Name: Cryosectioning שיטה לMicrodissection של Murine גס רירית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 16 s
Description: למד שיטת קריוסקציה למיקרודיסקציה של אפיתל קולוני במעי גס של עכברים. טכניקה זו מאפשרת בידוד אזורים שונים של קריפטות ותאי פני השטח לניתוח ביטוי גנים וחלבונים ב-PCR וב-Western blot.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

נתמך על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (DK55679, ו-DK59888 ל-A.N.). מיקרוסקופיה משולבת של הדמיה תאית של אוניברסיטת אמורי מענק מרכז הסרטן המקיף של מכון הסרטן ווינשיפ, P30CA138292, ופרס פיתוח הקריירה של קרן קרוהן וקוליטיס של אמריקה ל-CTC ופרס מלגה ל-A.E.F.

ניסויים בשימוש C57BL / 6 עכברים בין 10 ל 12 שבועות של גיל. כל נהלי שימוש בבעלי חיים היו נבדקו ואושרו על ידי ועדת אמורי האוניברסיטה המוסדית טיפול בבעלי חיים והשימוש ובוצעו על פי המכון הלאומי לבריאות בקריטריונים. 1. התקנה ניסיונית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת cryostat <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאזן cryostat ל -20 מעלות צלזיוס, כולל להב microtome ותרמילים (זהירות קיצונית סביב הלהב!). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא cryomold ריק עם אוקטובר (מתחם טמפרטורה אופטימלי חיתוך) ולאזן לC -20 ° (~ 30 דקות). הסר ב- OCT הקפואה מהתבנית ולתקן אותה על צ&#39;אק עם אוקטובר הנוזלי. מניחים את הגוש / צ&#39;אק בזרוע microtome ולאפשר ב- OCT להגדיר במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את cryostat עד 10 מיקרומטר לכל סעיף ולגלח את בלוק אוקטובר עד שהוא שטוח. חזרה זרוע microtome מהלהב בכמה סנטימטרים. בשלב זה לא להתאים את הלהב או צ&#39;אק לשארית experiment. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את סכיני גילוח: הכן 2 סכיני גילוח לדגימה. באמצעות קובץ מתכת, משעמם קצה sharped של להבים. בשלב הבא, להסיר את אוגן האלומיניום עם מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום צמרמורת צלחת פיירקס או משטח שטוח אחר על קרח יבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן צלחת לנתיחה עם 10-15 סיכות לנתיחה. 50% צלחת תרבית רקמת 10 סנטימטרים מלאים בסיליקון יספיקו. הוסף 5 מיליליטר של חיץ הנקס ב RT. </li></ol> 2. Dissection של רקמות המעי הגס דיסטלי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום עכברים בתא אטום ועכברים להרדים משאיפת isoflurane ונקע בצוואר הרחם, ולאחר מכן לרסס אתנול 70% על 12 הבטן ובית החזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות חתך קטן בעור של הבטן עם מספריים ולאחר מכן לבצע חתך על מנת לחשוף את חלל הצפק. ניתן למצוא נהלים דומים מתואר כאן 12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את המעי גס בסף האנאלי ולהפריד לפדר עד למעי הגס ללא תשלום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלו מעי גס דיסטליקטע שבין 0 ל- 6 סנטימטר מהטבעת. כאן, עומק קריפטה הוא ~ 150 מיקרומטר (ראה איור 1). לחתוך את המעי הגס longitudinally באמצעות מספריים ולהסיר את תוכן הצואה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצמד את הרקמה לצלחת לנתיחה עם המשטח הרירי פונה כלפי מעלה. למתוח את הסיכות לנתיחה רקמות באמצעות על צלחת סיליקון במאגר הנקס ולתת מנוחה במשך 10 דקות ב RT (איור 1 ג). זה מסיר קפלים מרקמות ומאפשר שכבות השרירים להירגע. </li></ol> 3. רקמות הר על cryostat עבור חתך <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחליק בסכין גילוח בחלק הרצוי של רקמה ואז לשפוך את חיץ הנקס. להוסיף סכין גילוח אחר לראש, מה שהופך את כריך. חותך את קטע הרקמה ולהסיר את הסיכות. העבר את כריך סכין גילוח / רקמה לקרח יבש. לאפשר לרקמות להקפיא (5-10 דקות, 1D איור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרים את סכין הגילוח / כריך רקמות ולאפשר לו להתחמם מעט על ידי הנחת אצבע על BL העליוןADE (צד רירית עד. זה מכוון את הרקמה, כך ששכבות שרירים בסיסיות הם מחולק ראשונה.). הפרד את הכריך ולחתוך מסביב לקצוות של מגזר הרקמה. לחתוך קטע רקמה כ, x 1 סנטימטר על 0.5 סנטימטר. יש אזורי קצה נטייה להתכרבל, גורם לחלקים הסידוריים להכיל שכבות רקמה רבות. שים לב שנגמר חיתוך טוב יותר מאשר בחיתוך, כך לטעות בצד של זהירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר לרקמות לחמם עד הקרח על גבי הרקמה מתחיל להפשיר. בשלב זה לחץ במהירות ובזהירות את הרקמה לתוך בלוק אוקטובר בcryostat. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הלהב על ידי הנחת אצבע על המדגם. העברת החום תאפשר לך להסיר את הלהב מבלי לשבש את הרקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעיל הרקמה עם אוקטובר ולאזן במשך 5 דקות. חותך סעיפים 10 מיקרומטר ב( איור 1E, F). ראייה לבדוק את החלקים עד מאורות נראים. סעיפי מקום בצינורות 1.5 מיליליטר או בשקופיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לניתוח של mRNA או חלבון, לא מקוםהוא דגימות בצינורות עם 5 קריפטה-בסיס, 5 מעבר, וסעיפי 5 לכל צינור פני השטח. לאוסף RNA להוסיף 1 מיליליטר מגיב בידוד מסחרי ולדגור על RT במשך 10 דקות. לבצע טיהור RNA על פי הוראות יצרן. השתמש 5-10 מיקרוגרם של רנ&quot;א הכל לדור cDNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטיהור חלבונים, להוסיף 0.5 מיליליטר של Ripa הקר תמוגה חיץ (בתוספת מעכבי פרוטאז) לכל 5 חלקים. Sonicate 3 פעמים במחזור של 70%, על קרח. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף דגימות למאגר SDS טעינת עמוד (חיץ Laemmli) ולדגור על 100 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. דגימות בכפוף לעמוד SDS והעברה, ואז לחסום ב5% חלב / PBS עבור שעה 2. ביצוע ניתוח מערבי כתם ואחריו דגירה עם נוגדני KLF4 (1: 500) O / N ב 4 מעלות צלזיוס. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Noah, T. K., Donahue, B., Shroyer, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+development+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Intestinal development and differentiation.</a> Exp Cell Res. 317, 2702-2710 (2011).</li>
