Name: מערכת תפוקה Organotypic גבוהה לאפיון של תרופות רגישות של תאי מיאלומה נפוצה ראשיים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: חקור שיטת מעבדה גבוהה-תפוקה לאפיון רגישות תרופות בתאי מיאלומה נפוצה ראשיים. השיטה משמרת את מיקרו-סביבת מח העצם ומאפשרת מעקב לא פולשני לאורך זמן בתאים חיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה מומן על ידי המדינה בנקהד-קולי צוות מדע גרנט של פלורידה (2BT03), המכון הלאומי לבריאות / מכון לאומי לסרטן (1R21CA164322-01) וצוות מדע גרנט של מופיט מרכז הסרטן. עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי מתקן Translational Core המחקר בח מרכז Lee Moffitt הסרטן ומכון מחקר, מרכז NCI מיועד מקיף למלחמה בסרטן (P30-CA076292). גישה לתאים ראשוניים התאפשרה באמצעות סה&quot;כ סרטן טיפול הפרוטוקול במרכז סרטן מופיט.

<ol><li>Salmon, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+differential+sensitivity+of+human-tumor+stem+cells+to+anticancer+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Quantitation of differential sensitivity of human-tumor stem cells to anticancer drugs.</a> N Engl J Med. 298, 1321-1327 (1978).</li>
<li>Suggitt, M., Bibby, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((50+years+of+preclinical+anticancer+drug+screening%3A+empirical+to+target-driven+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">50 years of preclinical anticancer drug screening: empirical to target-driven approaches.</a> Clin Cancer Res. 11, 971-981 (2005).</li>
<li>Kirshner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unique+three-dimensional+model+for+evaluating+the+impact+of+therapy+on+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A unique three-dimensional model for evaluating the impact of therapy on multiple myeloma.</a> Blood. 112, 2935-2945 (2008).</li>
<li>Durie, B. G., Jacobson, J., Barlogie, B., Crowley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnitude+of+response+with+myeloma+frontline+therapy+does+not+predict+outcome%3A+importance+of+time+to+progression+in+southwest+oncology+group+chemotherapy+trials%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Magnitude of response with myeloma frontline therapy does not predict outcome: importance of time to progression in southwest oncology group chemotherapy trials.</a> J Clin Oncol. 22, 1857-1863 (2004).</li>
<li>Harousseau, J. L., Attal, M., Avet-Loiseau, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+complete+response+in+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The role of complete response in multiple myeloma.</a> Blood. 114, 3139-3146 (2009).</li>
<li>Khin, Z. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+preclinical+assay+for+chemosensitivity+in+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A preclinical assay for chemosensitivity in multiple myeloma.</a> Cancer Res. 74, 56-67 (2014).</li>
<li>Misund, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+measurement+of+drug+sensitivity+of+myeloma+cells+co-cultured+with+bone+marrow+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">A method for measurement of drug sensitivity of myeloma cells co-cultured with bone marrow stromal cells.</a> J Biomol Screen. 18, 637-646 (2013).</li>
<li>Ramasamy, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-based+experimental+model+to+evaluate+the+concomitant+effect+of+drugs+on+the+tumour+microenvironment+and+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence-based experimental model to evaluate the concomitant effect of drugs on the tumour microenvironment and cancer cells.</a> Br J Haematol. 157, 564-579 (2012).</li>
<li>McMillin, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+cell-specific+bioluminescence+platform+to+identify+stroma-induced+changes+to+anticancer+drug+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Tumor cell-specific bioluminescence platform to identify stroma-induced changes to anticancer drug activity.</a> Nat Med. 16, 483-489 (2010).</li>
<li>Koh, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+cells+for+microscopy+using+cytospin%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Preparation of cells for microscopy using cytospin.</a> Methods Enzymol. 533, 235-240 (2013).</li>
<li>Al-Quran, S. Z., Yang, L., Magill, J. M., Braylan, R. C., Douglas-Nikitin, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+bone+marrow+plasma+cell+infiltrates+in+multiple+myeloma%3A+the+added+value+of+CD138+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Pathol%22%5BJournal%5D)">Assessment of bone marrow plasma cell infiltrates in multiple myeloma: the added value of CD138 immunohistochemistry.</a> Hum Pathol. 38, 1779-1787 (2007).</li>
<li>Najar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stromal+cells+promote+or+suppress+the+proliferation+of+T+lymphocytes+from+cord+blood+and+peripheral+blood%3A+the+importance+of+low+cell+ratio+and+role+of+interleukin-6%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stromal cells promote or suppress the proliferation of T lymphocytes from cord blood and peripheral blood: the importance of low cell ratio and role of interleukin-6.</a> Cytotherapy. 11, 570-583 (2009).</li>
<li>Scott, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+i+trialist%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Oncol%22%5BJournal%5D)">Phase i trialist.</a> Lancet Oncol. 13, 236(2012).</li>
</ol>

למחברים אין ניגוד אינטרסים לחשוף.

