הקרנת תפוקה גבוהה של וריאציות סרבנות בlignocellulosic יומסה: סה"כ ליגנין, מונומרים ליגנין, ואנזימתי שחרור סוכר

המטרה הכללית של הליך זה היא למדוד את העמידות (recalcitrants) למסננים של קדם-טיפול תרמוכימי והידרוליזה אנזימטית בין וריאנטים קשריים של ביומסה. זאת מושג תחילה על ידי הכנת דגימות הביומסה לבדיקה באמצעות שלבי גודל, הפחתה, והוצאה של עמילן וסוכרים מסיסים. השלב השני הוא חלוקת הביומסה בדיוק גבוה לתוך פלטות ריאקטור בעלות תפוקה גבוהה, התואמות תרמוכימית.

הדגימות עוברות טיפול מקדים בריאקטור קיטור. לאחר מכן, הדגימות עוברות עיכול באמצעות cellulase מסחרי סטנדרטי למשך שלושה ימים כדי להידרוליז את התאית וההמי-צלולוז. השלב הסופי הוא קביעת רמות הגלוקוז והקסילוז ששוחררו במהלך ההידרוליזה האנזימטית באמצעות בדיקות GO pod ו-XDH.

בסופו של דבר, כימות גלוקוז וקסילוז בסביבה בעלת תפוקה גבוהה משמש לקביעת שחרור הסוכר היחסי בין דגימות, על בסיס גרם סוכר לגרם ביומסה התחלתית. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות אחרות בקנה מידה מעבדתי, כגון קדם-טיפול והידרוליזה אנזימטית בקנה מידה מעבדתי, הוא שניתן לבצע טכניקה זו על מאות או אפילו אלפי דגימות בו-זמנית. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום המרת הביומסה, כגון אילו זנים או וריאנטים נוטים יותר להמרה לסוכרים ולמוצרים עוקבים.

לפיכך, ניתן להרחיב את ההשלכות של טכניקה זו להבנת המבנה והתפקוד של דופן התא, מכיוון שניתן לסרוק את המוטציות שנגרמו במסלול הביוסינתזה של דופן התא כדי לזהות שינויים כימיים מבניים. שיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי עמידות דופני תאי צמחים (recalcitrants). היא יכולה להיות מיושמת גם לרכיבים אחרים של המרת ביומסה, כגון מחקרים על פעילות אנזימטית וסינרגיה.

בדרך כלל, אנשים שאינם מיומנים בשיטה זו יתקשו בביצועה, כיוון שהיא כוללת קבוצות דגימות גדולות של וריאנטים של ביומסה שיש לטפל בהם באופן זהה ובמקביל בקנה מידה של מיליגרמים. לכן, היא דורשת רובוטיקה וציוד מיוחדים. כדי להתחיל את ההליך, העבירו כ-250 milligrams של ביומסה שטוחה מראש משקיות אנטי-סטטיות עם ברקוד לשקיקי תה ממוספרים; גלגלו בזהירות את שקיק התה, תוך הקפדה לקפל את הקצוות מעל הביומסה כדי למנוע אובדן במהלך הסרת העמילן והמיצוי. לאחר מכן, סגרו כל שקיק תה באמצעות חוט נחושת מצופה בדיבך ורשמו את מספר שקיק התה עבור כל דגימה עם ברקוד.

הוסיפו 500 מיליליטר של תמיסת אנזים להסרת עמילן שהוכנה מראש למכל פלסטיק. לאחר מכן, הוסיפו 120 שקיקי תה לתמיסת האנזים עם הבאפר עבור פרוטוקול עיבוד במנות. לאחר דגירה בשייקר, שטפו והשריו את הביומסה במספר ליטרים של מים דה-יוניים למשך 30 דקות, לאחר שטיפה יסודית של הביומסה ללא העמילן.

להסרת מלחים מהבופר, הכניסו את שקיקי התה לעמודת Soxhlet לצורך מיצוי. הגדירו את מערכת הזיקוק החוזר (reflux) של Soxhlet באמצעות 95% ethanol, ובצעו מיצוי של הדגימות במשך 24 שעות. עם השלמת המיצוי, פתחו את שקיקי התה והחזירו את הביומסה המיובשת למבחנה המקורית בעלת ברקוד.

שקיות אנטי-סטטיות העבירו לפחות 50 milligrams של הביומסה המיובשת למשפך עם ברקוד. סרקו את הברקודים של השקיות האנטי-סטטיות ושל המשפך המקבל כדי להבטיח מעקב מדויק אחר הדגימות. לאחר טעינת המשפכים לרובוט שקילה מוצקים, שקלו באופן רובוטי five milligrams מהדגימות המיובשות לתוך כלי פלדת אל חלד עמיד לחומצה.