<li>Humphries, A., Wright, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colonic+crypt+organization+and+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Colonic crypt organization and tumorigenesis.</a> Nat Rev Cancer. 8, 415-424 (2008).</li>
<li>Weber, C. R., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+bowel+disease%3A+is+it+really+just+another+break+in+the+wall%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Inflammatory bowel disease: is it really just another break in the wall.</a> Gut. 56, 6-8 (2007).</li>
<li>Bjerknes, M., Cheng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+the+isolation+of+intact+epithelium+from+the+mouse+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">Methods for the isolation of intact epithelium from the mouse intestine.</a> Anat Rec. 199, 565-574 (1981).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459, 262-265 (2009).</li>
<li>Rand, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+depletion+dissociates+and+activates+heterodimeric+notch+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Calcium depletion dissociates and activates heterodimeric notch receptors.</a> Mol Cell Biol. 20, 1825-1835 (2000).</li>
<li>Gjorevski, N., Boghaert, E., Nelson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Epithelial-Mesenchymal+Transition+by+Transmission+of+Mechanical+Stress+through+Epithelial+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Microenviron%22%5BJournal%5D)">Regulation of Epithelial-Mesenchymal Transition by Transmission of Mechanical Stress through Epithelial Tissues.</a> Cancer Microenviron. 5, 29-38 (2012).</li>
<li>Lechner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+pattern+of+laser+microdissected+colonic+crypts+of+adenomas+with+low+grade+dysplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Gene expression pattern of laser microdissected colonic crypts of adenomas with low grade dysplasia.</a> Gut. 52, 1148-1153 (2003).</li>
<li>Reizel, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colon+stem+cell+and+crypt+dynamics+exposed+by+cell+lineage+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Colon stem cell and crypt dynamics exposed by cell lineage reconstruction.</a> PLoS Genet. 7, e1002192(2011).</li>
<li>Kosinski, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+patterns+of+human+colon+tops+and+basal+crypts+and+BMP+antagonists+as+intestinal+stem+cell+niche+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Gene expression patterns of human colon tops and basal crypts and BMP antagonists as intestinal stem cell niche factors.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 15418-15423 (2007).</li>
<li>Tamura, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pit+pattern+and+three-dimensional+configuration+of+isolated+crypts+from+the+patients+with+colorectal+neoplasm%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Pit pattern and three-dimensional configuration of isolated crypts from the patients with colorectal neoplasm.</a> J Gastroenterol. 37, 798-806 (2002).</li>
<li>Geem, D., Medina-Contreras, O., Kim, W., Huang, C. S., Denning, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+dendritic+cells+and+macrophages+from+the+mouse+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of dendritic cells and macrophages from the mouse intestine.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , e4040(2012).</li>
<li>Laukoetter, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JAM-A+regulates+permeability+and+inflammation+in+the+intestine+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">JAM-A regulates permeability and inflammation in the intestine in vivo.</a> J Exp Med. 204, 3067-3076 (2007).</li>
<li>Neumann, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+commensal+bacteria+and+regional+Wnt+gene+expression+in+the+proximal+versus+distal+colon%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Gut commensal bacteria and regional Wnt gene expression in the proximal versus distal colon.</a> Am J Pathol. 184, 592-599 (2014).</li>
<li>Capaldo, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proinflammatory+cytokine-induced+tight+junction+remodeling+through+dynamic+self-assembly+of+claudins%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Proinflammatory cytokine-induced tight junction remodeling through dynamic self-assembly of claudins.</a> Mol Biol Cell. 25, 2710-2719 (2014).</li>
<li>Wells, J. M., Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+make+an+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">How to make an intestine.</a> Development. 141, 752-760 (2014).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף

המנגנונים המולקולריים המעורבים בהפצה הגס אפיתל תאים והתמיינות הם הבינו היטב. זה כולל פערים בהבנה של סביבת האיתות התאית של התא בתאי גזע בבסיס מאורות אפיתל במעי הגס שלנו. יש גם עניין גובר בתהליכים שבבסיס בידול האנתרוציט. לדוגמא, עלה הבנה של הבידול בvivo נדרשת כאמת מידה למחקרים שמטרתם לייצר במבחנה מערכות מעיים עיקריות 16. ההליך שלעיל כולל מספר צעדים שדורשים תשומת לב נוספת. ראשית, הסרת הקצוות סביב קטע הרקמה הקפוא (כאמור בסעיף 3.2) נדרש כקצות רקמת התלתל במהלך נתיחה והקפאה. כישלון להעביר תוצאות קצוות אלה הוא אוכלוסייה מעורבת של תאי שטח ובסיס קריפטה. ההרכבה הרקמה באוקטובר לחסום מראש צונן, מפולס היא גם חיונית. Tהפרוטוקול שלו יכול להיות מותאם לאזורים אחרים של מעי גס דיסטלי על ידי שינוי מספר הסעיפים בכל בריכה. לדוגמא, כפי שמוצג באיור 1, אורך קריפטה רירית משתנה בין 150-300 מיקרומטר. לכן, כאשר לומדים את האזור שבין 4 ס&quot;מ 6 סנטימטר מפי הטבעת, מספר סעיפים צריך להיות מוגבר בין 15 ל 30. חשוב לציין, פרוטוקול זה לא מומלץ למעי הגס הפרוקסימלי (7 ס&quot;מ 9 סנטימטרים) בשל קפלים ( plicae obliquae) המשתרעת לתוך הלום שהופך אותו בלתי אפשרי לתאי שטח וקריפטה-בסיס נפרדים על ידי חתך סדרתי. טכניקות חתך סידוריים שימשו ללמוד קריפטה-בסיס ומשטח אוכלוסיות תאי אפיתל בבני אדם. עם זאת, הפרוטוקול שלנו מוסיף צעדים נוספים הנדרשים בשל גודלו הקטן של רקמה עכברית. אנו מציעים כי בפרוטוקול לעיל יאפשר לחקירת קריפטה-בסיס ואוכלוסיית תאי אפיתל פני השטח במערכות עכבר גנטי צייתנית. ואכן, חלקים נקוו yieחלבון LD באיכות גבוהה וניתוח במורד הזרם המתאים RNA. יישומים עתידיים יכולים לכלול המחקר של מסלולי איתות תא או immunoprecipitation הכרומטין. עם זאת, יש לציין כי, כמו כמה מהשיטות חלופיות שתוארו לעיל, וכתוצאה מכך החלקים מכילים תערובת של תאי אפיתל propria lamina וביניים. לסיכום, הפרוטוקול המתואר כאן מספק שיטה מהירה, תשואה גבוהה לניתוח תהליכים מולקולריים באזורים במרחב המובהקים של רירית המעי עכברית.

בטנת אפיתל במעי הגס היא רקמת משובי מאוד, עם תאי גזע תושב חידוש הרקמות כל כמה ימים 1. תהליך זה של התחדשות דורש התחזוקה של תא בתאי גזע שגשוג. במשך זמן, תאי בת פיק החדש יאבדו פוטנציאל השגשוג ונודדים לעבר פני השטח luminal של המעי. ביחד עם הגירה, ותאים להתמיין enterocytes יוצרי מחסום בוגר או תאי גביע ייצור ריר. כישלון של תכנית בידול זה חשב לתרום להתפשר מחסום האפיתל כגון נצפה במחלת מעי דלקתית וסרטן מעי גס 2,3. מחקר מפורט של התהליכים לעיל דורש מתודולוגיות לבידוד אוכלוסיות קריפטה-בסיס ותאי שטח. מספר שיטות קיימות, כל אחד עם יתרונות וחסרונות ייחודיים. שיטות קיימים לבידוד של תאי אפיתל במעי כוללות פרקסוכנים, מרומם רוח וניתוק מכאני, וכתוצאה מכך הבידוד של מאורות כל, גיליונות אפיתל, או תאים בודדים, תלויים ב4,5 תנאי ניסוי. אלה הם שיטות תשואה גבוהות, אך שינויים באיתות אינטר כבר דיווחו בתנאים אלה שלא יכולים לייצג את הסביבה המקומית 6,7. microdissection ללכוד לייזר מאפשר לאיסוף חומר שונה במרחב, אבל משיג תשואת 8,9 מולקולרי נמוכה. ברקמת מעי הגס אנושית, שיטות cryosectioning אופקיים סידוריים פותחו 10. עם זאת, רקמות הריריות עכברית הן להחריד קטנות לניכוס ישיר של טכניקה זו. בבני אדם, באורכי קריפטה מעיים (הרחוקים בין הכוך-הבסיס ותאי שטח) במעי הגס נע בין 100-1,000 ~ מיקרומטר 11. בעכברים, אורכי קריפטה הם בין 50-300 ~ מיקרומטר (ראו איור 1 א). הגודל הקטן של מאורות עכברי מציב אתגר לIsolation של שתי אוכלוסיות תאים אלה תוך שימוש בפרוטוקולים קיימים. עכשיו אנו מתארים בעלות נמוכה, שיטת תשואה גבוהה לבידוד של קריפטה-בסיס ומשטח אוכלוסיית תאי אפיתל במעי הגס רקמה עכברית. רקמה שנקטפו באופן זה עשויה אז להיות מנותח על ידי מספר היישומים במורד הזרם סטנדרטיים, כוללים מכתים immunofluorescence, RT-PCR (תגובת שרשרת זמן-פולימראז ריאל) או מערבי סופג.

