גישת העכבר עגול החלון לototoxic סוכן משלוח: מהיר וטכניקה אמינה גרימת ניוון תא שבלול

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבסס מודל של פגיעה באוזן הפנימית על ידי הזרקה אסטרטגית של חומרים אוטוטוקסיים ישירות לנישת החלון העגול (round window niche) של השבלול בעכבר. דבר זה מושג תחילה על ידי דיסקציה של שכבת השומן התת-עורית והרחקה עדינה של גוף השריר כדי לחשוף את פריאוסטאום של בולת התוף (tympanic bulla periosteum). השלב השני הוא פתיחת הבולה על ידי הסרה הדרגתית של רסיסי עצם עד לחשיפת נישת החלון העגול.

בשלב הבא, מייבשים לחלוטין את הנוזל הנראה לעין באוזן התיכונה ובגומחת החלון העגול, כדי לאפשר ויזואליזציה אופטימלית של גומחת החלון העגול. השלב הסופי הוא מילוי גומחת החלון העגול בחומר האוטוטוקסי הנבחר מבלי לפגוע בעורק ה-STA pedial, ולאחר מכן ביצוע חזרות מתאימות בהתאם למפרטי החומר. לבסוף, נעשה שימוש בהליכים תפקודיים, הכוללים תגובת גזע המוח השמיעתית והערכה מורפולוגית, כדי להראות את השימור הסלקטיבי או את הניוון של המיקרו-ארכיטקטורה הקוכלארית.

היתרון המרכזי של טכניקה זו, המדד הקיים שלנו, הוא שפרוצדורה זו מאפשרת חשיפה מצוינת של הנישה בחלון הרשאי ומאפשרת יישום ישיר של הזדקנות אוטוטוקסית סלקטיבית. יתרונות הטכניקה כוללים שימור של המיקרו-ארכיטקטורה של האוזן הפנימית, הימנעות מרעילות סיסטמית, תחילת השפעה מהירה, דגנרציה סלקטיבית של סוגי תאי קוכלאה מסוימים ותוצאות הניתנות לשחזור. ניתן להחיל טכניקה זו עם שינויים קלים על מיני מכרסמים אחרים, כולל חולדות, חזירי ים וגרבילים.

כעת אדגים את הפרוצדורה במעבדתי. כל היבטי המחקר בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות הוועדה המוסדית הרלוונטית לטיפול בבעלי חיים ושימוש בהם. כל הפרוצדורות הניסייניות בחוליות המתוארות כאן אושרו תחת ההנחיות של הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש בהם של האוניברסיטה הרפואית של דרום קרוליינה (Medical University of South Carolina).

לאחר הרדמת בעל החיים בהתאם לנהלים המאושרים, ניתן משכך כאבים טרום-ניתוחי במינון של 0.1 milligrams per kilogram. במקרה זה נעשה שימוש ב-Buprenorphine. יש לוודא שבעל החיים הגיע לרמת הרדמה כירורגית.

לא אמורה להיות תגובה לצביטה בבהו, ורפלקס הכתיבה צריך להיות נעדר בעכברים כפי שניתן לראות כאן. טענו 0.2 milliliters של תמיסה מימית המכילה את החומר האוטוטוקסי שנבחר למזרק טוברקולין של one milliliter המצויד במחט קהה במידה 28 gauge ואורך half inch, והוציאו כל אוויר מהמזרק שכן בועות עלולות למנוע יישום תקין של החומר. השתמשו במכונת תספורת חשמלית כדי להסיר את הפרווה באזור, מהקפלי האצפלי ועד לחגורת הכתף.

הרחב את הסרת השיער מקו האמצע הסגיטלי הגבי (dorsal sagittal midline) לצדדים עד לזווית המנדיבולה. השתמש בסכין גילוח חד-פעמית כדי להבטיח הכנה גבורה ונקייה. סטריליז את העור באזור שהוכן בהתאם לפרוטוקולים המוסדיים.

כאן נמרח Betadine לסירוגין עם ethanol באופן טופיקלי בתנועה מעגלית למשך שתי דקות. הניחו פד חימום קטן מתחת לגוף כדי לשמור על טמפרטורת הגוף של החיה. בטמפרטורה של 36 עד 38 °C, קבעו את ראש החיה באמצעות מכשיר להחזקת הראש.

