שיטה ממוחשבת לשחזור כדי לכמת את צפיפות נימים באמצעות Nailfold Capillaroscopy
27 באוקטובר 2015
קפילרוסקופיה היא מתודולוגיה לא פולשנית, יעילה, זולה יחסית וקלה ללמידה להדמיה ישירה של נימים במיקרו-סירקולציה. עם זאת, רק פרסום אחד עד כה מתאר את האמינות של תוכנה מורכבת הזמינה לכימות נתוני קפילרוסקופיה. כאן, אנו מציגים פרוטוקול פשוט ואמין לכימות נימים באמצעות אלגוריתם סטנדרטי.
המטרה הכללית של הליך זה היא לכמת את מספר הנימיים למילימטר רבוע באזור העור שנמצא ישירות מתחת לחסודה (cuticle) של הציפורן. הדבר משיג תחילה על ידי צילום מונוכרומטי של מיטת הציפורן מתחת לחסודה. השלב השני הוא ייבוא התמונה לתוכנת עיבוד תמונה במחשב.
לאחר מכן, התמונות עוברות עיבוד. כדי להמחיש טוב יותר את נימי הדם, השלב הסופי הוא זיהוי וספירה של כל הנימים בתוך שטח של מילימטר רבוע אחד. בסופו של דבר, עיבוד התמונות משמש להצגת הכמות והמורפולוגיה של נימי הדם של הפרט. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הקרדיווסקולרי, כגון כיצד יתר לחץ דם, סוכרת ומחלות אחרות עשויות להשפיע על המיקרוסירקולציה.
בעזרת מצלמה דיגיטלית מונוכרומטית, השגו תמונות של נימי דם כפי שתואר בעבר. לאחר מכן, צלמו תמונות כיול של סרגל עם סימוני מילימטרים, תוך שימוש באותה מצלמה ובתנאי הגדלה ששימשו להשגת תמונות הנימים. ייבאו את תמונת הסרגל לתוכנת דימות המחשב ומדדו את מספר הפיקסלים בקו של מילימטר אחד בצילום של הסרגל.
רשמו מספר זה וחשבו את מספר הפיקסלים הנמצאים באזור של מילימטר אחד על מילימטר אחד. לאחר מכן, פתחו את אחת מתמונות הנימיים, הגבירו את החשיכה של הנימיים והבהירו את הרקע על ידי התאמת התמונה באמצעות היסטוגרמה אופטימלית (best fit histogram). לאחר מכן, השתמשו בפקודה create ROI בתפריט הנפתח כדי ליצור אזור עניין (ROI) של מילימטר אחד על מילימטר אחד בחלק העליון של המסך.
גררו ומקמו את אזור העניין (region of interest) במיקום שבו הלולאות הנימיות הן הברורות ביותר. ודאו שאזור העניין ממוקם כך ששיאו של הלולאות הנימיות נמצא בחלקו העליון ביותר של האזור. המפתח לשחזור ולסטנדרטיזציה של שלב זה בפרוטוקול הוא מיקום נכון של תיבת אזור העניין בגודל מילימטר רבוע אחד.
כלל אצבע טוב לשמירה על סטנדרטיזציה הוא להניח את התיבה בשיא או בקצה הלולאות הנימיות של התמונה. לאחר מיקום נכון, לחצו על ה-ROI ולאחר מכן בחרו ב-crop מהתפריט הנפתח שמופיע, ואז ביצעו flatten לתמונה כך שכל התאמות התמונה העתידיות יחולו באופן אחיד על התמונה. לאחר מכן, הגבירו את הניגודיות (contrast) של התמונה ל-75 כדי שהנימים ייראו באופן מקסימלי.
במידה ונדרש, בצעו הסרת רעשים (despeckle) מהתמונה כדי להחליק את קצות הנימים. השלימו את ניגודיות התמונה על ידי התאמת ההיסטוגרמה למודל המתאים ביותר, כך שהנימים יופיעו בשחור והרקע בלבן. בכל תמונה, בחרו ידנית חלק אחד של נימה מוגדרת היטב באמצעות תכונת "target object" כדי שזו תזוהה על ידי התוכנה כאובייקט לספירה.