לסיכום, מדובר בשיטת תפוקה חזקה וגבוהה לכמת chemosensitivity של תאי MM ראשוניים ופרמקודינמיקה vivo לשעבר של תרופות בבנייה מחדש של מח העצם. השלבים הקריטיים בפרוטוקול זה הם הזריעה הנכונה של הבארות והתמקדות נאותות (ראה איור 2 לתוצאות צפויות): להבטיח שתאי MM וסטרומה הם מפוזרים באופן אחיד, שתאי סטרומה הם חסיד לתחתית הבאר, שכל MM תאים נמצאים באותו מישור המוקד, ושיש לי תאי MM ההיבט של דיסק בהיר מוקף בטבעת כהה. <p class="jove_content" style=";text-align:right;...

מטרתה של שיטה זו היא לאפיין את רגישות התרופה של מיאלומה נפוצה (MM) תאים ראשוניים לפנל של סוכנים לשעבר vivo, קרוב ככל האפשר לתנאים פיסיולוגיים, ועם דיוק די בכך שתוצאות אלה יכולים לשמש לזיהוי תת עמיד לכימותרפיה.&quot; אוכלוסיות בניטל הגידול וסופו של דבר, לparameterize מודלים חישוביים נועדו לאמוד תגובה קלינית. מודלים חישוביים הם כלים רבי עוצמה לניתוח מערכות מורכבות, כגון אינטראקציות סרטן-מארח-טיפול. עם זאת, מודלים הם רק טובים כמו הנתונים המשמשים לparameterize. למרבה הצער, רוב המידע זמין בספרות לא ניתן להשתמש בצורתה הנוכחית לparameterize מודלים כאלה, כפי שהם לעתים קרובות מתקבלים בתנאי ניסוי סותרים. כך, ניסויים חדשים נדרשים לעתים קרובות במטרה להשיג את הסט של פרמטרים ניסיוניים צורך. רוב מבחני הכדאיות, לעומת זאת, הם הרסניים והשלנו מוגבל למספר קטן של נקודות זמן, לעתים קרובות רק אחד. זה מציב מכשול באופן משמעותי את השימוש במבחני chemosensitivity לparameterize מודלים חישוביים, מאז ניסויים כאלה אינם מספקים מידע על הדינמיקה הזמנית של המערכת. זה נכון במיוחד עם תאי סרטן ראשוניים, אשר לעתים קרובות מוגבלים לכמה מיליון לדגימה, ויש תוחלת חיים קצרות לאחר ביופסיה, ובכך להגביל את מספר תנאי ניסוי זמינים. בנוסף, רוב מבחני כדאיות דורשים ההפרדה של הסרטן מהתאים שאינם סרטני (סטרומה) ​​בזמן של כימות, אשר מוסיפה עבודה נוספת לפרוטוקול, נוסף מדאיגה את התאים, ומגביל את מספר הניסויים שניתן לבצע . לפני 40 שנים, סלמון ומשתפי פעולה 1 מוצעת המפורסם שלהם בassay הקמת המושבה מבחנה להערכת chemosensitivity של תאים סרטניים. למרבה הצער assay זה מצא מעורב הצלחה בשל המספר הקטן של mye מרובהדגימות חולה לומה (MM) שהיו מסוגלים להרכיב מושבות בתנאי שליטה: הערכה היה שתת-קבוצה קטנה בלבד של 0.001% ל -0.1% מתאי MM היתה מסוגל שכפול, שכפי שכונו בתאי גזע מסוג מיאלומה נפוצה 2. זה מוגבל באופן משמעותי את שיעור ההצלחה של assay ומספר התרופות שיכולים להיבדק בפעם אחת, אפילו יותר דגמים אחרונים 3. בעיה זו היא הרבה יותר חשובה עכשיו כאשר סוכני MM (סטנדרטיים או ניסיוניים) הם רבים יותר מאשר לפני ארבעה עשורים. מגבלה עיקרית של מבחני המוקדמים אלה היא התפוקה שלהם dichotomized: או חולה הוא &quot;רגיש&quot; או &quot;עמיד&quot; לתרופה מסוימת. אין מידע מסופק בדבר מידת הרגישות וההטרוגניות של אוכלוסיית הגידול. לפיכך, חולים עם תת-אוכלוסיות קטנות של תאים עמידים בצמיחה מהירה יסווגו כ&quot; רגיש &quot;לטיפול, אבל היה להרע זמן קצר, ולכן לא בןefit מטיפול. לאור החשיבות של משך התגובה בהישרדות כוללת (OS) של חולי סרטן 4,5, ברור איך מבחני אלה לא היו מסוגלים להעריך כראוי OS באופן עקבי. כדי לעקוף מגבלות אלה, וכדי להיות מסוגלים לייצר מודלים חישוביים מטופל ספציפי שמעריכים תגובה קלינית אישית לפנל של תרופות, פיתחנו שיטה לרגישות סמים בדיקות לא הרסני של מיאלומה נפוצה שורות תאים (MM) ותאי MM עיקריים בשיקום vivo לשעבר של מייקרו-סביבת מח העצם, כוללים מטריצה ​​וסטרומה 6 תאיים. assay זה, עם זאת, היה ההגבלה להסתמך על שקופית מסוימת מסחרית microfluidic, שממדים ועלות הגביל את מספר הניסויים או