מדידת TCR-pMHC כריכה באתר באמצעות assay מיקרוסקופית המבוסס על סריג
30 באוקטובר 2015
כתב יד זה מתאר כיצד לבצע (מולקולה בודדת) Förster Resonance Energy Transfer (FRET) - מבחנים מבוססי Förster למדידת דינמיקת הקישור בין קולטן אנטיגן של תאי T (TCR) ומולקולות MHC עמוסות פפטידים אנטיגניות כפי שהן מתרחשות בתוך הסינפסה האימונולוגית של תא T במגע עם שכבת שומנים דו-שכבתית נתמכת מישורית פונקציונלית.
בסרטון זה, נראה כיצד למדוד את הקינטיקה בין קולטן האנטיגן של תאי T לבין קומפלקס תאימות היסטולוגית עיקרי טעון פפטיד או PMHC ב-C 2 שנמצא בתוך הסינפסה האימונולוגית בין תא T לשומן נתמך במישור. אנו נדריך אותך בקצרה בהיבטים חשובים של ייצור חלבון ואימות השלמות התפקודית של בליי השומנים באמצעות מדידות שטף סידן. למידע מפורט יותר על אופן הכנת בליי שומנים וכיצד להגדיר מיקרוסקופ פלואורסצנטי של מולקולה אחת, אנא עיין בתרומה המקבילה שלנו בכתב העת לניסויים חזותיים, לאחר מכן נסביר בפירוט כיצד לבצע ולנתח מדידות העברת אנרגיה ראשונות או תהודה בבאג וברמת מולקולה בודדת.
כדי להסיק את הקינטיקה של קשירת PMHC לקולטן תאי T סינפטיים כדי להסביר את האסטרטגיה מבוססת השריגים שלנו המשמשת בגישה הכוללת שלנו, אנו מתחילים עם המבנה הגבישי של קולטן תאי T או TCR כאן בכחול כשהוא קושר את האנטיגן שלו, מולקולת MHC עמוסה בפפטיד או PMHC המוצגת בצהוב ואדום. אנו מציגים גם שבר שרשרת יחיד של התחומים המשתנים מנוגדנים תגובתי בטא לקולטן תאי T המכונה גיל 57. עבור מדידות כמותיות המבוססות על fre, חובה לתייג הן את תורם ה-fre, במקרה שלנו, את מקטע השרשרת הבודד והן את קולטן ה-fre, ה-PMHC באופן ספציפי לאתר.
זה אפשרי עבור חלבונים רקומביננטיים באמצעות החדרת ציסטאין לא משודר, אשר לאחר מכן ניתן לקשור קוולנטית לכוח פלואור מצומד קרדית. כפי שמוצג, אנו מחברים את התורם המוזן Alexa Fluor 5 5 5 או צד שלוש לשבר השרשרת הבודד ולמקבל השריג. זרימת Alexa 6, 4 7 או SI 5 לקצה C של הפפטיד הקשור ל-MHC.
מרחק האינדי כפי שמוצג במבנה מרוכב זה הוא כ-41 אנגסטרום, אפילו פחות מהרדיוס הראשון, מרחק העברת האנרגיה המקסימלית בין שני הצבעים. בניסויים שלנו, אנו משתמשים בזכוכית מישורית הנתמכת בשומנים כפולים המציגים אנטיגן חלופי. אלה מתפקדים עם PMXC, מולקולת הטבע B שבע אחת ומולקולת ההדבקה I chem אחת.
בדרך זו ניתן לבצע הדמיה במצב פלואורסצנטי של השתקפות פנימית כוללת, המאיר את כוח הפלואור בסמיכות לממשק, ובכך מפחית את הרקע הסלולרי באופן משמעותי. ניתן לזהות את העצב רק כאשר שבר שרשרת יחיד המסומן TCRs מעורבים על ידי PM hcs משובצים בשכבה. זה מאפשר לנו לדמיין את קשירת T-C-R-P-M-H-C ואז לחשב את קינטיקה הקישור ב-C שני גנים היסטו מקופלים כהלכה Tact.
