Name: Screenable In vivo Assay עבור מיטוכונדריאלי מאפנני שימוש הטרנסגניים Bioluminescent Elegans Caenorhabditis (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 43 s
Description: למד זיהוי תרופות פוגעות במיטוכונדריה או מועילות באמצעות Caenorhabditis elegans טרנסגני עם ביולומינסנציה. שיטה זו מאפשרת סינון ספריות תרופות להערכת רמות ATP בחי אורגניזם שלם.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצים להודות לדיוויד גריי מהיחידה לגילוי תרופות בדנדי על תרומת תרכובות מעכבות לוציפראז גחליליות DDD00001434, DDD0001477, DDD00000635 ו-DDD00023047; טיבור הרקני (האוניברסיטה הרפואית של וינה) על ההצעה של אוקסלואצטט כתרכובת בדיקה; וצ'רלי דיר (אוניברסיטת אברדין) לאיורים. עבודה זו מומנה על ידי פרס BBSRC Pathfinder (BB/FOF/PF/4/11) ואוניברסיטת אברדין.

<ol><li>Lagido, C., Pettitt, J., Flett, A., Glover, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bridging+the+phenotypic+gap%3A+real-time+assessment+of+mitochondrial+function+and+metabolism+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Physiol%22%5BJournal%5D)">Bridging the phenotypic gap: real-time assessment of mitochondrial function and metabolism of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> BMC Physiol. 8, 7(2008).</li>
<li>Lagido, C., McLaggan, D., Flett, A., Pettitt, J., Glover, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+sublethal+toxicity+assessment+using+bioluminescent+Caenorhabditis+elegans%2C+a+novel+whole-animal+metabolic+biosensor%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Sci%22%5BJournal%5D)">Rapid sublethal toxicity assessment using bioluminescent Caenorhabditis elegans, a novel whole-animal metabolic biosensor.</a> Toxicol Sci. 109, 88-95 (2009).</li>
<li>McLaggan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+sublethal+levels+of+environmental+pollutants+found+in+sewage+sludge+on+a+novel+Caenorhabditis+elegans+model+biosensor%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Impact of sublethal levels of environmental pollutants found in sewage sludge on a novel Caenorhabditis elegans model biosensor.</a> PloS one. 7, e46503(2012).</li>
<li>Rodriguez-Enriquez, S., Juarez, O., Rodriguez-Zavala, J. S., Moreno-Sanchez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multisite+control+of+the+Crabtree+effect+in+ascites+hepatoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Multisite control of the Crabtree effect in ascites hepatoma cells.</a> Eur J Biochem. 268, 2512-2519 (2001).</li>
<li>Marroquin, L. D., Hynes, J., Dykens, J. A., Jamieson, J. D., Will, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circumventing+the+Crabtree+effect%3A+replacing+media+glucose+with+galactose+increases+susceptibility+of+HepG2+cells+to+mitochondrial+toxicants%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Sci%22%5BJournal%5D)">Circumventing the Crabtree effect: replacing media glucose with galactose increases susceptibility of HepG2 cells to mitochondrial toxicants.</a> Toxicol Sci. 97, 539-547 (2007).</li>
<li>Rooney, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+5%27-fluoro-2-deoxyuridine+on+mitochondrial+biology+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Gerontol%22%5BJournal%5D)">Effects of 5'-fluoro-2-deoxyuridine on mitochondrial biology in Caenorhabditis elegans.</a> Exp Gerontol. 56, 69-76 (2014).</li>
<li>Bodhicharla, R., Ryde, I. T., Prasad, G. L., Meyer, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tobacco-specific+nitrosamine+4-%28methylnitrosamino%29-1-%283-pyridyl%29-1-butanone+%28NNK%29+induces+mitochondrial+and+nuclear+DNA+damage+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Mol+Mutagen%22%5BJournal%5D)">The tobacco-specific nitrosamine 4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone (NNK) induces mitochondrial and nuclear DNA damage in Caenorhabditis elegans.</a> Environ Mol Mutagen. 55, 43-50 (2014).</li>
<li>Leung, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+early+life+exposure+to+ultraviolet+C+radiation+on+mitochondrial+DNA+content%2C+transcription%2C+ATP+production%2C+and+oxygen+consumption+in+developing+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Pharmacol+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Effects of early life exposure to ultraviolet C radiation on mitochondrial DNA content, transcription, ATP production, and oxygen consumption in developing Caenorhabditis elegans.</a> BMC Pharmacol Toxicol. 14, 9(2013).</li>
<li>Kuang, J. J., Ebert, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+failure+to+extend+lifespan+via+disruption+of+complex+II+is+linked+to+preservation+of+dynamic+control+of+energy+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">The failure to extend lifespan via disruption of complex II is linked to preservation of dynamic control of energy metabolism.</a> Mitochondrion. 12, 280-287 (2012).</li>
<li>Lagido, C., Pettitt, J., Porter, A. J., Paton, G. I., Glover, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+application+of+bioluminescent+Caenorhabditis+elegans+as+multicellular+eukaryotic+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Development and application of bioluminescent Caenorhabditis elegans as multicellular eukaryotic biosensors.</a> FEBS Lett. 493, 36-39 (2001).</li>
<li>Lewis, J. A., Fleming, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+culture+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Basic culture methods.</a> Methods Cell Biol. 48, 3-29 (1995).</li>
<li>Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStiernagle%2C+T+%22WormBook%22">WormBook</a>. , 1-11 (2006).</li>
<li>Brenk, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lessons+learnt+from+assembling+screening+libraries+for+drug+discovery+for+neglected+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22ChemMedChem%22%5BJournal%5D)">Lessons learnt from assembling screening libraries for drug discovery for neglected diseases.</a> ChemMedChem. 3, 435-444 (2008).</li>
<li>Lagido, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLagido%2C+C+%22Nematodes+as+environmental+indicators%22">Nematodes as environmental indicators</a>. Wilson, M. J., Kakouli-Duarte, T. , CABI. 225-251 (2009).</li>
<li>Thorne, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Firefly+luciferase+in+chemical+biology%3A+a+compendium+of+inhibitors%2C+mechanistic+evaluation+of+chemotypes%2C+and+suggested+use+as+a+reporter%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Firefly luciferase in chemical biology: a compendium of inhibitors, mechanistic evaluation of chemotypes, and suggested use as a reporter.</a> Chem Biol. 19, 1060-1072 (2012).</li>
<li>Houtkooper, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitonuclear+protein+imbalance+as+a+conserved+longevity+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mitonuclear protein imbalance as a conserved longevity mechanism.</a> Nature. 497, 451-457 (2013).</li>
<li>Andreux, P. A., Houtkooper, R. H., Auwerx, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+approaches+to+restore+mitochondrial+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Pharmacological approaches to restore mitochondrial function.</a> Nat Rev Drug Discov. 12, 465-483 (2013).</li>
<li>Tsang, W. Y., Lemire, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+genome+content+is+regulated+during+nematode+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Bioph+Res+Co%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial genome content is regulated during nematode development.</a> Biochem Bioph Res Co. 291, 8-16 (2002).</li>
<li>Decuyper, C., Vanfleteren, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen-Consumption+during+Development+and+Aging+of+the+Nematode+Caenorhabditis-Elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Biochem+Phys+A%22%5BJournal%5D)">Oxygen-Consumption during Development and Aging of the Nematode Caenorhabditis-Elegans.</a> Comp Biochem Phys A. 73, 283-289 (1982).</li>
<li>Dillin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rates+of+behavior+and+aging+specified+by+mitochondrial+function+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Rates of behavior and aging specified by mitochondrial function during development.</a> Science. 298, 2398-2401 (2002).</li>
<li>Zheng, S. Q., Ding, A. J., Li, G. P., Wu, G. S., Luo, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+absorption+efficiency+in+Caenorhbditis+elegans+delivered+by+different+methods%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Drug absorption efficiency in Caenorhbditis elegans delivered by different methods.</a> PloS one. 8, e56877(2013).</li>
<li>Yochem, J., Gu, T., Han, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+marker+for+mosaic+analysis+in+Caenorhabditis+elegans+indicates+a+fusion+between+hyp6+and+hyp7%2C+two+major+components+of+the+hypodermis%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A new marker for mosaic analysis in Caenorhabditis elegans indicates a fusion between hyp6 and hyp7, two major components of the hypodermis.</a> Genetics. 149, 1323-1334 (1998).</li>
<li>Vanfleteren, J. R., DeVreese, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rate+of+aerobic+metabolism+and+superoxide+production+rate+potential+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Zool%22%5BJournal%5D)">Rate of aerobic metabolism and superoxide production rate potential in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> J Exp Zool. 274, 93-100 (1996).</li>
<li>Garigan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+tissue+aging+in+Caenorhabditis+elegans%3A+a+role+for+heat-shock+factor+and+bacterial+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of tissue aging in Caenorhabditis elegans: a role for heat-shock factor and bacterial proliferation.</a> Genetics. 161, 1101-1112 (2002).</li>
<li>Davies, S. K., Leroi, A. M., Bundy, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorodeoxyuridine+affects+the+identification+of+metabolic+responses+to+daf-2+status+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">Fluorodeoxyuridine affects the identification of metabolic responses to daf-2 status in Caenorhabditis elegans.</a> Mech Ageing Dev. 133, 46-49 (2012).</li>
<li>Partridge, F. A., Tearle, A. W., Gravato-Nobre, M. J., Schafer, W. R., Hodgkin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+C.+elegans+glycosyltransferase+BUS-8+has+two+distinct+and+essential+roles+in+epidermal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The C. elegans glycosyltransferase BUS-8 has two distinct and essential roles in epidermal morphogenesis.</a> Dev Biol. 317, 549-559 (2008).</li>
<li>Castro, P. V., Khare, S., Young, B. D., Clarke, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+Battling+Starvation+Stress%3A+Low+Levels+of+Ethanol+Prolong+Lifespan+in+L1+Larvae%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans Battling Starvation Stress: Low Levels of Ethanol Prolong Lifespan in L1 Larvae.</a> PloS one. 7, (2012).</li>
<li>Baugh, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((To+Grow+or+Not+to+Grow%3A+Nutritional+Control+of+Development+During+Caenorhabditis+elegans+L1+Arrest%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">To Grow or Not to Grow: Nutritional Control of Development During Caenorhabditis elegans L1 Arrest.</a> Genetics. 194, 539-555 (2013).</li>
<li>Baugh, L. R., DeModena, J., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+Pol+II+Accumulates+at+Promoters+of+Growth+Genes+During+Developmental+Arrest%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA Pol II Accumulates at Promoters of Growth Genes During Developmental Arrest.</a> Science. 324, 92-94 (2009).</li>
<li>Maxwell, C. S., Antoshechkin, I., Kurhanewicz, N., Belsky, J. A., Baugh, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutritional+control+of+mRNA+isoform+expression+during+developmental+arrest+and+recovery+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Nutritional control of mRNA isoform expression during developmental arrest and recovery in C. elegans.</a> Genome Res. 22, 1920-1929 (2012).</li>
<li>Cressman, C. P., Williams, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reference+toxicants+for+toxicity+testing+using+Caenorhabditis+elegans+in+aquatic+media%5BTitle%5D)+AND+%22Am+Soc+Test+Mater%22%5BJournal%5D)">Reference toxicants for toxicity testing using Caenorhabditis elegans in aquatic media.</a> Am Soc Test Mater. 131, 518-532 (1997).</li>
<li>Khanna, N., Cressman, C. P., Tatara, C. P., Williams, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tolerance+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans+to+pH%2C+salinity%2C+and+hardness+in+aquatic+media%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Environ+Con+Tox%22%5BJournal%5D)">Tolerance of the nematode Caenorhabditis elegans to pH, salinity, and hardness in aquatic media.</a> Arch Environ Con Tox. 32, 110-114 (1997).</li>
<li>Benedetti, C., Haynes, C. M., Yang, Y., Harding, H. P., Ron, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin-like+protein+5+positively+regulates+chaperone+gene+expression+in+the+mitochondrial+unfolded+protein+response%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin-like protein 5 positively regulates chaperone gene expression in the mitochondrial unfolded protein response.</a> Genetics. 174, 229-239 (2006).</li>
<li>Yang, W., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Mitochondrial+Superoxide+Signal+Triggers+Increased+Longevity+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+Biol%22%5BJournal%5D)">A Mitochondrial Superoxide Signal Triggers Increased Longevity in Caenorhabditis elegans.</a> Plos Biol. 8, (2010).</li>
</ol>

