Name: ניתוח ביטוי מירנה ברקמות קליניות בסרטן הערמונית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 29 s
Description: למדו פרוטוקול מופשט לניתוח ביטוי מירנה ברקמות FFPE של סרטן הערמונית באמצעות PCR בזמן אמת והכלאה in situ. השיטה מאפשרת זיהוי ביומרקרים לדיאגנוסטיקה ופרוגנוזה של מחלה זו.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לד&quot;ר רוג&#39;ר אריקסון על תמיכתו וסיוע בהכנת כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לסרטן במכונים הלאומי לבריאות (גרנט מספר RO1CA177984; RO1CA138642), פרויקט תכנית VA בסרטן הערמונית (BX001604).

קבוע פורמלין, משובץ פרפין (FFPE) או דגימות סרטן ערמונית קפואים התקבלו מSFVAMC. דגימות מחולי סרטן הערמונית שעברו כריתה רדיקלית של ערמונית בSFVAMC. נכתב הסכמה מהדעת התקבלה מכל החולים והמחקר אושר על ידי ועדת קליפורניה בסן פרנסיסקו על מחקר אנושי. לחלופין, microarrays רקמות סרטן הערמונית היו רכש ממקורות מסחריים ומשמש למירנה ניתוחים על ידי איש. מידע Clinicopathological ומעקב לחולי סרטן ערמונית ניתחו נאסף. 1. דגימות רקמה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך דגימות רקמת סרטן ערמונית לסעיפים 10 מיקרומטר באמצעות microtome וכתם עם H &amp; E הבאה הפרוטוקול של היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סקור שקופיות צבעוניות לזיהוי מוקדי סרטן ערמונית כמו גם אפיתל בלוטות נורמלי סמוך. הערה: הפתולוג לוח מוסמך לבחון את השקופיות ואמא H &amp; E מוכתמותRK לגידול ואזורים נורמלים. השתמש בשקופיות סומנו כמדריכים בסעיפים הבאים למירנה ניתוחים מגידול לעומת אזורים נורמלים. </li></ol> 2. ניתוח ביטוי מירנה על ידי בזמן אמת כמותי PCR הערה: זרימת עבודה זו כוללת את השלבים הבאים: microdissection לייזר לכידת, בידוד של רנ&quot;א הכל (כולל מירנה וmRNA), assaying של miRNAs הבוגר באמצעות מבחני ביטוי TaqMan MicroRNA כמפורט בסעיפים הבאים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> RNA הפקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בידוד של מירנה מערמונית רקמות FFPE סרטן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> microdissection ללכוד לייזר (LCM) הערה: בצע את השלבים 2.1.1.1.1- 2.1.1.1.4 במנדף כימי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן שקופיות רקמה (10 מיקרומטר חלקים) לLCM. סעיפי רקמות Deparrafinize על ידי השרייה בקסילן (2x), במשך 10 דקות כל אחד, אז רעננות הרקמות על ידי דוגרים השקופיות עבור 5 דקות כל אחד באתנול מדורג (100%, 95%, 90%, 80%, 70%) ואחריו מזוקק מים(5 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות התייבשות, קטעי כתם עם hematoxylin למשך 30 שניות ואחריו מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רקמות מקום באתנול מדורג (70%, 95% 90%, 80%, 70%) (5 דקות כל אחד) וקסילן (5 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגלשות יבשים במנדף ולאחר מכן למקם במכשיר LCM לmicrodissection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע microdissections עם מערכת LCM בהתאם להוראות היצרן 24. פתולוג השימוש מסומן שקופיות כמדריכים לזיהוי מוקדי סרטן ערמונית, כמו גם הרקמה נורמלית סמוכה. השתמש בקרן הלייזר בקוטר 10-20 פעימות מיקרומטר עם כוח של 70-90 mW. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אזורי לכידתו של עניין עם פעימות לייזר אינפרא-אדומים על כובעי LCM. לשלב תאים 2-5 כמוסות להפקת מירנה לדגימה. כדי להבטיח את השלמות של RNA חילוץ, מייד לעבד תאים שנתפסו להפקת מירנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, תאי lyse במאגר חילוץ מירנה (על פי הפרוטוקול של היצרן) וSTOמחדש lysates ב -80 מעלות צלזיוס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מירנה הפקה וניתוח מרקמות microdissected LCM <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלץ RNA המוחלט מרקמות microdissected FFPE באמצעות ערכה מסחרית הבאה הוראות היצרן. הערה: התשואה של רנ&quot;א מmiscrodissection לכידת לייזר היא בדרך כלל נמוכה. לכן, RNA הוא eluted להיקפים נמוכים (20-30 μl) ומשמש לפרופיל ביטוי באמצעות מבחני ביטוי TaqMan microRNA הבאים הוראות יצרן (גם מתואר בסעיף 2.2). אופטימיזציה של RNA קלט בזמן אמת איתור PCR של miRNAs הבוגר עולה כי 5 μl של רנ&quot;א eluted הוא אופטימלי עבור כל תגובת שעתוק לאחור מירנה ספציפית. כשליטת אנדוגני, משמש RNU48 / RNU24. לתגובות שליטה, 2 μl של רנ&quot;א eluted משמש לתגובת השעתוק לאחור. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בידוד של מירנה מערמונית רקמות קפואות סרטן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Homogenize קפוא רקמות ערמונית כריתה על ידי שחיקה הרקמות בחנקן נוזלי באמצעות מכתש ועלי. העבר את הרקמה הומוגני לצינור microcentrifuge בעזרת מרית מקוררת. לשמור מרגמה / העלי ומרית באותה הטמפרטורה על ידי טבילה ברקמה כל כך הומוגני חנקן נוזלי ניתן להעביר בקלות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף מגיב guanidine המסחרית isothiocyanate-פנול (1 מיליליטר / 0.1 גרם של רקמה) לרקמה הומוגני ודגירה בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות. הערה: רקמות הומוגני במגיבה isothiocyanate-פנול guanidine המסחרית יכולות להיות מאוחסנות ב -80 מעלות צלזיוס במשך כמה חודשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף כלורופורם לhomogenate (0.2 מיליליטר כלורופורם / מיליליטר) ולנער במרץ למשך 30 שניות. דגירה דגימות ב RT במשך 3-5 דקות ואחריו צנטריפוגה ב 10,000 XG במשך 20 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את השלב העליון המימי לצינור 1.5 מיליליטר טרי סטרילי RNase ללא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף נפח שווה של אלכוהול איזופרופיל. לערבב דגירה במשך 10 מילn ב RT ואחריו צנטריפוגה ב XG 12,000 במשך 20 דקות ב 4 מעלות צלזיוס עד גלולה RNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant ולשטוף את גלולה RNA עם 1 מ&quot;ל של אתנול 70%. צנטריפוגה ב XG 12,000 במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לשאוב supernatant. כדורים יבשים RNA ב RT למשך 5-10 דקות. לפזר RNA ב50-100 nuclease ללא מים μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע כימות של RNA באמצעות ספקטרופוטומטר nanodrop ולקבוע שלמות RNA עם bioanalyzer. התאם ריכוזי RNA עד 10 ng / μl. השתמש 10-50 RNA ng לתגובת cDNA הספציפי miRNA- אחרי זמן אמת PCR ניתוחים (סעיף 2.2). </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PCR בזמן אמת כמותי לניתוח ביטוי מירנה הערה: miRNAs הבוגר Assay באמצעות פרוטוקול RT-PCR שני שלבים כמפורט להלן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך תמלול (RT) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך לתמלל cDNA מ- RNA באמצעות ערכת שעתוק לאחור מירנה בהתאם להוראות היצרן.השתמש 10-50 ננוגרם של רנ&quot;א הכל עם פריימר הספציפי מירנה מערכת מבחני MicroRNA וRT. השתמש RNU48 / RNU24 / RNU6B שולטת. לדלל cDNA 1: 5 ל01:10 (תלוי בשפע של מירנה ניתחה) ולהשתמש בזיהוי PCR בזמן אמת כפי שמתוארת בשלב הבא. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזמן אמת PCR לאיתור של מבוגרים מירנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגביר מוצרי ה- PCR מדגימות cDNA באמצעות מבחני MicroRNA עם תערובת אמן אוניברסלית מהירה בהתאם להוראות יצרן. לנרמל דגימות לRNU48 / RNU24 / שליטת RNU6B. השתמש בשיטה ההשוואתית CT (מחזור סף) כדי לחשב את השינויים יחסי בביטוי גנים במערכת ה- PCR בזמן אמת מהירה. לנתח כל דגימה בשלושת עותקים. </li></ol></li></ol></li></ol> ניתוח ביטוי 3. מירנה על ידי באתרו הכלאה (עורך) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום טיפול ברקמות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך 5 מיקרומטר חלקים מלוקי רקמת סרטן ערמונית FFPE באמצעות microtome. </li><lאני&gt; תקן סעיפי רקמות על ידי דוגרים השקופיות על 56 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. הערה: ניתן לאחסן שקופיות ב RT במשך כמה שבועות למירנה ניתוחים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Deparrafinize הרקמות על ידי שריה השקופיות עם קסילן (2x), במשך 15 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רעננות הרקמות על ידי דוגרים השקופיות עבור 5 דקות כל אחד באתנול מדורג (100% (2x), 95%, 90%, 80%, 70%) ואחריו מים מזוקקים (5 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את השקופיות עם paraformaldehyde 4% ב- ​​PBS בטמפרטורת חדר למשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את השקופיות עם PBS (2x) בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פנק את השקופיות עם 10 מיקרוגרם / מיליליטר proteinase K ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות במאגר K proteinase המחומם מראש (5 טריס-HCL מ&quot;מ pH 7.4, 1 mM EDTA, 1 מ&quot;מ NaCl). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות טיפול proteinase-K, לשטוף את השקופיות עם גליצין 0.2% ב PBS למשך 30 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שקופיות בPBS (1X) בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את השקופיות עם Paraformaldehyde 4% ב- ​​PBS במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגלשות יש לשטוף עםPBS במשך 5 דקות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכלאה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום להכליא את השקופיות עם פתרון הכלאה מראש במשך 3-4 שעות על 55 מעלות צלזיוס בתא humidified. השתמש במגבוני מעבדה רקמה ספוגים ב- 50% SSC פוראמיד / 50% 5x כדי לשמור על התא humidified. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 5 בדיקות &quot;שכותרתו digoxigenin בריכוז של 20-50 ננומטר במאגר הכלאה. לדלל בדיקה מירנה ספציפית (20-50 ננומטר) ובדיקה קטנה RNA הגרעיני שליטת U6 (20 ננומטר), חום ב -90 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות, מניח אותו על קרח, ולהוסיף למאגר הכלאת קרח קר (2-4 ng / μl ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר פתרון הכלאה מראש, להוסיף פתרון הכלאה (בדיקה + חיץ הכלאה, לכל שקופית 100 μl), דגירה של 12-16 שעות בטמפרטורת הכלאת בדיקה ספציפית (טמפרטורת הכלאה = בדיקה-21 Tm מעלות צלזיוס). לבצע הכלאות בתא humidified (50% פוראמיד / 50% SSC 5x). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלבי כביסה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את השקופיות עם 2x SSC במשך 10 דקות ב 45 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף tהוא מחליק עם SSC 1.5x במשך 10 דקות ב 45 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את השקופיות עם SSC 0.2X (2x) על 37 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה שקופיות עם פתרון חסימת 1x במשך 1-2 שעות בטמפרטורת חדר </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זיהוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה השקופיות עם 1: 100 PBS בדילול נוגדן אנטי digoxigenin AP-מצומדות ל1-4 שעות או הלילה בשעת 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את השקופיות עם PBS (3x) בטמפ &#39;החדר למשך 10 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את השקופיות (2x) עם אלקליין phosphatase חיץ (100 מ&quot;מ טריס pH 9.5, 50 מ&quot;מ MgCl 2, 100 מ&quot;מ NaCl, Tween-20 0.1%) ב RT במשך 5 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה השקופיות במצע BM הסגול AP בחושך ב RT עבור 1-20 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את השקופיות עם PBS המכיל 0.1% Tween-20 ולשטוף (2x) במים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר השקופיות באמצעות תקשורת הרכבה מימית ולבחון תחת מיקרוסקופ. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+statistics%5BTitle%5D)+AND+%22CA+Cancer+J+Clin%22%5BJournal%5D)">Cancer statistics.</a> CA Cancer J Clin. 65 (1), 5-29 (2015).</li>
<li>Shen, M. M., Abate-Shen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+genetics+of+prostate+cancer%3A+new+prospects+for+old+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Molecular genetics of prostate cancer: new prospects for old challenges.</a> Genes Dev. 24 (18), 1967-2000 (2010).</li>
<li>Sequeiros, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+markers+for+prostate+cancer+in+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Molecular markers for prostate cancer in formalin-fixed paraffin-embedded tissues.</a> Biomed Res Int. 2013, 283635(2013).</li>
<li>Cary, K. C., Cooperberg, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomarkers+in+prostate+cancer+surveillance+and+screening%3A+past%2C+present%2C+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Ther+Adv+Urol%22%5BJournal%5D)">Biomarkers in prostate cancer surveillance and screening: past, present, and future.</a> Ther Adv Urol. 5 (6), 318-329 (2013).</li>
<li>Sartori, D. A., Chan, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomarkers+in+prostate+cancer%3A+what%27s+new%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Biomarkers in prostate cancer: what's new.</a> Curr Opin Oncol. 26 (3), 259-264 (2014).</li>
<li>Friedman, R. C., Farh, K. K., Burge, C. B., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Most+mammalian+mRNAs+are+conserved+targets+of+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs.</a> Genome Res. 19 (1), 92-105 (2009).</li>
<li>Rodriguez, A., Griffiths-Jones, S., Ashurst, J. L., Bradley, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+mammalian+microRNA+host+genes+and+transcription+units%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Identification of mammalian microRNA host genes and transcription units.</a> Genome Res. 14 (10A), 1902-1910 (2004).</li>
<li>Borchert, G. M., Lanier, W., Davidson, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+polymerase+III+transcribes+human+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">RNA polymerase III transcribes human microRNAs.</a> Nat Struct Mol Biol. 13 (12), 1097-1101 (2006).</li>
<li>Cai, X., Hagedorn, C. H., Cullen, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+microRNAs+are+processed+from+capped%2C+polyadenylated+transcripts+that+can+also+function+as+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Human microRNAs are processed from capped, polyadenylated transcripts that can also function as mRNAs.</a> RNA. 10 (12), 1957-1966 (2004).</li>
