Name: ללא תווית מולקולה בודדת איתור באמצעות תהודה אופטית Microtoroid (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: למד זיהוי מולקולות בודדות ללא תווית באמצעות טכנולוגיית תהודה אופטית FLOWER. השיטה מאפשרת גילוי ננו-חלקיקים זעירים בפתרון ללא צורך בסימון, ומסייעת בחקר קינטיקת קיפול חלבונים וביוכימיה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך בחלקו על ידי פרס שירות המחקר הלאומי (T32GM07616) מהמכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית.

1. התקנה ניסיונית והכנת דוגמאות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפברק microtoroids באמצעות יתוגרפיה, תחריט, ונמס הליך כפי שתואר לעיל 6. לפברק microtoroids על גבי פרוסות סיליקון (שבב) שיש לי קוטר גדול של 80-100 מיקרומטר, וקוטר קטן של 2 מיקרומטר בדרך כלל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להירגע בערך מטר של סיבים במצב יחיד אופטיים (125 חיפוי מיקרומטר, 4.3 מיקרומטר קוטר שדה במצב) מסליל הסיבים שלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצע החלק התיר של הסיבים האופטיים, להפשיט קטע קטן (2.5 סנטימטרים) של ציפוי הפולימר סביב הסיב האופטי באמצעות חשפניות תיל. הערה: זה הוא החלק מהסיבים האופטיים שישמשו לevanescently זוג אור לתוך microtoroid. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את הסיבים הפשיטו עם אלכוהול isopropanol ומוך חופשי למחוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחזיק חלק זה של הסיבים במקום באמצעות בעל סיבים עשוי מהדק מגנטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסיבים הפשיטו דקים ל~ 500 ננומטר ידי meltinז ומושך באמצעות לפיד מימן ושני מנועי צעד נעים בכיוונים מנוגדים על 60 מיקרומטר / min. מקם את הסיבים האופטיים בתוך החלק העליון של הלהבה, שאמורה להיות ~ 10 מ&quot;מ גבוה. פסק למשוך הסיבים כאשר השידור דרך הסיבים מפסיק משתנה, אשר יכול להיות במעקב או חזותי (על ידי צפייה באור שמפוזר רוחבי ממצמוץ הסיבים לסירוגין) או על ידי חיבור הסיבים לphotodiode אשר מצורף לאוסצילוסקופ . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קליב קצה אחד של הסיבים האופטיים ולהכניס אותו לתוך מתאם סיבים חשוף. הנח הקצה הזה של הסיבים לקלט של photoreceiver. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כמה סיבי הקצה השני של סליל הסיבים לליזר באמצעות מצמד סיבים אופטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את שבב microtoroid על גבי בעל מדגם (פלדת אל-חלד, 37.8 מ&quot;מ x 6.4 מ&quot;מ x 3.2 מ&quot;מ) או באמצעות אפוקסי או סרט דו צדדי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר בעל מדגם על גבי שלב מיצוב שכולל של ננו-הבלטה 3-ציר (nשלב anocube) (ראה רשימת ציוד) על גבי מיקרומטר 3-ציר. לבצע את כל הניסויים על שולחן אופטי מבודד פניאומטית כדי למזער תנודות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עמדה גסה שבב המדגם באמצעות מיקרומטר 3-הציר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יישר מקביל שבב המכיל microtoroid לסיבים האופטיים באמצעות ננו-positioner. הערה: יישר את microtoroid במרחק של אורך גל אחד של אור הקלט (~ 633 ננומטר). להדמיה של תהליך זה משתמש בשתי עמודות הדמיה (צינור עם עדשה ומצלמה אובייקטיביות, לראות את רשימת ציוד) ממוקם בחלק העליון ובצד של השבב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייעל את הקיטוב של אור הלייזר המכוון דרך הסיבים האופטיים באמצעות בקר קיטוב ב- קו (ראה רשימת ציוד) עם ידית כדי להתאים את הקיטוב. הערה: קיטוב אופטימלי מושגת כאשר לטבול הנמדד בהעברת הסיב האופטי מופיע הצר. שים לב לטבול זה על אוסצילוסקופ (ראה שלב 2.2 לפרטים נוספים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לִבנוֹתמדגם קאמרי ידי epoxying coverslip זכוכית על הבמה המדגם באמצעות שקופיות מיקרוסקופ הזכוכית כspacer. הערה: מארז פרספקס מכסה את כל ההתקנה עשוי להיות שימושי עבור מזעור זרמי אוויר. פתח קטן יש להשאיר כדי לאפשר פתרון להישאב בבאמצעות צינורות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרמית לאזן השעיות חלקיק או תמיסות מימיות מולקולה בודדת ל≥ 1 שעה באמבט מים RT (~ 500 מיליליטר). הערה: דוגמאות מדוללות לריכוז הרצוי בצינורות microcentrifuge באמצעות המאגרים הקשורים צוינו מהיצרן, למשל, PBS או HEPES. אם אין אירועים מחייבים מזוהים, להגדיל את ריכוז מלח למאגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלקיקי מערבולת המכילים פתרונות קצרים (1 מיליליטר) ל~ 2 