יש המחברים אין לחשוף

אורגניזם המודל C. elegans מספק מערכת ניסיונית חזקה. זה קל לתרבות ומייצר צאצאים זהים גנטי בשפע עם מחזור חיים 3.5 יום מביצה ללהתרבות מבוגר (דרך שלבי זחל לנוער L1 עד L4). בשל גודלו הקטן, זה יכול להיות מבוגר בנוחות ב96-גם צלחות, להקל הקרנת מתחם. אנו מציגים פרוטוקול הקרנה פנוטיפי המבוסס על זנים של ג elegans הפועלים כin vivo חיישנים של רמות אנרגיה. 14 הפרוטוקול ישים לכל מעבדה, אם כי נדרש luminometer צלחת 96-היטב וקבינט סטרילי. זה חשוב כדי למנוע זיהום במבחנים על ידי שימוש בטכניקת מעבדה טובה. אם עובד באופן ידני, את המספר המרבי של צלחות נמטודות השגה הוא 13 לכל ניסוי המאפשר בדיקה של 2x צלחות תרופת 96-היטב וכולל שתי צלחות רכב. נציגי תוצאות מוצגות למורכבת המיטוכונדריה אני מעכב rotenonדואר, גנרטור paraquat סופראוקסיד, oxaloacetate ביניים מחזור חומצת לימון וארבע תרכובות עם פעילות מעכבת גחלילית בלוציפראז ידועה. שתי התרכובות הראשונות הובילו לירידה בפליטת אור כפי שחזו ואילו oxaloacetate הוביל לשיפור, עשוי לנבוע מדור גדול יותר של ה- ATP. ערכות נתונים oxaloacetate גם להדגים את השונות המהותיות בניסויים מבוססים על לוציפראז גחלילית ככתב. מינימום של שלושה ניסויים בלתי תלויים הם מומלץ לוודא חוסן של תגובות לתרכובות בלתי ידועות. העיכוב של פעילות לוציפראז גחלילית היה מזוהה עם assay במבחנה באמצעות ערכה מסחרית. 3 אחד המתחמים הביאו לעלייה משמעותית בקרינת GFP בקנה אחד עם מעכב הגדלת הרמות של גחלילית בלוציפראז באמצעות קשירת האנזים של לוציפראז פעיל מתויג GFP אתר, והופך אותו ליותר יציב. 15 במקרים מסוימים(לא במקרה הספציפי הזה) זה יכול להוביל לרמות גבוהות של פליטת אור כאשר המעכב שנעקר על ידי מצע עודף. 15 הוא, לכן, חשוב שלא לפרש את התוצאות בטעות מתרכובות שאינטראקציה עם אנזים הגחלילית כירידה או עליית רמות ה- ATP / פונקציה של המיטוכונדריה. שינויים באות הארה לעתים קרובות למדי לתאם עם מדידות נוספות של בריאות כגון תנועה, התפתחות וצמיחה. כדוגמא, מתחם הוא מעכב לוציפראז חשוד אם ירידה דרמטית באות פליטת אור מזוהה אך תולעים הם נבדלים מבקרות על ידי תצפית מיקרוסקופית. עלייה בקרינת GFP, לא מוסברת על ידי גידול או autofluorescence מתחם, יכולה גם להצביע על מעכב. מספר מעכבי לוציפראז 15 ידוע וכבר נכנס לPubChem. לכן במקרה הראשון, זה תרגול טוב להתייעץ מידע על מעכבי לוציפראז מוחזקים על ידי PubChem; אחרי testing של השפעות המתחם במבחני חוץ גופייה עם האנזים המטוהר 3 ו / או אישור של השפעות על תפקוד המיטוכונדריה ידי אמצעים נוספים. 16,17 מדידות הקרינה GFP מאפשרות זיהוי של רמות לוציפראז גחלילית (וזיהוי הפוטנציאל של כמה מעכבי אנזים בלוציפראז כפי שפורט לעיל) מה שהופך את מקרה חזק למדידת נקודת קצה זו לצד פליטת אור במידת האפשר. נורמליזציה של קריאות פליטת אור לGFP היא גם אמצעי לטיפול חשבונאי בשינויים במספרי תולעת בין בארות (אם כי זה יכול גם להיות מושגת על ידי הכללה של משכפל טכני מרובה). לרגישות רבה יותר, חשוב להפחית הקרינה רקע מקריאות. הפרוטוקול מעריך את התרומה של ההשעיה החיידקים לקרינת הרקע, לעומת זאת autofluorescence נמטודות לא היווה (הגבלה של assay הנוכחי, קריטית במיוחד לכל סטו הזדקנותבהתחשב בכך שמת עליות autofluorescence נמטודות עם גיל). גם autofluorescence של תרכובות מבחן צריך להיות מוערך במקביל. הנורמליזציה GFP הייתה נראית הכרחית שבו חוקרים מבקשים להתאים את הפרוטוקול כדי להשוות בריכות ATP סלולריות במוטציות גנטיות שונות או אחרי ההשתקה של גנים שונים, במטרה לשלוט על כל הבדלי מתח ברמת הביטוי של transgene פליטת אור. פרמטרים קריטיים בפרוטוקול כוללים את השלב ההתפתחותי שבו חשיפה היא יזם, אורך החשיפה, וקבלת מספרים דומים של נמטודות בבארות שונות. חשיפה יכולה להתחיל בכל שלב של התפתחות של נמטודות, אולם שלב L3 ומעלה עדיפה. משלב זה והלאה, נמטודות תלויה בזרחון חמצוני לפיתוח לבגרות, כפי שמעיד גידול מאוד משמעותי בתוכן mtDNA, צריכת חמצן ורמות ה- ATP. 18,19,20 הפרוטוקול הנוכחי יוזם ירידייור בשלב L4. הסיבה לaliquoting נמטודות ל96-גם צלחות רק בשלב זה (ולא כאשר הם סיפקו ראשון עם מזון בשלב L1), היא שלמרות צלחות מונחות בתאים לחים כדי למזער אידוי, מידת האידוי עדיין מתרחשת ב החממה שלנו רועד, נראית כטיפין קטנות מאוד להרכיב על העפעפיים (זה לא יכול להיות בעיה עם חממות רועדות אחרות). על ידי aliquoting נמטודות לצלחות ממש לפני התוספת של תקני סמים, ריכוז התרופה בפועל אינו מושפע מכל וריאציה קטנה בנפח בשל התאדות. טעינת צלחת נמטודות עם רכב היחיד היא שימושית כדי לבדוק שנמטודות חולקו באופן שווה בין בארות. כל הבדלים מובהקים לרכב רק צלחת יהיו מעידים על טכניקה לקויה מחלק נמטודות לבארות. אורך החשיפה הוא גורם חשוב לשקול. אם השפעות על מצב אנרגיה באופן עצמאי של צמיחה של עניין, פרוtocol יכול להיות שונה כדי להתאים חשיפות קצרות יותר (מתגובות כמעט מיידיות ל, למשל, 2 שעות). מצד השני, כניסה של תרכובות לג רקמות elegans עשויות לקחת קצת זמן. לדוגמא נדרשות 12-24 שעות כדי להשיג ריכוזים פנימיים מרביים של רזברטרול ו5-fluoro-2&#39;-deoxyuridine (FUDR). 