Name: פרוטוקול הבידוד של hepatocytes האדם הראשי הקביל סרן אוכלוסיות של תאים בכבד ללא parenchymal (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: חקור שיטת בידוד תאי כבד אנושיים ותאים לא-פארנכימליים מאותו תורם באמצעות פרפוזיה וסריג צפיפות. טכניקה זו מאפשרת ייצור תרביות שכבה ומודלים הנדסתיים לחקר תפקוד כבדי ורעילות תרופות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות ג&#39;יה לי ליו על תמיכתם בבריאה של איור 1. מחקר זה מומן על ידי המשרד הפדרלי הגרמני לחינוך ולמחקר (BMBF) פרויקט כבד וירטואלי: 0,315,741.

הערה: כל התאים היו מבודדים מרקמת כבד אנושית הלא tumorous שנקטעה, שנשאר לאחר כריתה חלקית כבדה עם גידולים בכבדים ראשוניים או משניים. הסכמה מדעת של החולים הושגה על פי הקווים המנחים האתיים של השריטה - Universitätsmedizin ברלין. 1. הכנת חומרים ופתרונות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את כל המכשירים ואת החומרים מראש כדי למנוע זיהום חיידקים במהלך תהליך הבידוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרונות הנדרשים זלוף של המדגם רקמת הכבד, את תהליך הבידוד של hepatocytes ותאי הכבד הלא parenchymal וטיפוח בתאי כבד אנושיים ראשוניים על פי לוחות 1 ו -2, עם יוצא מן הכלל של פתרון העיכול אשר מוכן טרי לפני השימוש. כל הפתרונות יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס ומומלץ להשתמש בהם בתוך 4 שבועות לאחר ההכנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לְעַקֵרכל הפתרונות באמצעות מסנן העליון 0.22 מיקרומטר הבקבוק. </li></ol> 2. הכנת ציוד זלוף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרה לציוד עבור זלוף ועיכול המדגם הכבד הרקמות כפי שמוצג באיור 1 א. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כוונו את הטמפרטורה באמבט מים עד 39 ° C על מנת להבטיח פעילות P collagenase אופטימלי במהלך זלוף ועיכול. </li></ol> 3. זלוף ועיכול מדגם רקמת כבד (1.5 שעות) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר דגימת רקמה עם הקפסולה של שלמי Glisson מרקמת כבד הכריתה. כאשר חיתוך דגימת רקמה, לנסות לקבל משטח חיתוך קטן עם כלי גלוי טוב. הימנע פעמים איסכמיה חמה על ידי הובלת וטיפול המדגם הכבד רקמות על הקרח עד זלוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את משקל הרקמה בתנאים סטריליים ולמקם המדגם כבד רקמות בצלחת פטרי בזרימת האוויר למינרית. נקו את פני השטח של דגימת רקמה עם רטייה סטרילי מן מחדשmaining דם ולשטוף את סט הצינורית באמצעות שאני זלוף-פתרון 1x על מנת להבטיח כי כל הצינורית הייתה חדירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש רקמות דבקות לתקן את הזיתים של קנולות בחלק כלי דם גדול. בהתאם לגודל של המדגם כבד רקמות ומספר הכלי על פני השטח, להשתמש צינורית משובצת 3 עד 8 קנולות. בדוק את זלוף ולבדוק דליפות. סגור את כל כלי הדם, אשר להדליף לי 1x זלוף-פתרון ברור, עם דבק רקמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את מדגם רקמת כבד cannulated לתוך המשפך ביכנר על דיסק המסנן המחורר שלה (איור 1 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את קצב הזרימה של המשאבה peristaltic בין 7.5 מ&quot;ל / דק &#39;ו 14.6 מ&quot;ל / דקה תלוי במספר קנולות משומשים על התנגדות של רקמת הכבד. התאם את קצב הזרימה בכל פעם על מנת להבטיח כי קיים זלוף נוכחי אבל איטי. Perfuse הרקמה עד הדם המלא סמוק החוצה אבל לפחות 20 דקות. שים את הרקמות הופכות בהיר באזורים עם perfusi הטובעַל. הערה: במקרים מסוימים, ייתכן שיהיה צורך לצבוט אחד קנולות עם מהדק פלסטיק או להגביר את הלחץ הפנימי של שטח על ידי דחיפת ברכות עם מרית נגד הקפסולה הכבד, כדי לייעל את זלוף. שינוי צבע מלא בצהוב בהיר לצבע חום בהיר מציין זלוף טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שנה את נוזל זלוף-פתרון העיכול המכיל collagenase P (טבלה 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסדר מחדש את ההתקנה (איור 1 א) עבור שלב העיכול. לכן לבצע זרימה מעגלית של פתרון העיכול על פי איור 1B עבור עד 15 דקות. הערה: זה קריטי להפסיק זלוף מיד כאשר המדגם הכבד רקמות מתעכל מספיק. עיכול טוב ניתן לצפות, כשאף הרקמה מראה סימן של גמישות לפי הערכה ותחזוקה של דפורמציות כמוסה, כאשר הוא דחף עם מרית. </li></ol> 4. בידוד של hepatocytes (1 hr) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Tכד משאבת peristaltic ונח המדגם כבד רקמות בצלחת זכוכית. יש לשטוף את החלק החיצוני של דגימת רקמה עם פתרון-Stop קרים כקרח (טבלה 1). הסר את קנולות מהדגימה כבדת הרקמות. השתמש אזמל כדי לפתוח את המדגם כבד רקמות, על ידי חריטה באמצע האזור שבו קנולות צורפו. שמור על עצמך כי הקפסולה Glisson&#39;s נשאר ללא פגע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את החלק הפנימי של דגימת הרקמה ולאחר מכן לכסות את דגימת הרקמה השלמה עם פתרון-Stop קר כקרח. לנער את הרקמה בעדינות כדי לשחרר את התאים מתוך הרקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף את השעית התא ולסנן אותו דרך משפך מבט (משפך פלסטיק מרופד תחבושות) לתוך 50 צינורות פלסטיק מיליליטר. הוסף עוד עצור-פתרון מדגם כבד הרקמה עד נפח סופי של 500 מיליליטר הוא נצרך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ההשעיה התא ב 50 XG, 5 דקות, 4 ° C. איסוף supernatant בידוד תא הלא parenchymal מאוחר יותר. שטוף את התא גלול עם PBS (איור 2א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה השעית התא שוב ב 50 XG, 5 דקות, 4 ° C. אסוף את supernatant מחדש להשעות גלולה במדיום דגירה Hepatocyte (לוח 2, תרשים 2B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את המספר הסלולרי ואת כדאיות השעית התא וכתוצאה מכך באמצעות מכתים trypan הכחול. לספור את החיים תאים מתים בתא לספור נויבאואר. לחשב את מספר הסלולרי, הכדאיות ואת התשואה של PHH תוך שימוש בנוסחאות להלן. תשואה (נספר תאים) = תאים נספר x גורם לדילול נפח x של השעיה תא (מ&quot;ל) x 10,000 תשואה (hepatocytes / (מדגם כבד גרם רקמה)) = (תשואה (hepatocytes / (תקשורת מיליליטר)) נפח x של השעית תא (מיליליטר)) / (משקל של מדגם כבד רקמות (ז)) כדאיות (%) = 100% x (מספר תאי חיים) / (מספר תאים כולל) </li></ol> 5. טיהור hepatocytes (1 hr) הערה: שלב טיהור זו מומלצת, אם את הכדאיותנמוך מ -70%. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע כל הצעדים על הקרח. הכן שיפוע צפיפות 25% על ידי ערבוב פתרון שיפוע צפיפות 5 מ&quot;ל ו 15 מ&quot;ל PBS עבור צנטריפוגה שיפוע צפיפות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים מקסימום של 50 תאי Mio בסך הכל מתוך השעית התא העשירה hepatocyte בזהירות ובאיטיות על גבי שכבת שיפוע צפיפות 25% על מנת להבטיח כי הפרדה ברורה של שני השכבות מושגת (איור 2 ג). שים את הצינורות בזהירות לתוך צנטריפוגות צנטריפוגות ב 1,250 XG, 20 דק &#39;, 4 ° C ללא בלם (איור 2 ד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את ההשעיה תא הנותרים ואת התאים המתים שלבי הביניים. בהתאם אחד תכולת השומן עלול גם לשאוב שיפוע-פתרון צפיפות. הערה: PHH עם תוכן שומנים נמוך צורה כדורית צפופה ואת שיפוע הצפיפות ניתן aspirated לחלוטין. PHH עם תוכן שומנים גבוה צורה כדורית מפוזרת יותר והרבה תאי קיימא עשוי להישאר פתרון שיפוע צפיפות מעל הגלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">Re- להשעות את כדורי hepatocyte עם PBS ו צנטריפוגות שוב ב 50 XG, 5 דקות, 4 ° C. פינת כדורי, לשטוף שוב עם PBS מחדש להשעות PHH מטוהרים במדיום דגירה Hepatocyte. בצעו ספירת תאים כפי שמתואר בשלב 4.6. </li></ol> טיפוח 6. hepatocytes <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את כלי תרבית תאים עבור זריעה של PHH על ידי ציפוי אותם עם תאי מטריקס עבור קולגן זנב חולדה למשל (אני סוג קולגן). כן קולגן עכברוש הזנב לפי הפרוטוקול הוקם על ידי רג&#39;אן et al. 17 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את מניות קולגן עכברוש זנב פתרון 1: 200 ב PBS. העברת 100 μl / 2 ס&quot;מ חולדה פתרון הזנב קולגן לתוך תרבות מנות, מטפלת כי כל פני השטח מכוסה. דגירת פלסטיק תרבית תאים עבור 20 דקות בטמפרטורת חדר. לשאוב את פתרון קולגן זנב חולדה הנותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Seed 15 x 10 4 hepatocytes / 2 ס&quot;מ במדיום Hepatocyte דגירה על תרבות disheשעות מצופות קולגן זנב חולדה. טפחו את התאים חממה humidified על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 לפחות שעה 4. לאחר 4 שעות את hepatocytes דבק והמדיום ניתן לשנות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע חקירות תלויות בהגדרת הניסוי. זמן תרבות של 48 שעות מומלץ לאפשר לתאים להתאושש תהליך הבידוד. </li></ol> 7. בידוד של תאים בכבד ללא parenchymal (1.5-2 שעות) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה supernatant אסף (שלב 4.5 ו -4.6) בשעה 72 XG, 5 דקות, 4 ° C לחסל אריתרוציטים ו hepatocytes הנותרים. פינת את supernatants צנטריפוגות אותם פעמיים כדי לקבל שני כדורי תא: 300 XG, 5 דקות, 4 ° C עבור שקיעה של HSC, LEC ובחלקו KC ו -650 XG, 7 דקות, 4 מעלות צלזיוס במשך שקיעה של הנותרים KC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברכה הן כדורים מחדש להשעות אותם HBSS. כן 25% לבין מפלי צפיפות 50% על ידי פתרון שיפוע צפיפות ערבוב PBS עבור centrif שיפוע צפיפותugation (שיפוע הפתרון צפיפות 25%: 5 מ&quot;ל פתרון מפל צפיפויות 15 מ&quot;ל PBS, פתרון שיפוע צפיפות 50%: 10 מ&quot;ל פתרון מפל צפיפויות 10 מ&quot;ל PBS, ראה איור 2). מניח את פתרון שיפוע צפיפות 25% בזהירות על גבי שכבת פתרון שיפוע צפיפות 50%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את ההשעיה NPC בזהירות ובאיטיות על גבי שכבת פתרון שיפוע צפיפות 25% באופן הפרדה ברורה של שתי שכבות מושגת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ההשעיה תא על שיפוע צפיפות 1,800 XG, 20 דק &#39;, 4 ° C ללא בלם (איור 2.2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב תאים מתים ופסולת תא מהשכבה העליונה. ה NPC ממוקם ביניים בין שכבת שיפוע צפיפות 25% ו -50% (איור 2). אסוף NPC, לשטוף אותם עם HBSS צנטריפוגות ההשעיה תא החלת השלב צנטריפוגה כפול שתואר לעיל (שלב 7.2.). </li></ol> הפרדת 8. של תאי Kupffer (דבקשלב ההפרדה) (1 hr) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצעו ספירת תאים עבור KC בשבריר NPC כמתואר בשלב 4.6. (לקבלת מראה של KC ההשעיה לראות איור 3B). צנטריפוגה השבר NPC עם הצעד צנטריפוגה כפול שתואר לעיל (שלב 7.2) מחדש להשעות את NPC ב Kupffer תא זריעת בינוני (טבלה 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרעים חלק KC המכיל על כלי תרבית תאים פלסטיק בצפיפות של 5 x 10 5 KC / 2 ס&quot;מ. דגירת תרבויות KC במשך 20 דקות בתוך חממת humidified על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. KC הראשי לדבוק על פלסטיק תרבית תאים בתוך פרק הזמן קצר (איור 2.3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף את supernatant המכיל אינו דבק NPC, המורכב בעיקר של הבקר ואת HSC. פינה את supernatants להפרדה מאוחרת של בקר (ראה סעיף 9) ו HSC (ראה סעיף 10). שטוף את KC החסיד עם HBSS ולטפח אותם במדיום תרבית תאי Kupffer (לוח 2) על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 בתוך חממה humidified. </li></ol> 9. הפרדה לתאי אנדותל (1.5 שעות) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה supernatant אסף (שלב 8.5.) ב 300 XG, 5 דקות, 4 ° C. שטפו את הכדור עם PBS. לאחר צנטריפוגה XG ב 300, 5 דקות, 4 ° C מחדש להשעות את התאים תא stellate / בינוני ההפרדה תא האנדותל ולבצע ספירת תאים עבור כל התאים הנותרים כמתואר בשלב 4.6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re- להשעות 1 x 10 7 תאים Mio ב 1 מ&quot;ל תא stellate / בינוני ההפרדה תא האנדותל, להוסיף 20 μl פתרון חסימת מן-KIT MACS ו -20 μl של חרוזים מיקרו CD31 עבור immunolabeling דגירה ההשעיה וכתוצאה מכך במשך 15 דקות ב 4 טמפרטורת ° C (איור 2.4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקר בנפרד HSC כמתואר בפרוטוקול manufacturer&#39;s עבור מערכת מיון התא המופעלת המגנטי MACS (איור 2.5). Elute מגנטית שמר LEC CD31 חיובי, ולהשהות אותם stellate Cell / בינוני תרבות תא האנדותל (טבלה 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע תא לספור עבור בקר כמתואר בשלב 4.6. בקר זרע בצפיפות של 1.25 x 10 5 תאים / 2 סנטימטר בכלי תרבית תאים מצופים קולגן זנב חולדה (ראה שלב 6.1). טפחו את התאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באינקובטור humidified. </li></ol> 10. הפרדת תאי stellate (0.5 שעות) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> HSC ללא תווית להעביר את עמודת ההפרדה במהלך הליך MACS. אסוף את שבריר HSC (ראה שלב 9.5, איור 2.5). בצעו ספירת תאים כפי שמתואר בשלב 4.6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> HSC זרע עם צפיפות של 5 x 10 4 תאים / 2 ס&quot;מ בכלי תרבית תאים מצופה קולגן זנב חולדה (ראה שלב 6.1) ב תא stellate / בינוני תרבות תא האנדותל (טבלה 2) ולטפח אותם על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באינקובטור humidified. </li></ol><img alt= &quot;טבלה 1&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 53,069 / 53069table1.jpg&quot; /&gt; טבלה 1: זלוף פתרון בידוד. <img alt="טבלה 2" src="/files/ftp_upload/53069/53069table2.jpg" /> תקשורת ותרבות ובידוד: טבלה 2.