חלקים חוץ-תאיים של P 7 one ו-I chem one מטוהרים מסופרנטנטים של תרביות תאי חרקים הנגועים בנגיף BUC המתאים. הטיהור מתבצע בשלושה שלבים, החל מכרומטוגרפיה של ניקל אנטי ארוס, ולאחר מכן כרומטוגרפיה של חילופי ברזל והדרת גודל. הטרודימרים מסוג MHC מסוג MHC מתבטאים ב-e coli כגופי הכללה ומקופלים מחדש במבחנה בארבע מעלות צלזיוס ונוכחות של פפטיד מחזיק מקום באמצעות דילול מהיר במאגר חמצון.
פפטיד מחזיק החלל ייבקע מאוחר יותר באמצעות חשיפה לאור UV. מתחמי PMHC מקופלים כראוי מלבד טיהרו וריכזו את מחזיק החלל. פפטיד נחתך ומוחלף ב-pH 5.2 בפפטיד הפלואורסצנטי.
המוצר הסופי מטוהר בגודל המעמד. שבר השרשרת הבודד מתבטא בציסטאין לא משודר כאשר גופי הכללה באי קולי מקופלים מחדש במבחנה באמצעות דיאליזה מדורגת ומטוהרים בגודל. לאחר מכן הוא מתויג באמצעות הציסטאין הלא משודר שלו עם צבע מצומד וגודל מטוהרים. שוב.
כל החלבונים הרקומביננטיים עוברים לבסוף דיאליזה כנגד PBS המכיל 50% גליצרול מרוכז למיליגרם חלבון אחד למיליליטר ומתחילים לטווח ארוך במינוס 20 מעלות צלזיוס. השתמש במדד היחס URA שני צבעים כדי למדוד את רמות הסידן התוך תאיות בתאי T כאמצעי לאימות עוצמת הגירוי של בלי השומן. טען את פיצוץ תא ה-T עם ה-URA 2:00 לפנות בוקר.
תרכובת זו נכנסת לתאים דרך מוטי ה-AM שלה, אך לאחר מכן היא נלכדת בפנים באמצעות פעולת אסטראזות, אשר מבקעות את חלק ה-AM. הוסף פירה 2:00 AM לכ-3 מיליון תאי T בריכוז סופי של חמישה מיקרומטר MO לליטר. העבירו את התאים מצלחת 24 הבאר לצינור חדש ודגרו בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
שטפו את התאים פעם אחת במאגר הדמיה המכיל תמיסת מלח חוצצת של הנקס כולל סידן ומגנזיום ו-1% אלבומין. כדי לנטר סידן תוך תאי, השתמש במערכת מיקרוסקופ הפוכה אוטומטית בעלת יכולת UV. התחל את פרוטוקול התזמון והוסף פחות שני תאי T טעונים לשכבת השומנים הדו-שכבתית הפונקציונלית הממוקמת במוקד שלב המיקרוסקופ, רוכשים במרווחי זמן קבועים, תמונת DIC ושתי תמונות פלואורסצנטיות הנרגשות באור UV של 340 ו-380 ננומטר.
מיד לאחר יצירת מגע דו-שכבתי תאי T מאמצים רמות סידן גבוהות כפי שנקרא על ידי יחס URA 2 15 דקות לתוך הריצה. הוסף נוגדן חוסם לתאים הרווי את כל האנטיגנים של PMHC. כתוצאה מכך, רמות הסידן התוך-תאיות יורדות לאלו של המצב הלא מופעל, המשמש מאוחר יותר כהתייחסות.
