זיהוי של חיידקים פתוגנים נדירים לפי 16S rRNA ג'ין סידור MALDI-TOF MS
July 11th, 2016
זמן ספיגה/יינון לייזר בסיוע מטריקס של ספקטרומטריית מסה של טיסה (MALDI-TOF MS) וטכניקות מולקולריות (ריצוף גנים 16S rRNA) מאפשרות זיהוי של פתוגנים חיידקיים נדירים באבחון שגרתי. מטרת פרוטוקול זה טמונה בשילוב של שתי הטכניקות מה שמוביל לנתונים מדויקים ואמינים יותר.
המטרה הכוללת של פרוטוקול ספקטרומטריית מסה זה של MALDI-TOF היא לשפר את האפיון של פתוגנים נדירים באמצעות הליך מהיר וחסכוני. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום המיקרוביולוגיה האבחנתית, היא מאפשרת חינוך מהיר של פתוגנים חיידקיים נדירים. היום, אנו רוצים לדבר על odoratimimus וחיידקים מהסוג Myroides.
להדגים את השיטה ולדבר על פרשנות התוצאות. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו עשויים להתקשות מכיוון שהעברת חיידקים, שכבת על עם מדדים ופרשנות של תוצאות דורשים מיומנויות טכניות ומומחיות מיקרוביולוגית. הרעיון להשתמש ב-MALD-TOF MS לבדיקת חיידקים נדירים היה לנו בבית החולים שלנו שסבל מזיהום מזון סוכרתי שנגרם על ידי myroides odoratimus.
התחל פרוטוקול זה עם מיצוי DNA חיידקי, DNA ריבוזומלי 16S PCR וריצוף סנגר כמתואר בפרוטוקול הטקסט. השתמש בקיסם עץ כדי להעביר מושבת חיידקים בודדת לבאר של יעד פלדה של 96 בארות. הבחין במיקרוליטר אחד של 70% חומצה פורמית על גבי האורגניזם המיובש באוויר על מטרת הפלדה, והשאיר לייבוש למשך כשתיים עד שלוש דקות.
כסו את הנקודה במיקרוליטר אחד של תמיסת מטריצה המכילה 50 מ"ג/מ"ל CHCA בממס אורגני המורכב מ-50% אצטוניטריל, 2.5 חומצה טריפלואורואצטית ו-47.5% מים. הניחו למריחה ולמטריצה המכוסה להתייבש באוויר כחמש דקות במכסה המנוע. כדי להציג את הדגימות, אוורר את יציאת טעינת הדגימה של ספקטרומטר המסה על ידי לחיצה על כפתור הכניסה/יציאה של המכשיר.
פתח את יציאת הטעינה והכנס את לוחית המטרה MALDI-TOF MS עם מטריצת מריחת החיידקים המיובשת פלוס. סגור את הנמל והתפנה שוב. התבונן בוואקום וכשהוא מגיע ל -4.5 מיליון מיליבר התחל את המדידה.
פתח את תוכנת הניתוח MMIS ולחץ על תפריט הקובץ. בחר סיווג חדש"וחלון חדש בשם MALDI Biotyper Real Time Classification Wizard"אמור להיפתח. הקלד את שם הפרויקט בשדה שם פרויקט "ולחץ על חדש, תחת תיבת הדו-שיח החדשה בשם פרויקט חדש, בדוק את שם הפרויקט והמשך על ידי לחיצה על כפתור אישור".
באשף הסיווג בזמן אמת של MALDI Biotyper, שים לב לחלון המיקום של Analyte. בחר מיקומי יעד, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על מיקום כלשהו שנבחר ובחר הוסף דוגמאות. בתצוגת הטבלה שנפתחה באופן אוטומטי, הקלד את השם לדוגמה, מזהה לדוגמה ובאופן אופציונלי, הערה.
לחץ על כפתור הבא כדי להמשיך. לאחר מכן, שים לב לחלון הבחירה של שיטות MALDI Biotyper. בחר טקסונומיה של ברוקר"מתוך ה-MSPs מעצי הטקסונומיה ולחץ על הבא"כדי להמשיך.
לאחר מכן, שים לב לחלון סיכום הפרוייקט. בדוק את הערכים שהוכנסו לעיל עבור פרויקט הסיווג בפועל. התחל את הפעלת הסיווג על ידי לחיצה על כפתור סיום.
המדידות מתחילות אוטומטית כאשר מגיעים לוואקום המתאים. עקוב אחר ריצת הסיווג עד להשלמת המדידה בהצלחה. לאחר השלמת המדידה, פתח את התפריט תצוגה"ולחץ על תוצאות"כדי להציג את טבלת התוצאות בפרויקט סיווג בזמן אמת של MALDI Biotyper One.
הצג את תוצאות הסיווג של Bruker-Daltonik MALDI Biotyper כקובץ html בדפדפן האינטרנט המוגדר כברירת מחדל. הדפס ושמור את התוצאות. מוצגים כאן ספקטרומים המתקבלים על ידי MALDI-TOF MS הנמדדים ומסווגים בזמן אמת.
לספקטרום מוקצה שם מין וערך ניקוד המשקף את איכות המדידה. ציונים מעל 2.300 מייצגים זיהוי מינים סביר ביותר. ציון בין 2.000 ל-2.300 מצביע על זיהוי מינים בטוח.
ציון מתחת ל-1.700 ו-2.000 מציין זיהוי מינים סביר. וציון מתחת ל-1.700 אינו אמין. זיהוי פתוגנים חיידקיים הגדלים על תרבית טהורה על מדיום מוצק אורך שתיים-שלוש דקות.
