Name: מדידת TCR-pMHC כריכה באתר באמצעות assay מיקרוסקופית המבוסס על סריג (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 19 min 5 s
Description: למדו למדוד קינטיקת קישור TCR-pMHC בסינפסה האימונולוגית באמצעות מיקרוסקופיית FRET. שיטה זו מאפשרת ניתוח כמותי של אפיניות, קצב פירוק וקצב קישור ברמת מולקולה בודדת וברמת אוכלוסייה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

תואר שני נתמכה על ידי מענק של שרדינגר קרן המדע האוסטרי (FWF, J3086-B11) ותודה מקס פלנק-החברה לתמיכה כספית ומנהלית. GS וJH נתמכו על ידי קרן המדע והטכנולוגיה וינה (WWTF, LS13-030).

<ol><li>Garcia, K. C., Adams, J. J., Feng, D., Ely, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+basis+of+TCR+germline+bias+for+MHC+is+surprisingly+simple%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol.%22%5BJournal%5D)">The molecular basis of TCR germline bias for MHC is surprisingly simple.</a> Nat Immunol.. 10, 143-147 (2009).</li>
<li>Huppa, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TCR-peptide-MHC+interactions+in+situ+show+accelerated+kinetics+and+increased+affinity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature.%22%5BJournal%5D)">TCR-peptide-MHC interactions in situ show accelerated kinetics and increased affinity.</a> Nature.. 463, 963-967 (2010).</li>
<li>Huppa, J. B., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interdisciplinary+science+of+T-cell+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+immunology.%22%5BJournal%5D)">The interdisciplinary science of T-cell recognition.</a> Advances in immunology.. 119, 1-50 (2013).</li>
<li>Axmann, M., Schuetz, G. J., Huppa, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Molecule+Microscopy+on+Planar+Supported+Bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Vizualized+Experiments+J.+Vis.+Exp.%22%5BJournal%5D)">Single Molecule Microscopy on Planar Supported Bilayers.</a> Journal of Vizualized Experiments J. Vis. Exp.. 101, e53158(2015).</li>
<li>Xie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photocrosslinkable+pMHC+monomers+stain+T+cells+specifically+and+cause+ligand-bound+TCRs+to+be+preferentially+transported+to+the+cSMAC%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Photocrosslinkable pMHC monomers stain T cells specifically and cause ligand-bound TCRs to be preferentially transported to the cSMAC.</a> Nat Immunol. 13, 674-680 (2012).</li>
<li>Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRET+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">FRET imaging.</a> Nat Biotechnol. 21, 1387-1395 (2003).</li>
<li>Toebes, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+use+of+conditional+MHC+class+I+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Design and use of conditional MHC class I ligands.</a> Nat Med. 12, 246-251 (2006).</li>
<li>Tsumoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+recovery+of+functional+single-chain+Fv+fragments+from+inclusion+bodies+overexpressed+in+Escherichia+coli+by+controlled+introduction+of+oxidizing+reagent--application+to+a+human+single-chain+Fv+fragment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Highly efficient recovery of functional single-chain Fv fragments from inclusion bodies overexpressed in Escherichia coli by controlled introduction of oxidizing reagent--application to a human single-chain Fv fragment.</a> J Immunol Methods. 219, 119-129 (1998).</li>
<li>Ruegg, U. T., Rudinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reductive+cleavage+of+cystine+disulfides+with+tributylphosphine%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Reductive cleavage of cystine disulfides with tributylphosphine.</a> Methods Enzymol. 47, 111-116 (1977).</li>
<li>Ruprecht, V., Brameshuber, M., Schütz, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-color+single+molecule+tracking+combined+with+photobleaching+for+the+detection+of+rare+molecular+interactions+in+fluid+biomembranes%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Two-color single molecule tracking combined with photobleaching for the detection of rare molecular interactions in fluid biomembranes.</a> Soft Matter. 6, 568-581 (2010).</li>
<li>Dustin, M. L., Bromley, S. K., Davis, M. M., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+self+through+two-dimensional+chemistry+and+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of self through two-dimensional chemistry and synapses.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 17, 133-157 (2001).</li>
<li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-substrate+contacts+illuminated+by+total+internal+reflection+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence.</a> The Journal of cell biology. 89, 141-145 (1981).</li>
<li>Grakoui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunological+synapse%3A+a+molecular+machine+controlling+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation.</a> Science. 285, 221-227 (1999).</li>
<li>Kaizuka, Y., Douglass, A. D., Varma, R., Dustin, M. L., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+for+segregating+T+cell+receptor+and+adhesion+molecules+during+immunological+synapse+formation+in+Jurkat+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Mechanisms for segregating T cell receptor and adhesion molecules during immunological synapse formation in Jurkat T cells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104, 20296-20301 (2007).</li>
<li>Varma, R., Campi, G., Yokosuka, T., Saito, T., Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+receptor-proximal+signals+are+sustained+in+peripheral+microclusters+and+terminated+in+the+central+supramolecular+activation+cluster%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">T cell receptor-proximal signals are sustained in peripheral microclusters and terminated in the central supramolecular activation cluster.</a> Immunity. 25, 117-127 (2006).</li>
<li>Purbhoo, M. A., Irvine, D. J., Huppa, J. B., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+killing+does+not+require+the+formation+of+a+stable+mature+immunological+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">T cell killing does not require the formation of a stable mature immunological synapse.</a> Nat Immunol. 5, 524-530 (2004).</li>
<li>Binz, H. K., Stumpp, M. T., Forrer, P., Amstutz, P., Pluckthun, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+repeat+proteins%3A+well-expressed%2C+soluble+and+stable+proteins+from+combinatorial+libraries+of+consensus+ankyrin+repeat+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Designing repeat proteins: well-expressed, soluble and stable proteins from combinatorial libraries of consensus ankyrin repeat proteins.</a> J Mol Biol. 332, 489-503 (2003).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרס כלכלי מתחרה.