לאחר מכן, בחרו חלק קטן מהרקע באמצעות תכונת הרקע, שישמש כנקודת ייחוס לאזורים שיש להתעלם מהם במהלך אלגוריתם הספירה. הגדירו את הקוטר המינימלי של האובייקטים שנספרים לחמישה פיקסלים, כדי למנוע ספירה של רעשי רקע כנימים. השתמשו כעת בפונקציית הספירה כדי לספור באופן מיידי את כל הנימים בתמונה עבור כל נבדק.
ספרו את הממוצע משלוש עד ארבע תמונות על מנת לקבל הערכה מהימנה יותר. כדי לחסוך בזמן, צרו מאקרו שיבצע באופן אוטומטי רצף ספציפי של תהליכים על תמונה אחת או יותר, תחילה על ידי בחירה ב-record macro ומתן שם למאקרו בהתבסס על השלבים והתהליכים שבוצעו ואשר תוארו בסרטון זה. לאחר מכן, בצעו את שלבי העיבוד של התמונה בזמן שהמאקרו מקליט.
בעת שימוש במקרו עבור תמונות עתידיות, פשוט לחצו על run macro והתוכנה תחיל apply באופן אוטומטי את השיפורים שהוקלטו לתמונות הרצויות. השלב היחיד הדורש קלט מהמשתמש הוא בחירת אזור החיתוך (crop) של התמונה. ניתן לספור תמונה שעובדה באופן אופטימלי בתוך 30 שניות, והיא מבדילה בבירור בין נימים לרקע, וכן בין נימים בודדים זה לזה.
התמונה המשופרת הסופית מוצגת כאן. הספירה הכוללת שנקבעה עבור תמונה זו הייתה 54 קפילרים לממ"ר. לאחר שליטה בטכניקה זו, ניתן להשתמש בה כדי לכמת ולעבד 12 תמונות בתוך 20 דקות.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
קפילרוסקופיה היא שיטה לא פולשנית להדמיית נימי דם במחזור הדם המיקרווסקולרי. מאמר זה מציג פרוטוקול מהימן לכימות נימי דם באמצעות אלגוריתם סטנדרטי.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מיקרוסירקולציה
- ויזואליזציה של נימים
- מחקר קרדיו-וסקולרי
רקע
- קפילרוסקופיה מאפשרת תצפית ישירה על קפילריות.
- מחקרים קודמים סיפקו נתונים מוגבלים לגבי המהימנות של תוכנות לכימות קפילריות.
- שיטה זו חיונית להבנת המיקרוסירקולציה במחלות שונות.
- כימות קפילריות יכול לספק תובנות לגבי מצבים כגון יתר לחץ דם וסוכרת.
מטרת המחקר
- פיתוח פרוטוקול פשוט ואמין לכימות נימיים.
- שיפור ההבנה של מורפולוגיית הנימיים וכמותם.
- מענה לפערים במתודולוגיות קיימות לניתוח נימיים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- צלם תמונה מונוכרומטית של מיטת הציפורן מתחת לקו העור (cuticle).
- ייבא את התמונה לתוכנה לעיבוד תמונות במחשב.
- בצע מניפולציות על התמונה לשיפור הוויזואליזציה של הנימיות.
- זהה וספור את הנימיות בתוך שטח מוגדר (1 mm²).
תוצאות עיקריות
- הפרוטוקול מאפשר כימות מדויק של נימי דם.
- מניפולציה של התמונה משפרת את הנראות של מורפולוגיית הנימים.
- ניתן ליישם שיטה זו כדי לחקור את השפעותיהן של מחלות על מיקרו-סירקולציה.
- התוצאות יכולות להוות בסיס למחקר קרדיווסקולרי ולפרקטיקות קליניות.
מסקנות
- הפרוטוקול שפותח הוא מהימן וקל ליישום.
- הוא מספק נתונים בעלי ערך להבנת המיקרוסירקולציה.