<ol><li>Pfeiffer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+characterization%2C+and+cultivation+of+human+hepatocytes+and+non-parenchymal+liver+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Isolation, characterization, and cultivation of human hepatocytes and non-parenchymal liver cells.</a> Exp Biol Med. , Maywood. (2014).</li>
<li>Si-Tayeb, K., Lemaigre, F. P., Duncan, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organogenesis+and+development+of+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Organogenesis and development of the liver.</a> Dev Cell. 18 (2), 175-189 (2010).</li>
<li>Alpini, G., Phillips, J. O., Vroman, B., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+the+isolation+of+liver+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Recent advances in the isolation of liver cells.</a> Hepatology. 20 (2), 494-514 (1994).</li>
<li>Godoy, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+2D+and+3D+in+vitro+systems+using+primary+hepatocytes%2C+alternative+hepatocyte+sources+and+non-parenchymal+liver+cells+and+their+use+in+investigating+mechanisms+of+hepatotoxicity%2C+cell+signaling+and+ADME%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Recent advances in 2D and 3D in vitro systems using primary hepatocytes, alternative hepatocyte sources and non-parenchymal liver cells and their use in investigating mechanisms of hepatotoxicity, cell signaling and ADME.</a> Arch Toxicol. 87 (8), 1315-1530 (2013).</li>
<li>Gómez-Lechón, M. J., Castell, J. V., Donato, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocytes--the+choice+to+investigate+drug+metabolism+and+toxicity+in+man%3A+in+vitro+variability+as+a+reflection+of+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol+Interact%22%5BJournal%5D)">Hepatocytes--the choice to investigate drug metabolism and toxicity in man: in vitro variability as a reflection of in vivo.</a> Chem Biol Interact. 168 (1), 30-50 (2007).</li>
<li>Ginai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+bioreactors+as+in+vitro+models+in+pharmaceutical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Today%22%5BJournal%5D)">The use of bioreactors as in vitro models in pharmaceutical research.</a> Drug Discov Today. 18 (19-20), 922-935 (2013).</li>
<li>Schyschka, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+3D+cultures+but+not+2D+cultures+preserve+specific+transporter+activity+for+acetaminophen-induced+hepatotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Hepatic 3D cultures but not 2D cultures preserve specific transporter activity for acetaminophen-induced hepatotoxicity.</a> Arch Toxicol. 87 (8), 1581-1593 (2013).</li>
<li>Kostadinova, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+long-term+three+dimensional+liver+co-culture+system+for+improved+prediction+of+clinically+relevant+drug-induced+hepatotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Appl+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">A long-term three dimensional liver co-culture system for improved prediction of clinically relevant drug-induced hepatotoxicity.</a> Toxicol Appl Pharmacol. 268 (1), 1-16 (2013).</li>
<li>Messner, S., Agarkova, I., Moritz, W., Kelm, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-cell+type+human+liver+microtissues+for+hepatotoxicity+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Multi-cell type human liver microtissues for hepatotoxicity testing.</a> Arch Toxicol. 87 (1), 209-213 (2013).</li>
<li>Nussler, A. K., Nussler, N. C., Merk, V., Brulport, M., Schormann, W., Yao, P., Hengstler, J. G. The Holy Grail of Hepatocyte Culturing and Therapeutic Use. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNussler%2C+AK+%22Strategies+in+Regenerative+Medicine%22">Strategies in Regenerative Medicine</a>. Santin, M. , Springer. New York. 1-38 (2009).</li>
<li>Friedman, S. L., Roll, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+hepatic+lipocytes%2C+Kupffer+cells%2C+and+sinusoidal+endothelial+cells+by+density+gradient+centrifugation+with+Stractan%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of hepatic lipocytes, Kupffer cells, and sinusoidal endothelial cells by density gradient centrifugation with Stractan.</a> Anal Biochem. 161 (1), 207-218 (1987).</li>
<li>Knook, D. L., Blansjaar, N., Sleyster, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+Kupffer+and+endothelial+cells+from+the+rat+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of Kupffer and endothelial cells from the rat liver.</a> Exp Cell Res. 109 (2), 317-329 (1977).</li>
<li>Alabraba, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+approach+to+isolation+and+culture+of+human+Kupffer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A new approach to isolation and culture of human Kupffer cells.</a> J Immunol Methods. 326 (1-2), 139-144 (2007).</li>
<li>Friedman, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolated+hepatic+lipocytes+and+Kupffer+cells+from+normal+human+liver%3A+morphological+and+functional+characteristics+in+primary+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Isolated hepatic lipocytes and Kupffer cells from normal human liver: morphological and functional characteristics in primary culture.</a> Hepatology. 15 (2), 234-243 (1992).</li>
<li>Lalor, P. F., Lai, W. K., Curbishley, S. M., Shetty, S., Adams, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+hepatic+sinusoidal+endothelial+cells+can+be+distinguished+by+expression+of+phenotypic+markers+related+to+their+specialised+functions+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Human hepatic sinusoidal endothelial cells can be distinguished by expression of phenotypic markers related to their specialised functions in vivo.</a> World J Gastroenterol. 12 (34), 5429-5439 (2006).</li>
<li>Lee, S. M., Schelcher, C., Demmel, M., Hauner, M., Thasler, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+human+hepatocytes+by+a+two-step+collagenase+perfusion+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of human hepatocytes by a two-step collagenase perfusion procedure.</a> J Vis Exp. (79), (2013).</li>
<li>Rajan, N., Habermehl, J., Coté, M. F., Doillon, C. J., Mantovani, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+ready-to-use%2C+storable+and+reconstituted+type+I+collagen+from+rat+tail+tendon+for+tissue+engineering+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications.</a> Nat Protoc. 1 (6), 2753-2758 (2006).</li>
<li>Chang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+hepatic+stellate+cells+from+mouse+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biochim+Biophys+Sin+%28Shanghai%29%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of hepatic stellate cells from mouse liver.</a> Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 46 (4), 291-298 (2014).</li>
<li>Zeng, W. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+to+isolate+and+culture+rat+kupffer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A new method to isolate and culture rat kupffer cells.</a> PLoS One. 8 (8), e70832(2013).</li>
<li>Tokairin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+specific+isolation+of+rat+sinusoidal+endothelial+cells+by+the+immunomagnetic+bead+method+using+SE-1+monoclonal+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hepatol%22%5BJournal%5D)">A highly specific isolation of rat sinusoidal endothelial cells by the immunomagnetic bead method using SE-1 monoclonal antibody.</a> J Hepatol. 36 (6), 725-733 (2002).</li>
<li>Damm, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+parenchymal+and+non-parenchymal+liver+cell+isolation%2C+culture+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology+International%22%5BJournal%5D)">Human parenchymal and non-parenchymal liver cell isolation, culture and characterization.</a> Hepatology International. 7, 915-958 (2013).</li>
<li>Baccarani, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+human+hepatocytes+from+livers+rejected+for+liver+transplantation+on+a+national+basis%3A+results+of+a+2-year+experience%5BTitle%5D)+AND+%22Liver+Transpl%22%5BJournal%5D)">Isolation of human hepatocytes from livers rejected for liver transplantation on a national basis: results of a 2-year experience.</a> Liver Transpl. 9 (5), 506-512 (2003).</li>
<li>Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q., Liu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+primary+culture+of+rat+hepatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and primary culture of rat hepatic cells.</a> J Vis Exp. (64), (2012).</li>
<li>Gerlach, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+isolation+of+sinusoidal+endothelial+cells+from+pig+and+human+liver%5BTitle%5D)+AND+%22J+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">Large-scale isolation of sinusoidal endothelial cells from pig and human liver.</a> J Surg Res. 100 (1), 39-45 (2001).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים מתחרים.