21 לכן, חשיפה ארוכה יותר (18 עד 24 שעות) עשויות להיות מוצדקות על מנת למקסם את רמות חשיפה. זמן החשיפה צריך להיות מוגבל לפעמים שאינם מאפשרים רמות משמעותיות של רבייה להתקיים בבאר. אנו ממליצים שהזמן התפתחותי הכולל של נמטודות נשמר תחת 66-67 שעות. למרות נוח, נמטודות הם מעוברת עד אז ויזמה egglaying. עם זאת מצאנו קריאות פליטת אור מהכנות ביצה להיות זניח (לא מוצג). ביטוי transgene מונע sur-5 האמרגן מזוהה ראשון רק 01:58 שעות וחצי לאחר הפריה בשלב 100 התא 22 וגקליפת הביצה hitinous עשויה להגביל כניסה של luciferin. אחרים מצאו כי ביצי embryonated לא תרמו באופן משמעותי לחילוף החומרים של מבוגרים הרה להולדת. 23 עם זאת, תנאים המאפשרים ייצור צאצאים משמעותי יש להימנע. אם העדיף, לוח הזמנים הניסיוניים יכול להיות מוזזים לאחור: יש לנו יזמנו בעבר חשיפה לרעלן סביבתי בשלב (36 שעות) הזחל מאוחר L3 וביצעו מדידות פליטת אור וGFP ב 55 שעות 2 רקעים לחלופין, גנטיים שתנאים סטריליים. יכול לשמש כדי למנוע ייצור צאצאים, כמו למשל FER-15 (B16) השני; FEM-1 מוטציה כפולה IV (hc17) אשר יכול להישמר על 15 מעלות צלזיוס, אך הוא סטרילי בC ° 25. 24 השימוש בFUDR לגרום לעקרות אינו מומלץ כמו זה יכול בעצמו משפיע על חילוף חומרים נמטודות. 25 assay יכול גם להתבצע בזנים עם העור הקרני חדיר יותר כגון פסד של funct החלקייון אוטובוס-8 מוטציות שהם multidrug רגיש בשל להגדיל חדירות של תרופות. 26 זה יקלו חשיפות וריכוזים נמוכים מתחם קצרים יותר. התנאים להוספת luciferin לנמטודות אלה עשויים גם צריכים התאמה כלומר, 1% DMSO ו0.05% Triton-X100 במאגר הארה לא ייתכן שיידרשו כדי לשפר את זמינות luciferin. הפרוטוקול משתמש 1% DMSO כרכב למסירת מתחם. למרות שאינו קטלני, ריכוז זה של DMSO יש כמה תופעות ביולוגיות כפי שכבר דנו בפרסום קודם. 3 רבים של ספריות תרופה הזמינות ערוכים 100% DMSO, בריכוזים שיהיו מתאימים למבחנים מבוססי תאים לאחר הדילול של רכב 0.1%. ריכוזים גבוהים יותר מתחם נדרשים לעורר תגובות בג elegans בהשוואה לתאים אנושיים, כך שלעתים קרובות לא ניתן לערוך מבחני בנמוכים מ 1% DMSO. שוב, השימוש בזנים עםיותר העור הקרני חדיר עלול להוביל לבדיקה עם ריכוזים נמוכים של רכב. ריכוזים של% גבוהים יותר מאשר 1 DMSO אינם מומלצים. זמן דגירה סט עם luciferin לקראת קריאה צריך להיות דבק. כפי שניתן לראות בעבר, הארה מגיעה לרמות המרביות שלה בתוך דקות השניה לאחר הוספת luciferin, שנותר יציב יחסית ל5 דקות הראשונות, ואחריו ירידה הדרגתית איטית בהארה על 30 דקות הבאות 1. יכולים להתבצע תגובות הקינטית לכימי מסוים בשלב ראשוני זה של 30 דקות אחרי מחלק ראשוני של luciferin. הפרוטוקול כרוך צעד רעב הבא אוסף של ביצים כדי להשיג סנכרון של אוכלוסיית נמטודות. אנו ממליצים סנכרון של אוכלוסיות מבחן נמטודות מאז שלבי התפתחות שונים נבדלים ברמות ה- ATP סלולריות ועשויים להגיב באופן שונה לתרכובות הבדיקה. על ידי ביצוע הרעב במלא Sבינוני בניגוד לM9, נמטודות הבקיעה מסופקות עם מקור פחמן (אתנול), כך זחלים שלא לפתח אך לא מורעבות לחלוטין. 27,28 זה גם הוכח שנעצר L1 של דרוכים לתגובה מהירה למזון ו שיעור L1 נורמלי צמיחה מושגת בתוך 3 שעות לאחר אוכל הופך להיות זמין. 29 עם זאת, האפשרות שצעד הרעב עשוי לשנות את חילוף החומרים של ג לא ניתן לשלול elegans. 30 מסיבה זו באורך של רעב לא יעלה על 24 שעות (18 שעות מספיקות לסנכרון). ייתכן שיש לי מעבדות מסוימות את האפשרות של שימוש Biosorter קופאס לסנכרון גיל עוקף את צעד הרעב לגמרי. ייתכן שיש לי מעבדות אחרות העדפה להרחבת אוכלוסיית נמטודות על תקשורת מוצקה (צלחות NGM עם OP50) לפני ההלבנה (שלב 3.1) וזה יעבוד היטב גם. אנו משתמשים במדיום S במהלך חשיפת מתחם כמדיום סטנדרטי עבור culturing נמטודות, however תקשורת אחרת ניתן לבחור, למשל בינוני K או די מים קשים EPA משמש לעתים קרובות ללימודי ecotoxicological. 31,32 הפרוטוקול מספק אמצעי לסינון ולזהות מועמדים לבדיקות נוספות במונחים של ההשפעות על תפקוד המיטוכונדריה. בשלב הסינון ראשוני סביר להניח כי כמה תרכובות יהיו כבר החמיצו בשל נבדק רק אחד ריכוז, לכן מסכי תרופה לא צריכים להיחשב ממצה. יכולים להיות מאומתים על ידי להיטי השימוש בטכניקות להערכת היבטים שונים של תפקוד המיטוכונדריה לצריכת חמצן דוגמא, ג elegans זנים עם מיטוכונדריה GFP להביע, כתמים לפוטנציאל קרום המיטוכונדריה ו / או מדידות ROS. 16,33,34 המשמעות הגדולה ביותר של המתודולוגיה היא להיות אמצעי לסינון מספר רב של תרכובות ו / או תנאים ברמת האורגניזם רב-תאית, וחשוב מכך כדי להיות מסוגל לנצל את הנְהִילוּת הגנטית דואר של ג elegans לחקור מנגנוני פעולה. הטכניקה עשויה לעזור להאיץ ולמצוא נתיבים חדשים לגילוי של תרכובות ויעדים מעניינים. זה שחזה כי השילוב של החיישן עם רקע גנטי הקשורים למחלות בבני אדם להקרנה של ספריות מתחם בהקשר רלוונטי מחלה יש הרבה מה להציע.