מדידת אינטראקציות בין חלבונים באתרו היא רצויה מאוד במיוחד כאשר התמודדות עם אינטראקציות זיקה נמוכות כגון TCR-pMHC מחייב 11. סיבה לכך הוא על-השיעור, כמו גם את היציבות של אינטראקציות אלה השפיעו באופן משמעותי על ידי נסיבות מסוימות שבהם מחייבים מתרחשים. גישות הדמיה מבוססת סריג מינימאלי פולשנית ולכן הם באופן עקרוני בצורה מושלמת המתאימים למשימות כגון, עדיין כרוכות במספר המכשולים שצריכים להתגבר ראשון. רעש שנוצר על ידי autofluorescence הסלולרי מגביל את הרגישות של המדידות ולכן צריך להיות כל הזמן במינימום. מיקרוסקופיה TIRF משרתת את הצורך הזה גם 12 מאוד אבל דורשת functionalization זכוכית שקופיות, באופן אידיאלי בצורה של bilayer שומנים מישוריים נתמך זכוכית מעוטרת עם חלבונים של הבחירה 13-15. יתרון נוסף של גישת reconstitutive חלקית הוא ששותפי סריג bilayer תושב רקומביננטי יכולים להיות הרבה מ &#39;עפרות שכותרתו בקלות באופן כמותי, באתר ספציפי והגיוני עם fluorophores קטנה יותר ובהירה יותר יהיה אפשרי עם חלבונים הביעו פני תא. TCRs מתויג עם SCF רקומביננטי V של, שאינו משפיע על הכרת תא T, כפי שנבדק בעבר 2. יתר על כן, הרכב החלבון של SLB, למשל הצפיפות של pMHCs והבחירה של גורמי אבזר יכולים להיות מותאם לצרכים של אחד ספציפיים. אנחנו ביצענו בעבר ניסויים עם משתנה צפיפות של pMHCs גירוי, אך לא זוהו הבדלים משמעותיים ב2D-K את ו2D-K D 2. עד כה כאן ההכרה של מולקולות MHC II כיתה כבר עסקה רק, בעיקר בגלל האופי של שסע פפטיד מחייב, אשר פתוח בשני הקצוות וכך להכיל פפטידים גדולים כוללים מקשר לקובץ מצורף fluorophore. במקרים מסוימים גישה כזו עלולה גם לעבוד עבור CLA MHC תיוגss אני מולקולות 16 אבל יש לנקוט זהירות רבה כדי לוודא את השימוש בם בניסויים. הרגישות של תאי T כלפי אנטיגנים, שניתן למדוד באמצעות מבחני התפשטות תאי T, כמו גם pMHC-TCR מחייב קינטיקה כפי שנמדדו במבחנה על ידי תהודת plasmon פני השטח לא צריך להיות מושפעת על ידי התוספת של מקשר וfluorophore ל פפטיד. לחלופין, מעמד MHC אני מולקולות עצמן יכול להיות מתויג באופן ספציפי לאתר עם ההקדמה של ציסטאין מזווג בתוך הרצף של השרשרת הכבדה (תצפיות לא פורסמו). עם השימוש בבדיקות מולקולריות מתאימות כל אינטראקציה בין חלבונים סינפטיים יכולה בעיקרון להיות למדה באופן מתואר במסמך זה. בדיקות כאלה, למשל, של SCF V או חלבונים עוצב Ankyrin חזרו (DARPins) 17, צריכה להיות חד ערכי וצריך לקשור היעד שלהם ביציבות מבלי להשפיע על האינטראקציה של עניין. כמובן, informatio המבניn רצוי מאוד לעיצוב בדיקה רציונלים אבל לא חובה מוחלטת. בעת הקמת זוג שותפי סריג חדש, מומלץ להקליט ולנתח סריג בכמויות הגדולה הראשונה. אתרים של קובץ מצורף תווית עשויים להיות מגוונים במידה ניכרת על מנת למקסם את אות סריג וגם כדי לוודא שתשואות שנמדדו סריג להשתנות בהתאם למרחק בין הצבע. ברגע שהמערכת מותאמת, מולקולה בודדת סריג אותות עשויים להיות מוקלטים על ידי הגבלת התיוג של שותף סריג שפע הגבוה ל10-30% והלבנת שותף סריג שפע הנמוך עד מולקולות בודדות הן פתירות בתחום התאורה. אחרון חביב יש לציין כי SLBs משוער כמה אבל לא את כל ההיבטים של קרום פלזמה פיסיולוגי. תכונות כגון עקמומיות קרום וגמישות, מידור תחום, שחלופי cytoskeletal ותנועתיות תא, כמו גם מגוון גבוה של חלבונים בממברנה-הביע משטח אינן מיוצגות על ידי SLBs אבל עשוי להשפיע לאהוא לעבד תחת חקירה. הרבה מאמץ צריך להיות מושקע להקים שיטות הדמיה המאפשרות ניטור אינטראקציות חלבון-חלבון עם רזולוציה מולקולה בודדת בסינפסות הפיזיולוגית, שאינן נגישים להדמית TIRF.

