Screenable In vivo Assay עבור מיטוכונדריאלי מאפנני שימוש הטרנסגניים Bioluminescent Elegans Caenorhabditis

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לזהות רעילות מיטוכונדריאלית או השפעות מועילות של תרופות המשתמשות באורגניזם המודל. אלגנטיות C. זה מושג על ידי כימות in vivo של רמות TP בזני אלגן ים טרנסגניים המבטאים את האנזים המצליב-גחלילי המותך לחלבון הפלואורסצנטי הירוק.

גן ההיתוך מעניק שתי תכונות נפרדות לנמטודות. הראשון הוא שכאשר ניתנים למצע לוציפר, הנמטודות פולטות אור בטווח הנראה ביחס למאגרי ה-A TP התאיים שלהן. והשני הוא שכאשר הם מוארים באורך הגל המתאים, הם יציגו פלואורסצנטיות ירוקה חזקה.

הקרינה אינה תלויה בנמטודות ברמות TP והיא פרופורציונלית למסה או למספרים שלהן. לכן, ניתן להשתמש בו כדי לנרמל את מדידות הביו-לומינסנציה. במהלך בדיקה טיפוסית, אוכלוסייה של תולעים מסונכרנות התפתחותית גדלה לשלב הזחל L.

לאחר מכן מטפלים בנמטודות בתרכובות תרופות הבדיקה למשך תקופה מסוימת לפני מדידת הקרינה והביולומינסנציה. התוצאות מראות רעילות פוטנציאלית לתרופות. כאשר הביולומינסנציה מופחתת, אות משופר מצביע על פגיעה בבדיקות נוספות להשפעות מועילות על תפקוד המיטוכונדריה.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו בדיקת תרופות על תאים מתורבתים, הוא שהסקר מתבצע בהקשר הפיזיולוגי של אורגניזם רב-תאי חי שלם עם קרוב ל-50% רפואת עיניים גנטית לבני אדם. וכמו בני אדם, האלגנטיות למעשה דורשת זרחון חמצוני מיטוכונדריאלי כדי להתפתח לבגרות והמיטוכונדריה שלה חולקת גם עם מיטוכונדריה יונקים מאפיינים רבים מבחינת המבנה שלהם, תפקודם, הביו-אנרגטיקה שלהם פרמטרים קריטיים בפרוטוקול כוללים את השלב ההתפתחותי בו החשיפות החלו את משך החשיפה לנמטודה, לתרופה המעניינת ולזריעה של מספר דומה של נמטודות לכל אחת מהבארות, וכמובן, הימנעות מזיהום ביום הראשון. בתנאים סטריליים מעבירים נמטודות מלוח גידול נמטודה אחד בשישה סנטימטרים בשני מיליליטר של מדיום שלם S לבקבוק עם 30 גרם לליטר אי קולי.

OP 50 במדיום שלם S, ואז מדגרים את הבקבוק בניעור ביום הרביעי, מלבינים את התרבית של נמטודות GR כדי לקצור את הביצים ולסנכרן את אוכלוסיית התולעים. לאחר מכן דגרו את הביצים למשך הלילה בבקבוק זכוכית המכיל 15 מיליליטר של מדיום שלם S עם ניעור למחרת, היום החמישי, הנמטודות יהיו באותו שלב של צמיחה. כדי לקבוע את מספר התולעים שבקעו באמצעות קצה נקי בכל פעם, העבירו שלוש אליקוטות של 100 מיקרוליטר של נמטודות לצינורות מיקרו נפרדים המכילים 900 מיקרוליטר של מדיום, בתוספת 0.01% בין 20 פיפטות למעלה ולמטה כמה פעמים כדי לשחרר את כל התולעים שנדבקות לקצה.

לאחר מכן ספרו את הנמטודות בארבע טיפות נפרדות של 10 מיקרוליטר מכל אחד מצינורות הדילול המשולשים, וחישבו את נפח תרחיף הנמטודות הנדרש להקמת שתי תרביות של 20 מיליליטר עם 10 נמטודות לכל 10 מיקרוליטר, שפכו נפחים משוערים לשני צינורות חרוטיים של 15 מיליליטר שנשקלו מראש. שקלו את הצינורות כדי לקבוע את הנפח בפועל שחולק. לאחר מכן כדי להתאים את נפחי היעד מערבולת בעדינות ולהסיר נפח עודף.

כעת, שטפו את הנמטודות בסך הכל 14 מיליליטר של S טרי, מדיום שלם לכל צינור והחייאה השעו את הכדורים בחמישה מיליליטר של S מדיום שלם עם 30 גרם לליטר שווה. אופ 50. העבירו את הנמטודות לצלוחיות זכוכית חרוטיות המכילות 15 מיליליטר S עם 30 גרם לליטר שווה.

OP 50 לנפח כולל של 20 מיליליטר לבקבוק ולתעד את זמן ההאכלה. ממוצע של מספר הנמטודות בתשע טיפות של 10 מיקרוליטר כדי לאשר שהתרביות מדוללות ל-10 נמטודות לכל 10 מיקרוליטר. מניחים את התרבויות בחממה למשך 42 עד 44 שעות.