תרופות שיכולים להתבצע באחת בפיסת הציוד שניתן. המערכת שתוארה כאן משתרעת assay המקורי זה לגבוה-throughput פלטפורמת organotypic מנה-תגובה, להקרנה במבחנה של תרופות, המבוססים על אלגוריתם ניתוח תמונה דיגיטלי שאינו הרסני לכמת כדאיות תא. כל טוב ב384 או 1,536 גם צלחות הוא שחזור 3D של מייקרו-סביבת מח העצם, כוללים תאים ראשוניים MM, מטריקס, וגורמי סטרומה וצמיחה המופקת מחולה. מיקרוסקופיה חי וניתוח תמונה דיגיטלי המשמשים לאיתור אירועי מוות של תאים בריכוזי תרופה שונים, המשמשים ליצירת משטחי מנה-תגובה. מהנתונים במבחנה, מודל מתמטי מזהה את הגודל וchemosensitivity של תת-אוכלוסיות בתוך נטל הגידול של המטופל, וניתן להשתמש בו כדי לדמות כיצד הגידול יגיב לתרופה (ים) בתנאים פיסיולוגיים במשטר קליני 6 ( איור 1). החידושים העיקריים של פלטפורמה זו הם: (א) מספר הקטן של תאי הסרטן הנדרשים (1,000-10,000 לconcent סמיםמנה); (ב) הערכת יעילות תרופה בתנאים פיסיולוגיים (מטריקס, סטרומה, גורמי גדילה המופק ממטופל); (ג) לא רעיל מסמני כדאיות 7 מאז רק הדמיה שדה בהירה משמש, ובכך אין צורך transfect תאים עם הקרינה 8 או 9 פליטת אור; (ד) הדמיה רציפה מספקת אפקט תרופה כפונקציה של ריכוז וחשיפת זמן (פרמקודינמיקה); ו- (ה) השילוב בין במבחנה ומודלים חישוביים אבולוציוני, להעריך את התוצאות קליניות 6 (סילבה et al., בהכנה). הגורם המרכזי המאפשר את אלגוריתם ניתוח תמונה הדיגיטלי להבחין סרטן מתאי סטרומה הוא הזיקה שונה שלהם לתחתית באר: תאי MM אינם דבקים, ויישארו בהשעיה במטריצה, ואילו תאי סטרומה לדבוק בתחתית גם ואז למתוח. הפרדה זו מתרחשת למרות שMM וסטרומהמחדש נזרע באותו הזמן, ומתרחש במהלך תהליך O / N של דגירה. הזריעה של הצלחת מסתובב למטה בצנטריפוגה הבאה נוספת מאיצה את התהליך הזה. כתוצאה מכך, תאי MM מופיעים בתמונה כדיסקים בהירים עגולים מוקפים בטבעת כהה, בעוד סטרומה שומרת על פרופיל נמוך וגוון כהה יותר (איור 2). לפיכך, assay במתכונתה הנוכחית הוא מתאים ביותר לתאי סרטן שאינו חסיד, למרות התאמות באלגוריתם יכולות להיעשות לסרטן וסטרומה נפרדים המבוססות על תכונות מורפולוגיות אחרות, כגון גודל וצורה. בפרוטוקול זה אנו מתארים שני סוגים של מטריקס (קולגן ומטריצת קרום במרתף), כמו גם שני סוגים של שיתוף תרבויות, עם BMSC (תאי גזע mesenchymal מח עצם נגזר) וHUVECs, המייצג את נישות ביניים וperivascular של מח העצם , בהתאמה. שימוש בצלחת 384 גם, 5 ריכוזים לסמים ושתי חזרות, הצלחנו TESלא עד ליום 31 בסמים שונים עם המדגם של מטופל יחיד. בצלחות 1,536 היטב מספר זה הוא 127. איור 3 מתאר את הפריסה המשמשת כיום לזריעת תאים ידנית, ואילו איור נוסף 1 מייצג את החלוקה האופטימלית באמצעות pipettor רובוטית. בעיצוב מאיור 3, כל צלחת 384 גם יכולה לשאת 3 דגימות חולה עם 7 תרופות שונות, או מדגם אחד חולה נבדקו עם 21 תרופות. כל תרופה מיוצגת על ידי 5 ריכוזים, וכל מצב הוא זורעים בכפילויות. 4 בארות שליטה (אין תרופה הוסיפה) הם זורעים לכל סט של 7 תרופות (למשל, בארות 36-39, 126-129 ו200-203). כדי להבטיח את העוצמה של התרופות המשמשות, שורת תאי מיאלומה האנושית (למשל, H929 או MM1.S) היא גם זרע, ומסומם בכפילויות בריכוז הגבוה ביותר של כל אחד מהתרופות המשמשות (בארות 76-89). הביקורת החיובית קו התא מבטיחה כי יש לי התרופות המשמשות עוצמה מספקת, שכן עקומות תגובת המינון שלהם הן AC הדומהניסויי רוס. שתי בארות הם זורעים עם שורת תאי מיאלומה כשליטה לתנאי הסביבה, במילים אחרות, כדי לזהות בעיות אפשריות בחממת הספסל העליון במהלך ההדמיה (בארות 75 ו -90). הספירה של הבארות כדלקמן דפוס זיגזג כדי לצמצם את המרחק מכוסה על ידי הבמה הממונעת של המיקרוסקופ, אשר מפחיתה את זמן רכישה ומפחיתה בלאי של הציוד.

