מדידת TCR-pMHC כריכה

בסרטון זה, נראה כיצד למדוד את הקינטיקה בין הקולטן לאנטיגן של תאי T לבין קומפלקס התאימות הראשית הטעון פפטיד (pMHC) ב-C2, בתוך הסינפסה האימונולוגית שבין תא T לשכבת ליפידים נתמכת מישורית. נדריך אתכם בקצרה בהיבטים חשובים של ייצור חלבונים ואימות השלמות התפקודית של שכבת הליפידים באמצעות מדידות של זרימת סידן. למידע מפורט יותר על אופן הכנת שכבת ליפידים וכיצד להקים מיקרוסקופ פלואורסצנציה של מולקולה בודדת, אנא עיינו בכתבה המקבילה שלנו ב-Journal of Visualized Experiments. לאחר מכן, נסביר בפירוט כיצד לבצע ולנתח מדידות של העברת אנרגיה ברזוננס (FRET) ב-bulk וברמה של מולקולה בודדת.

כדי להסיק את הקינטיקה של קישור קולטן תאי T סינפטי ל-PMHC ולהסביר את האסטרטגיה מבוססת ה-FRET ששימשה בגישה הכוללת שלנו, נתחיל עם המבנה הגבישי של קולטן תאי T (TCR), המוצג כאן בכחול, בעת קישורו לאנטיגן שלו, מולקולת MHC טעונה פפטיד (PMHC) המוצגת בצהוב ובאדום. כמו כן, נציג פרגמנט של שרשרת בודדת של הדומיינים המשתנים מנוגדן רגיב ל-TCR בטא, המכונה age 57. לצורך מדידות FRET כמותיות, הכרחי לסמן הן את תורם ה-FRET, במקרה שלנו הפרגמנט של השרשרת הבודדת, והן את מקבל ה-FRET, ה-PMHC, באופן ספציפי לאתר.

דבר זה אפשרי עבור חלבונים רקומביננטיים באמצעות הכנסת ציסטאין שאינו מקופל, שניתן לקשור לאחר מכן באופן קוולנטי לפורופור שצומד למולקולה. כפי שמוצג, אנו מחברים את תורם ה-FRET, ‏Alexa Fluor 555 או Cy3, למקטע החד-שרשראתי ואת מקבל ה-FRET, ‏Alexa Fluor 647 או Cy5, לקצה ה-C של הפפטיד הקשור ל-MHC.

מרחק ה-Indy כפי שמוצג במבנה מורכב זה הוא כ-41 angstrum, פחות אף מהרדיוס הראשון, שהוא המרחק של העברה אנרגטית מקסימלית של חצי בין שני הצבעים. בניסויינו, אנו משתמשים בשכבות ליפידים דו-שכביות על תמיכת זכוכית מישורית כתאי אפסורגט המציגים אנטיגן. אלה פונקציונליים עם PMXC, המולקולה B seven one ומולקולת ההיצמדות I chem one.

בדרך זו ניתן לבצע דימוי במצב פלואורסצנציה של החזרה פנימית מלאה, המאיר את הפלואורסצנציה בקרבה מיידית לממשק, ובכך מפחית משמעותית את הרקע התאי. Fret ניתן לזיהוי רק כאשר TCRs מסומנים במקטע שרשרת בודדת נקשרים ל-PM hcs המוטמעים בשכבה. דבר זה מאפשר לנו להדמיות את הקישור של T-C-R-P-M-H-C ולאחר מכן לחשב את קינטיקת הקישור ב-C שני histo gene Tact מקופלים כראוי.

חלקים חוץ-תאיים של P71 ו-Ichem1 מטוהרים מתוכניות (supernatants) של תרביות תאי חרקים שהודבקו בנגיפי BUC המתאימים. הטיהר מתבצע בשלושה שלבים, המתחילים בכרומטוגרפיית ספיחה של ניקל-NTA, ולאחריהם חילוף יונים וכרומטוגרפיית הדרת גודל. הטרודימרים של MHC Class II עם תג Hisטו מובעים ב-E. coli כגופי הכללה (inclusion bodies) ומקופלים מחדש in vitro בטמפרטורה של 4°C בנוכחות פפטיד תומך (space holder peptide) באמצעות דילול מהיר בבפר רדוקס.

הפפטיד המשמש כתושב מקום (space holder) יבוקע מאוחר יותר באמצעות חשיפה לאור UV. קומפלקסי PMHC מקומפלים כראוי, מלבד אלו המזוהים עם תושב המקום המטוהר והמרוכז. הפפטיד נבוקה ויוחלף ב-pH 5.2 בפפטיד פלואורסצנטי.