הפרוטוקול שפורסם מתאר טכניקה לבודדת PHH הטהור NPC, כלומר KC, HSC ו בקר, בו זמנית באיכות גבוהה וטוהרים מאותה דגימת רקמת כבד אנושית. רוב הפרסומים העוסקים isolations תא כבד מכסים רק אחד מאותם אוכלוסיות תאי 18-20 ונהלי בידוד מבוצעים עם רקמה אנושית הם נדיר (נבדק על ידי Damm et al.) 21. התאמת שיטות הוקמו עם רקמה מן החי (למשל, חולדה כבדה) כדי כבד אנושי חשף מספר הבדלים במאפייני תא בין בעלי חי אוכלוסיות תאים אנושיים. הקמת שיטת בידוד תא כבד המכסה את א...

רקמת כבד אנושית היא מאוד מורכבת מורכבת משני גופי תאים שונים, תאי parenchymal ותאי הלא parenchymal (NPC). תאי כבד Parenchymal כוללים hepatocytes ו cholangiocytes. Hepatocytes מייצג 60 עד 70% של תאי כבד סכו להסביר את רוב הפונקציות הכבדות מטבולית, למשל, חומצות מרות ומשלים סינתזת גורם, biotransformation ואנרגית מטבוליזם 2,3. שבר NPC הקטן מהווה 30-40% של תאים כבדים כוללים. NPC לכלול אוכלוסיות תאים שונות, כלומר תאי Kupffer (KC), תאי אנדותל כבדים (LEC) ותאי stellate הכבדים (HSC). שבריר תא הטרוגנית זו ממלאת תפקיד מרכזי בתהליכים פיסיולוגיים של הכבד. בנוסף, NPC להשתתף בתיווך נזק כבד חריפה, למשל, פגיעה בכבד הנגרמת התרופה (דילי) וכן לפציעת כבד כרונית, כגון שחמת 4. בשנים האחרונות, hתאי כבד באומן הפכו יותר ויותר חיוני במחקר ופיתוח של בדיקות סמים, פיתוח תרופות וזיהוי הביוכימיים חדשים במחלות כבדות. עבור בדיקות במבחנה monocultures PHH עדיין נחשבים &quot;תקן הזהב&quot; 5. המגבלה העיקרית של מודלים כבדים homotypic הנוכחיים היא dedifferentiation ואובדן התפקוד של hepatocytes תוך מספר ימים 4. הקמת טכניקות תרבות 3-ממדי (3D) הוכיחה כי מגבלות אלה ניתן לפצות 4,6. עם זאת, אפילו טכניקות תרבות 3D מודרניות אינן מסוגלות להציג את כל מצבי hepatotoxic של פעולות 7. אוכלוסיות NPC חסרות במודלים במבחנה הקיימים נדונות כסיבה אפשרית לאי התאמה זו למצב vivo. הוכח כי תקשורת תאי תאים בין אוכלוסיות תאים בכבד השונות ממלא תפקיד מרכזי הומאוסטזיס פיסיולוגי אלא גם pathophysiologic מעבד 8. לכן את תשומת הלב המדעית מתמקדת יותר ויותר על NPC ואינטראקציות תאי התאים שלהם. שימוש ותכליתי במערכות שיתוף תרבות רקמות מהונדסות יכול להיות פתרון עבור הביקוש הרב של מודלים כבדים במבחנת 8,9 שהן קרובות ככל למצב in vivo ככל האפשר. כרגע האתגר המרכזי הוא הפיתוח של מודל כבד אנושי סטנדרטי שיתוף תרבות, המכיל חלקים ברורים של PHH ו NPC. כתוצאה מכך, טכניקות לבידוד תאי הכבד הטרוגנית מאוד נדרשות ואלה צריכים להיות מותאמים על מנת לקבל אוכלוסיות תאים טהורות. בעוד פרוטוקולים סטנדרטיים עבור בידוד PHH קיימים 10, הבידוד הסטנדרטי של NPC אדם עדיין בפיתוח. רוב שפורסמו פרוטוקולי בידוד NPC מבוססים על ניסויים עם תאים שאינם בני אדם 11,12. רק כמה פרסומים לתאר את תהליך הבידוד של האדם NPC ורוב מכסים רקשיטות הבידוד של תא בודד מקלידים 11-16. מאפייני התא החשובים ביותר כי כבר רתמו להפרדה סלולרית הם גודל, צפיפות, התנהגות-הקשר, ואת הביטוי של חלבוני פני שטח. על סמך מאפיינים אלה פתחנו פרוטוקול פשוט לבודדים PHH, KC, בקר ואת HSC, אשר פורסם בעבר בביולוגיה ניסויית ורפואת 1. בגלל העניין הרחב בטכניקה זו, המטרה של מאמר זה היא לספק פרוטוקול מפורט יותר על תהליך הבידוד כבד התא כולל וידאו, אשר יאפשר לשחזר את הטכניקה יותר בקלות. הפרוטוקול כולל גם שיטות בקרה איכות להערכת תשואה ואת הכדאיות וכן להערכת זיהוי ורמת ניקיון באמצעות immunostainings הספציפי.