המטרה הכוללת של הליך זה היא הכימות המהיר של מצב האנרגיה של ג elegans in vivo עם נוף לשימוש זה כנקודת סיום בהקרנת מתחם. הרציונל מבוסס על הביטוי המהונדס של לוציפראז הגחלילית בג נמטודות elegans 1-3 באמצעות פלסמיד (1 pSLGCV <a href="https://www.addgene.org/49862" target="_blank">https://www.addgene.org/49862).</a> האנזים בלוציפראז הוא התמזגו לGFP חלבון פלואורסצנטי הירוק ובא לידי ביטוי בכל מקום וconstitutively בציטופלסמה (peroxisome לוציפראז מיקוד אות הוסר). זה מוביל לפליטת אור כאשר luciferin המצע מסופק אקסוגני. כתולעת היא שקופה, אור ניתן למדוד בluminometer כיחידות יחסי אור (RLU). דלקי ATP סלולריים תגובת פליטת אור וזמינותו קובעים את רמות האור מיוצרות. כתוצאה מכך, luminometry מציע convenienלא אומר להערכת רמות ה- ATP היחסית ועל ידי פונקציה של המיטוכונדריה הרחבה, מאז ייצור ATP מתרחש בעיקר במיטוכונדריה. קשר בין רמות תפקוד ופליטת האור של המיטוכונדריה כבר הוכיח בעבר באמצעות ההשתקה של גני המיטוכונדריה הובלת אלקטרונים שרשרת ונלווית תפוקת אור מופחתת. 1 זני פליטת אור שנוצרו היו מיועדים PE254 (feIs4) ו PE255 (feIs5) 1 (ראה רשימת חומרים) וניתן להשתמש בם לסירוגין. 3 מספר המחקרים מנוצל זני חיישן אלה לדווח על רמות ה- ATP הסלולריות in vivo לאחר חשיפה לכימיקלים xenobiotic שונים כגון אזיד הנתרן 1, 2 קדמיום, ביוב בוצת תמצית 3, 5&#39;-fluoro-2-deoxyuridine 6, וnitrosamine טבק ספציפי 7. גם הזנים היו שימושיים כדי לפקח על השפעות של חשיפה לקרינת אולטרה סגולה C <sעד&gt; 8 ואת ההשפעות של שיבוש תפקוד שרשרת הנשימה במיטוכונדריה. 1.9 גרסה מוקדמת של חיישן הארה המבטא את הגן בלוציפראז ללא היתוך GFP (PE39) שימשו גם בחקירת השפעות של מתכות כבדות ושל דרכי הנשימה . Uncoupler 10 זני PE254 וPE255 לשאת לוציפראז: הקרינה היתוך וGFP GFP הוצגה להגדיל באופן יחסי עם מסת נמטודות, מציע אמצעי נוח לנורמליזציה של ערכי הארה 6,9 ההשפעות של סכום ההפרש של תולעים בכל טוב יכולות להיות גם. נלקח בחשבון על ידי כולל משכפל טכני מרובה בassay (מינימום של 5 בארות לכל מצב). 3 הפרוטוקול מציע את האפשרות של ניטור vivo של רמות אנרגיה (בניגוד ליותר מבחינה טכנית מייגע במבחנה קביעות ATP) מאפשר הקרנת מתחם ולמקם מחדש בהקשר הפיזיולוגי של כל muהאורגניזם lticellular. ההליך יכול להתארך למגוון של רקע גנטי על ידי חציית transgene המשולב chromosomally לזנים מוטנטים זמינים ו / או על ידי השתקת גנים על ידי התערבות RNA; כך, תוך ניצול מלא של ג elegans כאורגניזם מודל. השיטה אמורה לעזור להפחית כישלון בשלב מאוחר של מועמדי סמים בשל רעילות המיטוכונדריה ולתרום תרומה לצמצום ניסויים בבעלי חיים גבוהים יותר.

<table><tbody><tr><td>Orion II Microplate Luminometer</td> מערכות <td></td><td>גילוי Berthold</td><td>עם מזרק ותוכנת Simplicity 4.2; העברת נתונים לאקסל בתום מדידת הלוחות</td></tr><tr><td>פלואורמטר FLx800&nbsp;</td><td>Biotek</td><td></td><td>עם תוכנת Gen5; העברת נתונים לאקסל בתום מדידת הצלחת</td></tr><tr><td>Ks 130 פלטפורמת טלטול בסיסית</td><td>Ika</td><td>#0002980000</td><td></td></tr><tr><td>Innova 4349</td> New <td>Brunswick Scientific</td><td></td><td>שייקר חממה בקירור</td></tr><tr><td>צנטריפוגה אפנדורף 5804R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>עם רוטור אפנדורף A-4-44&nbsp; (עבור 50/15 ו-#160; שפופרות מ"ל)</td></tr><tr><td>Stripette, Costar</td><td>Corning</td><td>#4489</td><td>פיפטה סרולוגית</td></tr><tr><td>Cellstar 50 מ"ל שפופרות</td><td>Greiner bio-one</td><td>#227661</td><td></td></tr><tr><td>שפופרות Cellstar 15 מ"ל</td><td>Greiner bio-one</td><td>#188261</td><td></td></tr><tr><td>Cellstar 60 מ"מ צלחות תרבית רקמות&nbsp;</td><td>Greiner bio-one</td><td>#628160</td><td></td></tr><tr><td>שקופיות מיקרוסקופ סופרפרוסט</td><td>VWR</td><td>#631-0909</td><td></td></tr><tr><td>מרית סטרילית</td><td>Corning</td><td>#3007; #3004</td><td>לשקילת כימיקלים</td></tr><tr><td>0.22 מ"מ מסנני Millex GP Millipore</td><td></td><td>#SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>צינורות Axygen eppendorf 1.5 מ"ל</td><td>Fisher Scientific</td><td>#MCT-150-R</td><td></td></tr><tr><td>Corning 96 צלחת בדיקת באר</td><td>VWR</td><td>#3603</td><td>צלחת שחורה תחתית שקופה עם מכסה</td></tr><tr><td>Nunc 96 צלחת בדיקה היטב</td><td>Fisher Scientific</td><td>#236105</td><td>צלחת לבנה עם מכסה</td></tr><tr><td>מגיב מאגר 60 מ"ל</td><td>Thermo Scientific Finnpipette</td><td>#9510027</td><td>משמש כשוקת לנמטודות בסעיף פרוטוקול 4.4.1</td></tr><tr><td>קופסת אחסון/דamp תא</td><td>Roche Diagnostics</td><td>#10 800 058 001</td><td>174 x 101 x 56.6 מ"מ, משמש כתא לח עם מגבות נייר רטובות; 2x צלחות של 96 בארות עם מכסים יכולות להתאים לאחת, התחתונה יושבת על גבי מכסה מיקרופלייט</td></tr><tr><td>אקונומיקה: תמיסת נתרן היפוכלוריט 4-4.99% תכולת כלור</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>#239305</td><td>אחסן במחירים 4&#160; &deg; ג,&nbsp; אטום עם Parafilm למניעת אובדן כלור וכיסוי בנייר כסף</td></tr><tr><td>D-Luciferin, מלח אשלגן</td><td>Biotium Inc</td><td># 10101-2</td><td>בדיקות מולקולריות יכולות לשמש גם כספק; הכינו מלאי של 20 מ"מ ב-ddH2O, שמרו על -20 מעלות; C in aliquots</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td># P9416</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>CalBiochem</td><td>#317275</td><td>טוהר 99.99%</td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Alfa Aesar</td><td>#A16046</td><td>דילוט ל-10% ב-ddH2O</td></tr><tr><td>Nystatin</td><td>CalBiochem</td><td>#475914</td><td></td></tr><tr><td>C. elegans זנים ביו-לומינסנטים</td><td>המעבדה של המחבר</td><td>עצמו PE254, PE255</td><td>מכילה מערכים משולבים feIs4 ו-feIs5 [Psur-5::luc+::gfp; rol-6(su1006)] בהתאמה על כרומוזום V ו-X; בחר לביטוי הומוגני וחזק של luc::GFP על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית (למשל בחר 15 תולעים) מדי פעם.</td></tr><tr><td>E. coli OP50</td><td>CGC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>כימיקלים כלליים</td><td>סיגמא אולדריץ'/פישר סיינטיפיק</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