<table><tbody><tr><td>Microtome</td><td>Leica Biosystems, Nussloch גרמניה</td><td>CM 1510-3</td><td></td></tr><tr><td>MyiQ גלאי PCR בזמן אמת</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM 510&nbsp;</td><td>מיקרוסקופ קונפוקלי</td> <td>Carl Zeiss</td><td></td></tr><tr><td>OCT</td><td>Tissue-Tek, Sakura Finetek, Torrance CA</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>cryo-mold</td><td>Tissue-Tek, Sakura Finetek, Torrance CA</td><td>4557</td><td>25mmx20mmx5mm</td></tr><tr><td>להב מיקרוטום בפרופיל גבוה</td><td>Leica Biosystems, Nussloch גרמניה</td><td>818</td><td></td></tr><tr><td>GEM להבים תעשייתיים</td><td>סכיני גילוח בטיחות אמריקאים</td><td>62-0314</td><td></td></tr><tr><td>בסיס אלסטומר סיליקון סילגארד</td><td>דאו קורנינג, מידלנד MI</td><td>3097358</td><td></td></tr><tr><td>27 1/2 גרם מחט</td><td>בקטון-דיקינסון, פרנקלין לייקס, ניו ג'רזי</td><td>305109</td><td>פינים לדיסקציה</td></tr><tr><td>TRizol</td><td>Life Technologies</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן ZO-1</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>187430</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן KLF4</td><td>איתות תאים</td><td>4038S</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן mGAPDH</td><td>Sigma</td><td>G8795</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן משני אלקסה מצומד</td><td>Invitrogen</td><td>A11034</td><td>488 נוגדן נגד ארנב</td></tr><tr><td>מצומד HRP משני</td><td>ג'קסון</td><td>111/115-001-003</td><td>ארנב/עכבר&nbsp;</td></tr><tr><td>Topro-3</td><td>Invitrogen</td><td>T3605</td><td></td></tr><tr><td>HANKs מאגר מלח מאוזן</td><td>Life Technologies</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>RIPA מאגר</td><td></td><td></td> ליזה <td>50mM Tris-HCl pH 7.4 150mM NaCl 1% NP40 0.25% Na-deoxycholate</td></tr><tr><td>פריימר TBP</td> 3'GGAATTGTACCGCAGCTTCAAA <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>פריימר TBP</td> 5'GATGACTGCAGCAAATCCTT <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>פריימר KLF4</td> <td>3'TGTGACTATGCAGGCTGTGGCAAA</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>פריימר KLF4</td> <td>5'ACAGTGGTAAGGTTTCTCCCCTGT</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

cryosectioning שיטה לmicrodissection של murine גס רירית

Cryosectioning Method for Microdissection of Murine Colonic Mucosa

רקמת רירית המעי הגס מספקת מחסום חיוני לאנטיגנים לומינליים. מחסום זה מורכב משכבה אחת של תאי אפיתל עמודים פשוטים. אפיתל המעי הגס מתהפך באופן דינמי ותאי אפיתל נוצרים בתאי הגזע המכילים קריפטות של ליברקון. תאי אב המיוצרים בבסיסי הקריפטה נודדים לעבר פני השטח הלומינליים, ועוברים תהליך של התמיינות תאית לפני שהם נשפכים ללומן המעי. על מנת לחקור תהליכים אלה ברמה המולקולרית, פיתחנו שיטה פשוטה למיקרו-דיסקציה של שני אזורים נפרדים מרחבית ברירית המעי הגס; אזור הקריפטה המתפשט, ותאי האפיתל של פני השטח המובחנים. מטרתנו היא לבודד קריפטות ספציפיות ואוכלוסיות תאי אפיתל על פני השטח מרירית המעי הגס של העכבר לבידוד RNA וחלבון.