<table><tbody><tr><td>LB-media</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>10000713</td><td>ביטוי חיידקים</td></tr><tr><td>Sf900 II</td><td>Life Technologies</td><td>10227402</td><td>מדיה של תאי חרקים לייצור נגיף בקולו</td></tr><tr><td>Insect-XPRESS עם L-גלוטמין (לונזה)</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>10564038</td><td>מדיה של תאי חרקים לביטוי נגיף בקולו</td></tr><tr><td>תאי Sf9</td><td>Life Technologies</td><td>11496-015</td><td>תאים לנגיף ייצור והרחבה</td></tr><tr><td>High Five Cells</td><td>Life Technologies</td><td>B855-02</td><td>תאים לביטוי פוטאין</td></tr><tr><td>LB-media</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>10000713</td><td>ביטוי חיידקים</td></tr><tr><td>מערכת Centramate</td><td>ריכוז חלבון</td><td>Pall</td><td></td> מנפחים גדולים</tr><tr><td>קלטת Centramate 10kDa ניתוק</td><td>Pall</td><td>OS010T12</td><td>ריכוז חלבון מנפחים גדולים</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 יחידות סינון צנטריפוגליות</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC900308</td><td>ריכוז חלבון</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-4 יחידות סינון צנטריפוגליות</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC800308</td><td>ריכוז חלבון</td></tr><tr><td>Amicon Stirred Ultrafiltration Cell דגם 200 מ"ל</td><td>EMD Millipore</td><td>5123</td><td>חלבון concentartion</td></tr><tr><td>&Auml; kta טהור 25L</td><td>GE Healthcare</td><td>29-0182-24</td><td>טיהור חלבון</td></tr><tr><td>Superdex 200 10/300 GL</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5175-01</td><td>טיהור חלבון</td></tr><tr><td>Superdex 75 10/300 GL</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5174-01</td><td>טיהור חלבון</td></tr><tr><td>Mono Q 5/50GL</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5166-01</td><td>טיהור חלבון</td></tr><tr><td>Ni Sepharose 6 Fast Flow</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5318-01</td><td>טיהור חלבון</td></tr><tr><td>טריקורן 10/20 עמודה</td><td>GE Healthcare</td><td>28-4064-13</td><td>טיהור חלבון</td></tr><tr><td>מערכת גילסון HPLC</td> טיהור <td>גילסון</td><td></td><td>של פפטידים מצומדים פלואורוכרום</td></tr><tr><td>Pursuit XRs C18, 5 ומיקרו; גודל חלקיקים מ', גודל עמודה 21.2*250 מ"מ</td> טיהור <td>A6000250X212 זריז</td><td></td><td>של פפטידים מצומדים פלואורוכרום</td></tr><tr><td>Pursuit XRs C18, 5 ומיקרו; m גודל חלקיקים, 21.2*50 מ"מ גודל עמודה</td><td>Agilent</td><td>A6000050G212</td><td>טיהור של פפטידים מצומדים פלואורוכרום</td></tr><tr><td>טריקורן 10/20 עמודה&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>28-4064-13</td><td>טיהור חלבון</td></tr><tr><td>מערכת HPLC גילסון</td> טיהור <td>גילסון</td><td></td><td>של פפטידים מצומדים פלואורוכרום</td></tr><tr><td>Pursuit XRs C18, 5 ומיקרו; גודל חלקיקים מ', גודל עמודה 21.2*250 מ"מ</td> טיהור <td>A6000250X212 זריז</td><td></td><td>של פפטידים מצומדים פלואורוכרום</td></tr><tr><td>Pursuit XRs C18, 5 ומיקרו; גודל חלקיקים m, גודל עמודה 21.2*50 מ"מ</td> טיהור <td>A6000050G212 זריז</td><td></td><td>של פפטידים מצומדים פלואורוכרום</td></tr><tr><td>Cy3 maleimide</td><td>GE Healthcare</td><td>PA23031</td><td>תיוג חלבון ספציפי לאתר באמצעות ציסטאין מוטנטי לא מזווג</td></tr><tr><td>Cy5 maleimide</td><td>GE Healthcare</td><td>PA25031</td><td>תיוג חלבון ספציפי לאתר באמצעות ציסטאין מוטנטי לא מזווג</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 C2 Maleimide</td><td>Life Technologies</td><td>A-20346</td><td>תיוג חלבון ספציפי לאתר באמצעות ציסטאין מוטנטי לא מזווג</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 C2 Maleimide</td><td>Life Technologies</td><td>A-20347</td><td>תיוג חלבון ספציפי לאתר באמצעות ציסטאין מוטנטי לא מזווג</td></tr><tr><td>Fura-2, AM, תא permean</td><td>Life Technologies</td><td>F-1221</td><td>צבע רגיש לסידן לתיוג תאים</td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד</td><td>Sigma Aldrich</td><td>151874</td><td>להמסת fura-2 am</td></tr><tr><td>תמיסת מלח מאוזנת של האנק בתוספת סידן/מגנזיום</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>10225362</td><td>מאגר הדמיה</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר אלבומין אבקה ליופילית</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>A2153</td><td>תוסף למאגר הדמיה</td></tr><tr><td>14-4-4S נוגדן</td><td>affimetrix eBioscience</td><td>14-5980-81</td><td>נוגדן חוסם ל-H2-I-Ek (מוכר על ידי 5C.C7, 2B4 ו-AND TCR)</td></tr><tr><td>5 מ"ל צינור פוליפרופילן תחתון עגול</td><td>Becton Dickinson</td><td>FALCON 352063</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &mu; m יחידת מסנן צנטריפוגלי Ultrafree-MC</td><td>EMD Millipore</td><td>מסנן</td> מזרק UFC30GV0S <td></td></tr><tr><td>0.2&micro; m</td><td>Millipore</td><td>GVWP04700</td><td></td></tr><tr><td>TetraSpeck Microspheres, 0.1 ומיקרו; m, פלואורסצנטי כחול/ירוק/כתום/אדום כהה</td><td>טכנולוגיות חיים</td> מיקרוסקופ <td>T-7279</td><td></td></tr><tr><td>למדידות סידן מבוססות פורה-2&nbsp;</td>מיקרוסקופ <td>DMI4000B</td><td></td> <td>LEICA</td></tr><tr><td>למדידות FRET (מולקולה בודדת)</td><td>LEICA/ZEISS/NIKON/OLYMPUS</td><td>לפרטים אנא עיין בתרומה המקבילה של JoVE מאת Axmann et al.</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>לפרטים אנא עיין בתרומה מקבילה של JoVE מאת Axmann et al.</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640, עם L-גלוטמין</td><td>Life Technologies</td><td>11554416</td><td>מדיה של תאי T</td></tr><tr><td>חומצת אמינו לא חיונית 100X</td><td>Hyclone</td><td>SH30238.01</td><td>תוסף מדיה של תאי T</td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין/L-גלוטמין 100x</td><td>Life Technologies</td><td>12000226</td><td>תוסף מדיה של תאי T</td></tr><tr><td>2-מרקפטואתנול</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6250</td><td>תוסף מדיה של תאי T</td></tr><tr><td>עכבר אינטרלוקין-2 חלבון רקומביננטי</td><td>BPS Bioscience</td><td>90185-B</td><td>תוסף מדיה של תאי T</td></tr><tr><td>בדרגת מחקר סרום בקר עוברי</td><td>Hyclone</td><td>SV30160.03</td><td>תוסף מדיה של תאי T</td></tr><tr><td>מקור (תוכנית ניתוח)</td><td>OrigenLab</td><td>http://www.originlab.com/</td> <td>התאמה לא ליניארית של שני פרמטרים (tauoff, [ntlag])</td></tr></tbody></table>