המוצר הסופי מטוהר לפי גודל. מקטע השרשרת הבודדת מבוטא עם ציסטאין שאינו מקושר כגופי תכליליות (inclusion bodies) ב-e coli, ומקופל מחדש in vitro באמצעות דיאליזה מדורגת וטיהור לפי גודל. לאחר מכן הוא מסומן באמצעות הציסטאין שאינו מקושר בעזרת צבע מצומד למאלייד (maleimide) ומטוהר שוב לפי גודל.

כל החלבונים הרקומביננטיים עוברים בסופו של דבר דיאליזה מול PBS המכיל 50% glycerol, מרוכזים לריכוז של one milligram protein per milliliter ונשמרים לטווח ארוך בטמפרטורה של Minus 20 degrees Celsius. השתמש ב-URA two dye רציומטרי למדידת רמות הסידן התוך-תאיות בתאי T כאמצעי לאימות העוצמה הגירוית של ה-lipid blay. טען את ה-T-cell blast עם ה-URA 2:00 AM ester.

תרכובת זו חודרת לתאים באמצעות מוטיב ה-AM שלה, אך היא נלכדת בתוכם על ידי פעולתן של אסטראזות, המבצעות ניתוק של חלק ה-AM. הוסף 2:00 AM לכ-3 מיליון תאי T בריכוז סופי של five microm MO לליטר. העבר את התאים מפלטת ה-24 בארות לשפורור חדש והדגר בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.

שטפו את התאים פעם אחת בבופר דימוי המכיל תמיסת Hanks buffered saline הכוללת סידן ומגנזיום ו-1% albumin. כדי לנטר סידן תוך-תאי, השתמשו במערכת מיקרוסקופ הפוך אוטומטית בעלת יכולת UV. התחילו את פרוטוקול התזמון והוסיפו פחות משני תאי T טעונים לשכבת הליפידים הפונקציונלית הממוקדת עלבמת המיקרוסקופ, ורכשו במרווחי זמן קבועים תמונת DIC ושתי תמונות פלואורסצנטיות שעוררו באור UV של 340 ו-380 nanometer.

מיד לאחר יצירת מגע עם השכבה הכפולה, תאי T מאמצים רמות סידן מוגברות, כפי שנקרא על ידי יחס ה-URA two לאחר 15 דקות מהתחלת ההרצה. הוסף לתאים נוגדן חוסם הרוויע את כל אנטיגני ה-PMHC. כתוצאה מכך, רמות הסידן התוך-תאיים יורדות לרמות של המצב שאינו מופעל, אשר ישמשו מאוחר יותר כנקודת ייחוס.

ברגע שרמות הנוגדן החוסם יורדות לערך המשקף את המצב הלא-מופעל, אותו ננרמיל לערך אחד עבור מדידות FRET, יש לצבוע את תאי ה-T בעזרת גשושית FRET מסוג Fragment single chain המגיבה ל-TCR. עבור כל ניסוי, העבירו כ-1 מיליון תאים למבחנה וסובבו אותם ב-400 G. שפכו את המצע וסננו את טיפות המצע הנותרות הדבקות לדפנות הפנימיות בעזרת נייר סופג. פעולה זו מבטיחה נפח אינקובציה מינימלי של כ-30 µL, כפי שציינתי קודם לכן.

הגשוש (probe) מסוג FRET מאוחסן בריכוז של 1 mg/mL ו-50% glycerol בטמפרטורה של 20°C-. הוא מסומן באופן ספציפי לאתר באמצעות Alexa Fluor 555 או Alexa Fluor 647, ביחס חלבון-צבע של 1:1. הוסף 0.3 µL מהגשוש אל התאים. נער את המשקע בעדינות מספר פעמים והדגר את התאים למשך 20 דקות על קרח.

שטפו את התאים בבופר דימוי קר מאוד (בטמפרטורת קרח). חזרו על הליך שטיפה זה פעם אחת. דגירה, סריפוגציה ואחסון בטמפרטורה נמוכה מבטיחים שתאי T לא יבצעו הפנמה של הגשוש הפלואורסצנטי בזמן שהם חשופים אליו.