ברגע שרמות הנוגדן החוסם יורדות לערך, המשקף את המצב הלא מופעל, אותו אנו מנרמלים לאחד למדידות שריגים, תאי T צריכים להיות מוכתמים בבדיקה תגובתית, שבר שרשרת יחיד תגובתי TCR עבור כל ניסוי, להעביר כמיליון תאים לתוך צינור ולסובב אותם למטה ב-400 G. היצמדות לקירות הפנימיים בעזרת מגבת נייר. זה מבטיח נפח דגירה מינימלי של כ-30 מיקרוליטר שהזכרתי קודם.
הפרופ מאוחסן בריכוז של מיליגרם אחד למיליליטר ו-50% גליצרול במינוס 20 מעלות צלזיוס. זה אתר מסומן במיוחד עם אלקסה, שפעת של 5, 5 5, גם שלושה ביחס חלבון דיטו של אחד ב 0.3 מיקרוליטר של הגשושית לתאים. העיף את הכדור בזהירות מספר פעמים ודגר על התאים למשך 20 דקות על קרח.
שטפו את התאים במאגר הדמיה קר כקרח. חזור על הליך כביסה זה פעם אחת. דגירה, אחסון צנטריפוגה בטמפרטורה נמוכה מבטיחים שתאי T לא יפנימו את הגשושית הפלואורסצנטית בזמן שהם נחשפים אליה.
זה יגרום לפלואורסצנטיות רקע מוגברת. יתר על כן, תאי T אינם מאבדים את הגשושית בקור במהלך הכביסה והאחסון לפני הנחת התא המכיל את הבילר על חילופי שלב המיקרוסקופ. ה-PBS ברציפות עם מאגר הדמיה נמנעים מחשיפה של הדו-שכבתי לאוויר בכל מחיר מכיוון שהדבר יהרוס אותו.
כדי להפחית את הרקע הסלולרי, אנו משתמשים בתאורת דשא. לשם כך, אנו ממקמים את קרן העירור בזווית קריטית שבה מתרחשת השתקפות פנימית כוללת. כבה את העירור, הפעל את האור הרחב והוסף את תא ה-T לתא ה-ltec ותן להם להתיישב על בליי השומן.
הפעל עירור והתמקד בתאורה שאינה דשא. קרום התא נצפה כטבעת לאורך הציר האופטי בכל מישור מוקד בדשא, ניתן לראות רק את קרום הבסיס במגע עם הדו-שכבתית. מישורי המוקד למעלה כבר אינם נרגשים ולכן אינם נראים.
פרוטוקול התזמון מתחיל בערימות העירור האדומות והירוקות להדמיית PMHC ו-TCR ואחריהם דופק אקונומיקה אדום כדי להסיר את מקבל ה-P-M-H-C-F. פולס ירוק להדמיית ה-TCR לאחר הלבנת מקבל שומן F, ופולס אדום לאימות ניסויי אבלציה של מקבל F מבוצעים בסולם זמן של תת-שנייה עם ההשהיה הקצרה ביותר האפשרית בין הפולסים הירוקים הראשונים לשני. לחלופין, ניתן לקבל תמונת DIC בהתחלה פיצול תמונה דו-צבעונית מאפשר זיהוי בו זמנית של התורם המוזן וערוץ המקבל המוזן.
עירור מקבל ההזנה מראה הצטברות של P HCS בסינפסה של תאי T. תמונה מוקדמת זו מאמתת את נוכחותם של PMCS ומציינת כריכת PMHC שכבר מתווכת TCR. מרגש. התורם הפד מוליד תמונות בשני הערוצים.
האות של ערוץ התורם המוזן מופחת במידה מסוימת בעוצמתו עקב העברת אנרגיה לערוץ המקובל F. האות של הערוץ המקובל מורכב מדימום שריג דרך התורם המוזן ועירור צולב של מקבל השריג. בכל מקרה, תמונה זו לא תשמש לניתוח.
בפרוטוקול הנוכחי. ערימת אקונומיקה מהירה עוקבת ומבטלת את כל כוח הפלואורו המקובל F. עוצמת תמונת התורם של F Fed לאחר הלבנה מקובלת מוחזרת כעת לרמות גבוהות יותר ללא אובדן עוצמה לתוך תעלת ה-fre.