<table><tbody><tr><td>EVOS FL AUTO</td><td>AMG</td> AMAFD1000 <td>+ AMC1000</td><td>מיקרוסקופ דיגיטלי מצויד בבמה ממונעת וחממה עליונה לספסל.</td></tr><tr><td>צלחת 384 בארות CellBind</td><td>CORNING</td><td>CLS3683 SIGMA</td><td>Corning CellBIND 384 צלחות באר 384 צלחת באר, פוליסטירן, משטח CellBIND, סטרילי, תחתית שטוחה שקופה, שחור, עם מכסה</td></tr><tr><td>1,536 צלחת באר CellBind</td><td>CORNING</td><td>CLS3832 ALDRICH</td><td>Corning 1,536 לוחות באר, בסיס נמוך, טיפול פני השטח CellBIND, סטרילי</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Plus&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>GE17-1440-02 SIGMA</td><td>לבידוד in vitro של לימפוציטים מדם היקפי אנושי.</td></tr><tr><td>חרוזים מגנטיים CD138</td><td>Miltenyi&nbsp;</td><td>130-051-301</td><td>חרוזים מגנטיים מצומדים נוגדנים לבחירת תאי CD138+.</td></tr><tr><td>עמודות LS</td><td>Miltenyi&nbsp;</td><td>&nbsp; 130-042-401</td><td>עמודה להפרדת תאים.</td></tr><tr><td>מפריד MidiMACS</td><td>Miltenyi&nbsp;</td><td>130-042-302</td><td>מגנט לעמודת הפרדה.</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6909 SIGMA</td><td>ECM ג'ל מבית Engelbreth-Holm-Swarm עכברים סרקומה</td></tr><tr><td>Getrex</td><td>Life Technologies</td><td>A1413201</td><td>מטריצת ממברנת מרתף ללא LDEV</td></tr><tr><td>HUVEC</td><td>Life Technologies</td><td>C-003-25P-B</td><td>תאי אנדותל וריד טבורי אנושי (HUVEC</td></tr>) <tr><td>RPMI-1640 מדיה</td><td>GIBCO</td><td>11875-093</td><td>RPMI 1640 בינוני + L-גלוטמין + פנול אדום</td></tr><tr><td>FBS</td> סרום בקר עוברי מופעל בחום <td>GIBCO</td><td>10082-147</td><td>, מאושר, מושבת בחום, ממקור ארה"ב</td></tr><tr><td>3.1 מ"ג/מ"ל קולגן בקר מסוג I</td><td>Advanced Biomatrix</td><td>5005-B</td><td>תמיסת קולגן בקר, סוג I, 3 מ"ג/מ"ל, 100 מ"ל</td></tr><tr><td>Precision XS</td><td>BIOTEK</td><td></td><td>PRC3841 מערכת פיפטור רובוטית</td></tr></tbody></table>

מערכת תפוקה organotypic גבוהה לאפיון של תרופות רגישות של תאי מיאלומה נפוצה ראשיים

An Organotypic High Throughput System for Characterization of Drug Sensitivity of Primary Multiple Myeloma Cells

בעבודה זו אנו מתארים גישה חדשנית המשלבת לשעבר מבחני רגישות תרופת vivo וניתוח תמונה דיגיטלי להעריך chemosensitivity וההטרוגניות של מיאלומה נפוצה תאים (MM) המופק מחולה. גישה זו מורכבת בזריעת תאי MM עיקריים חילוץ טרי מaspirates מח עצם לתאי microfluidic מיושמים בצלחות רב גם, כל אחת בהיקף של בנייה מחדש של מייקרו-סביבת מח עצם, כולל מטריקס (Matrix קולגן או קרום במרתף) וסטרומה (פונות תאי גזע המופקים mesenchymal) או תאי האנדותל אדם נגזר (HUVECs). התאים מסוממים עם סוכנים וריכוזים שונים, והם צילמו ברצף במשך 96 שעות באמצעות מיקרוסקופ שדה הבהיר, במיקרוסקופ ממונע מצוידים במצלמה דיגיטלית. תוכנת ניתוח תמונה דיגיטלית מזהה תאי חיים ומתים מנוכחות או עדר של תנועת קרום, ומייצרת עקומות של שינוי בכדאיות כo פונקציהF ריכוז תרופה וזמן חשיפה. אנו משתמשים במודל חישובים כדי לקבוע את הפרמטרים של chemosensitivity של אוכלוסיית גידול לכל תרופה, כמו גם את המספר של תת-אוכלוסיות הנוכחיות כמדד להטרוגניות גידול. מודלים מותאמי מטופל אלה לאחר מכן ניתן להשתמש כדי לדמות משטרי טיפול ולהעריך תגובה קלינית.