<li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+genes+are+transcribed+by+RNA+polymerase+II%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">MicroRNA genes are transcribed by RNA polymerase II.</a> EMBO J. 23 (20), 4051-4060 (2004).</li>
<li>Bartel, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs%3A+target+recognition+and+regulatory+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs: target recognition and regulatory functions.</a> Cell. 136 (2), 215-233 (2009).</li>
<li>Gordanpour, A., Nam, R. K., Sugar, L., Seth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+in+prostate+cancer%3A+from+biomarkers+to+molecularly-based+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Prostate+Cancer+Prostatic+Dis%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs in prostate cancer: from biomarkers to molecularly-based therapeutics.</a> Prostate Cancer Prostatic Dis. 15 (4), 314-319 (2012).</li>
<li>Hurst, D. R., Edmonds, M. D., Welch, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastamir%3A+the+field+of+metastasis-regulatory+microRNA+is+spreading%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Metastamir: the field of metastasis-regulatory microRNA is spreading.</a> Cancer Res. 69 (19), 7495-7498 (2009).</li>
<li>Saini, S., Majid, S., Dahiya, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diet%2C+microRNAs+and+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm+Res%22%5BJournal%5D)">Diet, microRNAs and prostate cancer.</a> Pharm Res. 27 (6), 1014-1026 (2010).</li>
<li>Saini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+Role+of+mir-203+in+Prostate+Cancer+Progression+and+Metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Regulatory Role of mir-203 in Prostate Cancer Progression and Metastasis.</a> Clin Cancer Res. 17 (16), 5287-5298 (2011).</li>
<li>Ambs, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+profiling+of+microRNA+and+messenger+RNA+reveals+deregulated+microRNA+expression+in+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Genomic profiling of microRNA and messenger RNA reveals deregulated microRNA expression in prostate cancer.</a> Cancer Res. 68 (15), 6162-6170 (2008).</li>
<li>Martens-Uzunova, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+and+prognostic+signatures+from+the+small+non-coding+RNA+transcriptome+in+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Diagnostic and prognostic signatures from the small non-coding RNA transcriptome in prostate cancer.</a> Oncogene. 31 (8), 978-991 (2012).</li>
<li>Porkka, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+expression+profiling+in+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">MicroRNA expression profiling in prostate cancer.</a> Cancer Res. 67 (13), 6130-6135 (2007).</li>
<li>Schaefer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+and+prognostic+implications+of+microRNA+profiling+in+prostate+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Diagnostic and prognostic implications of microRNA profiling in prostate carcinoma.</a> Int J Cancer. 126 (5), 1166-1176 (2010).</li>
<li>Maugeri-Sacca, M., Coppola, V., De Maria, R., Bonci, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+role+of+microRNAs+in+prostate+cancer+and+therapeutic+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Oncog%22%5BJournal%5D)">Functional role of microRNAs in prostate cancer and therapeutic opportunities.</a> Crit Rev Oncog. 18 (4), 303-315 (2013).</li>
<li>Xi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+analysis+of+microRNA+expression+of+RNA+extracted+from+fresh+frozen+and+formalin-fixed+paraffin-embedded+samples%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Systematic analysis of microRNA expression of RNA extracted from fresh frozen and formalin-fixed paraffin-embedded samples.</a> RNA. 13 (10), 1668-1674 (2007).</li>
<li>Lucas, S. M., Heath, E. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+challenges+in+development+of+differentially+expressed+and+prognostic+prostate+cancer+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Prostate+Cancer%22%5BJournal%5D)">Current challenges in development of differentially expressed and prognostic prostate cancer biomarkers.</a> Prostate Cancer. , 640968(2012).</li>
<li>Singh, S. K., Kumar, R., Wengel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+Novel+Bicyclo%5B2.2.1%5D+Ribonucleosides%3A+2%27-Amino-+and+2%27-Thio-LNA+Monomeric+Nucleosides%5BTitle%5D)+AND+%22J+Org+Chem%22%5BJournal%5D)">Synthesis of Novel Bicyclo[2.2.1] Ribonucleosides: 2'-Amino- and 2'-Thio-LNA Monomeric Nucleosides.</a> J Org Chem. 63 (18), 6078-6079 (1998).</li>
<li>Suh, S. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-145+is+regulated+by+DNA+methylation+and+p53+gene+mutation+in+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-145 is regulated by DNA methylation and p53 gene mutation in prostate cancer.</a> Carcinogenesis. 32 (5), 772-778 (2011).</li>
<li>Shukla, C. J., Pennington, C. J., Riddick, A. C., Sethia, K. K., Ball, R. Y., Edwards, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-capture+microdissection+in+prostate+cancer+research%3A+establishment+and+validation+of+a+powerful+tool+for+the+assessment+of+tumour-stroma+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22BJU+Int%22%5BJournal%5D)">Laser-capture microdissection in prostate cancer research: establishment and validation of a powerful tool for the assessment of tumour-stroma interactions.</a> BJU Int. 101 (6), 765-774 (2008).</li>
<li>Nelson, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAKE+and+LNA-ISH+reveal+microRNA+expression+and+localization+in+archival+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">RAKE and LNA-ISH reveal microRNA expression and localization in archival human brain.</a> RNA. 12 (2), 187-191 (2006).</li>
<li>Chen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+quantification+of+microRNAs+by+stem-loop+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR.</a> Nucleic Acids Res. 33 (20), e179(2005).</li>
<li>Hanna, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+microRNAs+in+tissue+microarrays+by+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of microRNAs in tissue microarrays by in situ hybridization.</a> Biotechniques. 52 (4), 235-245 (2012).</li>
</ol>