<table><tbody><tr><td><חזק>ציוד כללי</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PIPETBOY</td><td>פיפטות אפנדורף</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ</td><td>אפנדורף</td> מיקרוסקופ קרל זייס <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>אולימפוס</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2-incubator</td><td>קלסר</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lamin Air</td><td>Heraeus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה Varifuge 3.0R</td><td>Heraeus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>כוס שתן</td><td>Sarstedt</td><td>2041101</td><td></td></tr><tr><td>מזרק פרפוזור 50 מ"ל</td><td>B.Braun</td><td>12F0482022</td><td></td></tr><tr><td>מסנן בקבוק עליון</td><td>Nalgene</td><td>1058787</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 מ"ל צינור חרוטי פוליפרופילן</td><td>BD Biosciences</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>פלקון 15 מ"ל צינור חרוטי פוליפרופילן</td><td>BD Biosciences</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>צלחת תרבית רקמות</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>533047 24 בארות</td></tr><tr><td>פיפטות סרולוגיות</td><td>BD Biosciences</td><td>357525, 357551, 357543</td><td>25 מ"ל, 10 מ"ל, 5 מ"ל</td></tr><tr><td>קצות פיפטות</td><td>SARSTEDT</td><td>0220/2278014, 0005/2242011, 0817/2222011</td><td>100 ומיקרו; l, 200 ומיקרו; l, 1,000 ומיקרו; l</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Catalog Number</strong</td><td>>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Isolation Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>water bath</td><td>Lauda</td><td></td><td></td></tr><tr><td>peristaltic</td><td></td> Circulation Carl Roth <td></td><td></td></tr><tr><td> תרמוסטט</td><td>מד pH לאודה</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>שוט קשקשים עדינים</td><td>Sartorius</td><td></td><td></td></tr><tr><td>stand</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B&uuml; chner משפך</td><td>Haldenwanger</td><td></td><td></td></tr><tr><td>פלסטיק משפך</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>סיליקון צינור</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>צינורית עם קצות</td><td></td><td></td><td></td>זית</tr><tr><td>זכוכית צלחת</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>אזמל</td><td>נוצה</td><td>12068760</td><td></td></tr><tr><td>Neubauer ספירה תא</td>מרים תאי <td>לידה</td><td></td><td></td>אופטי</tr><tr><td></td><td>Costar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>וילון כירורגי</td><td>Charit&eacute; Universit&auml; tsmedizin ברלין</td><td>A2013027</td><td></td></tr><tr><td>דחיסת</td><td>Fuhrmann</td><td>40013331</td><td></td></tr><tr><td>כפפות כירורגיות סטריליות</td><td>Gammex PF</td><td>1203441104</td><td></td></tr><tr><td>דבק רקמות</td><td>B. Braun</td><td>1050052</td><td></td></tr><tr><td>בקבוק זכוכית</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>קולגנאז P</td><td>Roche</td><td>13349524</td><td></td></tr><tr><td>Percoll Separating Solution</td><td>ביוכרום</td><td>L6145</td><td>צפיפות 1.124 גרם/מ"ל</td></tr><tr><td>Hank' s BSS</td><td>PAA</td><td>H00911-3938</td><td></td></tr><tr><td>דולבקו' s PBS</td><td>PAA</td><td>H15 - 002</td><td>ללא מ"ג/Ca</td></tr><tr><td>פלסטיפור</td><td>&nbsp;</td><td>13CKP151&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Merck</td><td>1,064,041,000</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>49,361,000</td><td></td></tr><tr><td>Hepes Pufferan&nbsp;</td><td>Roth</td><td>133196836</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E-5134</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Media Equipment&nbsp; </חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>PAA</td><td>E15-005</td><td>גלוקוז נמוך (1 גרם/ליטר) (ללא L-גלוטמין)</td></tr> <tr><td>תמיסת חיץ HEPES 1&nbsp; M</td><td>GIBCO</td><td>1135546</td><td></td></tr><tr><td>L-גלוטמין</td><td>GIBCO</td><td>25030-024</td><td>200 מ"מ</td></tr><tr><td>MEM NEAA</td><td>GIBCO</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין</td><td>GIBCO</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>PAA</td><td>E15 - 039</td><td>ללא L-גלוטמין</td></tr><tr><td>נתרן פירובט</td><td>GIBCO</td><td>1137663</td><td>100 מ"מ</td></tr><tr><td>טריפאן כחול פתרון</td><td>סיגמא-אולדריץ</td>' <td>T8154</td><td>0.4%</td></tr> <tr><td>ויליאם s E&nbsp; &nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>32551-020</td><td></td></tr><tr><td>עם GlutaMAX &trade;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>03780-50G</td><td></td></tr><tr><td>Fortecortin</td><td>Merck</td><td>49367</td><td>8 מ"ג/2 מ"ל</td></tr><tr><td>אינסולין אנושי</td><td>Lilly</td><td>HI0210</td><td>100 I.E./ml</td></tr><tr><td>N-אצטיל ציסטאין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A9165-5G</td><td></td></tr><tr><td>סרום עגל עוברי (FCS)</td><td>PAA</td><td>A15-101</td><td></td></tr><tr><td><חזק>שם</חזק></td><td>חברה</strong</td><td>>מספר קטלוגי</td><td>תגובות</strong</td></tr><tr><td>>ציוד לצביעה חיסונית</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD 68</td><td>R& D Systems, ארה"ב</td><td></td><td>חד שבטי</td></tr><tr><td>CK 19</td><td>סנטה קרוז</td><td>D2309</td><td>פוליקלונלי</td></tr><tr><td>CK18</td><td>סנטה קרוז</td><td>K2105</td><td>חד שבטי</td></tr><tr><td>וימנטין</td><td>סנטה קרוז</td><td></td><td>מונוקלונלי</td></tr><tr><td>GFAP</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td></td><td>מונוקלונלי</td></tr><tr><td>טריטון X-100</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>23.472-9</td><td></td></tr><tr><td>עיזים נגד עכבר IgG1-PE</td><td>סנטה קרוז</td><td>C0712</td><td></td></tr><tr><td>עיזים נגד ארנב IgG-FITC</td><td>סנטה קרוז</td><td>L0412</td><td></td></tr><tr><td>מתנול</td><td>J.T.Baker</td><td>1104509006</td><td></td></tr><tr><td>פורמלדהיד 4%</td> <td>Herbeta Arzneimittel</td><td>200-001-8</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין סרום בקר (BSA)</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>A7906-100G</td><td></td></tr></tbody></table>