הציפייה הבאה של מקבל השריגים מאמתת הלבנה מלאה של מקבל שומן F. בואו נתמקד בסינפסה כדי לכמת את התאוששות התורמים. קבע את עוצמת הרקע הממוצעת קבוע ללא קשר למקבל fre.
לאחר מכן פוטו-הלבנה קובעת את העוצמה הממוצעת של הסינפסה וזו של אשכול TCR מייצג. לאחר מכן מחושבת תפוקת השריג על ידי נורמליזציה של ההפרש לפני ואחרי אבלציה של מקבל. בדוגמה שלנו, אנו מודדים 16% פריט עבור הסינפסה כולה ו-26% פריט עבור הנציג.
תפוקות שריג אשכול TCR יומרו מאוחר יותר לתפוסות TCR, מה שמוליד נתוני מולקולה בודדת קבועים של דיסוציאציה סינפטית דו-ממדית. הגש אותנו להסיק את הקינטיקה של קשירת פפטיד TCR סינפטי MHC לניסויי איום של מולקולה אחת F. אנו משתמשים באותה ריאגנטים ואסטרטגיית עבודה כמו קודם.
עם זאת, כדי להבטיח שאכן נצפה באינטראקציה בין TCR יחיד ל-MHC פפטיד יחיד, אנו בוחרים לעמוד בקריטריון הבא. אירוע מועמד למולקולה בודדת fre צריך להיות בדיבור עם מקבל fre יחיד או מולקולת תורם fre. כאן אנו משתמשים ב-PMHC יחיד כמולקולה מקבלת fre כדי לאמת את אופי המולקולה הבודדת של אירוע ה-fre הנצפה, אך הרציונל ההפוך.
שימוש במקבלי מזון בכפתורים גבוהים יותר ותורמי פרד וכפתורים נמוכים הוא בהחלט אופציה. בדרך כלל אנו חושפים תאי T המגעים עם עירור שומנים מגרה עם עירור של 514 ו-647 ננומטר, עירור תורם ומקבל ברצף קל וחוזר על עצמו עם פיגור זמן מינימלי של אלפית שנייה ואחריו זמן עיכוב. זה יכול להשתנות בהתאם לדרישות הניסוי.
כדי לקבל אות פלואורסצנטי חזק מספיק לזיהוי פיסה בודדת תוך אלפיות שנייה מהעירור, עלינו ליישם צפיפות כוח עירור גבוהה הנעה בין קילוואט אחד לחמישה קילוואט לסנטימטר מרובע. עקב פוטו-הלבנה, מספר המולקולות הגלויות של מקבל שריג PMHC יורד במהירות לרמה שבה ניתן להבחין בכוח פלואורו של מקבל סריג יחיד בשכבה דו-שכבתית המכילה 30 או יותר PMCS מסומנים למיקרון מרובע. דוגמה מוצגת כאן לפיגור זמן כולל של 42 אלפיות השנייה.
אירוע שריג בודד המסומן בעיגול האדום הופך לגלוי בנקודת הזמן השנייה והשלישית. הוא מתמקם יחד עם מולקולת S חמש בודדת המסומנת בעיגול ירוק. בדוגמה זו, לאירוע השריג הנצפה יש אורך עקבות של שניים, לאסוף יותר עקבות של מולקולה בודדת כפי שמוצג בטבלה בכ-128 עקבות.
לאחר מכן, חשב את הסכום המצטבר המשלים של העקבות כפי שמוצג על ידי המספרים הירוקים ונרמל אותם כפי שמוצג התווה ערכים מנורמלים והתאם אותם לפונקציה מעריכית מונו. ערך התוחלת הוא קצת יותר מ-1.5 מסגרות זמן. ערך זה תלוי בפפטיד TCR, קשירת MHC ופוטוהלבנה כדי להיות מסוגל להבחין בין שתי התרומות הללו, ולכן יש לחשב את ערך התוחלת לפחות שלושה זמנים שונים.