למחברים אין גילויים כספיים.

במאמר זה, אנו מתארים זרימת עבודה פשוטה לביטוי מירנה פרופיל בFFPE ארכיון או רקמות קליניות בסרטן הערמונית קפואים. בסרטן הערמונית, מספר מחקרים מצביעים על תפקיד חשוב של מיקרו-רנ&quot;א בסרטן ערמונית ייזום, התקדמות וגרורות. עם זאת, תוצאות סותרות לעתים קרובות מתקבלות על 22 מירנה ספציפית מאז חילוץ מירנה ומנתחת את השיטות שונות באופן נרחב. לאור הראיות המתעוררות התמיכה יישום הפוטנציאל של miRNAs כסמנים לסרטן הערמונית חלופיים לפרוגנוזה של סרטן הערמונית, אבחון וטיפול, יש צורך לכמת ב...

הסרטן של בלוטת הערמונית הוא גידול ממאיר נפוצה זכר אובחן כי הוא אחד הגורמים עיקריים לתמותה מהסרטן הקשורים בקרב גברים. בארה&quot;ב, מוערך 220800 מקרים חדשים ו27540 מקרי מוות ידווחו בשנת 2015 1. סרטן הערמונית הוא מחלה הטרוגנית עם מחלה משתנה מאוד כמובן את הגידולים יכולים להיות עצלים או מאוד אגרסיביים. אתגר קריטי בניהול קליני בסרטן הערמונית הוא שמציב את חוסר ההתאמה של שיטות המשמשים כיום / סמנים ביולוגיים להקרנת מחלה, אבחון, הפרוגנוזה וטיפול 2. שיטות הקרנה נוכחית כוללות אנטיגן ספציפי לערמונית בדיקה (PSA) ובדיקה רקטלית דיגיטלית (DRE) ואחריו ביופסיות ערמונית 3. אנטיגן הספציפי לערמונית (PSA) הוא הסמן הביולוגי לסרטן הערמונית הנפוץ ביותר שיש מהפכה ניהול ושיעורי הישרדות משופרת 4 קליניים משמעותי. עם זאת, בשל מגבלות מובנות של Lac PSA כוללk של סגוליות, הקרנה מבוססת ה- PSA הוביל לעל אבחון ועל טיפול במחלה. לאור זאת, מאמצים אינטנסיביים מתבצעים מכוונים חיפוש עבור סמנים לסרטן הערמונית חלופיים, במיוחד אלה שיכולים לחזות את האגרסיביות של המחלה וקבלת החלטות טובות יותר לטיפול 4,5. בשנים האחרונות, מיקרו RNA (miRNAs) צמחו כסמנים לסרטן הערמונית חלופיים מבטיחים. מיקרו RNA (miRNAs) מהווה כיתה אבולוציונית שימור של RNAs קידוד שאינו קטן המדכאים ביטוי גנים לאחר תעתיק באמצעות אינטראקציות רצף ספציפי עם 3&#39;- האזורים מתורגמים (UTRs) של מטרות mRNA מקור. הערכה היא כי&gt; 60% של mRNAs נשמרים מטרות של miRNAs 6. גני מירנה ממוקמים באזורי intergenic או בתוך אינטרונים או אקסונים חלבון / חלבון שאינו של קידוד גנים 7. גנים אלה עיבד מועדף על ידי RNA פולימראז II לפרימהmiRNAs ר&quot;י (פרי-miRNAs, ארוך כמה קילו-בסיס) שמבנים משניים גזע לולאה בצורת סיכת ראש הטופס. פרי-miRNAs אלה מעובדים לmiRNAs המבשר (טרום miRNAs, ארוך 60-75 נוקלאוטיד) שמיוצאים לציטופלסמה ועיבוד נוסף לmiRNAs הבוגר (18-25 נוקליאוטידים ארוך) 8-10. miRNAs לווסת תהליכים תאיים מרכזיים, כולל התפשטות, פיתוח, בידול ואפופטוזיס 11. מחקרים מראים חוסר ויסות נרחבת של פרופילי ביטוי מירנה בגידולים ממאירים אנושיים שונים, כוללים סרטן הערמונית 12-15. פרופילי ביטוי מירנה כבר דיווחו להיות dysregulated נרחב בסרטן הערמונית גרורתי ראשוני ו. ביטוי שינה מירנה נקשר עם התקדמות סרטן הערמונית, תוקפנות והישנות המדגישה את הפוטנציאל פרוגנוסטיים של miRNAs 12,14,16-19. גוף הולך וגדל של ראיות מצביע על כך שmiRNAs לשחק תפקידים מכניסטית חשובים בייזום סרטן הערמונית, פיתוח, התקדמותיון וגרורות. בסך הכל, miRNAs הם מתעוררים סמנים ביולוגיים חלופיים מבטיחים כלאבחון סרטן הערמונית והפרוגנוזה שיכול להבחין בין רקמות וסיוע נורמלים וסרטן בריבוד של גידולי ערמונית 12. כמו כן, miRNAs הם מטרות חשובות לפיתוח תרופות יעילות נגד סרטן הערמונית 20. בשל גודלם הקטן והתנגדות לפעילות RNase אנדוגני, miRNAs הם סמנים ביולוגיים יציבים שניתן לאתר בקלות ברקמות-קבוע פורמלין 21 ובביופסיות ערמונית 22. יתר על כן, פרופילי הביטוי של miRNAs כבר לעומת ברקמות קפואות ופורמלין קבוע ונמצאו להיות מתואמים חזק 21. עם זאת, ביטוי מירנה פרופיל ברקמות קליניות בסרטן הערמונית הוא לעתים קרובות מאתגר בשל ההטרוגניות גידול, טעויות דגימה, זיהום וכו &#39;סטרומה הפיתוח של miRNAs כסמנים ביולוגיים יעילים לסרטן הערמונית רלי כבדותes על זיהוי מדויק שלהם ברקמות קליניות. כאן אנו מתארים זרימת עבודה פשוטה המשמשת במעבדה שלנו לביטוי מירנה פרופיל בFFPE ארכיון או דגימות קליניות בסרטן הערמונית קפואים. אנו מעסיקים שילוב של זמן אמת כמותי PCR וכלאה באתר למירנה ניתוחים של דגימות קליניות, עם המידע לשעבר מניב כמותית נוספת והאחרון להמחשת ביטוי ההפרש של סמנים ביולוגיים מירנה פוטנציאליות במערך של רקמות. בתוך זרימת עבודה זו, אנו לייעל את השיטות הקיימות להפקת מירנה מFFPE ורקמות ערמונית קפוא, ביטוי מנתח ידי TaqMan-בדיקה מירנה RT-PCR ומירנה בטכניקת הכלאה באתר מבוסס באמצעות חומצות גרעין נעולים (LNA) מבוסס בדיקות 23. בדיקות מבוססות LNA מציעות רגישות וסגוליות מוגברות בהשוואה לדנ&quot;א או בדיקות המבוססות RNA- ומאפשרת זיהוי חזק של כל רצפי מירנה, ללא קשר לתוכן GC שלהם וגם לאפשר discrimination של משפחות מירנה. פרוטוקול מירנה ISH מותאם שלנו יכול להיות מיושם על שקופיות סרטן ערמונית רקמות או microarrays רקמות סרטן הערמונית (TMA), עם האחרונים מציע את הפוטנציאל להאצת גילוי סמן ביולוגי מירנה.