פרוטוקול הבידוד של hepatocytes האדם הראשי הקביל סרן אוכלוסיות של תאים בכבד ללא parenchymal

Protocol for Isolation of Primary Human Hepatocytes and Corresponding Major Populations of Non-parenchymal Liver Cells

לצד hepatocytes parenchymal, הכבד מכיל תאים שאינם parenchymal (NPC) כלומר תאים Kupffer (KC), תאי אנדותל הכבד (LEC) ותאי stellate הכבד (HSC). דו מימדי (2D) תרבות של hepatocyte אדם מן המעלה הראשונה (PHH) עדיין נחשב &quot;תקן הזהב&quot; במבחנה בדיקות של חילוף החומרים סמים הרעילות. זה ידוע היטב כי monoculture 2D של PHH סובל dedifferentiation ואובדן תפקוד. לאחרונה הודגם כי הכבד NPC למלא תפקיד מרכזי בכבד (patho-) פיזיולוגיה החזקת פונקציות PHH. המחקר הנוכחי מתמקד בשחזור של האדריכלות רקמות in vivo על ידי 3D- ומודלים לתרבות משותפת כדי להתגבר על המגבלות של monocultures 2D. בעבר פרסמנו שיטה לבודדת בתאי כבד אנושיים וחקרתי את התאמתו של תאים אלה לשימושם בתרביות תאים בביולוגיה ניסויית ורפואת 1. בהתבסס על הריבית הרחבה te זהchnique המטרה של מאמר זה הוא לספק פרוטוקול מפורט יותר על תהליך הבידוד כבד התא כולל וידאו, אשר יאפשר רבייה קלה של טכניקה זו. בתאי כבד אנושיים בודדו מדגימות רקמת הכבד האנושי של התערבויות כירורגיות ידי טכניקה P זלוף שני שלבים EGTA / collagenase. PHH הופרד NPC ידי צנטריפוגה ראשונית ב 50 x ז. צעדי צנטריפוגה שיפוע צפיפות שמשו להסרת תאים מתים. אוכלוסיות תאים בכבד הפרט בודדו את שבר NPC מועשר באמצעות מאפייני תאים ספציפיים ונהלי מיון תא. לצד בידוד PHH הצלחנו להפריד KC, הבקר ואת HSC לגידול נוסף. יחדיו, הפרוטוקול המובא מאפשר בידוד של PHH ו NPC באיכות ובכמות גבוהה ממדגם רקמות התורם אחד. הגישה אוכלוסיות תאים בכבד מטוהרים יכול לאפשר יצירה של in vivo כמו li אדםמודלים Ver.

ההפרדה לתוך חלק parenchymal ולא parenchymal, באמצעות צנטריפוגה שיפוע צפיפות כהליך לנקות בשילוב עם השימוש של נכסים היצמדות MACS מובילה לבידוד PHH ו NPC מוצלח. PHH ו NPC ניתן לבודד באיכות ובכמות גבוהות. איור 1 מציג את התקנת נציג וציוד זלוף והעיכול כבדים. 10% FCS נוספה P collagenase המכיל זלוף - הפתרון השני להפחית פעילות חלבונים של פרוטאזות וכדי לייצב פעילות P collagenase בתמורה. בזמנים עיכול ארוך יותר מכך נדרש לבידוד NPC ניתן ליישם א...

מתוארת טכניקה לבידוד הפטוציטים אנושיים ותאי כבד לא פרנכימליים מאותו תורם. סוגי תאי הכבד השונים בונים את הבסיס למודלים תפקודיים של כבד והנדסת רקמות. שיטה חדשה זו שואפת לבודד תאי כבד בתפוקה גבוהה ובכדאיות.

Beside parenchymal hepatocytes, the liver consists of non-parenchymal cells (NPC) namely Kupffer cells (KC), liver endothelial cells (LEC) and hepatic ...