הדק בעדינות תפס קטן מעל גב האף של בעל החיים כדי להחזיקו במקומו. ודא שתושבת הראש מחוברת בצורה נוקשה למרכזו של זרוע מפרקי בצורת U. חבר מוט ברוחב one centimeter לזרוע השמאלית של ה-U, שישמש כמשענת ראש צד שמאל כדי לאפשר גישה לצד ימין.

לאחר שהעכבר מקובע היטב במחזיק הראש, סובבו אותו למנח שכיבה על הצד השמאלי (left lateral decubitus). מקמו את הגוף בזהירות על משטח הניתוח השטוח כדי להבטיח יציבות לאורך כל ההליך ולמנוע מאמץ פיתול מיותר על החוליות הצוואריות. מקמו מיקרוסקופ ניתוחי המסוגל להגיע להגדלה של 10 x ו-20 x מעל שדה הניתוח.

יש לוודא שהמיקרוסקופ יכול לשמור על מיקומו ללא תמיכה ידנית, כך ששתי הידיים יהיו פנויות לביצוע הניתוח בזמן עבודה תחת הגדלה מיקרוסקופית. השתמש במספריים חדים או בלהב סקלפל כדי לבצע חתך פוסט-אוריקולרי (מאחורי האוזן) באורך של 1 עד 1.5 סנטימטר, במרחק של כ-6 עד 8 מילימטרים מהקיפול הצפלי של האוזן. הימנע מחיתוך עמוק כדי לשמר את המבנים הווסקולריים שמתחתיו.

בצעו דיסקציה קהה דרך שכבת השומן התת-עורי. במידה והדיסקציה מבוצעת בכיוון ונטראלי למדיאלי, יש להיזהר כדי להימנע מפגיעה בווריד הג'וגולרי החיצוני. במקרה של דימום, השתמשו בג'לטין ספיג, בספוגים או בכדורי כותנה כדי לעצור את הזרימה.

לאחר ששכבת השומן חולקה כראוי, חשפו את שרירי הצוואר. נקודת ציון חשובה היא ענף עצבי קטן של העצב הגולגולתי ה-11, העוטף את הקצה האחורי של ה-C CTO mastoid. כדי להרחיב את הגישה לכיוון ה-pinna, השתמשו במרחיב עצמי (self retaining retractor) כדי להסיט בעדינות את גוף שריר ה-CTO mastoiditis לכיוון אחורי.

הפרידו בעדינות את הפסציה השקופה העוטפת את גוף השריר. כמו כן, הסיטו בעדינות את בלוטת הפרוטיד ואת הווריד הג'וגולרי החיצוני לכיוון ההפוך. כאשר גוף שריר ה-CTO Masto מסוטה כראוי, ניתן לראות את כיפת הפריאוסטאום המבריקה של ה-tympanic bulla בהיבט המדיאלי של ה-bulla, נקודת ההחדרה של שריר צווארי עמוק יותר.

ה-Sterno Mastoiditis יבוא למבט. הנח רטרקטור עם נעילה עצמית כדי להחזיק את ה-CTO mastoid פתוח באמצעות טכניקה דו-ידנית, והשתמש בעדינות בדיאתרמיה ביפולרית כדי לחלק את ה-bull periosteum ולחשוף את העצם שמתחתיו. לאחר מכן, השתמש בפינצטה או במכשיר קימור אוטולוגי כדי להרים בעדינות ולדחוף את ה-periosteum לכיוון היקפי כדי לחשוף באופן מלא את ה-bull dome.

כעת השתמש במקדח שיניים המונע ברצועה עם קצה קוני של מילימטר אחד או שניים כדי לקדוח בזהירות חור מנחה של 2 mm דרך עצם ה-bulla. קדח בין השוליים הגבאיים (caudal) של כיפת העצם לבין הקו העכור הנראה למיטעיים המשתרע לאורך ההיבט הרוסטרלי (rostral) של ה-bulla. לאחר מכן, קדח בזהירות חור מנחה שני בקרבת מקום. כדי להקל על הסרת הגג של עצם ה-bulla, השתמש בפינצטה עדינה (jewelers tip forceps) כדי להסיר את עצם ה-bulla בכיוון גבי (dorsal) וגבאי (caudal).