screenable<em&gt; in vivo</em&gt; assay עבור מיטוכונדריאלי מאפנני שימוש הטרנסגניים bioluminescent<em&gt; elegans caenorhabditis</em

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

אורגניזם המודל הרב-תאי Caenorhabditis elegans הוא נמטודה קטנה בגודל של כ-1 מ"מ בבגרות. הוא חסכוני וקל לתרבית ולחלוקה במדיום נוזלי מה שהופך אותו למתאים היטב להקרנה בתפוקה בינונית. אימתנו בעבר את השימוש בלוציפראז טרנסגני המבטא זני C. elegans כדי לספק הערכה מהירה in vivo של רמות ה-ATP של הנמטודה. 1-3 כאן אנו מציגים את החומרים וההליך הנדרשים לביצוע בדיקות ביולוגיות עם הזנים הביולוגיים C. elegans PE254 או PE255 (או כל אחד מהזנים הנגזרים שלהם). הפרוטוקול מאפשר זיהוי in vivo של השפעות תת-קטלניות של תרופות שעשויות לזהות רעילות מיטוכונדריאלית, כמו גם זיהוי in vivo של השפעות תרופתיות מועילות פוטנציאליות. תוצאות מייצגות מסופקות עבור הכימיקלים פרקווט, רוטנון, אוקסלואצטט ועבור ארבע תרכובות מעכבות לוציפראז גחליליות. ניתן להרחיב את המתודולוגיה כדי לספק פלטפורמה לסינון ספריות תרופות עבור תרכובות המסוגלות לווסת את תפקוד המיטוכונדריה. הערכה פרה-קלינית של רעילות תרופות מתבצעת לעתים קרובות על קווי תאים אנושיים סרטניים אימורטליים הנובעים מ-ATP בעיקר מגליקוליזה ולעתים קרובות סובלניים לחומרים רעילים מיטוכונדריאליים. 4,5 לעומת זאת, C. elegans תלוי בזרחון חמצוני כדי לקיים את ההתפתחות לבגרות, תוך יצירת הקבלה לבני אדם ומתן הזדמנות ייחודית להערכת תרכובות בהקשר הפיזיולוגי של אורגניזם רב-תאי חי שלם.

