פרוטוקול הבידוד של hepatocytes האדם הראשי הקביל סרן אוכלוסיות של תאים בכבד ללא parenchymal

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הכבד והטוקסיקולוגיה ולהציע לנו הזדמנות לפיתוח תרבית משותפת חדשה במבחנה ומודלים חדשים של כבד מהונדס רקמות. היתרון של טכניקה חדשה זו הוא לבודד את כל אוכלוסיות תאי הכבד מאותו תורם ומאותה פיסה קטנה של רקמת כבד. כדי להתחיל בהליך זה, שקלו את רקמת הכבד שזה עתה נותחה בתנאי סטייל והניחו את דגימת רקמת הכבד במכסה המנוע של זרימת האוויר הלמינרית.

לאחר מכן נקה את הדם הרחק מפני השטח של דגימת הרקמה. לאחר מכן, שטפו את הצינוריות באמצעות תמיסת זלוף 1X אחת. השתמש בדבק הרקמות כדי לקבע את זיתי הקנולות בכלי הדם הגדולים יותר.

לאחר מכן, בדוק את הזלוף ובדוק אם יש דליפות של הצינוריות. לאחר מכן, סגור את כל כלי הדם הדולפים תמיסת זלוף שקופה 1X אחת עם דבק רקמות. לאחר מכן, הנח את דגימת רקמת הכבד הקנולטיבית במשפך בוכנר.

לאחר מכן, הגדר את קצב הזרימה של המשאבה הפריסטלטית בין 7.5 ל -14.6 מילליטר לדקה, תלוי במספר הקנולות המשמשות ובהתנגדות רקמת הכבד. יש לשטוף את הרקמה עד שכל הדם נשטף החוצה למשך 20 דקות לפחות ולמשך 30 דקות לכל היותר. במקרים מסוימים, יתכן שיהיה צורך להדק את אחת הקנולות בעזרת מלחציים מפלסטיק או להגביר את הלחץ הפנימי של אזור על ידי לחיצה רכה על כמוסת הכבד בעזרת מרית על מנת לייעל את הזלוף.

שינוי צבע מלא מאדום חום לחום בהיר או צהוב בהיר מעיד על זלוף טוב. לאחר מכן, החלף את נוזל הזלוף לתמיסת עיכול המכילה קולגנאז P.לאחר מכן, סדר מחדש את ההגדרה לשלב העיכול. לאחר מכן, בצע זרימה מעגלית של תמיסת עיכול עד 15 דקות.

הפסק מעת לעת את הזלוף ובדוק את מידת העיכול. חיוני להפסיק את הזלוף עם תמיסת העיכול מיד כאשר דגימת רקמת הכבד מתעכלת מספיק. הוציאו את הכבד מהמכשיר כשהוא מוכן והכניסו אותו לכלי זכוכית.

שטפו את החלק החיצוני של דגימת הרקמה עם תמיסת Stop קרה כקרח. הסר את הצינוריות מדגימת רקמת הכבד. לאחר מכן, השתמש באזמל כדי לפתוח את דגימת רקמת הכבד על ידי חיתוך אמצע האזור שבו חוברו הצינוריות וודא שהקפסולה של גליסון נשארת שלמה.

שטפו את החלק הפנימי של דגימת הרקמה ולאחר מכן כסו את כל דגימת הרקמה בתמיסת עצירה. לאחר מכן, יש לנער את הרקמה בעדינות על מנת לשחרר את התאים ממנה. לאחר מכן, אספו את תרחיף התאים וסננו אותו דרך משפך גזה לתוך 10 צינורות פלסטיק של 50 מיליליטר.

הוסף עוד תמיסת Stop לדגימת רקמת הכבד עד לצריכת נפח סופי של 500 מיליליטר. לאחר מכן, צנטריפוגה את תרחיף התא, אסוף את הסופרנטנט לבידוד NPC מאוחר יותר, ואגד את כדורי התא לצינורות פלסטיק של 250 מיליליטר. לאחר מכן, שטפו את כדורי התא עם PBS.

לשם כך, צנטריפוגה את מתלה התאים. אסוף את הסופרנטנט, אסוף את הכדורים והשהה מחדש את הכדור במדיום הדגירה של הפטוציטים. לאחר מכן, קבע את מספר התא ואת הכדאיות בתרחיף התא המתקבל באמצעות צביעה כחולה של טריפאן.