<table><tbody><tr><td>Microtome</td><td>Leica Biosystems&nbsp;</td><td>RM2255</td><td></td></tr><tr><td>Arcturus Autopix עבור LCM</td><td>Arcturus/Life Technologies</td><td>LCM1621/LCM1110</td><td>לחלופין, ניתן להשתמש במערכת Arcutus Xt מבית Life Technolgies.&nbsp;</td></tr><tr><td>CapSure Macro LCM</td><td>Caps Life Technologies</td><td>LCM0211</td><td></td></tr><tr><td>miRNeasy FFPE Kit&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>217504</td><td></td></tr><tr><td>7500 מערכת PCR מהירה בזמן אמת&nbsp;</td><td>יישומי ביוסיסטמס / טכנולוגיות חיים</td><td>4351106</td><td></td></tr><tr><td>ערכת שעתוק הפוך MicroRNA של טקמן&nbsp;</td><td>אפלייד ביוסיסטמס / טכנולוגיות חיים</td><td>4366596</td><td></td></tr><tr><td>טקמן מיקס מאסטר PCR אוניברסלי מהיר&nbsp;</td><td>Applied Biosystems/Life Technologies</td><td>4352042</td><td></td></tr><tr><td>בדיקת LNA עם תווית DIG עבור U6</td><td>Exiqon</td><td>99002-01</td><td></td></tr><tr><td>BM מצע AP סגול</td><td>Roche</td><td>11442074001</td><td></td></tr><tr><td>פתרון טרום הכלאה&nbsp;</td><td>Biochain</td><td><a href="http://www.biochain.com/coa/K21910XXCA.pdf">K2191050-1</a></td><td></td></tr><tr><td>פתרון הכלאה&nbsp;</td><td>Biochain</td><td><a href="http://www.biochain.com/coa/K21910XXCA.pdf">K2191050-2</a></td><td></td></tr><tr><td>פתרון חוסם&nbsp;</td><td>Biochain</td><td><a href="http://www.biochain.com/coa/K21910XXCA.pdf">K2191050-8</a></td><td></td></tr><tr><td>AP-conjugated anti-digoxigenin נוגדן Biochain</td><td></td><td><a href="http://www.biochain.com/coa/K21910XXCA.pdf">K2191050-7</a></td><td></td></tr><tr><td>מדיית הרכבה מימית&nbsp;</td><td>מעבדות וקטור&nbsp;</td><td>ח-5501&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>טריזול (מגיב גואנידין איזותיוציאנט-פנול)&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td><a href="https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15596018">15596-018</a></td><td></td></tr><tr><td>Harris hematoxylin</td><td>Statlab</td><td>SL200</td><td></td></tr><tr><td>Eosin&nbsp;</td><td>סטאטלאב</td><td>SL201&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

ניתוח ביטוי מירנה ברקמות קליניות בסרטן הערמונית

miRNA Expression Analyses in Prostate Cancer Clinical Tissues

אתגר קריטי בסרטן ערמונית ניהול קליני (PCA) הוא שמציב את חוסר ההתאמה של סמנים ביולוגיים המשמשים כיום להקרנת מחלה, אבחון, הפרוגנוזה וטיפול. בשנים האחרונות, מיקרו RNA (miRNAs) צמחו סמנים ביולוגיים חלופיים מבטיחים כלאבחון סרטן הערמונית והפרוגנוזה. עם זאת, הפיתוח של miRNAs כסמנים ביולוגיים יעילים לסרטן הערמונית מסתמך במידה רבה על זיהוי מדויק שלהם ברקמות קליניות. מירנה ניתוחים בדגימות קליניות בסרטן הערמונית הוא לעתים קרובות מאתגרת בשל ההטרוגניות גידול, טעויות דגימה, זיהום וכו &#39;סטרומה מטרתו של מאמר זה היא לתאר את זרימת עבודה פשוטה למירנה הניתוחים בFFPE ארכיון או דגימות קליניות בסרטן הערמונית קפואים באמצעות שילוב של בזמן אמת PCR (RT-PCR) וכלאה באתר (עורך). בתוך זרימת עבודה זו, אנו לייעל את השיטות הקיימות להפקת מירנה מFFPE וtissu ערמונית קפואהes וביטוי מנתחים ידי TaqMan-בדיקה מירנה RT-PCR מבוסס. בנוסף, אנו מתארים שיטה מותאמת לISH מנתחת זיהוי formiRNA ברקמות ערמונית באמצעות חומצת גרעין נעול (LNA) - בדיקות מבוססות. פרוטוקול מירנה ISH מותאם שלנו יכול להיות מיושם על שקופיות סרטן ערמונית רקמות או microarrays רקמות סרטן הערמונית (TMA).