הקפידו לא לנקב את עורק ה-EDL הנמצא ישירות מתחת ל-bullock cap. צמצמו את כמות העצם המוסרת כדי למנוע כניסה מרובה של נוזלים לאוזן התיכונה לפני יישום החומר. השתמשו בפתיל נייר כדי להסיר את כל הנוזלים הנראים באוזן התיכונה ובגומחת החלון העגול (round window niche) עד להופעת העצם היבשה.

שלב זה הוא קריטי להצלחת הפרוטוקול. תוך써 צפייה באזור תחת הגדלה מקסימלית, השתמשו במחט בעלת קליבר דק במזרק טוברקולין של 1 ml כדי להניח טיפה אחת של חומר אוטוטוקסי (Ototoxic agent) ישירות אל גומחת החלון העגול (round window niche) כך שהיא תמולא לחלוטין. המתינו 10 דקות כדי שהחומר יישאר בגומחת החלון העגול.

בשלבים המוקדמים, יש לעקוב מקרוב אחר החלפת השתקפות אור קטנה בבסיס של הגומחה היבשה במניסקוס נוזלי עמום ומטושטש. דבר זה מעיד על כך שהגומחה מתמלאת כראוי. לאחר שחלפו 10 דקות, יש לספוג לחלוטין את החומר ולהחליפו במריחה חדשה של אותו חומר.

מספר היישומים תלוי בחומר שבו נעשה שימוש. זמן החשיפה נע בדרך כלל בין 30 ל-60 דקות. לאחר היישום האחרון, השאר את ה-bull פתוח והשתמש בפינצטה כדי לסגור את הרקמה הרכה מעל אתר הניתוח.

השתמשו בתפר מונופילמנט לא-ספיג במידה 4-0 לסגירת העור מעל אזור הניתוח. אפשרו לבעל החיים להתאושש מההרדמה בכלוב בית נקי, אשר צריך להיות מצויד במצע למגורים ובמזון רך. עקבו אחר בעלי החיים מדי יום עד להקרבה ולאיסוף רקמת השבלול מ-C-B-A-C-A-J בוגרים.

עכברים משני המינים נחשפו לסוכן האוטוטוקסי Hept ethanol. הדיפוזיה התבצעה דרך החלון העגול. נצפו עליות משמעותיות בספי thresholds של BR בעכברים שטופלו ב-hept, מהיום הראשון לאחר הניתוח ועד ליום ה-14, בהשוואה לבעלי חיים בביקורת שעברו ניתוח דמה שבו הוזרר saline במקום hept.

אתנול לא הדגים הסטות משמעותית של סף השמיעה באף אחד מהתדרים שנבדקו. צביעה אימונו-היסטוכימית נגד תעלת אשלגן ממספתת פנימה (inwardly rectifying potassium channel), המוצגת בירוק, שימשה כשיטה עקיפה להדמיית הנזק וההחלמה של מבני השבלול. עוצמת הצביעה פחתה באופן ניכר בתוך ה-theria vais.

ביום הראשון לאחר הניתוח, נצפתה בצביעת נגד של הגרעין (המוצגת באדום) עדות לפגיעה בשלמות הגרעין ועיבוי כרומוזומלי, האופייניים לאפופטוזיס תאי. כאשר נמדדה עוצמת הצביעה של תעלות האשלגן באזורים של אוזניים שטופלו ב-stratis, נצפתה ירידה ראשונית, ולאחריה שינוי משמעותי חזרה לעוצמת הביקורת שבעה ימים לאחר החשיפה ל-hept, כאשר ההחלמה נמשכה לאחר מכן. לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע הליך זה בתוך 30 עד 60 דקות אם הוא מבוצע כראוי.

חשוב לזכור כי חשיפה נוספת או מילוי חוזר עשויים לסייע במניעת דילול בלתי רצוי של הסוכן האוטוטוקסי על ידי עיבוי דם או נוזל בינתיים. עם זאת, יש לנקוט משנה זהירות בגישה זו, שכן היא נוטה להגביר את הסיכון לפגיעה מקרית בעורק ה-cedal או להחדרת נוזל בינתיים לתוך הנישה של החלון העגול. טכניקה זעיר-פולשנית זו מאפשרת מחקר מפורט של תהליכים ביוכימיים עדינים, והייתה בעלת ערך מכריע בקידום מחקרנו שמטרתו להבין את הפוטנציאל הרגנרטיבי של השבלול in vivo.