קטעי רקמת מעי הגס עובדו להערכה היסטולוגית ו- H &amp; E מכתים 13. צפה בחתך מסורתי של הרירית נראה באיור 2 א. אזורים בסל מכילים פנימית וחיצוני muscularis, מורכב בעיקר מmuscularis המעגלי. ימשיך לכיוון הלום, רירית muscularis ניכרה בסמוך לתאי האפיתל קריפטה-בסיס, תאי מעבר נמצאים באמצע של הרקמה, ובסופו אוכלוסיות תאי שטח, להתמודד לומן המעי. שיטת חתך הסידורי המתוארת כאן שומרת על נטייה כזו שmuscularis האורך והחוזר נתקל לראשונה (איור 2), ואחריו את רירית muscularis (איור 2 ג). שים לב למראה של תאי ביניים שאינם שריר בחלק השמאלי העליונה של התמונה. לניתוח במורד הזרם מתואר להלן, סעיפי שריר מבוטלים. הסעיפים הבאים מכילים תאי אפיתל ורקמת ביניים (propria lamina), החל בתאי קריפטה-הבסיס (איור 2 ד). שים לב להעדרו של לומן מרכזי ברוב מאורות, המופיעים כהה יותר בשל הגרעינים הצפופים. שכבות אלה מכילים תא השגשוג. תאי המעבר מופיעים כצפופים בלוטות עם לומן בולט מרכזי (2E איור). לבסוף, יש לי אוכלוסיות תאי שטח מבנה לא סדיר, עם אזורים של monolayer אפיתל נצפה en פנים (איור 2F). סעיפים סידוריים כפי שתואר לעיל עשויים גם להיות מעובד לתיוג immunofluorescence ומיקרוסקופיה confocal (כפי שמתוארים כאן 14). איור 2G תערוכות מאורות מבודדים הקבועים וpermeabilized במתנול 100% ולאחר מכן מוכתמים לגרעינים (כחול) וחלבון צומת תאי תאי Zonula Occludens 1 (הסתדרות ציונית-1, ירוקה). בכיוון חתך המסורתי, תא קריפטה ומשטח ניתן לצפות בו זמנית (איור 2G </stronז&gt;). שים לב שקווי כתם junctional ZO-1 לומן של קריפטה המעי הגס. בטנת Z0-1 זה של לומן גם ניתן לראות בדוגמאות מחולקים סידוריים של אוכלוסיות תאי מעבר, במרכז של הבלוטות עגולות (איור 2G). כתם ZO-1 משופר נראה באוכלוסיות תאי שטח (איור ט 2 וי). גורמי בידול כמה ידועים להתבטא באופנת spatiotemporal לאורך ציר קריפטה-קרקע. זה כולל את הגורם כמו-Kruppel גורם שעתוק 4 (KLF4), אשר ידוע להיות מועשרים באוכלוסיות תאי שטח. שימוש בשיטות מסורתיות חתך, KLF4 נמצא בגרעינים של לומן מול אוכלוסיות תאי שטח (איור 2K). לפיכך, אנו מעריכים כי KLF4 mRNA יתבטא בעיקר באוכלוסיות תאי שטח. כדי לבדוק זאת, סעיפים סידוריים נאספו וקובצו לדגימות פני השטח, וכוך-בסיס מעבר. Subsequently, RNA היה לקצור באמצעות מיצוי Trizol סטנדרטי, עם טיהור נוספת על ידי טור RNeasy וטיפול DNAse. RNA נאסף מסעיפים 5 רצופים ונקווה, שהניבו בין 5-10 מיקרוגרם של RNA הכולל לדגימה. דגימות אלה אז היו נתונים בזמן אמת חצי כמותית PCR לשני KLF4 וגן התייחסות, חלבון TATA תיבה מחייבת 1 (TBP-1) (איור 2L) 14. כפי שניתן לראות באיור 2L, לאחר הנורמליזציה לTBP-1, תאי שטח נמצאו להביע עד 8 ​​פעמים mRNA KLF4 שבאו לידי ביטוי בתאי קריפטה. כמו כן, רמות חלבון KLF4 נמצאו להציג רגולציה המרחבי לאורך ציר קריפטה-פני השטח. סעיפים סידוריים היו נקווים כמתואר לעיל ולאחר מכן מודגרות במאגר תמוגה במשך 20 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. זה הניב בין 200-250 מיקרוגרם של חלבון לכל מדגם. דוגמאות אז היו נתונים ניתוח על ידי SDS-עמוד (איור 2M) 15. כפי שניתן לראות באיור 2M, עמ &#39;KLF4רמות rotein הן דרמטית גבוהות יותר באוכלוסיות תאי שטח. הממצאים לעיל מדגימים את היכולת של פרוטוקול זה לבודד את הכמויות גדולות של פני השטח ותאי אפיתל קריפטה מרירית המעי עכברית. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53112/53112fig1.jpg" /> איור 1: (א) רירית מראה סכמטי עכברית מעי הגס ושכבות שרירים חיצוניות. השיטה שלנו שואפת לאסוף אוכלוסיות תאי תא השטח וקריפטה-בסיס דיסקרטיים על ידי cryosectioning הסידורי (10 מיקרומטר כל אחד). שכבות השרירים חיצוניות מבוטלים. גובה (B) קריפטה משתנה לאורכו של המעי הגס (מרחק בין שכבות קריפטה-בסיס ומשטח). נקודות הנתונים מצביעות על מדידות קריפטה בודדות וסימנים מצביעים על משכפל ביולוגי (n = 4). מגזרים (C) קולון נאספו, נחצה, והצמידו על צלחת סיליקון לנתח. רקמה (ד) segment כ 3 סנטימטר מהטבעת נלחץ בין לסכיני גילוח וקפוא בקרח יבש. רקמות (E) אז רכובים על בלוק אוקטובר-מפולס מראש. (F) cryosections יוסרו ובחינה חזותית. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53112/53112fig2.jpg" /> איור 2:. נציגי נתונים () רקמת המעי הגס מוכתמת Hematoxylin-Eosin בחתך מראה את muscularis העגול (סנטימטר), רירית muscularis (מ&quot;מ), תאי קריפטה-בסיס, תאי מעבר, ותאי שטח. (ב - ג) שכבות שרירים מעי הגס. (ד) תאי קריפטה-בסיס. שים לב להעדרו של לומן מרכזי. (ה) תאים מעבר. (F) תאי שטח. הכתמה (G) Immunofluorescence של מאורות מעי הגס מבודדים. ZO-1 (ירוק) וגרעינים (כחולים) הם נצפו בחתך. (HI) ZO-1 וצביעה בגרעין תאי מעבר ומשטח. תצוגה מוגדלת של מכתים ZO-1 (J). (K) KLF4 (ירוק) מועשר באוכלוסיות תאי שטח. בזמן אמת הערכת PCR של רמות KLF4 mRNA בין שלושה התאים (L). ניתוח כתם מערבי של רמות חלבון KLF4 באוכלוסיות תאים אלה (M).