פרופיל ביטוי של miR-203 בדגימות קליניות בסרטן הערמונית העיקרית LCM על ידי RT-PCR ניתוחים (איור 1) RT-PCR ניתוחי ביטוי ביחס miR-203 ברקמות סרטן ערמונית העיקרית LCM והאזורים הסמוכים נורמלי ההתאמה בוצעו כפי שתואר בסאיני et al. 15 RNU48 שימש כביקורת. הטבלה שלהלן מסכמת את ביטוי miR-203 היחסי ברקמות גידול סרטן הערמונית בהשוואה לרקמות נורמליות סמוכות. <p class="jove_content" styl...

כאן אנו מתארים פרוטוקול פשוט לניתוחי ביטוי microRNA (miRNA) ברקמות קליניות של סרטן ערמונית קפוא (FFPE) או סרטן ערמונית קפוא טרי (PCa) המשתמשות ב-PCR כמותי בזמן אמת (RT-PCR) והכלאה באתרה (ISH).

A critical challenge in prostate cancer (PCa) clinical management is posed by the inadequacy of currently used biomarkers for disease screening, ...

המטרה הכללית של סרטון זה היא לתאר תהליך עבודה מפושט לניתוחים של micro RNA בדגימות קליניות מאובסרות של סרטן הערמונית, תוך שימוש בשילוב של quantitative real-time PCR ו-NC two hybridization עם יישום של גששים מבוססי locked nucleic acid. דבר זה מושג תחילה על ידי בידוד רקמה מחתכי FFPE של סרטן הערמונית באמצעות laser capture microdissection, ולאחריו ביצוע micro RNA extraction. לאחר מכן, נעשה שימוש ב-two step R-T-P-C-R כדי לכמת את ה-micro RNA ברקמה, ובניתוח C two hybridization כדי למקם את ה-micro RNA, אשר מבוצע באמצעות גששי LNA המסומנים ב-digo oxygen ונוגדן antigen המצומד ל-AP ומזוהה על ידי BM purple.התוצאות המוצגות מראות ביטוי של micro RNA ברקמות קליניות של סרטן ערמונית. לאחרונה, באמצעות טכניקות אלו, עלו microRNAs כסממנים ביולוגיים חלופיים ומבטיחים לסרטן הערמונית. עם זאת, ניתוח ביטוי של microRNA בדגימות קליניות של סרטן ערמונית הוא לרוב מאתגר בשל גורמים מתערבים כגון הטרוגניות של גידולי ערמונית וגורמים כמו זיהום סטרומלי.אנו עוסקים בתחום ה-microRNA וה-RNA שאינו מקודד ב-10 השנים האחרונות. ביצענו אופטימיזציה לתנאי הביטוי של microRNA בשלבים שונים של סרטן ערמונית מתקדם. אנו מאמינים שניתן להשתמש בביטוי של microRNA כסמן ביולוגי לאבחנה ולפרוגנוזה, מכיוון שהוא נמצא במתאם עם התוצאה הקלינית של סרטן הערמונית.אנו מאמינים גם כי ניתן להשתמש ב-microRNA לטיפול בסרטן הערמונית באמצעות טכנולוגיית ננו-חלקיקים. פרופיל ביטוי מדויק בקרצינומה של הערמונית נבלם לעיתים קרובות על ידי ההטרוגניות של הנגעים. קושי זה נפתר בחלקו באמצעות שימוש במיקרו-דיסקציה בלכידה לייזרית (LCM) לאיסוף תאים אפיתליאליים שפירים או ממאירים טהורים והפחתת ערבובם עם תאי ה-str.נמצא כי מיקרו-דיסקציה בלייזר (LCM) של רקמות FFP מאורכבות, ולאחריה פרופיל ביטוי של microRNA, מהווה טכניקה משלימה רגישה, אמינה וחסכונית. אופטימיזציה של היברידיזציה כפולה מספקת תמונה של מיקומי הביטוי של ה-microRNAs. לאחר איסוף הרקמות והכנתם כחתכים בעובי 10 מיקרון, הסר את הפרפין במנדף כימי, השרה את השקופיות ב-xylenes למשך 10 דקות פעמיים, ולאחר מכן בצע רהידרטציה לרקמות על ידי העברתן לסדרה של אמבטיות אלכוהול מימיות בריכוזים עולים. לאחר מכן, בצע צביעת hematoxylin למשך 30 שניות ושטוף את השקופיות במים.כעת, לאחר השחזור של המים, העבירו את הרקמות דרך סדרת אלכוהול מדורגת נוספת המתחילה ב-70%. לאחר מכן, השרו את החתכים ב-xylenes למשך חמש דקות והניחו להם להתייבש באוויר. העבירו את השקופיות היבשות למכשיר ה-laser capture microdissection. השתמשו בשקופיות שסומנו על ידי פתולוג כדי לזהות את מוקדי סרטן הערמונית ואזורים שפירים/נורמליים.יש לפעול לפי הנחיות היצרן לביצוע מיקרו-דיסקציה בלייזר (laser capture microdissection). הגדירו את רוחב הקרן ל-10 עד 20 microns והפעילו אותה בפולסים של 70 עד 90 milliwatts. השתמשו בפולסי אינפרה-אדום כדי ללכוד את האזורים הרלוונטיים על מכסי לכידה של מיקרו-דיסקציה בלייזר.עבור כל דגימה, העבירו את תכולת הפקק למבחנה לאיסוף ועבדו מיד את התאים להפקת micro RNA. הפקו את ה-RNA הכולל באמצעות ערכה מסחרית בהתאם להוראות היצרן. בצעו אלוציה של ה-RNA לתוך 20 עד 30 µL של מים נקיים מנוקלאז (nuclease free water) והמשיכו במהירות.בשלב הבא, השתמשו בערכה לתגובת טרנסקריפטזה הפוכה להכנת CDNAs באמצעות פריימרים ספציפיים ל-micro RNA. הגדירו כל תגובה תוך שימוש ב-10 עד 100 nanograms של total RNA. לאחר האיסוף, דללו את ה-CD NA פי חמישה עד 10 לריכוז של כ-one עד 20 nanograms.כעת הגדירו את תגובות ה-PCR בשלוש חזרות מתוך ה-CD NA באמצעות בדיקות micro RNA עם fast universal master mix עבור הביקורת. השתמשו ב-RNU 48 כתבנית לחישוב השינוי היחסי בביטוי הגנים. השתמשו בשיטת ה-comparative CT כדי להתחיל את הטיפול המקדים בפרוסות הרקמה בעובי חמישה מיקרון.