מדידת tcr-pmhc כריכה<em&gt; באתר</em&gt; באמצעות assay מיקרוסקופית המבוסס על סריג

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

תאי T הם ספציפיים ויעילים להפליא בעת זיהוי אנטיגנים בצורה של פפטידים המוטבעים במולקולות MHC (pMHC) על פני התאים המציגים אנטיגן (APCs). זאת למרות שקולטני אנטיגן של תאי T (TCRs) מפעילים בדרך כלל זיקה בינונית (טווח מיקרומטר) לאנטיגן כאשר הקישור נמדד במבחנה1. לאור הפרמטרים המולקולריים והתאים התורמים לרגישות לאנטיגן של תאי T, פותחה מתודולוגיה מבוססת מיקרוסקופיה כאמצעי לניטור קשירת TCR-pMHC באתרה, כפי שהיא מתרחשת בתוך הסינפסה של תא T חי ושכבת שומן מישורית מלאכותית ופונקציונלית (SLB), המחקה את קרום התא של תא מציג אנטיגן (APC) 2. המדידות מבוססות על העברת אנרגיית תהודה של Förster (FRET) בין צבע פלואורסצנטי מוסט כחול ואדום המחובר ל-TCR ול-pMHC. מכיוון שהיעילות של FRET עומדת ביחס הפוך לעוצמה השישית של המרחק בין הצבעים, ניתן להשתמש באותות FRET כדי להמחיש קשירת TCR-pMHC סינפטית. גישת המיקרוסקופיה הרגישה תומכת בזיהוי אירועי FRET של מולקולה בודדת. זה מאפשר לקבוע את הזיקה והקצב של אינטראקציות TCR-pMHC סינפטיות ובתורו להפנים את קצב הקשירה. ניתן ליישם מבחנים אנלוגיים כדי למדוד אינטראקציות אחרות בין קולטנים לליגנדים בסביבתם המקורית.