ביום השביעי, משוך את תרביות הנמטודות לבקבוק יחיד עם מערבולת עדינה מתמשכת. לאחר מכן העבירו שלושה-ארבעה מיליליטר של נמטודות לשוקת סטרילית אחת של 60 מיליליטר. השתמש בפיפטה של שמונה ערוצים ל-Eloqua, 25 מיקרוליטר של נמטודות תלויות לבאר לתוך 96.

ובכן לוחות מיקרוטיטר שחורים עם תחתית שטוחה ושקופה. לאחר מכן מחזירים את המכסים לצלחות ומניחים את הצלחות בצד. בכל פעם שנזרעו שני לוחות, העבירו עוד שניים, 2.5 מיליליטר של נמטודות לשוקת כדי להחליף את הנפח שאבד.

לאחר זריעת 13 עד 14 צלחות עם נמטודות, הוסיפו 74 מיקרוליטר של מדיום שלם S לכל באר והעבירו את הצלחות לתא לח ולחממה רועדת עד למתן התרופות, בזמן שהצלחות רועדות. הפשרה 2 96 צלחות תרופות ריתוך לבדיקה. ואז להשתמש בפיפטה רב ערוצית ולשנות את הקצוות בכל פעם.

העבירו מיקרוליטר אחד מהעמודה הראשונה של צלחת התרופה הראשונה לעמודות 1 עד 5 של צלחת נמטודה. העבירו מיקרוליטר נוסף מהעמודה השנייה של לוחית התרופה לעמודות שמונה עד 12 של צלחת הנמטודה. לאחר מכן הוסף מיקרוליטר אחד של רכב לעמודות שש ושבע של לוחית הנמטודה.

השתמש בעמודות הנותרות בלוחית התרופה כדי לטפל בשאר לוחות הנמטודות באותו אופן, והקפד לכלול גם שתי לוחיות שטופלו ברכב. לאחר מכן החזירו את כל הצלחות לתאים הלחים באינקובטור הרועד למשך 20 עד 22 שעות נוספות ביום השמיני. כדי להכין לוחית בקרת רקע לקריאות פלואורסצנטיות, שלב את תכולת הבאר מלוח נמטודות שטופל בכל הרכב ואפשר לנמטודות להתיישב במשך שתיים-שלוש דקות.

לאחר מכן אספו את החיידקים המכילים סנאט וטענו 100 דגימות מיקרוליטר לכל באר של מיקרו-פלטה שחורה עם תחתית שקופה. התבונן בלוח תחת מיקרוסקופ, ושים לב לבארות שבהן ניתן לראות את הנמטודות כדי לאפשר אי הכללה של בארות אלה מהערכת הרקע הפלואורסצנטי. לאחר מכן קרא את הקרינה לבסוף כדי למדוד את הביו-לומינסנציה עבור כל צלחת.

בתורו, חלקו 50 מיקרוליטר של מאגר זוהר טרי שהוכן לכל אחד, הניחו היטב את הצלחת על פלטפורמה רועדת והפעל את הטיימר לאחר שלוש דקות. קרא את הזוהר בשנייה אחת לכל מדידה. בניסוי מייצג ראשון זה, ריקבון הידוע כמעכב קומפלקס מיטוכונדריאלי אחד הפחית את תפוקת האור על ידי הנמטודות לאחר חשיפות קצרות יחסית וארוכות יותר בטווח ריכוזים.

בניסוי זה, קוטל העשבים פרקווט הוכח כמפחית משמעותית את הקרינה הביולוגית GFP ואת הביולומינסנציה המנורמלת של זן C PE 2 54. יתר על כן, הירידה בביולומינסנציה הייתה גדולה מזו של הקרינה, בהתאם להשפעות הידועות של ירידה בתפקוד המיטוכונדריה והפחיתה את ייצור ה-TP שעוררה התרופה. גרף זה ממחיש דוגמה לתרכובת המשפרת את הביולומינסנציה של הנמטודה, מחזור חומצת הלימון אוקסלואצטט ביניים בריכוז יחיד של שמונה מילי-מולאר.

שימו לב שהשונות הניסויית שנראית בין ריצות השכפול הללו אינה יוצאת דופן עבור ניסויים מבוססי לוציפר. כאן, תרכובות מעכבות לוציפראז גחליליות נצפו כמשפיעות על פעילות הלוציפרים במבחנה ב-25 מיקרומולר ו-100 מיקרומולר עם הנחתה כמעט מוחלטת של הפעילות על ידי תרכובת DDD. 1, 4 3 4, למרות שלא ניתן להשוות ישירות, נצפתה ירידה משמעותית בביולומינסנציה לאחר טיפול בתרכובת מעכבת לוציפר גם כן in vivo.

הוכחה כי שינויים בביולומינסנציה עשויים לנבוע מפעולת מעכבי אנזים לוציפר ולא משינויים ברמות ה-TP in vivo A. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לקחת בחשבון שתרכובות יכולות להשפיע ישירות על פעילות האנזים לוציפראז הגחלילית במקום להשפיע על מצב האנרגיה של התולעת. ולכן, ניתן לאמת תת-חימום באמצעות טכניקות רבות להערכת תפקוד המיטוכונדריה, כמו, למשל, קביעת צריכת חמצן, קביעת פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית של מיני חמצן תגובתיים, או הדמיה של מיטוכונדריה בזנים של אלגנטיות ים.

עם תג GFP, מיטוכונדריה.