דגם רקמות 3D ריאות אדם ללימודים פונקציונליים ב

המטרה הכללית של הליך זה היא לבנות מודל של רקמת ריאה in vitro למחקרים של זיהום ב-M tuberculosis. הדבר מושג תחילה על ידי שכבה של מטריצת קולגן של פיברובלסטים על גבי המסנן של תבנית תרבית תאים (insert). בשלב השני, תאי מערכת חיסון ותאי אפיתל של הריאה מזוהמים מושבצים על גבי שכבת הקולגן של הפיברובלסטים.

מודל הרקמה התלת-ממדית המתקבל נחשף לאחר מכן לאוויר כדי להקל על הפרשת המוקוס ועל הריבוד של האפיתל. בשלב הסופי, הרקמה נאספת ומקובעת. לבסוף, נעשה שימוש במיקרוסקופיה של אימונופלואורסצנציה כדי לנתח את ההיווצרות של גרנולומה מוקדמת המושרה על ידי M tuberculosis.

היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון שכבה Ein vitro של תאים, הוא שהתאים במערכת זו נמצאים בסביבה מיקרוסקופית תלת-ממדית (3D), המאפשרת היווצרות של גרנולומות בעקבות זיהום בחיידקים virulent המדמים שחפת בבני אדם. כדי להכין פיברובלסטים מוטמעים בקולגן, התחל בטיפול של תאי פיברובלסטים של ריאה ב-tripsin למשך 10 דקות ב-37 °C. כאשר התאים ניתקו, עצור את התגובה באמצעות 8 mL של DMEM מלא ולאחר מכן סבב את התאים בצנטריפוגה. השהה את המשקעים בריכוז של 230,000 תאים ל-mL ב-DMEM טרי והנח את התאים על קרח. לאחר מכן, הוסף אינסרט אחד לכל באר בתוך לוח שש.

השתמשו בפלטת בארות וסננו מיליליטר אחד של תערובת שכבה תאית שהוכנה טרי לתוך כל רכיב (insert), תוך וידוא שהתערובת מכסה את הרכיב כולו ללא בועות אוויר. לאחר מכן, הניחו את הפלטה באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C למשך 30 דקות. בסיום האינקובציה, ערבבו שני מיליליטר של collagen עם 615 µL של premix במבחנה קונית סטרילית על קרח, כדי לנטרל את ה-pH של ה-collagen עבור כל רכיב.

לאחר מכן, יש להוסיף לתערובת הקולגן 58 µL של DMEM מלא ו-327 µL של פיברובלסטים של ריאה לכל אינסרט. יש לבצע פיפטינג מעלה ומטה כדי לפזר את התאים באופן שווה בכל התערובת. כעת, יש להוסיף במהירות 3 mL של השכבה התאית לאורך דופן כל אינסרט, על גבי כל שכבת קולגן נטולת תאים.

יש להקפיד להימנע מיצירת בועות אוויר ולהחזיר את הפלטה לאינקובטור לתרבית תאים למשך שעתיים נוספות. לאחר פולימריזציית הקולגן, יש להוסיף 2 mL של DMEM מלא לתחתית של כל באר, ולהחזיר את הפלטה לאינקובטור למשך 24 שעות נוספות. למחרת, יש להשתמש בפינצטה נקייה כדי להרים בזהירות את התאים (inserts) אחד אחד, ולשאוב את מדיום התרבית מהתחתית של כל אחד מהם.

לאחר מכן, הוסיפו 2 mL של DMM מלא לתחתית של כל באר, ו-2 mL של DMM מלא לכל תבנית הכנסה (insert). החליפו את שני נפחי המצע מדי יומיים למשך חמישה עד שבעה ימים. להכנת המקרופאגים המודבקים, התחילו בדגירה של תרבית מקרופאגים למשך ארבע שעות עם *M tuberculosis* וירולנטי בריבוי הדבקה (multiplicity of infection) של 10.

בסיום הדגירה, שטפו את התאים שלוש פעמים ב-PBS כדי להסיר את החיידקים החוץ-תאיים, וטפלו במקרופאגים ב-2mM DTA למשך 10 דקות ב-37°C. כאשר התאים ניתקו, השעיקו אותם ב-complete DMM נטול אנטיביוטיקה. לאחר מכן, שאבו את כל המצע מלוח מטריצת הקולגן של הפיברובלסטים והוסיפו 1.5mL של complete DMM טרי נטול אנטיביוטיקה לתאים החיצוניים.

בשלב הבא, ערבבו מונוציטים המסומנים פלואורסצנטית עם המקרופאגים המודבקים ביחס של חמישה לאחד ב-50 µL של DM EM מלא ללא אנטיביוטיקה לכל אינסרט. לאחר מכן, הוסיפו 50 µL של תערובת המונוציטים והמקרופאגים לתוך כל אינסרט והחזירו את הפלטה לאינקובטור. לאחר שעה אחת, הוסיפו לאט 2 mL של מצע תרבית לאורך דפנות האינסרטים כדי למנוע תזוזת תאים, והדגירו את התרביות למשך 24 שעות נוספות.