חשוב לזכור כי ניתן למצוא פתוגנים של חיידקים נדירים רק עם MALDI-TOF MS כאשר המכשירים מכילים באופן אמין את הספקטרום המתאים. אחרת, יש למחוק אותו על ידי שילוב ספקטרום MaSDA מזנים מסווגים של המבודדים האופייניים להם. במקרה בו תוצאות הניקוד אינן מובילות לזיהוי מתח חד משמעי, ניתן ליישם שיטות נוספות, כגון פרופיל ביוכימי או ריצוף 16S rDNA.
למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי זיהוי חיידקים, ניתן ליישם אותה גם על מיקרואורגניזמים אחרים כגון פטריות או אנאירובים. יתר על כן, ניתן למדוד עמידות לחיידקים. אל תשכח לעבוד עם מטריצה שהיא חומר מסוכן, ללבוש כפפות, משקפי מגן ולעבוד מתחת למכסה המנוע.
יתר על כן, יש צורך לייבש את המטריצה ולמרוח היטב כדי למנוע התזות בתא הניתוח.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה
פרוטוקול זה מתאר את השימוש בספקטרומטריית מסה MALDI-TOF להעצמת הזיהוי של פתוגנים חיידקיים נדירים. על ידי שילוב שיטה זו עם טכניקות מולקולריות, חוקרים יכולים להשיג אבחון מדויק יותר במיקרוביולוגיה.
מרכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- מיקרוביולוגיה
- טכניקות אבחון
- זיהוי פתוגנים
רקע
- MALDI-TOF MS הוא כלי רב עוצמה לטיפוס פתוגנים.
- פתוגנים חיידקיים נדירים מהווים אתגרים באבחון שגרתי.
- הבנת המגבלות של שיטות מסורתיות היא חיונית.
- מיומנויות טכניות נדרשות ליישום יעיל.
מטרת המחקר
- לשפר את הטיפוס של פתוגנים נדירים.
- לספק הליך אבחון מהיר וחסכוני.
- להדגים את השיטה באמצעות דוגמאות חיידקיות ספציפיות.
שיטות בשימוש
- ספקטרומטריית מסה MALDI-TOF לסינון פתוגנים.
- רצף גן 16S rRNA לזיהוי מולקולרי.
- נהלים טכניים להעברה וכיסוי חיידקי.
- פרשנות של תוצאות ספקטרומטריית מסה.
תוצאות עיקריות
- זיהוי מוצלח של Myroides odoratimimus.
- הדגמה של אבחון מהיר לפתוגנים נדירים.
- הדגשת חשיבות המומחיות הטכנית.
- הספקת תובנות לגבי יישום השיטה בסביבות קליניות.
מסקנות
- MALDI-TOF MS בשילוב עם טכניקות מולקולריות משפר את האבחון.
- הכשרה חיונית לשימוש יעיל בשיטה.
- יישומים עתידיים עשויים להרחיב את היקף זיהוי הפתוגנים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Accurate identification of rare bacterial pathogens is critical for diagnostic microbiology in biopharma R&D, particularly for immunocompromised patient populations. Integrating MALDI-TOF MS with 16S rRNA sequencing enables rapid, cost-effective species-level identification, supporting mechanistic de-risking in antimicrobial target validation. This combined approach improves predictive confidence in preclinical models by reducing false negatives in pathogen detection.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by confirming rare pathogen identity in infection models.
- Operational Value: Provides robust, nomenclature-compliant strain identification essential for reproducible target de-risking.
- Predictive Value: Supports portfolio triage through accurate pathogen characterization in disease-relevant systems.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative score outputs (e.g., >2.300 for highly probable ID) that enable standardized hit confirmation in antimicrobial screens.
- Operational Value: Facilitates assay readiness via rapid (<3 min) pure-culture identification, improving screening throughput and scalability.
- Reproducibility Value: Ensures cross-lab comparability through standardized spectral matching and validated database reliance.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Bridges discovery to preclinical continuity by validating rare pathogens in clinically relevant infection models.
- Operational Value: Enables risk-adjusted advancement decisions when score thresholds (2.000–2.300) confirm secure species identification.
- Translational Continuity: Supports biomarker alignment when pathogen presence correlates with host response in immunocompromised models.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation to preclinical evaluation, where accurate pathogen identification informs mechanistic studies and lead compound assessment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by confirming rare bacterial agents in infection models, reducing mechanistic ambiguity.
- Screening: Delivers assay-ready, validated biological systems with quantitative outputs for reliable compound evaluation.
- Analytics: Provides score-based readouts (e.g., MALDI Biotyper classification) that enable objective condition comparison and hit validation.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through pathogen validation in disease-relevant systems, only when supported by source material.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable diagnostic capability across multiple rare pathogen projects, reducing redundant validation efforts.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation, reduction of false pathogen assignments, and mechanistic de-risking.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of pathogen identification across laboratories.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions in antimicrobial programs, capital efficiency via rapid diagnostics, and reduced late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Risk-based prioritization of antimicrobial candidates using confirmed pathogen identities in preclinical models.
Implementation Considerations
- Requires microbiological expertise for bacterial transfer, matrix overlay, and result interpretation.
- Dependent on MALDI-TOF MS instrumentation with updated taxonomic databases (e.g., Bruker Taxonomy) for accurate spectral matching.
- Necessitates standardized sample preparation protocols to ensure dry matrix and smear, preventing analyzer contamination.
- Requires fallback to 16S rRNA sequencing or biochemical profiling when MALDI-TOF scores fall below 1.700 for non-reliable identification.
- Involves safety protocols for handling hazardous matrix solutions (e.g., formic acid, acetonitrile) under fume hood with PPE.