נציגי תוצאות כדי להמחיש את השיטה התקבלו לrotenone (איור 1), paraquat (איור 2), oxaloacetate (איור 3), ו 4 תרכובות שהרימו מעכבים כגחלילית בלוציפראז במהלך ההקרנה של ספריית תרופת 13 (איור 4). החשיפה לסמים החלה בשלב L4 בכל המקרים, אבל ניסויי חשיפת paraquat היו התחילו ב 41 שעות לאחר האוכל סיפק ראשון לנמטודות לעומת 45-46 שעות לתרכובות האחרות. הפרוטוקול מאפשר למידה של גמישות בבחירת הזמן לחניכה של החשיפה לסמים ואורך החשיפה. צריכים להיות דבקות פעמים עם זאת, למטרות הקרנה, מוגדרים נבחרו פעם אחת, לשחזור בין ניסויים. נקודות קצה יש למדוד על ידי זמן התפתחותי 66-67 שעות על מנת למנוע הטלת ביצים נרחבת ובקיעה של צאצאים בבארות. הנחיות לתזמונים מסופקות בTתוכל 1. Rotenone, מורכב המיטוכונדריה אני מעכב, הופחת פליטת אור לאחר שני חשיפות קצרות יחסית (שעה 2) ועוד (24 שעות) לטווח של ריכוזים (איור 1). במקרה זה, אין מדידות GFP נלקחו, אך מספר החזרות טכניות בשימוש (n = 6) מספיק כדי לאזן את כל הבדלים במספרי תולעת בין בארות 3. חשיפת 24 שעות היא חלון של זמן שבו נמטודות לגדול, ופיתוח איטי יותר כתוצאה מעיכוב אני מורכב היה צפוי לתרום לירידה בפליטת אור. זו אושרה על ידי תצפית ויזואלית תחת stereoscope עם התפתחות מאוחרת ראתה, במיוחד בריכוזים של 20 מיקרומטר ומעלה; בנוסף כמה קטלני היה שם לב מ -40 מיקרומטר (תצפיות איכותיות לא לכמת). לא קטלני נצפה לאחר חשיפת 2 שעות אבל השפעות על תנועת תולעת נראו. ירידה חדה בפליטת אור ביחס להביא עלינו כיבוש בקרותrred בריכוז הנמוך ביותר של 2.5 מיקרומטר rotenone נבדק, שלתופעות לא מזוהות בקלות על ידי תצפית ויזואלית מהירה ב -2 חשיפת HR. ירידה בפליטת אור זה עולה בקנה אחד עם ATP הסלולרי מופחת. עיכוב מקסימאלי הושג עם הריכוז הנמוך ביותר של rotenone משמש (2.5 מיקרומטר) מצביע על כך שצריכים להתבצע בכל ניסויים הבאים במיוחד מיקוד rotenone בין 0 ל 5 מיקרומטר [טווח הריכוז 0-160 מיקרומטר נבחר כחלק מהשוואה עם תרופות אחרות תחילה זוהה כבעלי השפעה משמעותית על 10 מיקרומטר (שיפורסם במקום אחר)]. Paraquat קוטל העשבים משפיע על תפקוד המיטוכונדריה דרך גידול של מיני חמצן תגובתי. הנה, אנחנו מדגימים את השפעתה על פליטת אור של ג PE254 מתח elegans לאחר חשיפה למגוון רחב של ריכוזים למשך 24 שעות (איור 2). כזן נושא לוק :: היתוך GFP, הקרינה GFP הייתה also נמדד כאמצעי לנורמליזציה. 6,9 Paraquat ירד פליטת אור, הקרינה GFP ופליטת אור מנורמלת באופן משמעותי. מבחן פוסט הוק-Dunnet הצביע על כך שהריכוזים של paraquat עם הבדלים משמעותיים ביחס לשליטה ברכב היו 4 ו -8 מ&quot;מ לפליטת אור ופליטת אור מנורמל, כמו גם 2 מ&quot;מ לפליטת אור מנורמל. הריכוז רק הפחתת הקרינה GFP באופן משמעותי היה 8 מ&quot;מ, ריכוז שבו השפעות הצמיחה והתולעת המתה מדי פעם נראו (תצפיות איכותיות). הירידה בפליטת אור (ופליטת אור מנורמלת) הייתה גדולה יותר מזה של הקרינה, עולה בקנה אחד עם הירידה בתפקוד והשפעות על ייצור ATP במיטוכונדריה. Oxaloacetate ביניים מעגל חומצה הציטרית נבדק על ג PE254 מתח elegans בריכוז אחד של 8 מ&quot;מ, הוביל לעלייה בפליטת אור (איור 3). לא לזרוח GFPמדידות NCE התקבלו או תצפית חזותית נוספת שביצעה; עם זאת, כגון תגובה לריכוז יחיד הייתה זוכה לחשיפה נוספת מאשרות לטווח של ריכוזים, ותצפיות מפורטות יותר של השפעות. שיפור של פליטת אור על ידי המתחם הזה הוא לא מפתיע כפי שהוא יכול להיות הניח להוביל לפעילות גדולה יותר של מעגל החומצה הציטרית, עם ייצור סופו של דבר גדול יותר של ה- ATP (בכל זאת זה יהיה רצוי כדי לשלוט על כל השפעות על רמות לוציפראז על ידי הערכת הקרינה GFP בניסויים הבאים). ערכות נתונים oxaloacetate מוצגות חושפים את מידת ההשתנות בתגובה ראתה בניסויים מבוססים לוציפראז. מניסיוננו שונות זו תכונה של מערכת הבדיקה במיוחד לתנאי חשיפה פחות מזיקים. DDD00001434 התרכובות מעכבות גחלילית בלוציפראז, DDD0001477, DDD00000635 וDDD00023047 נבדקו הן במבחנה על ידי מסתכל על השפעות על puאנזים אחוז האימה וin vivo באמצעות ג לוק elegans: GFP להביע מתח. לא היו שום ראיות לכך שכל אחד מהתרכובות שנבדקו גרם למות נמטודות בתנאי החשיפה. כל 4 התרכובות השפיעו על הפעילות בלוציפראז במבחנה בריכוזים שנבדק 2 25 ו 100 מיקרומטר (איור 4 א). DDD00001434 נהרג הפעילות של לוציפראז המטוהר כמעט לחלוטין, אשר סיפק הצדקה אמינה לירידה הגדולה בin vivo פליטת אור (איור 4). אמנם, במבחנה ובמבחני vivo לא להשוואה ישירה, התגובה לDDD00023047 הייתה דומה בשני מבחני. DDD0001477 וDDD00000635 גרמו לירידה גדולה יותר בvivo מאשר במבחנה. תרכובות אלה נמסרו לתולעים חיים 22 שעות לפני מצע luciferin, ותוצאות עשויות לשקף שהם לא בקלות שנעקרו מהאתר הפעיל לוציפראז כאשר luciferin הפך available. לחלופין, DDD0001477 וDDD00000635 עלול להיות השפעה נוספת על רמות ה- ATP סלולריות. זה היה צריך להיות מוערך על ידי אמצעים שאינם כרוכים בלוציפראז גחלילית. של פתק היה השיפור החזק של אות ה- GFP בתולעים חיים החשופים למתחם DDD00000635. זה יידון בהמשך. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53083/53083fig1.jpg" /> איור 1. מורכב המיטוכונדריה אני מעכב rotenone ירד מעמד האנרגיה של ג elegans כפי שנמדד על ידי פליטת אור של PE254 מתח. תולעי שלב מסונכרן L4 (45-46 שעות לאחר אוכל הניתן לזחלי L1) נחשף ל0, 2.5, 5, 10, 20, 40, 80 ו -160 מיקרומטר rotenone בDMSO 1% ל -2 שעה (קצרה) או 24 שעות (חשיפה ארוכה) קריאות קודמות של פליטת אור בהתאמה וב48 69 שעות של פיתוח תולעת לאחר סיפק מזון. פליטת אור (יחידות אור יחידה יחסית, RLU) באו לידי ביטוי כאחוז מהרכב (1% DMSערכי O). ברים שגיאה מתארים SEM של משכפל טכני בכל ריכוז rotenone (n = 6). כל הריכוזים שנבדקו הביאו הבדל מאוד משמעותי מבחינה סטטיסטית ביחס לשליטה ברכב (p &lt;0.001). <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53083/53083fig2.jpg" /> איור 2. paraquat לחץ חמצוני ירד מעמד האנרגיה של ג PE254 elegans המתח באופן תלוי ריכוז (שנמדד על ידי פליטת אור). תולעים מסונכרן L4 שלב (לנוחות במקרה זה ב 41 שעות לאחר אוכל הניתן לזחלי L1) נחשף ל0, 0.25, 0.5, 1, 2, 4 או 8 paraquat מ&quot;מ עבור 24 שעות. הקרינה GFP (יחידות יחידה יחסית הקרינה, RFU) שימשה כדי לנרמל את נתוני פליטת אור (יחידת RLU), שני נקודות הקצה שהושגו בפיתוח משאבי אנוש 65. הנתונים באים לידי ביטוי כאחוז מפקדים (1% DMSO). ברים שגיאה מתארים SEM של משכפל טכני(N = 5 לריכוזים שונים; n = 18 עבור פקדים). כיוון אחד ANOVA: *** p &lt;0.001 ביחס לשליטה ברכב. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53083/53083fig3.jpg" /> איור 3. oxaloacetate ביניים מעגל חומצה הציטרית (8 מ&quot;מ) משופר פליטת אור של ג PE254 elegans מתח. תולעי שלב מסונכרן L4 (45-46 שעות לאחר אוכל הניתן לזחלי L1) נחשפו למוכנים טרי 8 oxaloacetate מ&quot;מ במשך 18 שעות ± 30 דקות. פליטת אור (RLU יחידה) הייתה לקרוא בזמן ההתפתחותי של שעות 63.5 שעות ± 1 ובאה לידי ביטוי כאחוז מהשליטה ברכב (DDH 2 O). עמודות שונות מייצגות ערכות נתונים שונות של 8 חזרות טכניות הוקצו 96 צלחות גם שונות בתוך אותו הניסוי. ברים שגיאה מתארים SEM של משכפל טכני (n = 8). 2 דרך-ANOVA עם &#39;קבע&#39; ו &#39;ריכוז&#39; כגורמים: ̵6; &#39;p&gt; 0.05,&#39; סט עמ הריכוז &#39;&lt;0.001 וטווח האינטראקציה p&gt; 0.05. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/53083/53083fig4ahighres.jpg" width="650" /> B <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/53083/53083fig4bhighres.jpg" width="650" /> איור 4. בדיקה של תגובות ל4 תרכובות מספריית דנדי גילוי תרופות מתחם 13 (C1: DDD00001434, C2: DDD0001477, C3: DDD00000635 וC4: DDD00023047) עם פעילות מעכבת ידועה על הארה לוציפראז גחלילית. (א) השפעה של תרכובות בפעילות של לוציפראז גחלילית מטוהר (נמדד כיחידות אור, RLU), מבוטא באחוזים של שליטה ברכב. ערכת CLSII פליטת אור ATP (רוש, מנהיים, גרמניה) שימשה על פי הוראות עם אותה הכמות של אנזים בלוציפראז aliquoted לבארות (96-W לבןell צלחות microtiter). ATP סופק בריכוז סופי של 10 מיקרומטר ו1 μl של מתחם (ריכוז סופי הצביע) או DMSO (1%) נוספו. אות הארה שולבה במשך 10 שניות. ברים שגיאה מתארים SEM של משכפל טכני (n = 4). ניתוח: כיוון אחד ANOVA; * P &lt;0.05 או *** p &lt;0.001 ביחס לשליטה ברכב. הבדלים בין 25 ל 100 מיקרומטר משמעותיים ביותר עבור C1 (DDD00001434; p &lt;0.001), ומשמעותי עבור C2 ו- C3 (בהתאמה DDD0001477 וDDD00000635; p &lt;0.05). (ב) בvivo מדידות של פליטת אור, פליטת אור מנורמלת לקרינת GFP ו הקרינה GFP של ג PE254 elegans מתח בזמן התפתחותי 67 שעות לאחר חשיפה לתרכובות מבחן במשך 22 שעות. ברים שגיאה מתארים SEM של משכפל טכני (n = 8). ניתוח סטטיסטי (דרך-ANOVA אחת) בוצעה על הנתונים אספו מ3 ערכות נתונים (3 xn = 8). * P &lt;0.05 או *** p &lt;0.001 ביחס לשליטה ברכב בהתאמה. בידולCES בין 25 ל 100 מיקרומטר רק מובהק סטטיסטי (p &lt;0.05) לפליטת אור מנורמלת בעקבות החשיפה לC4 (DDD00023047). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שעה ביום </td><td> יום 1 </td><td> יום 2 </td><td> יום 3 </td><td> יום 4 </td><td> יום 5 </td><td> יום 6 </td><td> יום 7 </td><td> יום 8 </td></tr><tr><td> 9-10 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> שלב 5 </td></tr><tr><td> 10-11 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> שלב 5 </td></tr><tr><td> 11-12 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> שלב 4 </td><td> שלב 5 </td></tr><tr><td> 12-13 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> שלב 4 </td><td></td></tr><tr><td> 13-14 </td><tד&gt; </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 14-15 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 15-16 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 16-17 </td><td> שלב 1 </td><td></td><td></td><td></td><td> שלב 3 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 17-18 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 18-19 </td><td></td><td></td><td></td><td> שלב 2 </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> סקירת טבלת 1. צעדי פרוטוקול להתבצע בכל יום של ניסויי נמטודות (סעיף 3) והציעה תזמונים.