כדי לזרוע את התרביות עם תאי אפיתל של ריאה, הוסיפו 4 מיליון תאי אפיתל למיליליטר ב-50 µL של dmm מלא על גבי מטריצות קולגן של פיברובלסטים ותאי מערכת החיסון. הדגרירו את התאים למשך שתי דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן למשך שעה אחת ב-37 °C. לאחר מכן, הוסיפו בעדינות 2 mL של DMM מלא נטול אנטיביוטיקה לתוך התבניות (inserts) כפי שהודגם כעת, וטרבבו את התאים למשך שלושה ימים נוספים.

חמישה ימים לאחר זריעת המקרופאגים המודבקים, שאבו את כל מצע התרבית מהצלחת והוסיפו 1.8 milliliters של DMM מלא ללא אנטיביוטיקה לתאים החיצוניים. לאחר מכן, חשפו את מודלי הרקמה התלת-ממדיים לאוויר באינקובטור למשך יומיים, ללא הוספת מצע לאינסרט ביום השביעי לאחר הזריעה.

הסיר את המצע לחלוטין מהפלטה וערבב את מודלי הרקמה עם 4%paraldehyde למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. לאחר מכן, בעזרת סקלפל, הפרד את הממברנות מהתושבות של הבארות (well inserts). בשלב הבא, השתמש בסקלפל נקי כדי להסיר בזהירות את דפנות מודלי הרקמה וחתך כל רקמה לארבעה חלקים ריבועיים בגודל שווה בקירוב.

העבירו את החלקים למשקפיות זכוכית מסוג super frosts והניחו להם להתייבש במשך חמש דקות. לאחר מכן, באמצעות מדיום קיבוע פלואורסצנטי המכיל anti fade ו-dpi, קבעו את הרקמות וכסו אותן בכיסויי זכוכית. השאירו את המשקייות בטמפרטורת החדר בחושך עד שיתייבשו, ולאחר מכן אטמו את קצוות כיסוי הזכוכית באמצעות לק ציפורניים.

לאחר ייבוש הלכה, טבול את השקופיות ב-70% ethanol לצורך העברה אל מחוץ למתקן BSL 3. כדי להדמיא את הרקמות, רכוש תמונות תלת-ממדיות של חמישה עד 10 שדות שונים המכסים את כל נתח הרקמה ברזולוציה של 512 על 512, עם עומק (Z-stack) של לפחות 20 micron ועובי של 1 עד 1.5 micron בין השכבות במיקרוסקופ קונפוקאלי פלואורסצנטי, לצורך כימות תלת-ממדי של צבירי התאים. פתח את התוכנה לעיבוד תמונות תלת-ממדיות וטען את התמונה הרלוונטית.

בשלב הבא, באמצעות כלי כוונון התצוגה, כווננו כל ערוץ עבור התמונה, הניגודיות, הבהירות ושקיפות המיזוג (blend opacity) כדי למטב את רינדור הנפח ולמזער את הפרעות הרעש. לאחר מכן, כדי להדמיא את פני השטח של הרקמה, בחרו את ערוץ המונוציטים האדומים והגדירו את הסף המתאים באמצעות המסננים כדי להגביל את הבחירה של המונוציטים האדומים או כדי להוציא את הרקע ככל שנדרש. לבסוף, ייצאו את הנתונים לתוכנת גיליון אלקטרוני מתאימה לצורך ניתוחים המשכיים.

ביום השביעי לאחר זריעת תאים שהודבקו ב-M tuberculosis, מיקרוסקופיה קונפוקאלית חושפת התקבצות של מונוציטים אדומים באתר הזיהום, כפי שניתן לראות בנוכחות החיידקים הירוקים המדמים את הנגעים של שחפת בבני אדם המכונים גרנולומה בתלת-ממד. הוויזואליזציה מאפשרת גמישות באינטראקציה, בבחינה ובכימות של מספר מאפיינים. תמונה בתלת-ממד, לדוגמה, בתמונות אלו המתארת מקבץ של מונוציטים באתר הזיהום של M tuberculosis.

ניתן להבחין בסידור המרחבי של חיידקים ירוקים וצבירי מונוציטים אדומים מהמבטים האפיקלי, הסיבובי והלטרלי. כצפוי, צבירים אלו לא נצפו ברקמות שאינן מזוהמות. כימות הגודל והמספר של מונוציטים, צבירי תאים ורקמות המזוהמות ב-M tuberculosis העלה כי גודלם של צבירי התאים גדל, בעוד שמספר המונוציטים הבודדים פחת בהשוואה למודלים של רקמות שאינן מזוהמות.

משתמשים פוטנציאליים במודל זה של רקמת ריאה כוללים מחקר על תפקידן של תאי חיסון שונים וחסינות רקמתית ב-tb, מחקר של פנוטיפים של mycobacteria ובדיקת מועמדים לתרופות להריגת mycobacteria בתוך הגרנולומה.