מערכת תפוקה Organotypic גבוהה לאפיון של תרופות רגישות של תאי מיאלומה נפוצה ראשיים

המטרה הכוללת של נוהל זה היא לכמת את הרגישות הכימית של תאים ראשוניים של מיאלומה נפוצה (multiple myeloma) למערך של סוכנים כימותרפויטיים. זאת מושגים תחילה על ידי ערבוב תאי מיאלומה נפוצה, שהבודדו משאיבת מח עצם טרייה, עם סטרומה ממקור חולה שעברה תרבית מקדימה וקולגן. בשלב השני, תערובת ה-CEL נזרעה על פלטה רב-באיריות.

לאחר מכן מטפלים בתאים בחומרי כימותרפיה רלוונטיים, ומעבירים את הצלחת לאינקובטור של מיקרוסקופ בעל במה ממוטרת לצורך דימוג רצף של התאים לאורך תקופת אינקובציה של 96 שעות. בסופו של דבר, ניתן להשתמש באלגוריתם לניתוח תמונות דיגיטלי כדי להפיק עקומות חיוניות עבור כל תרופה וריכוז. היתרונות העיקריים של טכניקה זו על פני בדיקות חיוניות קיימות לנקודת סיום הם היכולת לבחון מספר חומרי כימותרפיה אל מול דגימה בודדת של מטופל, והיכולת למדוד את חיוניות תאי המטופל באופן אורך לאורך מספר ימים, ללא צורך בהפרדת התאים מהסטרומה או מהמטריקס.

ההשלכות של טכניקה זו משתרעות אל עבר הטיפול בגידולי המטופויז, שכן ניתן להשתמש בה תיאורטית כדי לחזות תגובה קלינית למשטרי כימותרפיה ספציפיים. הרעיון לפרוטוקול זה עלה אצלנו תחילה כאשר הבנו שהחלפת השקופיות מיקרופלואידיות המקוריות שלנו בלוחיות רב-בארים תפחית משמעותית את העלות ואת הזמן הדרוש להשלמת הניסוי. כדי להכין תרביות משותפות של תאי מיאלומת מרובה ראשוניים ותאי גזע מזנכימליים המופקים ממוח העצם באמצעות פיפטור רב-ערוצי, התחילו בהשעיית התאים בריכוז פי שישה מהריכוז הסופי ב-RPMI 1640.

בשלב הבא, ערבבו 50 µL מכל סוג תא עם קולגן מסוג 1 שהוכן טרי, עד לנפח סופי של 300 µL. לאחר מכן, השתמשו בפיפט רב-ערוצי כדי להעביר ידנית 8 µL מתערובת התאים והמטריקס למרכז כל באער בלוח של 384 באערים, וסובבו את הלוח בצנטריפוגה כדי לרכז את כל התאים לאותו מישור מוקד.

לאחר הסבוב, דגרו את הפלטות בתנאי תרבית תאים למשך שעה אחת כדי לאפשר לג'ל להתפלמר. לאחר מכן, הוסיפו 80 µL של מצע גידול מועשר לכל באר ודגרו את הפלטה למשך לילה כדי לאפשר לסטרומה להיצמד לתחתית הפלטה. להכנת תרביות משותפות (co cultures) של סטרומה של מיאלומה נפוצה באמצעות פיפטור רובוטי, התחילו בהשעיה של 300 µL של תאי מיאלומה נפוצה חיוביים ל-CD138 ו-300 µL של תאי סטרומה בתוך מצע RPMI 1640, בריכוז הגבוה פי שישה מהצפיפות הסופית הרצויה, כפי שהודגם כעת.

לאחר מכן, ערבבו את שני סוגי התאים יחד בשפופרת של 1.5 מיליליטר המסומנת CD 1 38 positive והניחו את השפופרת באינקובטור לתרבית תאים. בשלב הבא, השעו 60 מיקרוליטר של קו תאי המיאלומת המרובה המתאים ו-60 מיקרוליטר של תאי הסטרומה בתווך RPMI 1640, בריכוז של פי שישה מהצפיפות הסופית הרצויה, וערבבו את שני סוגי התאים יחד בשפופרת של 1.5 מיליליטר המסומנת כשפופרת שנייה cell line, והדגירו אותה גם כן בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. טענו את קובץ הסקריפט לזריעת תאים לתוך הפפטור הרובוטי.

לאחר מכן, מקם קופסת טיפים לפיפט של 200 microliter בתחנה A, פלטת מיקרוטיטר בתחנה B ופלטת 84 בארות סטרילית בתחנה E של הרובוט. לאחר מכן, ערבב את תערובת התאים החיוביים CD 1 38 עם המבחנה של מצע CD 1 38 שהוכן מראש, והעבר 1.5 milliliters של תמיסת התאים שהתקבלה לבאר מספר אחת של פלטת המיקרוטיטר.

הנח את שאר התאים על קרח והפעל את התוכנית. הרובוט יזרע את 176 הבארות הראשונות של פלטת ה-384 בארות ואז יעצור. השתמש בזמן זה כדי להעביר את שאר התאים החיוביים ל-CD 1 38 לבארה מספר שתיים של פלטת המיקרוטיטר והמשך בתוכנית.

הרובוט יזהה את 144 הבארות הנותרות בלוחית ויעצור שוב. כעת ערבבו את התאים משפחור תאי השורה עם שפחור של תמיסת מקדימה (premix) של שורת תאים שהוכנה טרייה, והעבירו את התוכן לבערה מספר שלוש בלוחית המיקרוטיטר. לאחר מכן הפעילו שוב את התוכנית, כדי לאפשר לרובוט לזרוע את 64 הבארות הנותרות בלוחית ה-3 84 well.