- שיטה זו יכולה לסייע בהערכה של מצבים קרדיווסקולריים שונים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
כימות סטנדרטי של צפיפות קפילרי באמצעות קפילרוסקופיה ממוחשבת של קיפולי הציפורן נותן מענה לצורך קריטי בהערכה מיקרו-וסקולרית הדירה בשלבי הגילוי המוקדמים ובמחקר תרגומי. שיטה זו מפחיתה סובייקטיביות ועייפות של המבצע, ומאפשרת הערכה כמותית ואמינה של המיקרו-סירקולציה הרלוונטית למידול מחלות ולאישור מטרות טיפוליות. השחזוריות והיעילות שלה תומכות בקבלת החלטות מוצקה בנקודות השבח המרכזיות במסלולי הפיתוח של מחלות קרדיו-וסקולריות ומטבוליות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרות
- מאפשרה כימות אובייקטיבי של שינויים במיקרו-וסקולריזציה לצורך בדיקת השערות במודלים של מחלות.
- תומכת בתיקוף של מטרות פונקציונליות באמצעות אספקת מדדים סטנדרטיים של מיקרו-סירקולציה.
- מסייעת בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי צמצום הטיות של המבצע בהערכת צפיפות נימיים.
- משפרת את רמת הביטחון החזויה לצורך מיון ראשוני של תיקי פיתוח (portfolio triage) במחקר וסקולרי ומטבולי.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מכין בדיקות מבוססות תמונה שעברו תיקוף וניתנות לשחזור עבור סריקת תרכובות בהמשך התהליך.
- מסטנדרט את מדידת צפיפות הנימים, ובכך משפר את יכולת השחזור והניתבות להרחבה (scalability) של הבדיקה.
- מספק פלטיים כמותיים המתאימים להשוואה בין מחקרים שונים ובאתרים שונים.
- מאפשר ניתוח מהיר וחלקי-אוטומטי לתמיכה במוכנות לסריקה בקיבולת גבוהה (high-throughput screening).
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאים את הכימות המיקרו-וסקולרי לנקודות סיום הרלוונטיות למחלה לצורך פיתוח ביומרקרים תרגומיים.
- מספק רצף משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני על ידי אפשור פרוטוקולי מדידה עקביים.
- תומך בהחלטות קידום מותאמות סיכון המבוססות על נתוני מיקרו-סירקולציה חסונים.
- מפחית עמימות תרגומית על ידי קישור מדדי נימיות כמותיים לפנוטיפים של המחלה.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
שיטת קפילרוסקופיה ממוחשבת זו משתלבת ברצף שבין שלבי הגילוי לשלבים הפרה-קליניים, ותומכת הן בבדיקת השערות מוקדמת והן בהתאמה של סמנים ביולוגיים תרגומיים.
- ביולוגיה של הגילוי: מאפשרת בדיקה הדירה של היפותזות והבהרה של מסלולים במחקרי מיקרו-וסקולריות.
- סריקה: מספקת תוצאי צפיפות קפילרית כמותיים וסטנדרטיים לצורך פיתוח בדיקות והערכת תרכובות.
- אנליטיקה: מאפשרת השוואה סטטיסטית ואובייקטיבית של שינויים מיקרו-וסקולריים בין תנאים ניסיוניים שונים.
- מחקר תרגומי: תומכת בהלימה של סממנים ביולוגיים וברציפות בין מודלים in vitro למודלים in vivo כאשר המיקרו-סירקולציה מהווה נקודת סיום רלוונטית.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה זרימת עבודה חצי-אוטומטית וניתנת להרחבה, שניתן להתאימה למודלים שונים של מחלות ולצוותי מחקר שונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקרי מיקרו-וסקולריים.
- ערך תפעולי: מספק כימות סטנדרטי, הדיר ומהיר עם דרישות מינימליות להכשרה.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות go/no-go ויעילות הון על ידי אספקת נקודות קצה כמותיות וחזקות.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכון וקידום של תוכניות למחלות וסקולריות ומטבוליות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בסיסית בדימוי דיגיטלי ובפירוש של קפילרוסקופיה.
- נדרש גישה למצלמות דיגיטליות מונוכרומטיות ולתוכנה תואמת לניתוח תמונות.
- דורש סטנדרטיזציה בין-צוותית של רכישת תמונות ומיקום ROI לצורך הדירות (reproducibility).
- ניתן להתאמה למודלים שונים של מחלות שבהם מיקרוסירקולציה היא נקודת קצה (endpoint) רלוונטית.
- בחירה ידנית של ROI נשארת מקור פוטנציאלי לשונות ומצריכה הקפדה על פרוטוקול העבודה.