שיטה זו עשויה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחומי ההפטולוגיה והטוקסיקולוגיה, ולהעניק לנו הזדמנות לפיתוח מודלים חדשים של תרביות משותפות (co-culture) in vitro ומודלים של כבד בהנדסת רקמות. יתרונה של טכניקה חדשה זו הוא היכולת לבודד את כל אוכלוסיות תאי הכבד מאותו תורם ומאותה פיסה קטנה של רקמת כבד. כדי להתחיל בהליך זה, שקלו את רקמת הכבד שחולצה זה עתה תחת תנאי סטריליות, והניחו את דגימת רקמת הכבד תחת מ这篇文章 flujo אוויר למינרי.לאחר מכן, נקו את הדם מפני השטח של דגימת הרקמה. לאחר מכן, שטפו את הקנולות באמצעות תמיסת פרפוזיה 1X one. השתמשו בדבק רקמות כדי לקבע את זיתי הקנולות בכלי הדם הגדולים יותר.לאחר מכן, בדקו את הפרפוזיה ואת הדליפות מהקנולות. לאחר מכן, סגרו בעזרת דבק לרקמות את כל כלי הדם המדליפים תמיסות פרפוזיה 1X שקופות. לאחר מכן, הניחו את דגימת רקמת הכבד עם הקנולות לתוך משפעל בוכנר.לאחר מכן, קבעו את קצב הזרימה של משאבת הפריסטלטיקה בין 7.5 ל-14.6 מיליליטר לדקה, בהתאם למספר הקנולות שנעשה בהן שימוש ולהתנגדות של רקמת הכבד. בצעו פרפוזיה לרקמה עד שכל הדם ינוקה, למשך 20 דקות לפחות ועד מקסימום 30 דקות. במקרים מסוימים, עשוי להיות צורך לסגור אחת הקנולות באמצעות תפסים מפלסטיק או להגביר את הלחץ הפנימי של אזור מסוים על ידי לחיצה עדינה על קפסולת הכבד בעזרת שפכטל, וזאת על מנת למטב את הפרפוזיה.שינוי צבע מלא מאדום-חום לחום בהיר או צהוב בהיר מעיד על פרפוזיה טובה. לאחר מכן, החליפו את נוזל הפרפוזיה בתמיסת עיכול המכילה collagenase P. לאחר מכן, סדרו מחדש את המערך לשלב העיכול. בהמשך, בצעו זרימה מעגלית של תמיסת העיכול למשך עד 15 דקות.עצרו את הפרופוזיה מדי פעם ובדקו את מידת העיכול. חיוני להפסיק מיד את הפרופוזיה עם תמיסת העיכול כאשר דגימת רקמת הכבד מעוכלה מספיק. הוציאו את הכבד מהמכשיר כאשר הוא מוכן והניחו אותו בצלחית זכוכית.שטפו את החלק החיצוני של דגימת הרקמה בתוך תמיסת עצירה (Stop Solution) קרה מאוד. הוציאו את הקנולות מדגימת רקמת הכבד. לאחר מכן, השתמשו בסקלפל כדי לפתוח את דגימת רקמת הכבד על ידי חריץ במרכז האזור שבו היו מחוברות הקנולות, והקפידו שקפסולת גליסון (Glisson's capsule) תישאר שלמה.שטפו את החלק הפנימי של דגימת הרקמה ולאחר מכן כסו את כל דגימת הרקמה בתמיסת עצירה (Stop Solution). לאחר מכן, נערו את הרקמה בעדינות כדי לשחרר ממנה את התאים. לאחר מכן, אספו את תרחיף התאים וסננו אותו דרך משפך גזה לתוך 10 מבחנות פלסטיק בנפח 50-milliliter.הוסיפו תמיסת עצירה (Stop Solution) נוספת לדגימת רקמת הכבד עד להגעה לנפח סופי של 500 milliliters. לאחר מכן, סבבו את תרחיף התאים בצנטריפוגה, אספו את העילאי עבור בידוד NPC מאוחר יותר, וקבצו את משקעי התאים לשפופרות פלסטיק של 250-milliliters. לאחר מכן, שטפו את משקעי התאים בעזרת PBS.לשם כך, סבב במרכז centrifuge את תרחיף התאים. אסוף את הנוזל העליון (supernatant), איחד את המשקעים, ושחזר את המשקע בתווך דגירה להפטוציטים.כדי לבודד את תאי הכבד שאינם פהנכימליים, סנטריפיגו את העילאי שנאסף כדי להסיר את הכדוריות האדומות וההפטוציטים שנותרו. אספו את העילאיים וסנטריפיגו אותם פעמיים כדי לקבל את משקעי התאים עבור שיקוע של HCS, LEC, חלק מה-KC וה-KC שנותרו. לאחר מכן, השעיקו מחדש את המשקעים ב-HBSS. לאחר מכן, הכינו מדרג צפיפות של 25% ו-50% על ידי ערבוב של תמיסת מדרג הצפיפות עם PBS לצורך סנטריפיגציה במדרג צפיפות.שפוך בזהירות את תמיסתו של מדרג הצפיפות בריכוז 25% מעל שכבת תמיסת מדרג הצפיפות בריכוז 50%. לאחר מכן, הנח בזהירות ובאיטיות את תרחיף ה-NPC מעל שכבת תמיסת מדרג הצפיפות בריכוז 25% כדי להשיג הפרדה ברורה בין שתי השכבות. סבב את תרחיף התאים על מדרג הצפיפות ללא הפסקה.ה-NPC ממוקמים בממשק שבין שכבות מדרג הצפיפות של 25% ו-50%. שאבו את התאים המתים ואת ששאריות התאים מהשכבה העליונה ביותר ואספו את הממשק בזהירות. לאחר סנטריפוגה כפולה, בצעו ספירת תאים עבור ה-KC ופלקציית ה-MPC.לאחר מכן, סובב במרכזית את פראקציית ה-NPC באמצעות שלב הצנטריפוגציה הכפולה שתואר קודם לכן, והשהה את ה-NPC שנית בתמיסת זריעה לתאי קופפר (Kupffer Cell seeding medium). זרע את הפראקציה המכילה את ה-KC על כלי תרביות תאים מפלסטיק בצפיפות של 5×10⁵ KC לסנטימטר רבוע. דגרי את תרביות ה-KC למשך 20 דקות באינקובטור לח במטמפר של 37 °C ו-5% carbon dioxide.תאי KC ראשוניים צריכים להיספח לפלסטיקה של תרבית התאים בפרק זמן קצר. לאחר מכן, אספו את העליון המכיל את תאי ה-NPC שאינם נספחים, המורכבים בעיקר מ-LEC ו-HSC. כדי להפריד בין LEC ל-HSC, התחילו בצנטריפוגה של העליון.לאחר מכן, שטפו את המשקע באמצעות PBS. לאחר הצנטריפוגה השנייה, השעיכו שוב את התאים במצע הפרדת תאי אנדוטל מסוג stellate ובצעו ספירת תאים לכל התאים שנותרו. לאחר מכן, השעיכו 10 מיליון תאים במיליליטר אחד של מצע הפרדת תאי אנדוטל מסוג stellate.לאחר מכן, הוסיפו 20 µL של תמיסת חסימה (blocking solution) מהערכה של MAX ו-20 µL של microbeads CD31 עבור סימון אימונולוגי, והדגירו את התוצאה למשך 15 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הפרידו את ה-LEC מה-HSC כפי שמתואר בפרוטוקול היצרן עבור מערכת מיון תאים מופעלת מגנטית max, ואספו את פракציית ה-HSC. אלוטו את ה-LEC חיוביים ל-CD31 שנשמרו מגנטית והשעו אותם במצע תרבית לתאי אנדותל מסוג stellate cell.כאן, התמונות מציגות את אוכלוסיות תאי הכבד המבודדים השונות מיד לאחר תהליך הבידוד בתצפית של מיקרוסקופ ניגודיות פאזה. סט תמונות זה מציג את התאים המבודדים והמטופחים לאחר 24 שעות של תרבית. כאן מוצגת האפיון המבוסס על אימונופלואורסצנציה של פראקציות תאים שונות.PHH הראו אותות חיוביים עבור הסמן של ההפטוציטים CK18‏ 24 שעות לאחר הבידוד, KC היו חיוביים עבור הסמן CD68‏ 24 שעות לאחר הבידוד, LEC הראו אותות חיוביים לווימנטין 72 שעות לאחר הבידוד, ו-HSC היו חיוביים ל-GFAP‏ 72 שעות לאחר הבידוד. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור שבידוד מוצלח תלוי בעיכול אופטימלי של דגימת רקמת הכבד. לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לכם הבנה טובה לגבי אופן השליטה בעיכול וכיצד לבצע הפרדה במדרג צפיפות, שהם השלבים הקריטיים של הליך זה.לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום המחקר הרפואי לחקור תפקודים ומחלות של הכבד בתרביתי תאי in vitro שנוצרו לאחרונה ובמודלים של כבד בהנדסת רקמות.