פיגורים מתווים כעת את כל ערכי התוחלת כנגד פיגורי הזמן שלהם ומתאימים את נקודות הנתונים לפונקציה המוצגת המכילה את אורך החיים כאן. 2.12 שניות וערך התוחלת עבור PHOTOBLEACHING f Fred. התאוששות התורם לאחר הלבנה מקובלת של פרד כפי שמוצג כאן ובפירוט רב יותר לפני כן יכולה לשמש כדי לקבוע בכמה צעדים בלבד את קבועי הדיסוציאציה הדו-ממדיים מכיוון שהם יעילים בתוך הסינפסה החיסולוגית.
כאן אנו ממקדים את הניתוח שלנו במעורבות TCR ובאשכולות TCR שבהם קשירת T-C-R-P-M-H-C בולטת ביותר. כפי שמתברר מהמדידות המוצגות, תפוקות F FRED משתנות באופן מהותי. עבור אשכולות TCR בודדים.
הכפלת תשואות F fred עם גורם הפרופורציונליות C מולידה תפוסת TCR, יש לקבוע מונח המתאר את היחס בין מספר ה-TCRs הקשורים ל-PMHC למספרם הכולל C פעם אחת עבור קבוצה ספציפית של זוגות fre ומערכת FRE המופעלת. לקראת סוף מצגת זו, נסביר ביתר פירוט כיצד לקבוע C למשל, הכולל SI שלוש ו-SI 5 הממוקמים במיוחד על מקטע הנוגדן היחיד התגובתי TCR R וקצה C של הפפטיד הקשור ל-MHC. זה מסתכם בכשני קבועי דיסוציאציה סינפטיים, דו-ממדיים שניתן לחשב מתפוסת ה-TCR המכונה A והצפיפות ההתחלתית של PMCS הקיימת על בלי השומן.
מערכת היחסים המוצגת נגזרת מחוק פעולת ההמונים ומוסברת ביתר פירוט במאמר המלווה את הסרט הזה. בדוגמה שלנו, הצפיפות ההתחלתית של PMCS מסתכמת ב-30 מולקולות למיקרון מרובע. אנו מגיעים להתפלגות של kds דו-ממדיים, היעילים בסינפסה של תאי T עם ערך חציוני של כ-34 מולקולות למיקרון מרובע.
ניתן לחשב את התפלגות הקצב מהתפלגות KD הדו-ממדית הסינפטית וקצב הכיבוי המקביל כאן, 0.41 לשנייה כפי שנקבע באמצעות ניתוח עקבות של מולקולה בודדת ב-24 מעלות צלזיוס. הערך החציוני הוא כ-0.01 מיקרון מרובע למולקולה בשנייה. לסיכום, מדידות איום F בין TCR לפפטיד MHC מאפשרות ניתוח מקיף של כל הפרמטרים הקינטיים המתארים את דינמיקת התגובה ב-C שתיים.
באופן עקרוני ניתן להכליל מתודולוגיה זו לניתוח אינטראקציות אחרות של ליגנד קולטנים מכיוון שהן עשויות להיות חלק בלתי נפרד מזיהוי תאי התא. אחרון חביב, אנו דנים כיצד לגזור באופן ניסיוני את הקבוע C, הנדרש להמרת תפוקות שומן לתפוסות TCR. יש לבצע הליך זה פעם אחת בלבד.
לאחר מכן ניתן להשתמש בקבוע C שנקבע עבור כל הניסויים הבאים שבהם מיושמת אותה מערכת שריגים עם אותם רביעיות פלואור. בהליך זה, העברנו בעצם תפוקות שריגים שנמדדו באשכולות TCR בודדים באמצעות התאוששות התורם לאחר הלבנת פוטו של המקבל לערכי העוצמה המתאימים שזוהו בערוץ הרגיש. כפי שנדון קודם, תפוקת השריג נקבעת מתמונות ערוץ תורם השריגים המתוקנים ברקע לפני ואחרי אבלציה של מקבל השריגים.