הזרימה של הניסוי מתוארת בקצרה באיור 1 אם כל השלבים הושלמו בהצלחה, התמונות מתקבלות על ידי מיקרוסקופ צריכה להיות שווה ערך לאיור 2:. לחיות תאי MM צריכים לראות בבירור דיסקים בהירים וכBMSCs או HUVECs צריך להיות בקושי נראה ומופץ גם ברקע. כפי שניתן לראות באיור 2 א, תאי MM טווח בגודל מ מטופל אחד למשנהו, אבל באופן כללי הם קטנים יותר משורות תאים. מאז הם כמעט לא לשכפל vivo לשעבר במרווח של הניסוי (96 שעות) הם יכולים להיות שנזרעו בריכ...

אנו מתארים בדיקת רגישות לתרופות בתפוקה גבוהה עבור תאי מיאלומה נפוצה ראשוניים. הוא מורכב משחזור של מיקרו-סביבת מח העצם (כולל מטריצה חוץ-תאית וסטרומה) בצלחות מרובות בארות, ושיטה לא פולשנית לכימות אורך של כדאיות התא.

מערכת תפוקה Organotypic גבוהה לאפיון של תרופות רגישות של תאי מיאלומה נפוצה ראשיים

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and ...

המטרה הכוללת של נוהל זה היא לכמת את הרגישות הכימית של תאים ראשוניים של מיאלומה נפוצה (multiple myeloma) למערך של סוכנים כימותרפויטיים. זאת מושגים תחילה על ידי ערבוב תאי מיאלומה נפוצה, שהבודדו משאיבת מח עצם טרייה, עם סטרומה ממקור חולה שעברה תרבית מקדימה וקולגן. בשלב השני, תערובת ה-CEL נזרעה על פלטה רב-באיריות.לאחר מכן מטפלים בתאים בחומרי כימותרפיה רלוונטיים, ומעבירים את הצלחת לאינקובטור של מיקרוסקופ בעל במה ממוטרת לצורך דימוג רצף של התאים לאורך תקופת אינקובציה של 96 שעות. בסופו של דבר, ניתן להשתמש באלגוריתם לניתוח תמונות דיגיטלי כדי להפיק עקומות חיוניות עבור כל תרופה וריכוז. היתרונות העיקריים של טכניקה זו על פני בדיקות חיוניות קיימות לנקודת סיום הם היכולת לבחון מספר חומרי כימותרפיה אל מול דגימה בודדת של מטופל, והיכולת למדוד את חיוניות תאי המטופל באופן אורך לאורך מספר ימים, ללא צורך בהפרדת התאים מהסטרומה או מהמטריקס.ההשלכות של טכניקה זו משתרעות אל עבר הטיפול בגידולי המטופויז, שכן ניתן להשתמש בה תיאורטית כדי לחזות תגובה קלינית למשטרי כימותרפיה ספציפיים. הרעיון לפרוטוקול זה עלה אצלנו תחילה כאשר הבנו שהחלפת השקופיות מיקרופלואידיות המקוריות שלנו בלוחיות רב-בארים תפחית משמעותית את העלות ואת הזמן הדרוש להשלמת הניסוי. כדי להכין תרביות משותפות של תאי מיאלומת מרובה ראשוניים ותאי גזע מזנכימליים המופקים ממוח העצם באמצעות פיפטור רב-ערוצי, התחילו בהשעיית התאים בריכוז פי שישה מהריכוז הסופי ב-RPMI 1640.בשלב הבא, ערבבו 50 µL מכל סוג תא עם קולגן מסוג 1 שהוכן טרי, עד לנפח סופי של 300 µL. לאחר מכן, השתמשו בפיפט רב-ערוצי כדי להעביר ידנית 8 µL מתערובת התאים והמטריקס למרכז כל באער בלוח של 384 באערים, וסובבו את הלוח בצנטריפוגה כדי לרכז את כל התאים לאותו מישור מוקד.לאחר הסבוב, דגרו את הפלטות בתנאי תרבית תאים למשך שעה אחת כדי לאפשר לג'ל להתפלמר. לאחר מכן, הוסיפו 80 µL של מצע גידול מועשר לכל באר ודגרו את הפלטה למשך לילה כדי לאפשר לסטרומה להיצמד לתחתית הפלטה. להכנת תרביות משותפות (co cultures) של סטרומה של מיאלומה נפוצה באמצעות פיפטור רובוטי, התחילו בהשעיה של 300 µL של תאי מיאלומה נפוצה חיוביים ל-CD138 ו-300 µL של תאי סטרומה בתוך מצע RPMI 1640, בריכוז הגבוה פי שישה מהצפיפות הסופית הרצויה, כפי שהודגם כעת.לאחר מכן, ערבבו את שני סוגי התאים יחד בשפופרת של 1.5 מיליליטר המסומנת CD 1 38 positive והניחו את השפופרת באינקובטור לתרבית תאים. בשלב הבא, השעו 60 מיקרוליטר של קו תאי המיאלומת המרובה המתאים ו-60 מיקרוליטר של תאי הסטרומה בתווך RPMI 1640, בריכוז של פי שישה מהצפיפות הסופית הרצויה, וערבבו את שני סוגי התאים יחד בשפופרת של 1.5 מיליליטר המסומנת כשפופרת שנייה cell line, והדגירו אותה גם כן בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. טענו את קובץ הסקריפט לזריעת תאים לתוך הפפטור הרובוטי.לאחר מכן, מקם קופסת טיפים לפיפט של 200 microliter בתחנה A, פלטת מיקרוטיטר בתחנה B ופלטת 84 בארות סטרילית בתחנה E של הרובוט. לאחר מכן, ערבב את תערובת התאים החיוביים CD 1 38 עם המבחנה של מצע CD 1 38 שהוכן מראש, והעבר 1.5 milliliters של תמיסת התאים שהתקבלה לבאר מספר אחת של פלטת המיקרוטיטר.הנח את שאר התאים על קרח והפעל את התוכנית. הרובוט יזרע את 176 הבארות הראשונות של פלטת ה-384 בארות ואז יעצור. השתמש בזמן זה כדי להעביר את שאר התאים החיוביים ל-CD 1 38 לבארה מספר שתיים של פלטת המיקרוטיטר והמשך בתוכנית.