ההקלטה של סידן תוך תאי באמצעות צבע סידן פורע-2, כמו גם הניתוח הסלולרי שלאחר מכן כדי לאמת את עצמת גירוי ולכן הפונקציונליות של SLBs מוצג באיור 4. כמתבררת, רמות סידן לעלות בתאי T (מבוטאות 340nm 380nm יחס מנורמל פורע-2 / עם בסיס להיות 1) מייד ברגע שהם מתיישבים על SLBs גירוי. רמות סידן לחזור לרמות בסיס זמן קצר לאחר התוספת של נוגדנים אשר חוסם pMHCs מאירוסי TCR ואשר מסתיים הפעלת תאי T. איור 6 מתאר ניסוי טיפוסי מעורב התאוששות תורם סריג לאחר הלבנת acceptor, אשר מועסקת למדוד תשואות סריג ואשר משמשת לחישוב ערכי 2D-K D (שמוצג באיור 4). שים לב העלייה בעוצמת תורם סריג, המייצגת TCR שכותרתו באמצעות AF555, לאחר אבלציה המהירה והמלאה של סריגמיני cceptor (כאן: AF647 הקשורים pMHCs). ניכר גם היא הירידה החזקה בערוץ סריג, כלומר, ערוץ סריג-acceptor תחת עירור תורם סריג, לאחר הלבנת acceptor סריג. האות שנותרה בקושי נראית מתאימה לסריג bleedthrough תורם. תשואות סריג בתוך microclusters TCR הבודד או כל סינפסות מחושבות על בסיס הערכים שצוינו בעוצמה הנמדדת (איור 6). איור 7 מתאר לשגות מסלול והזמן של מולקולת אירוע סריג אחת גלוי בשתי מסגרות זמן. כפי שתואר לעיל במבוא התנהגות כזו נגרמת על ידי שני הריקבון של TCR-pMHC הסינפטי המחייבים וphotobleaching. להפלות בין שתי התרומות הללו, המסגרות הניסיוניות זמן רכישה צריכה להיות מגוונות בזמן: בעוד photobleaching נשאר קבוע, שינויים באורך מסלול אירוע סריג נגרמים רק על ידי קינטיקה המחייבות. כימות של tracelengths, w<html> hich מהווה את הבסיס לחישוב מחוץ לשיעורים והלבנה מוצגים באיור 7, מסופקים בשולחנות 1 עד 3. קביעת 2D-K D של דורשת הקלטה של תפזורת סריג תשואות לTCRs כותרת סריג-תורם. עם השימוש של C להסיק בניסוי הקבוע (איור 4), תשואת סריג נמדדה microcluster TCR או כל סינפסה ניתן להמיר את TCR תפוסה, כלומר, היחס של TCRs pMHC-עוסק וכולל (איור 4C) . עם צפיפות pMHC ידועה כיום על SLB לפני תוספת של T-cell, ניתן ליישם את הערכים כדי לקבוע ערכים הסינפטי 2D-K D (איור 4D). על-שיעורים ניתן לחשב עם החוק של פעולה המונית (2D-k ב= 2D-K את / 2D-K D) מהסינפטי נקבע מחוץ לשער וערכי 2D-KD. 1 &quot;src =&quot; / קבצים / ftp_upload / 53,157 / 53157fig1.jpg &quot;/&gt; איור 1. מתווה סכמטי של bilayer שומנים מישוריים המערכת נתמכת זכוכית (SLB). SLBs () מורכב מPOPC (90-99%) והשומנים סינטטיים DGS Ni-נת&quot;ע (1-10%) וליצור באופן ספונטני כאשר משטחי זכוכית נקיים נזקפים עם שלפוחית ​​unilamellar הקטנה (רכבי שטח) בהיקף של השומנים המקביל. (ב) לאחר שנוצר, יכול להיות פונקציונליות SLBs כזה עם חלקים מסיסים-מתויג polyhistidine תאיים נגזרים מpMHCs, costimulatory B7-1 חלבונים וחלבוני הדבקה ICAM-1, שישמש כנגמ&quot;שים לתאי T. לקבלת מידע נוסף על הכנת SLBs מתייחס לAxmann et al. 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig2.jpg" /> Figu<html> מחדש 2. פורסטר תהודת אנרגיה מבוסס ההעברה assay לכמת TCR-pMHC מחייב באתר. (א) מבנה מורכב של TCR ומורכב עם בר שרשרת אחת H57 עוסק pMHC ממחישה את הגישה מבוססת סריג המתואר במסמך זה. שים לב למרחק הקצר של כ 41 א מפריד בין שני fluorophores המקביל עובר סריג. אתרי acceptor לfluorophore-maleimides מסומנים בירוק ואדום. (ב) עיקרון גילוי אינטראקציות TCR-pMHC באתר מאויר. רק SCF V -decorated TCRs וpMHCs (כאן k IE), המהווים מתחמים ספציפיים, להצמיח אות סריג מדידה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> &quot;/&gt; איור 3. chromatograms של עליית שלב סינון ג&#39;ל נותנת הסופית לk -2x6H מולקולות IE monomeric של SCF V והטעון פפטיד. X-צירים מייצגים שימור נפח במ&quot;ל, Y-צירים מצביעים הספיגה ב 280 ננומטר ביחידות שרירותיות (AU) . (א) אתר-במיוחד H57 SCF V מסומן בmaleimide אלקסה פלואוריד 555 היה נתון לכרומטוגרפיה S75 להפריד צבע unreacted מהחלבון (שלב 1.2.5). שברים המתאימים למרווח שמירה 14 מיליליטר עד 15 (קווים מקווקווים) מייצגים כותרת V H57 SCF monomeric. מולקולות (ב) IE k -2x6H ומורכבים עם פפטיד בעל ANP-חלל UV-cleavable הייתה מוקרן UV, מודגרות עם אלכס אתר-במיוחד 647 פפטיד שכותרת maleimide ולבסוף נתון לכרומטוגרפיה S200 להפריד את החלבון מפפטיד בחינם (שלב 1.1.2.4). המרווח בין הקווים מקווקווים מכיל מקופל כראוי וpMHCs monomeric. (A, B) </sטרונג&gt; 0.7 מיליליטר המדגם היה מוחל על הטור בתחילת הרום (0 מיליליטר נקודה). שברים שנאספו רוכזו. יחס חלבון לצבע נקבע על ידי photospectrometry לפני הדיאליזה נגד גליצרול / 50% PBS (לאחסון ב -20 °). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig4.jpg" /> איור 4. קביעת D של 2D-K ו2D-K על ים. () המתאם בין תשואת סריג כפי שנקבע על ידי התאוששות תורם לאחר הלבנת acceptor ותפוסת TCR נמדדו בניסוי. תפוסת TCR ניתן לקבוע לmicroclusters TCR פרט כפי שהוסברה בסעיף 4.2. נכון ליניארית של הנתונים המוצגים על ידי הקו, המדרון שבם הוא שווה ל- C היחס בין TCRהתפוסה ותשואת סריג. C הוא ספציפי קבוע למערכת סריג וfluorophores (כאן Cy3 ו Cy5) מועסקות. בדוגמא זו הניבה 1.988. (ב) סריג נתוני תשואה נקבעו לmicroclusters TCR הבודד (N = 187, טמפרטורה = 24 ° C) דרך התאוששות תורם של הלבנת acceptor. מספרים מתחת ברים היסטוגרמה לציין את הגבול העליון בתוך המרווח. המרה (C) של הנתונים המוצגים ב( ב &#39;) על ידי הכפלה נמדד סריג תשואות עם הקבוע C שנקבע ב(). מספרים מתחת ברים לציין את הגבול העליון בתוך המרווח. היסטוגרמה (ד) (חצי-לוגריתמים, בסיס = 4) המתאר את חלוקת 2D-K D של נמדדה microclusters TCR הבודד. 2D-K D החציון מצויינים בכחול. מספרים מתחת ברים לציין את הגבול העליון בתוך המרווח. (E) היסטוגרמה מוצגת ב( ד) הוסב intOA 2D-K על -histogram (חצי-לוגריתמים, בסיס = 4) העסקת k הסינפטי לסירוגין במשך 24 ° C (0.41 s -1). 2D-k החציון נקבע על ערך מצויינים בכחול. הנתונים פורסמו במקור חופה et al. 2 והם דמיינו כאן בפורמט חדש. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig5.jpg" /> איור 5. אימות פונקציונלית של SLBs מועסק לגירוי תא T והדמיה. תקיעות T-cell () TCR-מהונדסים עמוסות פורע-2 התעמתו עם SLB גירוי מחסה pMHCs אנטיגני, ICAM-1 ו- B-7. פורע-2 פליטה סלולרית נרגשת ב340 ננומטר ו 380 ננומטר, כמו גם תמונות דסק&quot;ש נרשמו. כפי שצוין, ערכי יחס של עוצמות הפליטה נרגשות על 340 ו 380 ננומטר מוצג בפנל הימני. תוספת של pMHC חסימת נוגדנים 14 דקות לניסוי הריצה הביאה לירידה ברמות סידן תוך תאי דומים לזה של מנוחה תאי T. (ב) פרופיל זמני טיפוסי של יחסי פורע-2 ממוצע בתאי T הפנייה SLBs גירוי מאופיין על ידי עלייה ראשונית בסידן תוך תאי שהוא 2 עד 4 פעמים גבוהות יותר בהשוואה לזו של תאי T שאינו מופעלים או תאי T נשללו אנטיגן לאחר מצור בתיווך נוגדנים. עיגולים ירוקים מצביעים נקודות זמן מאוירות ב(). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig6.jpg" /> גורף 6. איור סריג תשואות כפי שנמדד באמצעות שחזור תורם סריג לאחר הלבנת acceptor סריג. <strאונג&gt; () מוצג הוא דוגמא לסריג-מדידה הסינפטי טיפוסית. כפי שעולה משמאל ועל גבי סדרה של תמונות נרכשה עם השימוש במפצל קרן פליטה הוליד תורם סריג וערוץ acceptor סריג (למידע מפורט יותר על מפצלי אלומה מתייחס לAxmann et al 4). הקו שמוצג בתמונה דסק&quot;ש עזבה מציין את הגבול של סינפסה T-cell. שים לב להפסד בעוצמה בתוך ערוץ acceptor סריג גם היא העלייה בעוצמת בערוץ תורם סריג לאחר הלבנת acceptor סריג (שלב 4). (ב) סריג ניתן לכמת את היעילות כפי שצוין לאזורים הסינפטי בודדים או לכל סינפסות. לבדיקה, תמונות לפני ואחרי הלבנת acceptor סריג מוצגות עם השימוש בשני שולחנות בדיקה (luts, ירוק ופיסיקה). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> </p&gt; <img alt="איור 7" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig7.jpg" /> איור 7. מולקולה בודדת סריג אירועים מופיעים ונעלמים צעדי insingle ומיושרים באופן מושלם עם fluorophore acceptor סריג יחיד. לשגות של המולקולה בודדת אירוע סריג הזמן מוצג. תמונות נרכשו באמצעות מצלמה EMCCD-אחורית מואר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig7large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 8" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig8.jpg" /> איור 8. קביעת τ את = 1 / k מן מסלולי smFRET נמדדו. (א) הסכומים המצטברים מנורמלים של אותות סריג לצפייה (הנגזרים מH57 SCF V -AF555 מעוצב 5c.c7 תקיעות T-cell מהונדס TCR הכרת IE &lt;sup&gt; k / K3-AF647 ב 24 מעלות צלזיוס) במשך ארבעה פיגורים שונים זמן (42 אלפיות שניים, 490 אלפיות שניים, 1,007 אלפיות שני, 1,989 אלפיות שני) היו זמם כפונקציה של המספר הכולל של תצפיות. פונקציות בכושר מונו מעריכי להצמיח מקביל ההפוך השלילית של ערכי הציפייה &lt;n (פיגור t)&gt;. ערכים (ב) ציפייה היו זממו נגד פיגור t עיכובים ומצוידים באמצעות משוואה &lt;n (פיגור t)&gt; = τ את / {(Τ את / &lt;n להלבין&gt;) + פיגור t} להניב τ את ו&lt; n להלבין&gt;. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig8large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