קבעו את השקופיות בטמפרטורה של 56 degrees celsius למשך שעה. לאחר מכן, בצעו דפראפיניזציה לשקופיות באמצעות שני רחצוֹת של xylene למשך 15 דקות כל אחת בטמפרטורת החדר; בעקבות ה-xylenes, בצעו רהידרטציה לרקמות באמצעות סדרת ethanol מדורגת. לאחר מכן, השרו את הרקמות במים למשך חמש דקות.בשלב הבא, קבעו את הרקמות באמצעות 4% PFA ב-PBS בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. שטפו את החומר המקבע באמצעות שתי שטיפות של חמש דקות ב-PBS. כעת, טענו proteinase K בריכוז 10 µg/mL לתוך באפר proteinase K שחומם מראש, והדגירו את הרקמות ב-37 °C למשך 10 דקות.לאחר הטיפול, שטפו את הנסקיות ב-0.2% glycine ב-PBS למשך 30 שניות ושטפו את הנסקיות ב-PBS בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. לאחר מכן, השרו אותן שוב ב-4% PFA למשך 15 דקות. שוב, שטפו את חומר הקיבוע באמצעות שני שלבי שטיפה ב-PBS של חמש דקות כל אחד.הרקמות מוכנות כעת להיברידיזציה. ראשית, שרטטו עיגול הידרופובי מסביב לרקמה באמצעות עט נתיב (path pen), כדי שהתמיסה בשלבים הבאים תישאר על נתח הרקמה. דגרו את הרקמות בבופר טרום-היברידיזציה למשך שלוש עד ארבע שעות ב-55 °C.בצע זאת בתא מלחח באמצעות מגבות הספוגות בתמיסה של 50% form amide ו-50% five XSSC. כעת הכן את הגבוב (diggen) ואת הגשושית הספציפית ל-micro RNA המסומנת, וכן את גשושית הביקורת. תכנן להכין דילול של 20 עד 50 nanomolar, אך ראשית דלל את הגשושיות ב-25 µL בלבד של בופר היברידיזציה, פחות מהכמות הדרושה לדילול הסופי. לאחר מכן, חמם את הגשושיות ל-90 °C למשך כארבע דקות.לאחר מכן, הניחו את הגששים על קרח. לבסוף, דללו את הגששים עוד יותר באמצעות תמיסת היברידיזציה קרה כדי להגיע לריכוז סופי של 20 עד 50 nanomolar. כעת, גרעו 100 עד 400 microliters של תמיסת גשש על כל זכוכית.לאחר מכן, דגרו אותם במשך 12 עד 16 שעות בטמפרטורת ההיברידיזציה המתאימה. למחרת, בצעו שטיפה עם תמיסת SSC במספר שלבים בעקבות השטיפות. דגרו את השקופיות בתמיסת חסימה בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת עד שעתיים לאחר החסימה.השרו את הרקמות ב-1:100 נוגדן אנטי-גנין המשורשר ל-AP ב-PBS. בצעו זאת למשך אחת עד ארבע שעות בטמפרטורת החדר או למשך לילה ב-4 °C. לאחר מכן, הסירו את עודפי הנוגדן באמצעות שלושה שטיפות ב-PBS למשך 10 דקות לכל שטיפה.בצע שני שטיפות של חמש דקות בכל אחד בבופר PBS בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הדגר את השקופיות ב-BM purple, סובסטרט AP, במיגון מאור בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת עד 20 שעות. למחרת, הסר את ה-BM purple על ידי שטיפה ב-0.1% Triton X-100 ב-PBS.לאחר מכן יש לשטוף אותם פעמיים במים ולהטמיעם במדיום הטמעה מימי באמצעות הפרוטוקול המתואר להפקת micro RNA ו-R-T-P-C-R. microRNA 2 0 3 נבדק בסרטן ערמונית וברקמות סמוכות נורמליות. הביטוי היחסי השתנה בחלק ניכר מהרקמות.RNU 48 שימש כביקורת. רקמות של סרטן ערמונית עברו מיקרו-דיסקציה תחת מיקרוסקופ או LCM, ולאחר מכן נותחו לרשמי הביטוי היחסי של microRNA. ביטוי miR-83 ברקמות הגידול נשווה לביקורות נורמליות תואמות.רקמה שהוכנה בשיטת LCM זיהתה ביטוי של micro RNA באופן מהימן יותר. ב-C בוצע היברידיזציה כפולה ל-microRNA 2 0 3 ברקמת סרטן ערמונית נורמלית וברקמת גרורה בעצם. U six's.גילוי RNA שימש כביקורת בהתבסס על עוצמת הצביעה. ביטוי של microRNA 2 0 3 דורג מאחת עד ארבע בתאים מכל רקמה. כך נמצא כי הביטוי נמוך באופן מובהק סטטיסטית ברקמת הגריעה הגרמית.לאחר צפייה בסרטון זה, תגיעו להבנה טובה של אופן הערכת הביטוי של microRNA בדגימות קליניות של סרטן ערמונית לאורך כל תהליך העבודה. חשוב ביותר לשמור על סביבה נקייה מ-RNA. כמו כן, עבודה עם Paraformaldehyde ותמיסות מלוח יכולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות כגון עבודה במכבסת כימיים (fume hood) וחבישת ציוד מגן אישי בעת ביצוע הליך זה.בעקבות הליך זה, אנו מבצעים ניתוח סטטיסטי כדי להעריך האם דפוסי ביטוי של microRNA נמצאים במתאם עם המשתנים הפתולוגיים הקליניים של המחלה, דבר המסייע לנו לענות על שאלות מפתח, כגון האם לביטוי של microRNA מסוים יש פוטנציאל פרוגנוסטי או דיאגנוסטי נלווה. פרוטוקול ההיברידיזציה המותאם שלנו ל-microRNA ב-C2 ניתן ליישום על סליידים של רקמות סרטן ערמונית או על מערכים של דגימות רקמה (tissue microarrays) של סרטן ערמונית. ניתן ליישם פרוטוקול זה גם על סוגי רקמות אחרים באמצעות התאמה.

mirna-expression-analyses-in-prostate-cancer-clinical-tissues

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

פולימראז כמותי זמן אמת תגובת שרשרת (QPCR) היא שיטה מהירה רגישה כדי לחקור את רמות הביטוי של microRNA שונים (מירנה) מולקולות דגימות הגידול. שימוש בביטוי זה השיטה של ​​מאות מולקולות שונות מירנה יכול להיות מוגבר, לכמת אותה ולנתח אותה מהתבנית cDNA אותו.