הרובוט יזהה את 144 הבארות הנותרות בלוחית ויעצור שוב. כעת ערבבו את התאים משפחור תאי השורה עם שפחור של תמיסת מקדימה (premix) של שורת תאים שהוכנה טרייה, והעבירו את התוכן לבערה מספר שלוש בלוחית המיקרוטיטר. לאחר מכן הפעילו שוב את התוכנית, כדי לאפשר לרובוט לזרוע את 64 הבארות הנותרות בלוחית ה-3 84 well.לאחר זריעת הבאר האחרונה, סובבו את התאים בצנטריפוגה והעבירו את תרביות השותפים (co cultures) לאינקובטור לתרביות תאים לצורך פולימריזציה של קולגן. לאחר שעה אחת, טענו את סקריפט שכבת המדיה לרובוט והניחו קופסת טיפים לפיפט של 120 µL בתחנה A, מאגר ריאגנטים עם 31 mL של מצע RPMI 1640 המועשר ב-fetal bovine serum, פלזמה של מטופל ואנטיביוטיקה בתחנה B, ואת פלטת ה-CED 3 בעלת 84 הבארים בתחנה E. לאחר מכן, הפעילו את התוכנית. הרובוט יעביר 81 µL מהמצע המועשר לכל באר.בסיום פעולת הרובוט, החזירו את התאים לאינקובטור כדי לאפשר לסטרומה להיצמד למצע למשך הלילה. כדי לטפל בתאים שנזרעו בתרופה הרצויה, טענו תחילה את הסקריפט של פלטת התרופה לשכבת המדיה בממשק המשתמש של הפפיטטור הרובוטי. לאחר מכן, הניחו קופסת טיפים לפפיטה של 120 µL בתחנה A, מיכל עם 21 mL של RPMI 1640 מועשר ב-FPS patient plasma ואנטיביוטיקה בתחנה B, ופלטת 3 84-well ריקה בתחנה E. הפעילו את התוכנית, והפפיטטור הרובוטי יוסיף 30 µL של מדיום לכל הבארות.לוחית 84 בארות 3. לאחר מכן, בהתאם לתבנית, יש להוסיף לכל באר בלוחית המיקרוטיטר 200 microliters של תרופה בריכוז של 20 פעמים מהריכוז המקסימלי, למעט באר הביקורת. לבאר הביקורת יש להוסיף מצע מודגש ב-FPS, פלזמה של חולה ואנטיביוטיקה.לאחר מכן, הניחו קופסת טיפים לפיפט של 120 microliter בתחנה A, את פלטת המיקרוטיטר של התרופות בתחנה B ופלטת 3 84 בארות של מצע גידול בתחנה C, והפעילו את תוכנית טעינת פלטת התרופות. הפיפטור הרובוטי יבצע דילול סדרתי של 1 ל-3 כפי שמוצג באיור זה. כעת, הניחו קופסת טיפים רעננה לפיפט של 120 microliter בתחנה A, את פלטת ה-3 84 בארות של התרופה המדוללת בתחנה B ואת פלטת ה-3 84 בארות עם התאים הזרועים בתחנה C, והפעילו את תוכנית הוספת התרופה.הפיפטור הרובוטי יעביר שמונה µL של תרופה מכל באר בלוח התרופות לבאר המקבילה לה בלוח התאים. לאחר טיפול בבאר האחרונה, העבר מיד את לוח התאים לאינקובטור של המיקרוסקופ הדיגיטלי. לאחר מכן, כדי לדמות את התאים, נקה את פנים האינקובטור השולחני באמצעות מגבון אלכוהול רטוב, והחלף בזהירות את מכסה הלוח במכסה של האינקובטור.בשלב הבא, בצעו את שלבי התוכנה להוספת נקודות ציון (landmarks) עבור אזורי העניין שצולמים one after another במהלך הניסוי. לבסוף, באמצעות עדשה עם הגדלה של 5 או 10x, התאימו את המיקוד של התאים עד שתאי המיאלומה המרובה ייראו כדיסקיות בהירות המוקפות בטבעת כהה ותאי הסטרומה יהיו בקושי גלויים. בניסוי זה, תאי המיאלומה המרובה החיים נצבעו בצבע פסאודו-ירוק, כאשר בסוף הניסוי, בריכוז התרופה הגבוה ביותר שבו כל תאי המיאלומה המרובה היו מתים, נצפה אות ירוק מועט או שאינו קיים כלל בתאי הסטרומה ובתאי אנדותל של וריד טהורי)$,$לאחר מכן, נעשה שימוש בתוכנת הרובוט כדי להתחיל במעקב אחר הירידה ההדרגתית בחיוניות הנובעת מהחשיפה לריכוזי תרופה שונים לאורך זמן. חשוב לבחון בקפידה את כל הבארים שבהן נזרעו התאים לפני תחילת תהליך הדימוי, שכן ארטיפקטים עלולים להטעות את תוכנת ניתוח התמונות ולהוביל לתוצאות שגויות. לדוגמה, כאן מוצגת תוצאה של צפיפות מוגברת של תאי סטרומה או זמן ממושך מדי בין ה-trypsinization לזריעה, אשר הובילו להיווצרות התגבשות של תאים, כפי שניתן לראות בתמונה זו.אם שורות התאים ייזרעו בשני צפיפויות גבוהות, הן יצרו מושבות במהלך השכפול, דבר שיפחית את דיוק אלגוריתם ניתוח התמונות הדיגיטלי ככל שיהיה קשה יותר להבחין בין תא אחד למשנהו; כאן נזרעו מעט מדי תאי מיאלומה נפוצה כאשר מספר תאי המיאלומה הנפוצה שהתקבלו משאיבת מחית הגרם הוא נמוך מ-500,000. יש לקבוע את הנפח המתה (dead volume) של המבחנה שבה נעשה שימוש לפני זריעת התאים, ולכלול נפח זה בחישובי הדילול. לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו בתוך שעתיים עד שלוש שעות.בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לשמור את המצע המעורב מראש המכיל את הקולגן על קרח כדי למנוע פולימריזציה לפני שהתאים מוכנים. הדבר סייע גם בבחינת האופן שבו ההטרוגניות של הרגישות לכימותרפיה של העומס הגידולי יכולה לקבוע את העומק והמשך התגובה של המטופל.