פרוטוקול מתואר לזיהוי in vivo של השפעות של מעכבי מיטוכונדריה באורגניזם המודל Caenorhabditis elegans ולזיהוי תרכובות משפרות פוטנציאליות. ניתן להשתמש בפרוטוקול זה כדי לסנן ספריות תרופות עבור תרכובות המווסתות את תפקוד המיטוכונדריה.

Screenable<em&gt; In vivo</em&gt; Assay עבור מיטוכונדריאלי מאפנני שימוש הטרנסגניים Bioluminescent<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and ...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לזהות רעילות מיטוכונדריאלית או השפעות מועילות של תרופות באמצעות אורגניזם המודל *C. elegans*. מטרה זו מושגת על ידי כימות in vivo של רמות ATP בזנים טרנסגניים של *C. elegans* המבטאים את אנזים הלוסיפראז של גחלילילין המחובר לחלבון פלואורסצנטי ירוק.הגן המאוחה מקנה לנמטודות שתי תכונות נפרדות. הראשונה היא שכאשר ניתן להן את התסבסט לוסיפר (Lucifer), הנמטודות פולטות אור בטווח הנראה באופן פרופורציונלי למאגרי ה-ATP התאיים שלהן. והשנייה היא שכאשר הן מוארות באורך הגל המתאים, הן יפגינו פלואורסצנציה ירוקה חזקה.הפלואורסצנציה אינה תלויה ברמות ה-TP בנמטודות והיא פרופורציונלית למסה או למספר שלהן. לכן, ניתן להשתמש בה כדי לנרמל את מדידות הביולומינצנציה. במהלך בדיקה טיפית, אוכלוסייה של תולעים מסונכרנת התפתחותית גודלה עד לשלב הלרבה L4.לאחר מכן, הנמטודות מטופלות בתרכובות התרופות הנבדקות למשך פרק זמן מסוים לפני מדידת הפלואורסצנציה והביולומינסנציה כאחד. התוצאות מעידות על רעילות פוטנציאלית של התרופה. כאשר הביולומינסנציה פחותה, אות מוגבר מצביע על "פגיעה" (hit) הדורשת בדיקה נוספת להשפעות מועילות על תפקוד המיטוכונדריה.היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון סריקת תרופות על תאים מתורגלים, הוא שהסריקה מתבצעת בהקשר הפיזיולוגי של אורגניזם רב-תאי חי ומלא, בעל דמיון גנטי לבני אדם של כמעט 50% בתחום האופתלמולוגיה. ובדומה לבני אדם, התפתחותו של התולעת לשלב הבגרות מחייבת למעשה פוספורילציה חמצונית מיטוכונדריאלית, והמיטוכונדריות שלו חולקות עם מיטוכונדריות של יונקים מאפיינים רבים מבחינת מבנהן, תפקודן והביואנרגטיקה שלהן. פרמטרים קריטיים בפרוטוקול כוללים את שלב ההתפתחות שבו הוחל החשיפה, משך חשיפת הנמטודה לתרופה הנבדקת, זריעה של מספר דומה של נמטודות לכל אחת מהבארות, וכמובן, מניעת זיהום. ביום הראשון, תחת תנאים סטריליים, העבירו נמטודות מתוך פלטת מצע גידול לנמטודות בקוטר 6 סנטימטרים עם 2 מיליליטר של מצע S complete לתוך בקבוק עם 30 גרם לליטר של E. coli.OP 50 במצע S complete, ולאחר מכן דגרו את הבקרה עם ניעור ביום הרביעי; השתמשו במלבינה על תרבית נמטודות GR כדי לאסוף את הביצים ולהסנכרן את אוכלוסיית התולעים. לאחר מכן, דגרו את הביצים למשך לילה בבקרה מזכוכית המכילה 15 milliliters של מצע S complete עם ניעור. למחרת, ביום החמישי, הנמטודות יהיו באותו שלב גדילה. כדי לקבוע את מספר התולעים שבקעו, תוך שימוש בקצה טיפ נקי בכל פעם, העבירו שלוש מנות של 100 microliter של נמטודות למבחנות מיקרו נפרדות המכילות 900 microliters של מצע, בתוספת 0.01% tween 20, תוך ביצוע פעולות פיפטינג מעלה ומטה מספר פעמים כדי לשחרר תולעים הנצמדות לטיפ.לאחר מכן, ספרו את הנמטודות בארבע טיפות נפרדות של 10 µL מכל אחת משלוש מבחנות הדילול, וחשבו את נפח תרחיף הנמטודות הדרוש להכנת שתי תרביות של 20 mL עם 10 נמטודות ל-10 µL; העבירו נפחים מקורבים לשתי מבחנות קוניות של 15 mL שנשקלו מראש. שקלו את המבחנות כדי לקבוע את הנפח המדויק שהועבר. כדי לדייק את הנפחים המבוקשים, בצעו ערבוב עדין במערבל וורטקס (vortex) והסִירו את הנפח העודף.כעת, שטפו את הנמטודות בסך כולל של 14 מיליליטר של מצע S complete טרי לכל מבחנה, והשעיו שוב את המשקעים בחמישה מיליליטר של מצע S complete עם 30 גרם לליטר של OP 50. העבירו את הנמטודות לבקבוקוני זכוכית קוניים המכילים 15 מיליליטר של S complete עם 30 גרם לליטר של OP 50.OP 50 לנפח כולל של 20 מיליליטר לכל בקבוק ורשמו את זמן ההאכלה. חשבו את הממוצע של מספר הנמטודות בתשעת טיפות של 10 microliter כדי לוודא שהתרביות דוללו ל-10 נמטודות ל-10 microliter. הניחו את התרביות באינקובטור למשך 42 עד 44 שעות.ביום השביעי, העבירו את תרביות הנמטודות לבקבוק אחד תוך써 ערבוב עדין ומתמיד. לאחר מכן, העבירו מנות של 3-4 מיליליטר של נמטודות לאגן סטרילי בנפח של 60 מיליליטר. השתמשו בפיפט רב-ערוצי (שמונה ערוצים) כדי להעביר 25 מיקרוליטר של נמטודות תלויות לכל באער בלוח 96.השתמשו בלוחות מיקרוטיטר שחורים עם תחתית שטוחה ושקופה. לאחר מכן, החזירו את המכסים ללוחות והניחו אותם בצד. בכל פעם ששני לוחות זורעים, העבירו שני מנות נוספות של 2.5 milliliter של נמטודות אל תוך התעלה כדי להחליף את הנפח שאבד.לאחר זריעת נמטודות ב-13 עד 14 פלטות, הוסיפו 74 µL של מצע S complete לכל באער והעבירו את הפלטות לתא לחות ולדגרה רוטטת עד למתן התרופה, כאשר הפלטות נשארות ברטיטציה. הפשיתו 2 פלטות תרופות של 96 באערים לצורך הבדיקה. לאחר מכן, השתמשו בפיפט רב-ערוצי והחליפו את הטיפים בכל פעם.העבירו מיקרוליטר אחד מהעמודה הראשונה של פלטת התרופה הראשונה לעמודות אחת עד חמש של פלטת הנמטודות. העבירו מיקרוליטר נוסף מהעמודה השנייה של פלטת התרופה לעמודות שמונה עד 12 של פלטת הנמטודות. לאחר מכן, הוסיפו מיקרוליטר אחד של Vehicle לעמודות שש ושבע של פלטת הנמטודות.השתמש בעמודות הנותרות בלוח התרופות כדי לטפל בשאר לוחות הנמטודות באופן דומה, והקפד לכלול גם שני לוחות שטופלו כולם בנשאי תרופה (vehicle) בלבד. לאחר מכן, החזר את כל הלוחות לתאי הלחות באינקובטור הנעורה ל-20 עד 22 שעות נוספות ביום השמיני. כדי להכין לוח בקרת רקע לקריאות פלואורסצנציה, שלב את תכולת הבארים מלוח נמטודות שטופל כולו בנשאי תרופה והמת שתי עד שלוש דקות להשקעת הנמטודות.לאחר מכן, אספו את החיידקים המכילים את snat והעמיסו דגימות של 100 µL לכל באער במיקרופלטה שחורה בעלת תחתית שקופה. בחנו את הפלטה תחת מיקרוסקופ, וסמנו את הבאערים שבהם ניתן להבחין בנמטודות כדי להחריגם מהערכת הרקע הפלואורסצנטי. לבסוף, קראו את הפלואורסצנציה כדי למדוד את הביולומינסנציה עבור כל פלטה.בתורם, העבירו 50 µL של תמיסת באפר לומניסצנציה שהוכנה טרי לכל באר, הניחו את הפלטה על פלטפורמת ניעור והפעילו את הטיימר לאחר שלוש דקות. קראו את הלומניסצנציה בקצב של שנייה אחת לכל מדידה. בניסוי מייצג ראשון זה, מעכב ידוע של קומפלקס מיטוכונדריאלי 1 הפחית את פליטת האור של הנמטודות לאחר חשיפות קצרות יחסית וגם ארוכות יותר, בטווח של ריכוזים שונים.בניסוי זה, הוכרח כי הרביץ פאראקוואט (paraquat) גורם להפחתה משמעותית בפלואורסצנציית ה-GFP הביולומינסצנטית ובביולומינסצנציה המנורמלת של זן C PE 2 54. יתרה מכך, הירידה בביולומינסצנציה הייתה גדולה מזו של הפלואורסצנציה, ממצא התואם את ההשפעות הידועות של ירידה בתפקוד המיטוכונדריאלי והפחתה בייצור ATP שנגרמות על ידי התרופה. גרף זה ממחיש דוגמה למתרכבת המגבירה את הביולומינסצנציה של הנמטודה, האוקסלואצטט, תוצר ביניים במעגל חומצה הלימונית, בריכוז בודד של שמונה מילימולאר.שימו לב שהשונות הניסויית שנצפתה בין הרצות שכפול אלו אינה חריגה עבור ניסויים המבוססים על לוציפראז. כאן, נצפה כי תרכובות מעכבות לוציפראז של גחליליות השפיעו על פעילות הלוציפראז in vitro בריכוזים של 25 micromolar ו-100 micromolar, כאשר התרכובת DDD גרמה להחלשה כמעט מלאה של הפעילות. 1, 4 3 4, למרות שאינם ניתנים להשוואה ישירה, נצפתה ירידה משמעותית בביולומינצנציה גם לאחר טיפול בתרכובת מעכבת לוציפראז in vivo.הדגמה לכך ששינויים בביולומינצנציה עשויים לנבוע מהשפעתם של מעכבי אנזים הלוסיפראז ולאו דווקא משינויים ברמות ATP in vivo. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לקחת בחשבון שתרכובות עשויות להשפיע באופן ישיר על פעילות אנזים הלוסיפראז של הגחלילית, במקום להשפיע על המצב האנרגטי של התולעת. לפיכך, ניתן לתקף את התוצאות באמצעות טכניקות רבות להערכת תפקוד מיטוכונדריאלי, כגון, למשל, קביעת צריכת חמצן, קביעת פוטנציאל ממבנה המיטוכונדריה, קביעת רמות של מיני חמצן רדיקליים, או הדמיה של מיטוכונדריה בזני *C. elegans*.מיטוכונדריה עם תג GFP.