דבר זה יגרום לבתהוריות רקע מוגברת. יתרה מכך, תאי T אינם מאבדים את הגשש בקור במהלך השטיפה והאחסון לפני הנחת התא המכיל את השכבה הדו-שכבתית (bilayer) על משטח ההחלפה של המיקרוסקופ. יש להחליף את ה-PBS בבפר רצוף במקשר דימוי (imaging buffer), תוך הימנעות מוחלטת מחשיפת השכבה הדו-שכבתית לאוויר, שכן הדבר יהרוס אותה.

כדי להפחית את הרקע התאי, אנו משתמשים בהארה מסוג turf. לשם כך, אנו ממקמים את קרן העירור בזווית קריטית שבה מתרחשת החזרה פנימית מלאה. כבו את העירור, הדליקו את האור הרחב, הוסיפו את ה-T-cell לתא ה-ltec והמתינו עד ששקעו על שכבת הליפידים.

הפעל את העירור ומקّد תאורה שאינה ב-turf. ממברנת התא נצפית כטבעת לאורך הציר האופטי בכל מישור מוקד; ב-turf רק הממברנה הבסיסלית הבאה במגע עם השכבה הכפולה נראית. מישורי מוקד שמעל אינם מעוררים יותר ולכן אינם נראים.

פרוטוקול התזמון מתחיל בפולסי עירור אדומים וירוקים להדמיית PMHC ו-TCR, ולאחריהם פולס הלבנה אדום להסרה של המקבל P-M-H-C-F. פולס ירוק להדמיית ה-TCR לאחר הלבנת המקבל F, ופולס אדום לאימות הסרת המקבל F, מבוצעים בלוח זמנים של פחות משנייה עם ההשהיה הקצרה ביותר האפשרית בין הפולס הירוק הראשון לשני. באופן רשות, ניתן לקבל תמונת DIC בתחילה; פיצול תמונות דו-צבעי מאפשר זיהוי סימולטני של ערוצי התור והמקבל.

עירור המקבל הסימון מראה הצטברות של P HCS בסינפסה של תאי T. תמונה זו מאששת את נוכחותם של pmcs ומצביעה על קישור PMHC המתווך על ידי TCR. מרגש. התורם הסימון יוצר תמונות בשני הערוצים.

עוצמת האות של ערוץ התור המעורר פוחתת במידה מסוימת עקב העברת אנרגיה לערוץ המקבל של FRET. האות של ערוץ המקבל של FRET מורכב מזליגה (bleed through) של התור המעורר והערכה צולבת (cross excitation) של מקבל ה-FRET. בכל מקרה, תמונה זו לא תשמש לצורך ניתוח.

בפרוטוקול הנוכחי, ביצוע הבהרה מהירה (fast bleach) מסירה את כל ה-F המקובל ב-fluoro force. עוצמת תמונת תורם F Fed לאחר הבהרה מקובלת של FRET משוקמת כעת לרמות גבוהות יותר ללא איבוד עוצמה בערוץ ה-fre.

הציפייה הבאה למקבל ה-FRET מאמתת הלבנה מלאה של מקבל ה-F. נבצע זום לתוך הסינפסה כדי לכמת את התאוששות התורם. קבע את עוצמת הרקע הממוצעת כקבוע ללא קשר למקבל ה-FRET.

בצעו פוטובליצ'ינג (Photobleaching) ולאחר מכן קבעו את העוצמה הממוצעת של הסינפסה ואת העוצמה של צביר TCR מייצג. נבואת ה-fret מחושבת לאחר מכן על ידי נרמול ההפרש לפני ואחרי אבלציית מקבל f. בדוגמה שלנו, מדדנו 16%fret עבור הסינפסה כולה ו-26%fret עבור המייצג.

תשואי ה-FRET של צבירי TCR יומרים מאוחר יותר לתפוסות TCR, אשר יניבו נתונים של קבוע הדיסוציאציה הסינפטידומימטי דו-ממדי ברמה של מולקולה בודדת. אלו יסייעו לנו להסיק את קינטיקת הקישור של TCR לפפטיד-MHC בסינפסה עבור ניסויי FRET של מולקולה בודדת. אנו משתמשים באותם ריאגנטים ובאותה אסטרטגיית עבודה כפי שבוצעו קודם לכן.

עם זאת, כדי להבטיח שאנו אכן צופים באינטראקציה בין TCR בודד לבין peptide MHC בודד, בחרנו לעמוד בקריטריון הבא. אירוע מועמד ל-fre של מולקולה בודדת חייב להתרחש באופן קולוקליבי עם מולקולת fre acceptor או fre donor בודדת. כאן אנו משתמשים ב-PMHC בודד כמולקולת fre acceptor כדי לאמת את טבעה של המולקולה הבודדת של אירוע ה-fre שנצפה, אך ניתן להשתמש ברציונל ההפוך.