שקלו שלוש חזרות של כל דגימה בתוך פלטות של 96 בארות, כאשר הדגימות מפוזרות ברחבי הפלטה כדי למזער וריאציות מקומיות. לאחר מכן, הוסיפו 250 µL של מים דה-יוניים לכל בארה ואטמו את הפלטות בעזרת סרט POLYTETRAFLUOROETHYLENE או PTFE עם דבק סיליקון. בעזרת חוד מלחם בגודל שמינית אינץ', נקבו את סרט ה-PTFE בכל פתח קיטור.

עבור כל פלטה, הדק את הפלטות בחוזקה עם אטמי PTFE מחוזקי זכוכית בעובי 0.031 inch בין הפלטות, כאשר פלטות ריקות ממוקמות בחלק העליון והתחתון של הערימה. בצע קדם-טיפול לדגימות באמצעות ריאקטור קיטור המוגדר ל-180 degrees Celsius למשך 17.5 minutes. עם סיום התהליך, קרר את פלטות הריאקטור ל-50 degrees Celsius על ידי הצפתם במים דה-יוניים.

כאשר הפלטות קרירות, סבבו אותן בצנטריפוגה עם רותור של דליים נתיעים. סובבו במהירות של 1700 GS למשך 20 דקות. לאחר מכן, הסירו את סרט האיטום העליון.

הוסיפו 40 µL של תמיסת מלאי אנזים בריכוז 8% שהוכנה מראש לכל באר. לאחר האיטום מחדש באמצעות סרט PTFE חדש, הניחו את הפלטה האטומה בתוך תפס פלטה מגנטי. ערבבו בעדינות את הדגימות על ידי הפיכה לפחות 15 פעמים והד기로 בטמפרטורה של 50 °C למשך 70 שעות. לאחר הדגירה, פלטות הריאקטור מעורבבות ומסובבות בצנטריפוגה.

לאחר מכן, נעשה שימוש ברובוט לטיפול בנוזלים לביצוע כימות של גלוקוז וקסילוז באמצעות בדיקות הצבעיות מקושרות אנזימים: xylose dehydrogenase, או XDH עבור קסילוז, ו-glucose oxidase, peroxidase, או go pod עבור גלוקוז. על משטח העבודה מוצבים מאגרי ריאגנטים של GO POD ו-XDH, וכן מים לדילול וערכות של קצוות 200 microliter ב-96 ערוצים עבור כל ריאגנט. קצוות אלו נעשה בהם שימוש חוזר עבור מספר לוחות ריאקטור.

המשטח כולל גם טיפים חד-פעמיים בנפח 200 microliter להסרת מים ולהגדרת סטנדרט סוכר, וכן סטנדרטים מוכנים מראש של סוכר. מבקבוקי HPLC מגלגל האחסון, הרובוט מביא שלוש פלטות micro titer שקופות, אחת להכנת דילול של תערובת ההידרוליזה ואחת עבור כל אחד מבדיקות ה-XDH וה-GoPod. התפסן מעביר את כל ארבע הפלטות למיקומים על המשטח.

פיפטיות חד-פעמיות בעלות 96 ערוצים בנפח 100 microliter מועברות מהקרוסלה אל הסיפון לצורך העברה מהריאקטור ללוחית הדילול, ומלוחית הדילול ללוחיות XDH ו-go pod. באמצעות פיפט רב-ערוצי של שמונה ערוצים בעל נפח משתנה, מסירים את המים שהתווספו לפני הקדם-טיפול משלושת הבארים בכל פינה של לוחית הריאקטור כדי למנוע זיהום צולב ללוחית הדילול. זאת מכיוון ש-12 בארים אלו משמשים לתקני סוכר באמצעות ראש הפיפטה בעל 96 הערוצים.

לאחר הסרת שלושת הטיפים בכל פינה, מוסיפים 180 microliters של מים לבארים של לוח הדילוציות. לאחר החלפת טיפים, מעבירים את ריאגנטים XD, H ו-go pod מהמאגרים שלהם ללוחות הבדיקה המתאימים, באמצעות ראש פיפטור עם 96 ערוצים.

בזמן שזה קורה, מוסיפים את תמיסות השם של הסוכרים לשלוש הבארות בכל פינה של לוח הדילול. לאחר החלפה לקצוות (tips) קטנים יותר, משתמשים בראש פיפטא של 96 ערוצים כדי להעביר 20 µL של עלי-נוזל (supernatant) מההידרוליזה ללוח הדילול, ואת הלוח מערבבים על ידי טלטול. יש לשאוב את הדגימה קרוב לחלק העליון של הנוזל כדי להגביל את זיהום הקצוות על ידי חלקיקי ביומסה.

לאחר הערבוב, מועברים 20 µL באופן סדרתי. באמצעות ראש פיפטינג בעל 96 ערוצים, מועבר התוכן ללוחיות XDH ו-go pod. לאחר שכל דגימה עורבבה על ידי תריאור (trier), קצוות הפיפטה של הריאקטור ולוחיות הדילול מוחזרים למסבב הפסולת במערכת הקרוסלה; את לוחות ה-XDH וה-go pod מעבירים למסבב נפרד ומניחים להם לעמוד במשך שעה אחת לפני הקריאה בספקטרופוטומטר, באמצעות קורא לוחות 96 בארות בטווח UV-Vis.