לאחר זריעת הבאר האחרונה, סובבו את התאים בצנטריפוגה והעבירו את תרביות השותפים (co cultures) לאינקובטור לתרביות תאים לצורך פולימריזציה של קולגן. לאחר שעה אחת, טענו את סקריפט שכבת המדיה לרובוט והניחו קופסת טיפים לפיפט של 120 µL בתחנה A, מאגר ריאגנטים עם 31 mL של מצע RPMI 1640 המועשר ב-fetal bovine serum, פלזמה של מטופל ואנטיביוטיקה בתחנה B, ואת פלטת ה-CED 3 בעלת 84 הבארים בתחנה E. לאחר מכן, הפעילו את התוכנית. הרובוט יעביר 81 µL מהמצע המועשר לכל באר.

בסיום פעולת הרובוט, החזירו את התאים לאינקובטור כדי לאפשר לסטרומה להיצמד למצע למשך הלילה. כדי לטפל בתאים שנזרעו בתרופה הרצויה, טענו תחילה את הסקריפט של פלטת התרופה לשכבת המדיה בממשק המשתמש של הפפיטטור הרובוטי. לאחר מכן, הניחו קופסת טיפים לפפיטה של 120 µL בתחנה A, מיכל עם 21 mL של RPMI 1640 מועשר ב-FPS patient plasma ואנטיביוטיקה בתחנה B, ופלטת 3 84-well ריקה בתחנה E. הפעילו את התוכנית, והפפיטטור הרובוטי יוסיף 30 µL של מדיום לכל הבארות.

לוחית 84 בארות 3. לאחר מכן, בהתאם לתבנית, יש להוסיף לכל באר בלוחית המיקרוטיטר 200 microliters של תרופה בריכוז של 20 פעמים מהריכוז המקסימלי, למעט באר הביקורת. לבאר הביקורת יש להוסיף מצע מודגש ב-FPS, פלזמה של חולה ואנטיביוטיקה.

לאחר מכן, הניחו קופסת טיפים לפיפט של 120 microliter בתחנה A, את פלטת המיקרוטיטר של התרופות בתחנה B ופלטת 3 84 בארות של מצע גידול בתחנה C, והפעילו את תוכנית טעינת פלטת התרופות. הפיפטור הרובוטי יבצע דילול סדרתי של 1 ל-3 כפי שמוצג באיור זה. כעת, הניחו קופסת טיפים רעננה לפיפט של 120 microliter בתחנה A, את פלטת ה-3 84 בארות של התרופה המדוללת בתחנה B ואת פלטת ה-3 84 בארות עם התאים הזרועים בתחנה C, והפעילו את תוכנית הוספת התרופה.

הפיפטור הרובוטי יעביר שמונה µL של תרופה מכל באר בלוח התרופות לבאר המקבילה לה בלוח התאים. לאחר טיפול בבאר האחרונה, העבר מיד את לוח התאים לאינקובטור של המיקרוסקופ הדיגיטלי. לאחר מכן, כדי לדמות את התאים, נקה את פנים האינקובטור השולחני באמצעות מגבון אלכוהול רטוב, והחלף בזהירות את מכסה הלוח במכסה של האינקובטור.

בשלב הבא, בצעו את שלבי התוכנה להוספת נקודות ציון (landmarks) עבור אזורי העניין שצולמים one after another במהלך הניסוי. לבסוף, באמצעות עדשה עם הגדלה של 5 או 10x, התאימו את המיקוד של התאים עד שתאי המיאלומה המרובה ייראו כדיסקיות בהירות המוקפות בטבעת כהה ותאי הסטרומה יהיו בקושי גלויים. בניסוי זה, תאי המיאלומה המרובה החיים נצבעו בצבע פסאודו-ירוק, כאשר בסוף הניסוי, בריכוז התרופה הגבוה ביותר שבו כל תאי המיאלומה המרובה היו מתים, נצפה אות ירוק מועט או שאינו קיים כלל בתאי הסטרומה ובתאי אנדותל של וריד טהורי)$,$

לאחר מכן, נעשה שימוש בתוכנת הרובוט כדי להתחיל במעקב אחר הירידה ההדרגתית בחיוניות הנובעת מהחשיפה לריכוזי תרופה שונים לאורך זמן. חשוב לבחון בקפידה את כל הבארים שבהן נזרעו התאים לפני תחילת תהליך הדימוי, שכן ארטיפקטים עלולים להטעות את תוכנת ניתוח התמונות ולהוביל לתוצאות שגויות. לדוגמה, כאן מוצגת תוצאה של צפיפות מוגברת של תאי סטרומה או זמן ממושך מדי בין ה-trypsinization לזריעה, אשר הובילו להיווצרות התגבשות של תאים, כפי שניתן לראות בתמונה זו.

אם שורות התאים ייזרעו בשני צפיפויות גבוהות, הן יצרו מושבות במהלך השכפול, דבר שיפחית את דיוק אלגוריתם ניתוח התמונות הדיגיטלי ככל שיהיה קשה יותר להבחין בין תא אחד למשנהו; כאן נזרעו מעט מדי תאי מיאלומה נפוצה כאשר מספר תאי המיאלומה הנפוצה שהתקבלו משאיבת מחית הגרם הוא נמוך מ-500,000. יש לקבוע את הנפח המתה (dead volume) של המבחנה שבה נעשה שימוש לפני זריעת התאים, ולכלול נפח זה בחישובי הדילול. לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו בתוך שעתיים עד שלוש שעות.

בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לשמור את המצע המעורב מראש המכיל את הקולגן על קרח כדי למנוע פולימריזציה לפני שהתאים מוכנים. הדבר סייע גם בבחינת האופן שבו ההטרוגניות של הרגישות לכימותרפיה של העומס הגידולי יכולה לקבוע את העומק והמשך התגובה של המטופל.