שימוש במקבלים (acceptors) בערוצים עליונים ובתורמים (donors) בערוצים תחתונים הוא בהחלט אפשרות. בדרך כלל אנו חושפים תאי T הבאים במגע עם שכבת ליפידים מעוררת לעירור באור באורך גל של 514 ו-647 ננומטר; עירור רצפי וחזרתי של התורם והמקבל עם השהיית זמן מינימלית של מילישנייה אחת, ולאחריו זמן המתנה. ניתן לשנות זאת בהתאם לדרישות הניסוי.

כדי לקבל אות פלואורסצנציה חזק מספיק לזיהוי צבע בודד תוך מילישניות מרגע העירור, עלינו להפעיל צפיפויות הספק עירור גבוהות הנעות בין 1 ל-5 kilowatts per square centimeter. בשל פוטובליצ'ינג (photobleaching), מספר מולקולות ה-PMHC המשמשות כמקבלי FRET נראה יורד במהירות לרמה שבה כוחות פלואורו-מקבל FRET בודדים הופכים למובחנים בשכבה דו-שכבתית המכילה 30 או יותר PMCS מסומנים לכל square micron. דוגמה מוצגת כאן עבור השהיית זמן כוללת של 42 milliseconds.

אירוע FRET בודד המסומן בעיגול אדום הופך לנראה בנקודות הזמן השנייה והשלישית. הוא ממוקם יחד עם מולקולת S five בודדת המסומנת בעיגול ירוק. בדוגמה זו, לאירוע ה-FRET הנראה יש אורך עקבה של שניים; אסוף עקבות FRET נוספים של מולקולות בודדות כפי שמוצג בטבלה, בסביבות 128 עקבות.

בשלב הבא, חשבו את הסכום המצטבר המשלים (complementary cumulative sum) של העקבות כפי שמוצג במספרים הירוקים, נרמלו אותם כפי שמוצג, פלוטו את הערכים המנורמלים והתאימו אותם לפונקציה מונו-אקספוננציאלית. ערך התצפייה הוא מעט יותר מ-1.5 timeframes. ערך זה תלוי ב-TCR peptide, בקישור ל-MHC ובפוטובליצ'ינג; כדי להיות able להבדיל בין שני תרומות אלו, יש לחשב את ערך התצפייה עבור לפחות שלושה זמנים שונים.

כעת שרטטו את כל ערכי התוחלת אל מול השהיי הזמן המתאימים להם, והתאימו את נקודות הנתונים לפונקציה המוצגת המכילה את זמן החיים, כאן 2.12 seconds, ואת ערך התוחלת עבור PHOTOBLEACHING f Fred. ניתן להשתמש בהתאוששות התורם לאחר הלבנה מקובלת של F Fred, כפי שמוצג כאן ובפירוט רב יותר קודם לכן, כדי לקבוע בכמה שלבים בלבד את קבועי הדיסוציאציה הדו-ממדיים כפי שהם פועלים בתוך הסינפסה האימונולוגית.

כאן אנו ממקדים את הניתוח שלנו במעורבות TCR ובצבירי TCR שבהם קישור T-C-R-P-M-H-C הוא הבולט ביותר. כפי שעולה מהמדידות המוצגות, ערכי F FRED משתנים באופן משמעותי עבור צבירי TCR בודדים.

הכפלת F fred במקדם הפרופורציונליות C נותנת את תפוסת ה-TCR, מונח המתאר את היחס בין מספר ה-TCRs הקשורים ל-PMHC לבין מספרם הכולל. יש לקבוע את C פעם אחת עבור סט ספציפי של זוגות fre ומערכת ה-FRE שבה נעשה שימוש. לקראת סוף מצגת זו, נסביר בפירוט רב יותר כיצד לקבוע את C, למשל, תהליך הכולל את SI three ו-SI five הממוקמים באופן ספציפי על פרגמנט הנוגדן החד-שרשראתי הרגיב ל-TCR R ובקצה ה-C של הפפטיד הקשור ל-MHC. זה מסתכם בכשני קבועים של דיסוציאציה דו-ממדית סינפטית, שניתן לחשב מתוך תפוסת ה-TCR המכונה A והצפיפות הראשונית של pmcs הנוכחים על השכבה הליפידית.

