הקרנת תפוקה גבוהה של וריאציות סרבנות בlignocellulosic יומסה: סה"כ ליגנין, מונומרים ליגנין, ואנזימתי שחרור סוכר

המטרה הכוללת של הליך זה היא למדוד את הטיפול המקדים התרמוכימי ואת עקשניות הידרוליזה של אנזימים בין גרסאות ביומסה קשורות. זה מושג על ידי הכנת דגימות הביומסה לבדיקה לפי גודל, הפחתה ומיצוי של עמילן וסוכרים מסיסים. השלב השני הוא לחלק את הביומסה בדיוק גבוה ללוחות כור בעלי תפוקה גבוהה תואמות כימית.

הדגימות מטופלות מראש בכור קיטור. לאחר מכן, הדגימות מתעכלות עם צלולאז מסחרי סטנדרטי למשך שלושה ימים כדי להידרוליזה של התאית ותאית ההמי. השלב האחרון הוא קביעת הגלוקוז והקסילוז המשתחררים במהלך הידרוליזה של אנזים באמצעות מבחני GO pod ו-XDH.

בסופו של דבר, כימות גלוקוז וקסילוז בתפוקה גבוהה משמש לקביעת שחרור הסוכר היחסי בין דגימות על בסיס גרם סוכר לגרם ביומסה התחלתית. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות אחרות בקנה מידה, כגון סולם ספסל, טיפול מקדים והידרוליזה אנזימטית, הוא שניתן לבצע טכניקה זו על מאות או אפילו אלפי דגימות בו זמנית. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום המרת הביומסה, כגון אילו זנים של וריאנטים מתאימים יותר להמרה לסוכרים ולמוצרים הבאים.

אז ניתן להרחיב את ההשלכות של טכניקה זו להבנת המבנה והתפקוד של דופן התא מכיוון שניתן לסנן את המוטציות שאנו מייצרים במסלול הביו-סינתטי של דופן התא לשינויים כימיים מבניים. ובכן, שיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי עקשנים לדופן תא הצמח. ניתן ליישם אותו גם על מרכיבים אחרים של המרת הביומסה, כגון פעילות אנזימים ומחקרי סינרגיה.

בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו איתה מכיוון שהיא כוללת קבוצות דגימות גדולות של וריאנטים של ביומסה שיש לטפל בהן באופן זהה ובמקביל בסולם המיליגרם. אז זה דורש רובוטיקה וציוד מיוחד כדי להתחיל את ההליך בכ-250 מיליגרם של ביומסה שנטחנה בעבר משקית אנטי סטטית עם ברקוד לשקית תה ממוספרת, גלגל בזהירות את שקית התה והקפד לקפל את הקצוות על הביומסה כדי למנוע אובדן במהלך עמילן ומיצוי. לאחר מכן, עטפו כל שקית תה סגורה באמצעות חוט נחושת מצופה פח ורשמו את מספר שקית התה עבור כל דגימה ברקודית.

הוסף 500 מיליליטר של תמיסת אנזים עמילן שהוכנה בעבר למיכל פלסטיק. לאחר מכן הוסיפו 120 שקיקי תה לתמיסת אנזימי החיץ לפרוטוקול אצווה אצווה. לאחר הדגירה בשייקר, יש לשטוף ולהשרות את הביומסה בכמה ליטר מים נטולי יונים למשך 30 דקות לאחר שטיפה ממצה של הביומסה המעומלנת.

כדי להסיר מלחי חיץ, הנח את שקיות התה בעמודה מוארת בגרב לצורך מיצוי. הגדר את ריפלוקס הגרב באמצעות אתנול 95%, וחלץ את הדגימות למשך 24 שעות. לאחר השלמת המיצוי, גלגלו את שקיות התה והחזירו את הביומסה המיובשת לברקוד המקורי.

שקיות אנטי סטטיות מעבירים לפחות 50 מיליגרם מהביומסה המיובשת למיכל ברקוד. סרוק את הברקודים של השקיות האנטי-סטטיות ושל הופר הקבלה כדי להבטיח מעקב מדויק אחר הדגימה. לאחר העמסת הקופסאות על רובוט שקילה מוצק, שקלו באופן רובוטי חמישה מיליגרם מהדגימות המיובשות לנירוסטה עמידה בפני חומצה.

