זיהוי של חיידקים פתוגנים נדירים לפי 16S rRNA ג'ין סידור MALDI-TOF MS

המטרה הכוללת של פרוטוקול ספקטרומטריית מסה זה של MALDI-TOF היא לשפר את האפיון של פתוגנים נדירים באמצעות הליך מהיר וחסכוני. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום המיקרוביולוגיה האבחנתית, היא מאפשרת חינוך מהיר של פתוגנים חיידקיים נדירים. היום, אנו רוצים לדבר על odoratimimus וחיידקים מהסוג Myroides.

להדגים את השיטה ולדבר על פרשנות התוצאות. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו עשויים להתקשות מכיוון שהעברת חיידקים, שכבת על עם מדדים ופרשנות של תוצאות דורשים מיומנויות טכניות ומומחיות מיקרוביולוגית. הרעיון להשתמש ב-MALD-TOF MS לבדיקת חיידקים נדירים היה לנו בבית החולים שלנו שסבל מזיהום מזון סוכרתי שנגרם על ידי myroides odoratimus.

התחל פרוטוקול זה עם מיצוי DNA חיידקי, DNA ריבוזומלי 16S PCR וריצוף סנגר כמתואר בפרוטוקול הטקסט. השתמש בקיסם עץ כדי להעביר מושבת חיידקים בודדת לבאר של יעד פלדה של 96 בארות. הבחין במיקרוליטר אחד של 70% חומצה פורמית על גבי האורגניזם המיובש באוויר על מטרת הפלדה, והשאיר לייבוש למשך כשתיים עד שלוש דקות.

כסו את הנקודה במיקרוליטר אחד של תמיסת מטריצה המכילה 50 מ"ג/מ"ל CHCA בממס אורגני המורכב מ-50% אצטוניטריל, 2.5 חומצה טריפלואורואצטית ו-47.5% מים. הניחו למריחה ולמטריצה המכוסה להתייבש באוויר כחמש דקות במכסה המנוע. כדי להציג את הדגימות, אוורר את יציאת טעינת הדגימה של ספקטרומטר המסה על ידי לחיצה על כפתור הכניסה/יציאה של המכשיר.

פתח את יציאת הטעינה והכנס את לוחית המטרה MALDI-TOF MS עם מטריצת מריחת החיידקים המיובשת פלוס. סגור את הנמל והתפנה שוב. התבונן בוואקום וכשהוא מגיע ל -4.5 מיליון מיליבר התחל את המדידה.

פתח את תוכנת הניתוח MMIS ולחץ על תפריט הקובץ. בחר סיווג חדש"וחלון חדש בשם MALDI Biotyper Real Time Classification Wizard"אמור להיפתח. הקלד את שם הפרויקט בשדה שם פרויקט "ולחץ על חדש, תחת תיבת הדו-שיח החדשה בשם פרויקט חדש, בדוק את שם הפרויקט והמשך על ידי לחיצה על כפתור אישור".

באשף הסיווג בזמן אמת של MALDI Biotyper, שים לב לחלון המיקום של Analyte. בחר מיקומי יעד, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על מיקום כלשהו שנבחר ובחר הוסף דוגמאות. בתצוגת הטבלה שנפתחה באופן אוטומטי, הקלד את השם לדוגמה, מזהה לדוגמה ובאופן אופציונלי, הערה.

לחץ על כפתור הבא כדי להמשיך. לאחר מכן, שים לב לחלון הבחירה של שיטות MALDI Biotyper. בחר טקסונומיה של ברוקר"מתוך ה-MSPs מעצי הטקסונומיה ולחץ על הבא"כדי להמשיך.

לאחר מכן, שים לב לחלון סיכום הפרוייקט. בדוק את הערכים שהוכנסו לעיל עבור פרויקט הסיווג בפועל. התחל את הפעלת הסיווג על ידי לחיצה על כפתור סיום.

המדידות מתחילות אוטומטית כאשר מגיעים לוואקום המתאים. עקוב אחר ריצת הסיווג עד להשלמת המדידה בהצלחה. לאחר השלמת המדידה, פתח את התפריט תצוגה"ולחץ על תוצאות"כדי להציג את טבלת התוצאות בפרויקט סיווג בזמן אמת של MALDI Biotyper One.

הצג את תוצאות הסיווג של Bruker-Daltonik MALDI Biotyper כקובץ html בדפדפן האינטרנט המוגדר כברירת מחדל. הדפס ושמור את התוצאות. מוצגים כאן ספקטרומים המתקבלים על ידי MALDI-TOF MS הנמדדים ומסווגים בזמן אמת.

לספקטרום מוקצה שם מין וערך ניקוד המשקף את איכות המדידה. ציונים מעל 2.300 מייצגים זיהוי מינים סביר ביותר. ציון בין 2.000 ל-2.300 מצביע על זיהוי מינים בטוח.

ציון מתחת ל-1.700 ו-2.000 מציין זיהוי מינים סביר. וציון מתחת ל-1.700 אינו אמין. זיהוי פתוגנים חיידקיים הגדלים על תרבית טהורה על מדיום מוצק אורך שתיים-שלוש דקות.

חשוב לזכור כי ניתן למצוא פתוגנים של חיידקים נדירים רק עם MALDI-TOF MS כאשר המכשירים מכילים באופן אמין את הספקטרום המתאים. אחרת, יש למחוק אותו על ידי שילוב ספקטרום MaSDA מזנים מסווגים של המבודדים האופייניים להם. במקרה בו תוצאות הניקוד אינן מובילות לזיהוי מתח חד משמעי, ניתן ליישם שיטות נוספות, כגון פרופיל ביוכימי או ריצוף 16S rDNA.

למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי זיהוי חיידקים, ניתן ליישם אותה גם על מיקרואורגניזמים אחרים כגון פטריות או אנאירובים. יתר על כן, ניתן למדוד עמידות לחיידקים. אל תשכח לעבוד עם מטריצה שהיא חומר מסוכן, ללבוש כפפות, משקפי מגן ולעבוד מתחת למכסה המנוע.

יתר על כן, יש צורך לייבש את המטריצה ולמרוח היטב כדי למנוע התזות בתא הניתוח.