הקשר המוצג נגזר מחוק הפעולה ההמונית והוא מוסבר בפירוט רב יותר במאמר הנלווה לסרטון זה. בדוגמה שלנו, הצפיפות הראשונית של pmcs מסתכמת ב-30 molecules per square micron. אנו מגיעים להתפלגות של 2D kds, אשר יעילים בסינפסה של תאי T עם ערך חציוני של כ-34 molecules per square micron.

ניתן לחשב את התפלגות קצב הקישור (on rate) מהתפלגות ה-KD הסינפטית בדו-ממד ומקצב הניתוק (off rate) המתאים כאן, 0.41 לשנייה כפי שנקבע באמצעות ניתוח עקבות FRET של מולקולות בודדות ב-24 degrees Celsius. ערך החציונה הוא כ-0.01 מיקרון רבוע למולקולה בשנייה. לסיכום, מדידות FRET בין TCR לבין peptide MHC מאפשרות ניתוח מקיף של כל הפרמטרים הקינטיים המתארים את דינמיקת התגובה ב-C two.

ניתן, באופן עקרוני, להכליל מתודולוגיה זו לניתוח של אינטראקציות בין רצפטורים לליגנדים אחרים, שכן אלו עשויים להיות חלק בלתי נפרד מזיהוי בין תא לתא. אחרון חביב, אנו דנים באופן שבו ניתן להגדיר ניסויית את הקבוע C, הדרוש להמרת תשואי שומנים למידור TCR. יש לבצע הליך זה פעם אחת בלבד.

ניתן להשתמש בקבוע C שנקבע עבור כל הניסויים הבאים שבהם ייושם אותה מערכת FRET עם אותם פלואורופורים. בהליך זה, הסתמכנו במהותו על נבכי FRET שנמדדו בצבירי TCR בודדים באמצעות התאוששות התורם לאחר הבהייה פוטוכימית של המקבל, והשלכנו אותם על ערכי העוצמה התואמים שזוהו בערוץ ה-FRET הרגיש. כפי שנדון קודם לכן, נבך ה-FRET נקבע מתוך תמונות ערוץ התורם של ה-FRET, לאחר תיקון רקע, לפני ואחרי אבלציה של מקבל ה-FRET.

יש ליישר את ערוץ ה-fret הרגיש עם ערוץ ה-F donor וצירים X ו-Y, ולתקן עבור הרקע. יש לבצע תיקון עבור bleed through של ה-Fred donor ו-cross excitation של ה-Fred accept כפי שמוצג כאן. תיאור מפורט של אופן התיקון עבור bleed through של ה-Fred donor ו-cross excitation של ה-Fred accept מסופק במאמר.

במקביל לסרטון זה, חשבו כעת עבור כל אשכול TCR את היחס בין אות ה-bug של תמונת ה-fret המתוקנת לבין תמונת ה-fret donor המתוקנת התואמת. קבעו את האות הממוצע המתוקן עבור תורמי fret בודדים ואירועי fret של מולקולה בודדת וחשבו את היחס. תפוסת ה-TCR נגזרת לאחר מכן על ידי הכפלת שני היחסים.

כעת, שרטטו את תנובת ה-fret שנקבעה עבור מקבצי TCR בודדים אל מול תפוסות ה-TCR שלהם. לאחר מכן, נקבע C באמצעות רגרסיה לינארית כפי שמוצג כאן. בדוגמה שלנו, ערך זה עומד על בערך שתיים.

לאחר צפייה בסרטון זה, תוכלו להשתמש בשכבה ליפידית פונקציונלית של חלבון בשילוב עם מיקרוסקופיית פלואורסצנציה של מולקולה בודדת, כדי למדוד את קינטיקת הקשירה הסינפטית בין PMHC ל-TCR. כל השלבים הדרושים, כולל ייצור חלבונים, סימון תאי T ומדידות FRET סופיות, נדونو בסרטון. יתרה מכך, ניתוח התמונות הוצג בפירוט, מהביא לקבלת עקומות הפעלה של תאי T וערכי FRET.

לבסוף, הוצגה המתודולוגיה העומדת בבסיס קביעת קצבי הקישור והניתוק (on off rates) הקינטיים. באופן עקרוני, ניתן להשתמש בגישה אנלוגית כדי לקבוע אינטראקציות אחרות בין ליגנדים לרצפטורים סינפטיים, אם כי ייתכן שיידרשו התאמות מתאימות.