יש ליישר את ערוץ השריג הרגיש עם ערוץ התורם F ו- X ו- Y ולתקן את הרקע. פרד תורם מדמם ופרד מקבל עירור צולב כפי שמוצג כאן. תיאור מפורט כיצד לתקן עבור פרד תורם דימום ופרד מקבל עירור צולב מסופק במאמר.
בליווי סרטון זה, חשב כעת עבור כל אשכול TCR את היחס בין אות הבאג של תמונת השריג המתוקנת לבין תמונת תורם השריג המתוקנת המתאימה. קבע את האות הממוצע המתוקן עבור תורמי שריגים בודדים ואירועי שריג של מולקולה בודדת וחשב את היחס. תפוסת ה-TCR נגזרת לאחר מכן על ידי הכפלת שני היחסים.
כעת, תשואות שריג עלילה נקבעו עבור אשכולות TCR בודדים כנגד תפוסות ה-TCR שלהם. C נקבע לאחר מכן באמצעות רגרסיה ליניארית כפי שמוצג כאן. בדוגמה שלנו, זה מסתכם בסיבוב שני.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות מסוגל להשתמש בשכבת שומנים דו-שכבתית פונקציונלית של חלבון בשילוב עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי של מולקולה בודדת כדי למדוד את קינטיקה הקישור הסינפטי בין PMHC ל-TCR. נדונו כל השלבים הדרושים כולל ייצור חלבון, תיוג תאי T ומדידות השריגים הסופיות. יתר על כן, ניתוח התמונה הוצג בפירוט והניב עקומות הפעלה של תאי T וערכי שריגים.
לבסוף, הוצגה המתודולוגיה העומדת בבסיס קביעת שיעורי הכיבוי הקינטיים. באופן עקרוני ניתן להשתמש בגישה אנלוגית כדי לקבוע אינטראקציות אחרות של ליגנד קולטן סינפטי, אם כי ייתכן שיהיה צורך בשינויים מתאימים.
סקירה כללית
מאמר זה מציג מתודולוגיה מבוססת מיקרוסקופיה למדידת קינטיקת הקישור של קולטן תאי T (TCR) למולקולות של קומפלקס תאימות רקמה ראשי טעון פפטיד (pMHC) בתוך הסינפסה האימונולוגית. באמצעות העברה של אנרגיית תהודה של פורסטר (FRET) בין TCR ל-pMHC המסומנים באופן ספציפי לאתר, גישה זו מאפשרת ניתוח כמותי של זיקת קישור, קצב התנתקות (off-rate) וקצב התחברות (on-rate) in situ, הן ברמה כוללת (bulk) והן ברמת המולקולה הבודדת. השיטה מנצלת שכבת ליפידים נתמכת (SLB) מישורית ומפונקציונלית כתחליף לממברנה של תא מציג אנטיגן (APC), מה שמאפשר ויזואליזציה מדויקת ומדידה קינטית של אינטראקציות TCR-pMHC.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- אימונולוגיה
- ביולוגיה של התא
- ביופיזיקה
- מיקרוסקופיה פלואורסצנטית
רקע
- תאי T מזהים אנטיגנים כפפטידים המוצגים על ידי מולקולות MHC על גבי APCs.
- אינטראקציות TCR-pMHC מציגות בדרך כלל זיקה מתונה in vitro, אך תאי T מפגינים רגישות גבוהה לאנטיגן in vivo.
- הבנת הקינטיקה המולקולרית של קישור TCR-pMHC בתוך הסינפסה חיונית להבנת מנגנוני ההפעלה של תאי T.