96 לוחות באר שוקלים שלושה שכפולים של כל דגימה המפוזרת סביב הצלחת כדי למזער וריאציות מקומיות. לאחר מכן, הוסף 250 מיקרוליטר של מים נטולי יונים לכל באר ואטום את הצלחות עם סרט POLYTETRAFLUOROETHYLENE או PTFE מגובה דבק סיליקון. בעזרת קצה מגהץ הלחמה בגודל שמונה אינץ', חודרים את סרט ה-PTFE בכל יציאת קיטור.

עבור כל צלחת, מהדקים את הצלחות בחוזקה עם אטמי PTFE מחוזקים בזכוכית בעובי 0.031 אינץ' בין הצלחות והצלחות הריקות בחלק העליון והתחתון של הערימה. טפל בדגימות באמצעות כור קיטור המכוון ל-180 מעלות צלזיוס למשך 17.5 דקות. בסיום, יש לקרר את לוחות הכור ל-50 מעלות צלזיוס על ידי הצפה במים נטולי יונים.

כאשר הצלחות קרירות, צנטריפוגה אותן בדלי מתנדנד. רוטור ב-1700 GS למשך 20 דקות. ואז הסר את סרט התקרה.

הוסף 40 מיקרוליטר של תמיסת מלאי אנזים 8% שהוכנה בעבר לכל באר לאחר איטום מחדש בעזרת סרט PTFE חדש, הנח את הצלחת האטומה לתוך מהדק צלחת מגנטית. מערבבים בעדינות את הדגימות על ידי היפוך לפחות 15 פעמים ודוגרים בחום של 50 מעלות צלזיוס למשך 70 שעות. לאחר הדגירה, לוחות הכור מעורבבים וצנטריפוגים.

לאחר מכן הרובוט לטיפול בנוזלים משמש לביצוע כימות של גלוקוז וקסילוז באמצעות בדיקות קולומטריות מקושרות לאנזים, קסילוז דהידרוגנאז, או XDH עבור קסילוז וגלוקוז אוקסידאז, פרוקסידאז, או גו פוד לגלוקוז. הסיפון מוגדר עם מאגרים של מגיב GO POD ו-XDH, כמו גם מים לדילול ומדפי קצה של 96 ערוצים של 200 מיקרוליטר לכל מגיב. טיפים אלה נמצאים בשימוש חוזר עבור לוחות כור מרובים.

הסיפון מכיל גם טיפים לשימוש חד פעמי, 200 מיקרוליטר להסרת מים ומהדורה סטנדרטית של סוכר, כמו גם תקני סוכר מוכנים מראש. בבקבוקוני HPLC מקרוסלת האחסון, הרובוט מביא שלוש לוחות מיקרו טיטר שקופים, אחד לביצוע דילול של תערובת ההידרוליזה ואחד כל אחד עבור מבחני XDH ו-GoPod. האחיזה מעבירה את כל ארבעת הלוחות למיקומים על הסיפון.

טיפים חד פעמיים של 96 ערוצים 100 מיקרוליטר מובאים לסיפון מהקרוסלה לשימוש בהעברה מהכור לצלחת דילול ומדילול לצלחות תרמיל XDH וגו. באמצעות צנרת שמונה ערוצים בטווח משתנה, המים שנוספו לפני הטיפול המקדים מוסרים משלוש הבארות בכל פינה של לוחית הכור כדי למנוע העברה לצלחת הדילול. מכיוון ש-12 הבארות הללו משמשות לתקני סוכר באמצעות ראש פיפטינג 96 תעלות.

לאחר הסרת שלושת הקצוות בכל פינה, מוסיפים 180 מיקרוליטר מים לבארות צלחת הדילול. לאחר החלפת טיפים, ריאגנטים של תרמילי XD, H ו-go מועברים מהמאגרים שלהם ללוחות הבדיקה שלהם. שימוש בראש פיפטינג 96 תעלות.

בזמן שזה קורה, תקני הסוכר מתווספים לשלוש הבארות של כל פינה של צלחת הדילול. שימוש בראש הפיפטינג בעל שמונה הערוצים לאחר המעבר לקצוות הקטנים יותר, ראש הפיפטינג בן 96 הערוצים משמש להעברת 20 מיקרוליטר של הידרוליזה לצלחת הדילול, והצלחת מעורבבת על ידי tri. יש לשאוב את הדגימה ליד החלק העליון של הנוזל כדי להגביל את עכירות הקצוות על ידי חלקיקי ביומסה.