כתב יד זה מתאר כיצד לבצע (מולקולה בודדת) Förster Resonance Energy Transfer (FRET) - מבחנים מבוססי Förster למדידת דינמיקת הקישור בין קולטן אנטיגן של תאי T (TCR) ומולקולות MHC עמוסות פפטידים אנטיגניות כפי שהן מתרחשות בתוך הסינפסה האימונולוגית של תא T במגע עם שכבת שומנים דו-שכבתית נתמכת מישורית פונקציונלית.

מדידת TCR-pMHC כריכה<em&gt; באתר</em&gt; באמצעות assay מיקרוסקופית המבוסס על סריג

T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen ...

measuring-tcr-pmhc-binding-in-situ-using-a-fret-based-microscopy-assay

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

שיטת ה-IP FCM מוצג, המאפשר רגיש, הערכה החזקה, ביוכימיות של חלבונים אינטראקציות הילידים, ללא צורך בהנדסה גנטית או גודל מדגם גדול.

IP-FCM: immunoprecipitation זוהה על ידי זרימת cytometry

פרוטוקול זה מתאר כיצד חלבונים תמונה אינטראקציות באמצעות assay סריג מבוססי הקרבה.

הדמיה חלבונים אינטראקציות In vivo</em

נתאר שיטה אשר מודד את קינטיקה של תחבורה יון של חלבונים בממברנה לצד ניתוח אתר ספציפי של שינויים קונפורמציה באמצעות הקרינה על תאים בודדים. טכניקה זו ניתנת להתאמה תעלות יונים, מובילי משאבות יונים יכול להיות מנוצל כדי לקבוע מגבלות המרחק בין יחידות משנה חלבון.