MicroRNA איתור גידולים הערמונית ב כמותי בזמן אמת PCR (QPCR)

רטרווירוסים אנושיים אנדוגני (HERV), אשר תופסים 8% של הגנום האנושי, לשמור על יכולות קידוד נדירות אבל מאה אלף חזרות ארוכות מסוף (LTRs). Microarray Affymetrix מותאם אישית תוכנן כדי לזהות ביטוי לוקוס HERV הבודד והיה בשימוש ברקמות סרטן ערמונית כהוכחה של מושג למחקרים קליניים בעתיד.

זיהוי מבוסס microarray של פרט HERV לוקוסים ביטוי: בקשה לגילוי סמן ביולוגי בסרטן הערמונית

מולקולרי איתות דרך גם אסטרוגן ומייקרו RNA הם קריטיים בהתפתחות סרטן השד וצמיחה. אסטרוגן מפעיל את קולטני האסטרוגן, שהם גורמי שעתוק. גורמי שעתוק רבים יכולים לווסת את הביטוי של מיקרו RNA, והוא יכול להיות צדודית מיקרו RNA מוסדר אסטרוגן תוך שימוש בטכניקות שונות בקנה מידה גדולה.

פרופיל של מיקרו RNA המוסדר אסטרוגן בתאי סרטן השד

מטרת פרוטוקול זה היא להשתמש במיקרו-דיסקציה של לכידת לייזר כשיטה יעילה לבידוד אוכלוסיות טהורות של סוגי תאים מרקמות ערמונית הטרוגניות לצורך ניתוח RNA במורד הזרם.

Microdissection לייזר לכידתו של אדם הערמונית האפיתל לניתוח RNA

אימונוהיסטוכימיה היא טכניקת מעבדה רבת עוצמה להערכת לוקליזציה וביטוי של חלבונים בתוך רקמות. שיטות אוטומטיות למחצה לכימות מציגות סובייקטיביות ולעתים קרובות יוצרות תוצאות בלתי ניתנות לשחזור. כאן, אנו מתארים שיטות לאימונוהיסטוכימיה מרובה וכימות אובייקטיבי של ביטוי חלבון ולוקליזציה משותפת באמצעות הדמיה מולטי-ספקטרלית.

כימות של ביטוי חלבון ו Co-לוקליזציה שימוש חיסונית-histochemical Multiplexed מכתים והדמיה Multispectral

כאן אנו מציגים פרוטוקול לאיתור ביטוי miRNA בדגימות חולות סרטן השד באמצעות הכלאה של miRNA באתר.

ניתוח Clinicopathological ביטוי מירנה שד רקמות סרטן על ידי שימוש מירנה<em&gt; באתרו</em&gt; כלאה

פרוטוקול חילוץ שונה זה משפר תשואות רנ"א ודנ"א מאזורים ממוקדים באופן מדויק יותר של עניין גושי רקמת histopathologic.

הכין ליבות רקמות פרפין מוטבע פורמלין-קבועות הוא רנ&quot;א הפקת DNA

חומצת גרעין השפלה ארכיוני רקמת הגידול הטרוגניות, חוסר דגימות רקמה קפוא טרי עלולה להשפיע לרעה על שירותי אבחון סרטן במעבדות פתולוגיה ברחבי העולם. כתב יד זה מתאר אופטימיזציה של פאנל של סמנים ביולוגיים שימוש assay חרוז מגנטי מולטיפלקס לסווג סרטן השד.

אופטימיזציה של וזמינותו הביטוי מבוסס-RNA מולטיפלקס באמצעות חומר ארכיוני של סרטן השד

אנו מציגים פרוטוקול כדי להעריך את רמת הביטוי של מחזורי microRNA (miRNAs) בדגימות הפלסמה של חולי סרטן. בפרט, השתמשנו ערכת זמינים מסחרית עבור מחזור miRNA החילוץ, שעתוק במהופך. לבסוף, ניתחנו את פאנל של 24 miRNAs שנבחר באמצעות לוחות מותאמים אישית בדיקה מראש הבחין בזמן אמת.

זיהוי של לוח מותאם אישית MicroRNA במחזור בחולים עם סרטן המעי הגס גרורתי

התנגדות תרפיה מתפתחת לעתים קרובות בחולים עם סרטן הערמונית מתקדם, ובמקרים מסוימים, סרטן מתקדם לסוג קטלני שנקרא סרטן הערמונית נוירואנדוקריניים. הערכת קטן ללא קידוד RNA-תיווך שינויים מולקולריים המאפשרים מעבר זה יאפשר מחלות טוב יותר ריבוד וזיהוי של מנגנונים סיבתי המובילים לפיתוח של סרטן הערמונית נוירואנדוקריניים.

רצפי RNA קטן ללא קידוד מתוך פורמאלין-רקמות קבועות וסרום-אקסוזומים נגזרות מחולי סרטן הערמונית עמידים סירוס

הפרוטוקול מתאר בדיקת הכלאה אימונופלואורסצנטית טנדם עם רקמה משובצת פרפין קבועה בפורמלין כדי לזהות ולכמת מיקרו-RNA וחלבונים מרובים בו זמנית.

הגברה וזיהוי של מיקרו-RNA באמצעות הכלאה נעולה של חומצת גרעין-באתרה כשיטת זיהוי וכימות חדשה

למדו פרוטוקול מופשט לניתוח ביטוי מירנה ברקמות FFPE של סרטן הערמונית באמצעות PCR בזמן אמת והכלאה in situ. השיטה מאפשרת זיהוי ביומרקרים לדיאגנוסטיקה ופרוגנוזה של מחלה זו.

ניתוח ביטוי מירנה ברקמות קליניות בסרטן הערמונית

גלה סרטונים נוספים