאיות של הכבד ללא קשר לתנאי הדה-סלולריזציה. תכולת ה-DNA למשקל יבש של מטריצת הכבד ירדה גם היא בכל קבוצות הניסוי בהשוואה לכבד מקומי. למרות שההבדלים היו מובהקים סטטיסטית רק בקבוצה בתנאי לחץ מתנדנדים.

בנוסף, יציקת קורוזיה של מטריצות הכבד המפורקות אישרה את שימור המיקרואנטומיה של הכבד במהלך תהליך הזלוף. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לקצור קנולאט ולחלחל כבדים אדומים להאטה הומוגנית הניתנת לשחזור. אל תשכח שעבודה עם Triton X 100 ו-SDS עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט באמצעי זהירות כמו לבישת כפפות גם על ידי ביצוע הליך זה.