כאן אנו מתארים שיטה פשוטה לבידוד של תאי פני השטח של המעי הגס של עכברים מובחנים מרחבית מתאי בסיס הקריפטה הבסיסיים.

Cryosectioning שיטה לMicrodissection של Murine גס רירית

The colonic mucosal tissue provides a vital barrier to luminal antigens. This barrier is composed of a monolayer of simple columnar epithelial cells. The ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבצע מיקרו-דיסקציה של שני אזורים מובחנים מרחבית במעי הגס: אזור קריפטות ה-K הפרוליפרטיבי ותאי אפיתל השטח המובחנים. דבר זה מושג תחילה על ידי הסרת מעי הגס של העכבר. השלב השני הוא הקפאת הרקמה בין שתי פלטות מתכת.בשלב הבא, הרקמה מותקנת על גבי בלוק OCT שפולים מראש. השלב האחרון הוא חיתוך הרקמה בקריוסטט במרווחים של 10 מיקרון. לבסוף, נעשה שימוש ב-PCR בזמן אמת או ב-Western blot כדי להראות שינויים בביטוי הגנים והחלבונים.היתרון בטכניקה שלנו הוא שהיא מהירה, זולה ומניבה תפוקה גבוהה. הפרוצדורה בוצעה על ידי כריסטיאן גרנר שמידט, טכנאי בקבוצה שלנו. כל ההליכים שכללו בעלי חיים נבחנו ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת אמורי, ובוצעו בהתאם לקריטריונים של המכונים הלאומיים לבריאות (National Institutes of Health).לאחר הגדרת הקריוסטט, כפי שנעשה בדרך כלל, יש להביא את להבי הקריוסטט ואת התפסנים לטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס. לאחר מכן, מלאו תבנית קריו ריקה בתרכובת OCT (optimal cutting temperature compound) והביאו אותה לטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס. תהליך זה יארך כ-30 דקות.הוצא את ה-OCT הקפוא מהתבנית וקבע אותו לראש המיקרוטום (chuck) באמצעות OCT נוזלי. הנח את הראש בזרוע המיקרוטום והמת 10 דקות עד להתקשחות ה-OCT. הגדר את הקריוסטט לעובי של 10 מיקרון לחתך, וגזז את בלוק ה-OCT עד שיהיה שטוח, ולאחר מכן הרחק את זרוע המיקרוטום מספר סנטימטרים מהלהב.בשלב הבא, הכינו שני להבי תער לכל דגימה באמצעות פצירה ממתכת, כדי להקהות את הקצה החד של הלהבים. לאחר מכן, הסירו את שולי האلومניום בעזרת פינצטה. הכינו צלחת תרבית רקמה בקוטר 10 סנטימטרים, מלאה ב-50% בסיליקון, ועם 10 עד 15 סיכות נישור.הוסיפו חמישה מיליליטרים של hanks buffer בטמפרטורת החדר לצלחית לאחר קטילת העכבר בשיטות מאושרות וחיתוך מקטע דיסטלי של המעי הגס במרחק של בין 0 ל-6 סנטימטרים מהפיחוס. השתמשו במספריים לחיתוך. פתחו את המעי הגס לאורכו והסירו את תכולת הצואה.הדביקו את הרקמה לצלחת הניתוח מסיליקון המכילה Hank's buffer, כאשר הפני המוקוזלי פונה כלפי מעלה. מתחו את הרקמה באמצעות סיכות ניתוח. לאחר מכן, הניחו לה לנוח במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר כדי להסיר קפלים מהרקמה ולאפשר לשכבות השריר להירגע.לאחר שהרקמה נחה, הסירו את כל הנעצים למעט אלו שבקצוות. החליקו להב תער תחת מקטע הרקמה הרצוי, ולאחר מכן שפכו את ה-hanks buffer. הוסיפו להב תער נוסף לחלק העליון כדי ליצור מבנה דמוי "סנדוויץ'".