- מיקרוסקופיה מבוססת FRET מאפשרת מדידה של אינטראקציות מולקולריות בממשק קרום התא בזמן אמת ובconvertTo רזולוציה מרחבית.
מטרת המחקר
- פיתוח והדגמה של שיטה למדידת קינטיקת קישור של TCR-pMHC בסינפסה החיסונית.
- כימות של זיקה (affinity), קצב ניתוק (off-rate) וקצב קישור (on-rate) של אינטראקציות TCR-pMHC in situ.
- מתן אפשרות לרזולוציה של מולקולה בודדת עבור אירועי קישור של רספטור-ליגנד.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- ייצור וניקוי של פירגמנטים רקומביננטיים של TCR וקומפלקסים של pMHC, המסומנים באופן ספציפי לאתר באמצעות פלואורופורים של תורם ומקבל.
- הרכבה של שכבות ליפידיות דו-שכבתיות פלטיתית פונקציונליות המשלבות pMHC, מולקולות קו-סטימולטוריות ומולקולות היצמדות.
- סימון של תאי T באמצעות גששי FRET ואימות התפקוד של השכבה הדו-שכבתיות באמצעות בדיקות זרימת סידן.
- מיקרוסקופיה של פלואורסצנציה בהחזרה פנימית כוללת (TIRF) לצורך זיהוי אותות FRET בממשק שבין תא ה-T לשכבה הדו-שכבתיות.
- ניתוח כמותי של תנובות FRET לפני ואחרי הלבנה פוטוכימית של המקבל (acceptor photobleaching) כדי לקבוע את קינטיקת הקישור והתפוסה.
- ניסויי FRET של מולקולה בודדת להפרדה של אירועי קישור בודדים של TCR-pMHC וחישוב פרמטרים קינטיים.
תוצאות עיקריות
- אותות FRET מדווחות באופן ספציפי על קישור TCR-pMHC בתוך הסינפסה, מה שמאפשר חישוב של קבועי דיסוציאציה סינפטיים (2D Kd).
- עקומים של FRET ברמה של מולקולה בודדת מספקים מדידות של קצב ניתוק (off-rate), ובשילוב עם נתוני תפוסה, מאפשרים חישוב של קצבי קישור (on-rates).
- החציונים של 2D Kd סינפטי וקצבים קינטיים נקבעו עבור אינטראקציות TCR-pMHC תחת תנאים ניסיוניים מוגדרים.
- השיטה מאפשרת הבחנה בין פוטובליצ'ינג (photobleaching) לבין אירועי קישור אמיתיים בניתוחים קינטיים.
מסקנות
- גישת המיקרוסקופיה המבוססת על FRET המתוארת מאפשרת ניתוח קינטי מקיף של אינטראקציות TCR-pMHC in situ.
- המתודולוגיה ניתנת להתאמה לבדיקת אינטראקציות רספטור-ליגנד אחרות בממשקים בין תאים.
- נתוני מולקולה בודדת כמותיים מספקים תובנות לגבי המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס זיהוי והפעלת אנטיגנים של תאי T.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מדידה כמותית של קינטיקת קישור TCR-pMHC in situ נותנת מענה לאתגר קריטי בתחום גילוי תרופות אימונולוגיות, על ידי כך שהיא מאפשרת הערכה ישירה של אינטראקציות רצפטור-ליגנד בתוך הסביבה הסינפטית הטבעית. בדיקת מיקרוסקופיה זו, המבוססת על FRET, מגבירה את הביטחון החזוי עבור תיקוף מטרה והפחתת סיכונים מכניסטיים בשלבים המוקדמים ביותר של פיתוח פייפליין של טיפולים אימונותרפיים. גישה זו תומכת בקבלת החלטות לגבי תיקי הפיתוח על ידי אספקת פרמטרים קינטיים החיוניים לתעדוף מועמדים למודולציה חיסונית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בדיקה ישירה של קינטיקת ההיקשרות בין TCR ל-pMHC בתוך הסינפסה האימונולוגית.