a-screenable-vivo-assay-for-mitochondrial-modulators-using-transgenic

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

הליך culturing נוזלי מבוסס מחלק...

תפוקה גבוהה הקרנת ו biosensing עם פלורסנט ג elegans מתחים

מקור: Anderson, Q. L. et al. C. elegans Pathosystem בעל תפוקה גבוהה, תכולה גבוהה, מבוסס נוזל. J. Vis. Exp. (2018)סרטון זה מדגים שיטת סינון בעלת תפוקה גבוהה המשתמשת ב-Caenorhabditis elegans כדי לחקור הפלות גנים במהלך אינטראקציות מארח-פתוגן. הוא מתאר את הנוהל להכנת תולעי נוקדאון והעברתן ללוחות בדיקה כדי להעריך את ההשפעות של הרג תולעים הנגרמת על ידי פתוגנים.

בדיקה מבוססת נוזל Multiwell לסינון C. elegans Knockdowns

סרטון זה מדגים בדיקת in vivo לחקר מיטופגיה ב- Caenorhabditis elegans. עם חשיפת הנמטודות לתרופה הגורמת למיטופגיה, המופע של מיטופגיה מוערך על ידי קו-לוקליזציה בין DCT-1, קולטן מיטופגיה על המיטוכונדריה הפגועה, לבין חלבון הממברנה האוטופגוזומלית LGG-1.

בדיקת In Vivo לזיהוי מיטופגיה בנמטודות טרנסגניות

עם גוף מערך עצביה הקטנים שקוף, מתועד היטב ומגוון הרחב של טכניקות גנטיות מתאימים...

בהדמיה עצבית סיד vivo ב C. elegans

התפשטות דמוית פריון של אגרגטים חלבוניים התגלתה לאחרונה כמעורבת במחלות ניווניות רבות. מטרת פרוטוקול זה היא לתאר כיצד להשתמש בנמטודה C. elegans כמערכת מודל לניטור התפשטות חלבון ולחקירת תופעות דמויות פריון.

חוקר את החלבונים כמו פריון-הפצת ורעילות של שימוש במטזואניים דגם אורגניזם<em&gt; C. elegans</em

גנטי בקידוד היסטון-miniSOG גורם מוטציות תורשתי הגנום כולו באופן אור תלוי כחול. שיטת mutagenesis זה היא פשוטה, מהירה, ללא כימיקלים רעילים, מתאים היטב סריקה גנטית קדימה ואינטגרציה transgene.

Optogenetic mutagenesis אקראי באמצעות היסטון-miniSOG ב<em&gt; C. elegans</em

Mitophagy, התהליך של פינוי נפגע המיטוכונדריה, הוא הכרחי עבור תחזוקה מיטוכונדריאלי הומאוסטזיס ובריאות. מאמר זה מציג חלק mitophagy האחרונה שיטות זיהוי תאים אנושיים, Caenorhabditis elegansועכברים.

במבחנה and In Vivo זיהוי של Mitophagy ב תאים אנושיים, C. Elegansועכברים

כאן נתאר פרוטוקול פשוט להפקת במהירות מאות צמיחה נמטודות מדיה אגר, 96-ובכן תרבות צלחות עם מספרים עקביים של Caenorhhabditis elegans לכל טוב. תרבויות אלה שימושיים להקרנה פנוטיפי של אורגניזם שלם. אנו מתמקדים כאן באמצעות תרבויות אלה לכימיקלים מסך עבור אפקטים פרו-אריכות ימים.

שיטה פשוטה להקרנה כימי תפוקה גבוהה ב Caenorhabditis Elegans

מחקר זה מציג פרוטוקולים עבור שתי גישות ניתוח פעילות לוקומוטור חצי אוטומטי ב C. elegans קומפלקס I מחלות גז-1(fc21) תולעים, כלומר, ZebraLab (בדיקת תפוקה בינונית) ו- WormScan (בדיקה בעלת תפוקה גבוהה) ומספקים ניתוח השוואתי בין מגוון רחב של שיטות מחקר לכימות התנהגות נמטודה ותפקוד עצבי שרירי משולב.

ניתוח השוואתי של שיטות ניסיוניות לכימות פעילות בעלי חיים בקאנורבדיטיס אלגנס מודלים של מחלות מיטוכונדריאליות

חיידקי מעיים עשויים להשפיע באופן חיובי או שלילי על בריאות המארח שלהם באמצעות מנגנונים ספציפיים או שמורים. Caenorhabditis elegans היא פלטפורמה נוחה לסינון עבור חיידקים כאלה. הפרוטוקול הנוכחי מתאר סינון בתפוקה גבוהה של 48 חיידקים מבודדים להשפעה על עמידות לעקה של נמטודה, המשמשים כפרוקסי לבריאות התולעים.

הקרנה בתפוקה גבוהה של מבודדים מיקרוביאליים עם השפעה על בריאות Caenorhabditis elegans

פרוטוקול זה מספק גישה סטנדרטית להדמיית מורפולוגיה מיטוכונדריאלית ברקמות מרובות של C. elegans במהלך ההזדקנות.

הדמיה וכימות מורפולוגיה מיטוכונדריאלית ב - C. elegans במהלך ההזדקנות

למד זיהוי תרופות פוגעות במיטוכונדריה או מועילות באמצעות Caenorhabditis elegans טרנסגני עם ביולומינסנציה. שיטה זו מאפשרת סינון ספריות תרופות להערכת רמות ATP בחי אורגניזם שלם.

Screenable

גלה סרטונים נוספים