חתוך את מקטע הרקמה והסר את פיני הקצה. העבר את "סנדוויץ'" הרקמה עם להב התער לתוך קרח יבש. אפשר לרקמה לקפוא למשך חמש עד 10 דקות.הרימו את "סנדוויץ'" רקמת התער ולמדו אותה להתחמם מעט על ידי הנחת אצבע על הלהב העליון. הפרידו את הסנדוויץ' וגזרו סביב קצותי מקטע הרקמה. גזרו מקטע רקמה בגודל של כ-0.5 סנטימטר על סנטימטר אחד.אפשרו לרקמה להתחמם עד שהקרח שמעליה מתחיל להמיס. בנקודה זו, לחצו את הרקמה במהירות ובזהירות אל תוך בלוק ה-OCT. בתוך הקריוסטט, הניחו אצבע מעל הדגימה.העברת החום תאפשר לך להסיר את הלהב מבלי לפגוע ברקמה. קבע את הרקמה ב-OCT והמתן חמש דקות להשגה של שיווי משקל. לאחר מכן, חתוך שכבות בעובי של 10 microns.הניחו את החתכים על שקופית ובדקו אותם חזותית עד להופעת הקריפטות. העבירו את החתכים למבחנות של 1.5 מיליליטר או על שקופיות. תמונה זו מציגה רקמת מעי גס שצבעה ב-hematin eoin בחתך רוחבי מסורתי, כאשר השריר המעגלי (circular muscularis) מסומן כ-cm.השרירית של הרירית (muscularis mucosa) המסומנת כ-MM; תאי בסיס הקריפטה, תאים מעבריים ותאי פני השטח נראים בבירור. תמונה זו מציגה את השרירית המעגלית לאחר חיתוך סדרתי. ככל שמתקדמים לעבר תאי פני השטח, ניתן לראות את השרירית של הרירית.תמונה זו מציגה תאי בסיס של קריפטה שנצבעו עבור h ו-D בהגדלה גבוהה יותר. שימו לב להיעדרה של לומן מרכזי. כאן נראים תאים מעבריים, ותמונה זו מציגה את תאי השטח.התמונות הבאות מציגות צביעה אימונופלורסצנטית של קריפטות מעי גדול מבודדות, כאשר הצביעה היא עבור חלפון נקודות החיבור בין התאים. Zo-1 (occludin-1) מופיע בירוק וגרעינים, המופיעים בכחול, נצפים בחתך רוחבי. תאי השטח והתאים המעבריים מוצגים כאן לאחר חיתוך סדרתי.מספר גורמי דיפרנציאציה מובעים באופן מרחבי-זמני לאורך ציר פני השטח של הקריפטה. זה כולל את גורם השעתוק cripple like factor four המוצג בירוק, המועשר באוכלוסיות תאי פני השטח כאשר נבחן בחתך רוחבי; חיתוך סדרתי מאפשר הערכת real-time PCR של רמות mRNA של KLF ארבע בין שלושת התאים. לבסוף, western blot זה מדגים את רמות חלבון KLA ארבע באוכלוסיות תאים אלו.אל תשכחו כי עבודה עם להבי מיקרוטום עלולה להיות מסוכנת ביותר, לכן היו זהירים במיוחד בכל פעם שאתם מבצעים הליך זה.

cryosectioning-method-for-microdissection-of-murine-colonic-mucosa

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

בסרטון זה אנו מדגימים טכניקה לבידוד קריפטים שלמים מהמעי הדק של עכבר. ניתן להשתמש בקריפטים השלמים המבודדים כדי להפיץ אורגנואידים תלת-ממדיים מאריכי חיים ומתחדשים במבחנה.

בידוד קריפטים במעי: שיטה לבידוד קריפטות שלמות ממודל המעי הדק של מורין

יש התעניינות הולכת וגובר בהבנת הפונקציות החיסוניות של אוכלוסיות מסוימות של תאים בתיקונים של Peyer (PPS), אתרים אינדוקטיביים העיקריים של רקמות הלימפה מעיים כרוכות בכך. כאן אנו מתארים פרוטוקולים מקבילים להכנת PP הכנות תא בודדות לניתוח cytometric זרימה וcryosections PP לimmunostaining.