- תומך בהפחתת סיכונים מכניסטית על ידי כימות האפיניות (affinity), קצב הניתוק (off-rate) וקצב ההיקשרות (on-rate) בהקשר פיזיולוגי רלוונטי.
- מספק נתוני תיקוף תפקודי של מטרות לאינטראקציות בין קולטנים אימונולוגיים לליגנדים.
- מסייע בביסוס ביטחון חיזוי בבחירת מועמדים עבור תוכניות אימונותרפיה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מבסס מערכת בדיקה כמותית ומתוכפת לניתוח קישור רספטור-ליגנד.
- מספק קריאות המבוססות על FRET בעלות הדירות, המתאימות לסריקה השוואית של TCR או וריאנטים של ליגנדים.
- מאפשר סטנדרטיזציה של מדידות קינטיות לאורך ריצות ומסירות ניסיוניות שונות.
- מכין מערכות ביולוגיות חסונות להערכה של תרכובות בשלבים הבאים ולמחקרים מכניסטיים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מקשר בין מדידות קינטיות in situ לבין הביולוגיה של הסינפסה החיסונית הרלוונטית למחלה.
- תומך ברציפות תרגומית על ידי גישור בין ממצאים משלב הגילוי למודלים פרה-קליניים של מודולציה חיסונית.
- מספק בסיס לקבלת החלטות לגבי קידום מועמדים לאימונותרפיה בגישה של התאמה לסיכון, בהתבסס על פרמטרים כמותיים של קישור.
- מספק תובנות מכניסטיות המנחות את אסטרטגיית הביומרקרים ואת בחירת המודל הפרה-קליני.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
בדיקה זו, המבוססת על FRET, משתלבת ברצף שבין השלב הגילוי לשלב הפרה-קלִיני על ידי מתן אפשרות לבדיקת היפותזות, אפיון פרמטרים קינטיים והפחתת סיכונים מכניסטיים של מטרות חיסוניות.
- ביולוגיה של גילוי: מכמת את קינטיקת הקשירה של TCR-pMHC כדי להבהיר מסלולי זיהוי חיסוניים ולתקף מטרות.
- סריקה: מספק פלטי FRET כמותיים וסטנדרטיים להשוואה אמינה של אינטראקציות בין רספטור לליגנד.
- אנליזה: מספק מדידות של זיקה (affinity), קצב ניתוק (off-rate) וקצב קישור (on-rate) לתמיכה בקבלת החלטות מבוססת נתונים.
- מחקר תרגומי: מקשר נתוני קינטיקה in situ למודלים פרה-קליניים של תגובה חיסונית לצורך רציפות.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע פלטפורמה ניתנת לשימוש חוזר, הניתנת להתאמה למערכות רספטור-ליגנד אחרות במחקרים של אימונולוגיה וטיפול תאי.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף של מטרות חיסוניות.
- ערך תפעולי: מאפשר סטנדרטיזציה של הבדיקה, הדירות ויכולת הרחבה עבור מדידות קינטיות.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של go/no-go ויעילות הון על ידי אספקת נתונים קינטיים ברי-ביצוע בשלב מוקדם של תהליך הפיתוח.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכון ובקידום של נכסים אימונותרפויטיים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בהנדסת חלבונים, סימון פלואורסצנטי ומסכיבייה מתקדמת.
- דורש גישה לתשתית של TIRF או מיקרוסקופיית פלואורסצנציה של מולקולה בודדת.
- מחייב סטנדרטיזציה קפדנית בין-צוותית של פרוטוקולי סימון והדמיה.
- עשוי לדרוש התאמה עבור זוגות רספטור-ליגנד או סוגי תאים שונים.
- יש לשלוט בקפדנות בפוטובליצ'ינג (Photobleaching) ובספציפיות של הגשש כדי להבטיח את תקינות הנתונים.