כדי לבודד את תאי הכבד הלא פרנכימליים, צנטריפוגה את הסופרנטנט שנאסף כדי לחסל את האריתרוציטים וההפטוציטים הנותרים. אסוף את הסופרנטנטים וצנטריפוגה אותם פעמיים כדי להשיג את כדורי התא לשקיעה של HCS, LEC, חלקית KC וה-KC הנותר. לאחר מכן, השעו מחדש את הכדורים ב-HBSS. לאחר מכן, הכינו שיפוע צפיפות של 25% ו-50% על ידי ערבוב תמיסת שיפוע הצפיפות ו-PBS לצנטריפוגה של שיפוע צפיפות.

הנח את תמיסת השיפוע בצפיפות של 25% בזהירות על גבי שכבת תמיסת השיפוע בצפיפות של 50%. לאחר מכן, הנח את מתלה ה-NPC בזהירות ובאיטיות על גבי שכבת תמיסת השיפוע בצפיפות של 25% כדי להשיג הפרדה ברורה של שתי השכבות. צנטריפוגה את מתלה התא על שיפוע הצפיפות ללא הפסקה.

ה- NPC ממוקמים בשלב הביניים בין שכבות השיפוע בצפיפות של 25% ו- 50%. שאפו את התאים המתים ופסולת התאים מהשכבה העליונה ביותר ואספו את האינטרפאזה בזהירות. לאחר צנטריפוגה כפולה, בצע ספירת תאים עבור ה-KC ושבר ה-MPC.

לאחר מכן, צנטריפוגה את שבר ה-NPC עם שלב הצנטריפוגה הכפול שתואר קודם לכן והשעיה מחדש של ה-NPC במדיום הזריעה של תאי קופפר. זרע את השבר המכיל KC על כלי תרבית תאי הפלסטיק בצפיפות של חמש פעמים 10 עד ה-KC החמישי לסנטימטר מרובע. דגרו את תרביות KC למשך 20 דקות בחממה לחה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס 5% פחמן דו חמצני.

KC ראשוני צריך להיצמד לפלסטיק תרבית התאים תוך פרק זמן קצר. לאחר מכן, אספו את הסופרנטנט המכיל את ה-NPC הלא דבוק המורכב בעיקר מ-LEC ו-HSC. כדי להפריד בין LEC ל-HSC, התחל עם צנטריפוגה של הסופרנטנט.

לאחר מכן, שטפו את הגלולה עם PBS. לאחר הצנטריפוגה השנייה, השעו מחדש את התאים במדיום הפרדת תאי האנדותל של תאי הכוכבים ובצעו ספירת תאים עבור כל התאים הנותרים. לאחר מכן, השעו מחדש 10 מיליון תאים במיליליטר אחד של מדיום הפרדת תאי אנדותל של תאי כוכבים.

לאחר מכן, הוסף 20 מיקרוליטר של תמיסת חסימה מערכת MAX ו-20 מיקרוליטר של מיקרו-חרוזי CD31 לתיוג חיסוני ודגר את התרחיף המתקבל למשך 15 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הפרד את LEC מ-HSC כמתואר בפרוטוקול היצרן עבור מערכת מיון התאים המופעלת מגנטית מקסימום ואסוף את שבר ה-HSC. הסר את ה-LEC החיובי CD31 שנשמר מגנטית והשהה אותם במדיום תרבית תאי אנדותל של תאי כוכב.

כאן, תמונות אלה מציגות את אוכלוסיות תאי הכבד המבודדות השונות ישירות לאחר תהליך הבידוד בתצוגת מיקרוסקופ ניגודיות פאזה. סט תמונות זה מציג את התאים המבודדים והמעובדים לאחר 24 שעות של טיפוח. האפיון המבוסס על אימונופלואורסצנציה של חלקי תאים שונים מוצג כאן.

PHH הראה אותות חיוביים לסמן הכבד CK18 24 שעות לאחר הבידוד, KC היו חיוביים לסמן CD68 24 שעות לאחר הבידוד, LEC הראה אותות חיוביים לוימנטין 72 שעות לאחר הבידוד, ו-HSC היו חיוביים ל-GFAP 72 שעות לאחר הבידוד. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שבידוד מוצלח תלוי בעיכול אופטימלי של דגימת רקמת הכבד. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לשלוט בעיכול וכיצד לבצע את הפרדת שיפוע הצפיפות, שהם השלבים הקריטיים בהליך זה.

לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום המחקר הרפואי לחקור תפקודים ומחלות כבד בתרביות תאים במבחנה שנוצרו לאחרונה ובמודלים של כבד מהונדס רקמות.