וגם בידוד Immunostaining ימפוציטים ותאי דנדריטים מהתיקונים של Peyer Murine

Myofibroblast הוא תא סטרומה השפעה של מערכת העיכול המווסת את התהליכים פיסיולוגיים חשובים במדינות שניהם נורמליות ומחלה. אנו מתארים טכניקה המאפשרת בידוד של myofibroblasts העיקרי משני בעכבר ורקמת מעי גס אנושית, אשר יכול להיות מנוצל לניסויים במבחנה.

בידוד של ראשוני myofibroblasts מעכבר ורקמות מעי גס אנושיים

מתואר השימוש במכשיר פשוט לחיתוך ו'גלגול' מעיים של עכברים להכנה מהירה של תכשירים שלמים.

מכשיר פשוט להכין במהירות mounts כל ממעי העכבר

קריו-סעיפים רצופים נאספים כדי לאפשר יישומים היסטולוגית והעשרה של RNA למדידות ביטוי גנים באמצעות אזורים סמוכים מתוך שרירי שלד יחיד עכבר. RNA באיכות גבוהה מתקבל מ 20 - 30 מ"ג של cryosections ומדידות ונקווה מושווים ישירות בין יישומים.

Cryosectioning של רציף אזורים של שרירי שלד עכבר אחת על ביטוי גנים ועל ניתוח היסטולוגית

המטרה של פרוטוקול זה היא להשיג דגימות RNA גבוהה-שלמות של הגרעינים המעית מבודד מבולבל, resected טריים מעיים רקמה אנושית באמצעות לייזר לכידת microdissection (LCM). פרוטוקול זה כולל הכנת קפואה דגימות של רקמות אנושיות מעיים, cryosectioning, ethanolic מכתים, התייבשות, הפונקציה LCM, והפקת RNA.

אופטימיזציה של לכידת לייזר Microdissection עבור בידודו של הגרעינים המעית מרקמות אנושיות מוקפאות

תאים Enterochromaffin (EC) מהווים תת קבוצה קטנה של מערכת העיכול תאים אפיתל. תאים EC חשמלית טמפרמנט, לשחרר סרוטונין, אך קשיים culturing זיהוי תאים EC מוגבלת מחקרים פיזיולוגיים. השיטה המוצגת כאן יוצר מודל תרבות ראשי לבצע בדיקה של תאים בודדים EC מאת אלקטרופיזיולוגיה.

אלקטרופיזיולוגיה התא כולו של ראשי Enterochromaffin מאתר בתרבית תאים

היעדר סטנדרטיזציה לעיבוד רקמות מאתר מפחית את האיכות של ניתוח histopathological מאתר לעומת דגימות אנושי. כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לבצע בדיקה histopathological מאתר מודלק, uninflamed הגס רקמות כדי להראות את הכדאיות של מערכות רובוטיות בשימוש שגרתי עבור עיבוד והטבעה דגימות אנושי.

באמצעות מערכות רובוטיות כדי לעבד ולהטביע דגימות מאתר חוקן עבור ניתוחים היסטולוגית

המטרה של פרוטוקול זה היא לבודד את התאים המונונרורים השוכנים בתוך המעי הגס של הנקודתיים על ידי העיכול אנזימטית של הרקמה באמצעות קולגן. פרוטוקול זה מאפשר בידוד יעיל של תאים מוניוצלולים וכתוצאה מכך השעיית תא בודד אשר בתורו יכול לשמש עבור immunophenotyping קלדה חזקה.

בידוד של לינה קינאין תאים מונמוננקה מקולון מורלין באמצעות קולגנאז

כאן, אנו מספקים תיאור מפורט של ההליך כדי לגרום ביופסיות צביטה מונחה קולונוסקופית בעכברים ולעקוב אחר סגירת פצע בזמן אמת. בנוסף, מסופקות שיטות להכנת רקמות לניתוחים היסטולוגיים, אימונוהיסטוכימיים ומולקולריים של מיטת הפצע.

ביצוע ביופסיות צביטה קולונוסקופיות מונחות בעכברים והערכת שינויים ברקמות הבאים

הפרוטוקול הנוכחי מתאר הקמת מערכת אורגנואידית של המעי הגס כדי לחקור את הפעילות והתפקוד של תאי גזע המעי הגס במודל נוקאאוט של קלודין-7.

תרבית תלת-ממדית של קריפטות המעי הגס של מורין לחקר תפקוד תאי גזע במעיים ex vivo

למד שיטת קריוסקציה למיקרודיסקציה של אפיתל קולוני במעי גס של עכברים. טכניקה זו מאפשרת בידוד אזורים שונים של קריפטות ותאי פני השטח לניתוח ביטוי גנים וחלבונים ב-PCR וב-Western blot.

Cryosectioning שיטה לMicrodissection של Murine גס רירית

גלה סרטונים נוספים