an-organotypic-high-throughput-system-for-characterization-drug

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

סרטון זה מדגים בדיקה החוקרת את תפקידם של תאים דמויי נויטרופילים בהגנה על תאי לימפומה מפני ציטוטוקסיות של חומרים כימותרפיים. תרבית משותפת תלת-ממדית, המורכבת מלימפומה ותאים דמויי נויטרופילים, מוקמת ונחשפת לווינקריסטין – תרופה כימותרפית. מגע ישיר עם תאים דמויי נויטרופילים גורם upregulation של חלבונים אנטי אפופטוטיים בתאי לימפומה, ובכך לקדם את הישרדותם בנוכחות vincristine.

קביעת תפקידם של תאים דמויי נויטרופילים ברגישות תאי לימפומה לתרופה ניסיונית

תאים אנושיים מסוג מיאלומה נפוצה (MM) דורשים מייקרו-הסביבה התומכת של תאי mesenchymal ורכיבי מטריצה ​​תאיים להישרדות ושגשוג. הקמנו in vivo מודל עובר עוף עם תאי מיאלומה וmesenchymal אדם engrafted ללמוד השפעות של תרופות לסרטן על צמיחת גידול, פלישה ואנגיוגנזה.

הקמת מודל xenograft מיאלומה נפוצה אדם בעוף לחקר צמיחת גידול, פלישה ואנגיוגנזה

הדוח הנוכחי מסכם פרוטוקול שניתן להשתמש בו כדי לדגמן את ההשפעה של נישת המיקרו-סביבה של מח העצם על תאים לוקמיים עם דגש על העשרת תת-האוכלוסייה העמידה ביותר לכימותרפיה.