הגדירו את אורך הגל למדידה ל-510 ננומטרים ורשמו את הבליעה אל מול דגימת ביקורת של הריאגנט (reagent blank). לאחר מכן, הגדירו את אורך הגל למדידה בקורא הלוחיות ל-340 ננומטרים ורשמו את הבליעה באמצעות שפכטל קטן. העבירו כארבעה מיליגרמים של הביומסה שהוכנה לכוס פלדה אל-חלודה בנפח 80 מיקרוליטר המיועדת לדוגם האוטומטי של ספקטרומטר המסות.

בעזרת מחלץ חורים סטנדרטי, הכינו ידנית דיסקיות סינון מזכוכית מגילי סיבי זכוכית מסוג ad ללא חומר מקשר. העמיסו את הדגימות למסלולי הדוגמאות האוטומטיים באמצעות פינצטה; העמיסו את הדגימות לכוסות באופן אקראי כדי למנוע הטיות עקב סחיפת הספקטרומטר עם הזמן. לאחר ביצוע הכיול והזנת הפרמטרים המתאימים בספקטרומטר המסה, התחילו ברכישת הנתונים והמתינו לפחות 60 שניות כדי להשיג נתונים מספיקים לאיסוף ספקטרא של רקע. לבסוף, הפעילו את שיטת הדגימה האוטומטית באמצעות זרימה של גז נשא הליום בקצב של 0.9 liters per minute.

דוגמה למגמות היא סקר של רמות עקשנות (recalcitrance) ב-755 וריאנטים טבעיים של צפצפה שנדגמו במערב הפסיפי. התוצאות מעידות כי ככל שיחס המזרק ל-guil עולה, העקשנות פוחתת עד ליחס של כ-שניים, ואז רמות השיפור בעקשנות מתייצבות. ניתן לראות כאן חריגים שבהם הגן PT four CL one היתעתק כלפי מטה (downregulated).

בצפצפה, מספר אחדים מתוך מאה הזנים שנבדקו הראו עלייה ברורה בעמידות לפירוק, כפי שניתן לראות מהירידה בשחרור סוכרים. זני קש חיטה שונים שגדלו במספר אתרים ונאספו לאחר מספר שינויים בתנאי הצמיחה, הניבו 20 אוכלוסיות נפרדות המבוססות על שילובים של המשתנים לעיל. קבוצות דגימות אלו ניתנות להבחנה בקלות ומצביעות על משתנים חיוביים ושליליים.

עבור פירוק תרמי (pyrolysis) של חומרים עמידים, ניתן להשתמש בספקטרומטריית מסות של אלומה מולקולרית כדי להעריך שינויים בהרכב דופן התא. מקטעי ספקטרום מסות משויכים למונומרים שונים של ליגנין. בעת השוואה בין דגימה בעלת תכולת ליגנין גבוהה לדגימה בעלת תכולת פחמימות גבוהה, הפערים בנתוני הספקטרום בולטים לעין.

כאן מודגם השימוש בנתוני ספקטרומטריית מסות, בשילוב עם ניתוח רכיבים ראשיים (PCA). תרשים העמסas (loadings plot) של הרכיבים הראשיים יכול לסייע בזיהוי התכונות הכימיות המוסברות בתרשים סיווג התוצאות (scores classification plot), וכן בהבהרה אילו תכונות משתנות בין מקבצי הדגימות. לאחר רכישת מיומנות בטכניקה זו, ניתן להשתמש בה לסריקה של אלפי דגימות בשבוע, במידה שהיא מבוצעת כהלכה. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לשמור על עקביות מרבית ולהשוות דגימות השייכות למערכה קשורה בלבד.

לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים אחרים לעבוד על שיטות סריקה בthroughput גבוה ותחומים אחרים של עמידות דפנות תאי צמחים, תוך שימוש בחומרים כגון נוזלים יוניים וקדם-טיפול בסיסי. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו יש להכין, לטפל ולנתח נכון קבוצות דגימות גדולות של ביומסה בקנה מידה מיקרוסקופי כדי לבחון הבדלים בעמידות, תוך שימוש בהקטנת גודל וחילוץ, קדם-טיפול תרמו-כימי והידרוליזה אנזימטית. אנא זכרו כי עבודה עם לחץ גבוה, קיטור וציוד אוטומטי היא מסוכנת ביותר ויש לנקוט בכל אמצעי הבטיחות, כגון לבישת ציוד מיגון אישי, וכן הבטחת קיומם של מנגנוני נעילה לבטיחות בכל הציוד בעת ביצוע הליכים אלו.