protocol-for-isolation-primary-human-hepatocytes-corresponding-major

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

Hepatocytes ראשיים מספקים כלי רב ערך כדי להעריך ביוכימיים, פונקציות מולקולרית, ואת חילוף החומרים במערכת ניסיונית רלוונטי מבחינה פיזיולוגית. אנו מתארים פרוטוקול אמין עכברוש זלוף הכבד באתרו, אשר באופן עקבי יוצר hepatocytes קיימא עד to1.0 ×...

בידוד תרבות ראשונית של תאים בכבד עכברוש

הליך זלוף collagenase שני שלבים שונה לבידוד של hepatocytes אדם מתואר. שיטה זו יכולה להיות מיושמת גם לכבדים של יונקים אחרים. Hepatocytes מבודד זמינים בתשואה גבוהה וכדאיות, מה שהופך אותם המודל מתאים למחקר מדעי בתחומים כגון התחדשות כבד, פרמקוקינטיקה וטוקסיקולוגיה.

בידוד של hepatocytes האנושי על ידי שני שלבים Collagenase זלוף נוהל

פציעות כבדות מלוות הרחבת תא ובתאים מייצגים אוכלוסייה הטרוגנית תא. סיווג רומן של תא הסלולר זה מאפשר הבחנה של תת מרובים. השיטה המתוארת כאן ממחישה את הזרימה cytometry ניתוח ובידוד טוהר גבוה של תת שונים שיכול לשמש מבחנים נוספים.

בידוד והעשרה של קבוצות משנה כבדים ובתאים המזוהים על ידי שילוב מרקר Surface Novel

כאן, אנו מציגים עבור בידודו של העכבר הראשי בריא ופונקציונליים hepatocytes פרוטוקול. הוראות לגילוי סינתזה של חלבון nascent הכבד על ידי המצע תיוג לא רדיואקטיבי נמסרו כדי לעזור להבין את המנגנונים שבבסיס סינתזת החלבון בהקשר של הומאוסטזיס אנרגיה-מטבוליזם בכבד.

בידוד של העכבר הראשי Hepatocytes לניתוח סינתזת חלבון Nascent בשיטה תיוג L שאינו רדיואקטיבי-azidohomoalanine

המטרה של פרוטוקול זה נועד לספק מדריך צעד אחר צעד כדי לבצע ניסויים זיהום "כבד-על-שבב" תלת-ממדי עם הנגיף הפטיטיס B.

"כבד-על-שבב" תרבויות של ראשי Hepatocytes ותאים Kupffer על זיהום בנגיף הפטיטיס B

הפטוציטים ראשוניים הם כלי רב ערך לחקר תגובת הכבד ומטבוליזם במבחנה. תוך שימוש בריאגנטים הזמינים באופן מסחרי, פותח פרוטוקול משופר ויעיל בזמן ובעבודה לבידוד הפטוציטים ראשוני של עכברים.

פרוטוקול יעיל יותר בזמן ובעבודה לבידוד הפטוציטים ראשוני של עכברים

פרוטוקול זה מפרט את השימוש בצנתר תוך ורידי מיוחד, צינורות חד פעמיים סטריליים סטנדרטיים, בקרת טמפרטורה בתוספת ניטור בזמן אמת, ומערכת אזעקה להליך זלוף קולגןאז דו-שלבי כדי לשפר את העקביות בכדאיות, בתפוקה ובפונקציונליות של הפטוציטים של חולדה ראשונית מבודדת.

בידוד של הפטוציטים ראשוניים של חולדות עם בקרת זלוף רב-פרמטרית

הפטוציטים עמוסי שומנים טבועים בהתחדשות הכבד, אך בדרך כלל הולכים לאיבוד עם צנטריפוגה הדרגתית של צפיפות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול בידוד תאים אופטימלי השומר על הפטוציטים סטאטוטיים, ומניב אוכלוסיות מייצגות של הפטוציטים מתחדשים לאחר כריתת כבד חלקית בעכברים.

בידוד של הפטוציטים מתחדשים לאחר כריתת כבד חלקית בעכברים

כאן אנו מציגים שיטה לא גנטית ליצירת ספרואידים אוטולוגיים אנושיים בכבד באמצעות תאים חד-גרעיניים שבודדו מדם היקפי במצב יציב.

ספרואידים של כבד אנושי מדם היקפי למחקרי מחלות כבד

פרוטוקול זה מציג טכניקת זילוח כבד אופטימלית של collagenase בשני שלבים במודל חולדה ומראה את השימוש בהפטוציטים מבודדים עבור תרבית ארוכת טווח במבחנה של אורגנואידים תלת-ממדיים.

זילוח כבד חולדה ובידוד הפטוציטים ראשוני: הליך ישן חיוני לתרבית אורגנואידים תלת-ממדית חדשנית

חקור שיטת בידוד תאי כבד אנושיים ותאים לא-פארנכימליים מאותו תורם באמצעות פרפוזיה וסריג צפיפות. טכניקה זו מאפשרת ייצור תרביות שכבה ומודלים הנדסתיים לחקר תפקוד כבדי ורעילות תרופות.

פרוטוקול הבידוד של hepatocytes האדם הראשי הקביל סרן אוכלוסיות של תאים בכבד ללא parenchymal

גלה סרטונים נוספים