לוקמיה עמידה דוגמנות כימותרפיה<em&gt; במבחנה</em

תפזורת ג'ין ביטוי מדידות ענן תא בודד הבדלים באוכלוסיות הטרוגניות תא. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול עבור ביטוי מפענוח ואינדקס איך החד-תאיים מיון על-ידי Florescence מופעל התא מיון (FACS) יכול להיות משולב על הטרוגניות, immunophenotypically מאפיינות אוכלוסיות תאים נפרדים מולקולרי.

הגישה קומבינטורית תא בודד כדי לאפיין את מולקולרית והטרוגניות Immunophenotypic של גזע האדם ואוכלוסיות קדמון

כאן נשתמש זוהרים, רנטגן, והדמיה פליטת פוזיטרונים טומוגרפיה/שחושב טומוגרפיה ללמוד איך מעכבים פעילות mTOR משפיעה על engrafted-מח עצם מיאלומה גידולים במודל xenograft. דבר זה מאפשר ניתוחים פיזיולוגית הרלוונטיים, לא פולשנית, והן עם מודאלים מרובים של מיאלומה נגד ההשפעה של טיפולים מיקוד engrafted מח עצם מיאלומה גידולים ויוו.

הדמיה עם מודאלים מרובים זוהרים, פליטת פוזיטרונים טומוגרפיה/חישובית טומוגרפיה של מיאלומה נפוצה מח עצם Xenografts בעכברים ליקר ביצים

אנו מציגים פרוטוקול למדידת תגובת סמים בזמן אמת בפרוסות רקמת הגידול organotypic. האסטרטגיה הניסיונית המתוארים כאן מספקת פלטפורמה לביצוע מסכי סמים בינוניים בעלי תפוקה גבוהה על פרוסות רקמה הנגזרות מגידולים קליניים או של העכבר בתנאים vivo לשעבר.

מדידת תגובת התרופה בזמן אמת בפרוסות רקמה אורגנוטימית לגידול

מערכת בדיקת תפוקה גבוהה במבחנה פותחה להערכת תרופות נגד סרטן באמצעות אורגנוידים של גידול שמקורם במטופל (PDOs), בדומה לרקמות סרטן אך אינן מתאימות למערכות במבחנה עם 96-well ו-384-well.

תפוקה גבוהה במבחנה במבחנה באמצעות organoids גידול נגזר המטופל

פרוטוקול זה מתאר הערכה מתוקננת של רגישויות לתרופות למעכבי איתות ממוקדים במודלים אורגנויד שמקורם בחולה NSCLC.

רגישות ליצירת פרופילים לטיפולים ממוקדים באורגנוידים שמקורם ב-EGFR-Mutant NSCLC

פרוטוקול זה מתאר שיטה אוטומטית למחצה לבדיקות סמים אורגנואידיות בתפוקה בינונית עד גבוהה ותוכנת ניתוח תמונה אוטומטית אגנוסטית למיקרוסקופ לכימות ולהמחשה של תגובות תרופתיות רב-פרמטריות בעלות אורגנואיד יחיד ללכידת הטרוגניות תוך-גופית.

בדיקת תרופות אורגנואידיות של גידולים רב-פרמטריים באמצעות הדמיית תאים חיים של Widefield לניתוח בתפזורת ואורגנואיד יחיד

פיתחנו גישה אונקוגנומית השוואתית חוצת מינים המשתמשת בניתוחים גנומיים ובמסכים גנומיים פונקציונליים כדי לזהות ולהשוות מטרות טיפוליות בגידולים הנובעים ממודלים של עכברים מהונדסים גנטית וסוג הגידול האנושי המתאים.

פרופיילינג גנטי וסינון נשירה בקנה מידה גנומי לזיהוי מטרות טיפוליות במודלים עכבריים של גידול ממאיר במעטפת עצב היקפית

כאן, מתוארת שיטה מבוססת ציטומטריית פוספופלואו לניתוח איתות במורד הזרם של מסלולי mTORC1, JAK/STAT5 ו-MAPK בתאי לוקמיה מיאלואידית אנושית חריפה שהושתלו בעכברים ומתקבלים מאספיראטים של מח עצם. רמות p-STAT5, p-4EBP1, p-RPS6 ו-p-ERK1/2 נמדדות בו זמנית באמצעות ציטומטר זרימה ספקטרלי מהדור הבא עם רגישות גבוהה.

ציטומטריית פוספו-פלואו תוך-תאית של השתלות קסנו-השתלות שמקורן בלוקמיה מיאלואידית חריפה

חקור שיטת מעבדה גבוהה-תפוקה לאפיון רגישות תרופות בתאי מיאלומה נפוצה ראשיים. השיטה משמרת את מיקרו-סביבת מח העצם ומאפשרת מעקב לא פולשני לאורך זמן בתאים חיים.

מערכת תפוקה Organotypic גבוהה לאפיון של תרופות רגישות של תאי מיאלומה נפוצה ראשיים

גלה סרטונים נוספים