בחינת Dynamics קונפורמציה של חלבונים בממברנה באתרו עם תיוג, האתר מכוון פלואורסצנטי

המידור של חלבונים גם בתוך קרום פלזמה או אל מקומות תאיים הוא אחד מנגנון רגולטורי כי יכול מאוד להשפיע על התוצאות איתות, ולכן, כדי להבין איתות חשוב ללמוד את התנהגות במרחב ובזמן של חלבונים המעורבים. המתואר כאן מערכת מבוססת מיקרוסקופיה TIRF ללמוד התמרה האות בתאי T, אבל הוא החלים רחב.

טכניקה מיקרוסקופית TIRF הדמיה בזמן אמת סימולטני של TCR וחלבונים הקשורים אליו לשידור אותות

העברת אנרגית פורסטר תהודה (סריג) מיקרוסקופית היא טכניקה רבה עצמה לניטור בזמן אמת של אירועי איתות בתאים חיים באמצעות חיישנים ביולוגיים שונים כעיתונאים. כאן אנו מתארים כיצד לבנות epifluorescence אישית סריג מערכת הדמיה ממרכיבים מסחריים זמינים וכיצד להשתמש בו לניסויי סריג.

סריג מיקרוסקופי לניטור בזמן אמת של אירועי איתות בתאים חיים באמצעות Biosensors Unimolecular

אנדוציטוזיס בתיווך קלת'רין, תהליך מהיר ודינמי ביותר שמפנים חלבונים רבים, כולל קולטני איתות. הפרוטוקול המתואר כאן מדמיין ישירות את הקינטיקה של אירועים אנדוציטיים בודדים. זה חיוני להבנת האופן שבו חברי הליבה של המנגנון האנדוציטי מתאמים זה עם זה, וכיצד מטען החלבון משפיע על תהליך זה.

חזותי אנדוציטוזה בתיווך clathrin של רצפטורים מצמידים חלבון G בהחלטה חד אירוע באמצעות TIRF מיקרוסקופית

המיטוכונדריה יכול לנצל את הפוטנציאל אלקטרוכימי על פני הקרום הפנימי שלהם (Δ Ψm) כדי לעקל סידן (Ca 2 +), המאפשר להם לעצב Ca cytosolic 2+ איתות בתוך התא. אנו מתארים שיטה המיטוכונדריה מדידה בו זמנית ספיגת Ca 2 + ו ΔΨ מ בתאים חיים באמצעות צבעי ניאון ו מיקרוסקופיה confocal.

מדידה בו זמנית של סידן מיטוכונדריאלי מיטוכונדריאלי ממברנה פוטנציאלית בתאים חיים באמצעות פלורסנט מיקרוסקופית

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לשימוש בו זמנית של פורסטר תהודה אנרגיה מבוססת על העברת מתח חיישנים שימדדו עומס חלבון ושחזור פלורסצנטיות לאחר photobleaching למדוד דינמיקה חלבון המאפשר מדידת כוח רגיש דינמיקה חלבונים בתאים חיים.

מדידה של דינמיקה רגישים ל"כוח הפזורים חלבונים בתאים חיים באמצעות שילוב של טכניקות פלורסנט

פרוטוקול זה מציג שיטה למדידת קשירת אדנין נוקלאוטיד לקולטנים בזמן אמת בסביבה תאית. הקישור נמדד כהעברת אנרגיית תהודה של פורסטר (FRET) בין נגזרות נוקלאוטידים של טריניטרופניל לבין חלבון המסומן בחומצת אמינו פלואורסצנטית לא קנוני.

מדידת קשירת נוקלאוטידים לחלבוני ממברנה שלמים ומתפקדים בזמן אמת

מחקר זה מציג הליך מפורט לביצוע ניסויים של העברת אנרגיה בתהודה פלואורסצנטית של מולקולה בודדת (smFRET) על קולטנים מצומדים לחלבון G (GPCRs) באמצעות תיוג ספציפי לאתר באמצעות שילוב חומצות אמינו לא טבעיות (UAA). הפרוטוקול מספק מדריך שלב אחר שלב להכנת דגימות smFRET, ניסויים וניתוח נתונים.

הדמיה של הדינמיקה הקונפורמציונית של קולטני ממברנה באמצעות FRET של מולקולה בודדת

השיטות לחקר ביו-אנרגטיקה מיטוכונדריאלית תחת ריכוזי מצע רלוונטיים פיזיולוגית בתאי מערכת החיסון מוגבלות. אנו מספקים פרוטוקול מפורט המשתמש בפלואורספירומטריה ברזולוציה גבוהה כדי להעריך שינויים בתגובה של פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית לדרישת אנרגיה בתאי T אנושיים, מונוציטים ותאים חד-גרעיניים היקפיים.

פלואורספירומטריה ברזולוציה גבוהה להערכת שינויים דינמיים בפוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית בתאי מערכת החיסון האנושית

למדו למדוד קינטיקת קישור TCR-pMHC בסינפסה האימונולוגית באמצעות מיקרוסקופיית FRET. שיטה זו מאפשרת ניתוח כמותי של אפיניות, קצב פירוק וקצב קישור ברמת מולקולה בודדת וברמת אוכלוסייה.

מדידת TCR-pMHC כריכה

גלה סרטונים נוספים