לאחר הערבוב מועברים 20 מיקרוליטר ברצף. השתמש בראש הפיפטינג של 96 הערוצים ל-XDH ולך צלחות תרמיל. כאשר כל אחד מהם מעורבב על ידי טרייר, כור קצות הדגימה וצלחות הדילול מוחזרים למדף פסולת בקרוסלה, צלחות התרמילים XDH ו-go מוסרות למתלה קרוסלה נפרד ומניחות לשבת שעה אחת לפני הקריאה בספקטרופוטומטר, באמצעות קורא צלחות אולטרה סגול גלוי 96

הגדר את אורך הגל הנמדד ל-510 ננומטר ורשום את הספיגה כנגד ריאגנט ריק. לאחר מכן, הגדר את אורך הגל הנמדד בקורא הלוחות ל-340 ננומטר ורשום את הספיגה באמצעות מרית קטנה. הוצא כארבעה מיליגרם מהביומסה המוכנה לכוס נירוסטה של 80 מיקרוליטר המיועדת לדגימת הרכב של ספקטרומטר המסה.

באמצעות אגרוף חורים רגיל, הפק ידנית דיסקי מסנן זכוכית מגיליונות סיבי זכוכית מסוג מודעה ללא דגימות עומס קלסר למדפי הדגימה האוטומטיים באמצעות פינצטה טען באופן אקראי דגימות לכוסות כדי למנוע הטיה עקב סחף ספקטרומטר לאורך זמן. לאחר ביצוע הכיול והזנת הפרמטרים המתאימים בספקטרומטר המסה, התחל ברכישת נתונים והמתן לפחות 60 שניות כדי להשיג מספיק נתונים לאיסוף ספקטרום רקע. לבסוף, התחל את שיטת דגימת הרכב האוטומטית באמצעות קצב זרימת גז נושא הליום של 0.9 ליטר לדקה.

דוגמה למגמות היא סקר של 755 וריאנטים טבעיים של צפצפה שנדגמו בצפון מערב האוקיינוס השקט. התוצאות מצביעות על כך שככל שיחס המזרק לאשם עולה, הסרבנות פוחתת עד ליחס של כ-2 או שהשיפור הסרבני מתאזן. ניתן לראות כאן חריגים שבהם הגן PT ארבע CL אחד היה מווסת.

בצפצפה, כמה ממאה הזנים שנבדקו מוגברים בבירור בסרבנים, כפי שמעידה ירידה בשחרור הסוכר. זנים שונים של קש חיטה שגדלו במספר אתרים ונקטפו לאחר מספר שינויים בתנאי הגידול הביאו ל-20 אוכלוסיות נפרדות המבוססות על שילובים של המשתנים לעיל. קבוצות מדגם אלה מובחנות בקלות ומצביעות על משתנים חיוביים ושליליים.

עבור פירוליזה עקשנית, ניתן להשתמש בספקטרומטריית מסה של קרן מולקולרית כדי להעריך שינויים בהרכב דופן התא. שברי ספקטרום מסה מוקצים למונומרים שונים של ליגנין. כאשר משווים מדגם עם ליגנין גבוה לעומת תכולת פחמימות גבוהה, הפערים בנתונים הספקטרליים ניכרים.

השימוש בנתוני ספקטרומטריית מסה, יחד עם ניתוח רכיבים עיקריים מודגם כאן. תרשים העמסת הרכיבים העיקריים יכול לסייע בזיהוי אילו תכונות כימיות מוסברות בתרשים סיווג הציונים, כמו גם להבהיר, אילו תכונות משתנות בין אשכולות הדגימה לאחר שליטה, ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי לסנן אלפי דגימות בשבוע אם מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב להיות עקבי ככל האפשר ולהשוות רק דגימות בתוך קבוצה קשורה.

אז לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים אחרים לעבוד על שיטות סינון בתפוקה גבוהה ותחומים אחרים לסרבנות דופן תא הצמח, תוך שימוש בדברים כמו נוזלים יוניים וטיפול מקדים אלקליין. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להכין, לטפל ולנתח כראוי קבוצות דגימות גדולות של ביומסה בקנה מידה מיקרו להבדלים בעקשנות באמצעות הפחתת גודל ומיצוי, טיפול מקדים תרמוכימי והידרוליזה של אנזימים, אנא זכור כי עבודה עם לחץ גבוה, קיטור וציוד אוטומטי מסוכנת ביותר וכי יש לנקוט בכל אמצעי הבטיחות, כגון לבישת ציוד מגן אישי, כמו גם מנעולי בטיחות על כל הציוד בזמן ביצוע הליכים אלה.