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק פתרונות חלקיקים המכילים לתוך תא המדגם של 1 מיליליטר / דקה באמצעות משאבת מזרק 1 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר המדגם קאמרי מילא, לכבות את משאבת המזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המתן 30 שניות לפני שנתוני הקלטה כדי למזעראת ההשפעות של תנודות מכאניות הנובעות מזרימת נוזל שיכול להשפיע על המדידה. </li></ol> נעילת 2. תדר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re-זוג toroid לסיבים האופטיים על ידי הזזת בעל המדגם עם nanopositioner, כי הצימוד יופרע בשל ההזרקה של נוזל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אתר את גל התהודה של microtoroid ידי סריקת לייזר קלט מבוקר מחשב באמצעות מגוון רחב של אורכי גל. לבצע שלב זה על ידי שליחת אות מתח צורת גל משולשת לאלמנט פיזואלקטריים בתוך בקר הלייזר המסדיר את אורך הגל של הלייזר. לבצע ניסויים באמצעות אור הנראה (635 ננומטר ± 2.5 ננומטר) כפי שיש קליטה נמוכה של אור במים באורך גל זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את העברת האור דרך הסיבים האופטיים על ידי חיבור הפלט של הסיבים האופטיים לphotoreceiver אוטומטי מאוזנת. חבר את הפלט של photoreceiver לאוסצילוסקופ באמצעות כבל BNC. שים לב on אוסצילוסקופ כי באורך גל התהודה של microtoroid, שידור דרך הסיב האופטי טיפות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף את הפלט של photoreceiver לכניסה הראשית של תדירות נעילת בקר משוב (ראה רשימת ציוד) באמצעות כבל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את בקר משוב תדירות נעילה במצב נעילה אוטומטית באמצעות שיא העליון של נעילה עם תדר רעד של 2 קילוהרץ והמשרעת של תנודה אורך גל של 19 FM. באופן אמפירי להגדיר את ההגדרות יחסיות-נפרד נגזרות בחלון התוכנה באמצעות כללי כוונון זיגלר-ניקולס 14. הערה: ערכים אלה צריכים להיות מוגדרים רק פעם אחת בתחילת כל הניסויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Auto-לנעול את אורך הגל של הלייזר לגל התהודה של microtoroid. לבצע שלב זה לאחר מילוי המדגם קאמרי. הערה: אם שינוי אורך הגל גדול מדי, אז בקר המשוב יאבד מנעול ולעבור באופן אוטומטי למצב סריקה כדי לאתר את מיקום אורך גל תהודה. OC זהכלאיים לגל עובר גדולים יותר מכ אחד linewidth (לפחות 600 FM עבור כל המערכות נחקרו כאן). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקליט את הפלט של בקר המשוב על 20 קילוהרץ באמצעות כרטיס רכישת נתונים 24 סיביות. לייצא את הנתונים כקובץ טקסט באמצעות תוכנת רכישת נתונים. </li></ol> 3. עיבוד נתונים וניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התמרת פורייה נתונים בMATLAB. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נמוך לעבור את הנתונים באמצעות מסנן &quot;לבנים-קיר&quot; עם הפסקת בkHz 1 כדי להסיר את תדר הרעד שהוטל של 2 קילוהרץ (ראה נוסף קוד קובץ 1 צילום המסך). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המחשוב ברמה גבוהה לסנן את הנתונים באמצעות גודל חלון של 16 הרץ. הערה: זה נעשה כדי להסיר מקורות ידועים של רעש, במקרה זה, רעש 60 הרץ קו אלקטרוני וההרמוניות שלה, כמו גם 100 הרץ (מגיע מהנהג הלייזר) וההרמוניות שלה (ראה נוסף קוד קובץ 1 צילום המסך). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פורייה הפוך להמיר את הנתונים חזרה לתחום הזמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסנן חציון נתונים באמצעות חלוןגודל של 1,001 דגימות (ראה נוסף קוד קובץ צילום המסך 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אתר שינויי צעד באורך גל התהודה באמצעות אלגוריתם הצעד-מציאת של et al Kerssemakers. 15. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור היסטוגרמות של משרעת של כל צעד מחייב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב גודל חלקיקים באמצעות משוואה. (1) (ראה דיון). </li></ol>

<ol><li>Lu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+sensitivity+nanoparticle+detection+using+optical+microcavities%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">High sensitivity nanoparticle detection using optical microcavities.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 5976-5979 (2011).</li>
<li>Su, J., Goldberg, A. F. G., Stoltz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+detection+of+single+nanoparticles+and+biological+molecules+using+microtoroid+optical+resonators%5BTitle%5D)+AND+%22Light%3A+Science+and+Applications%22%5BJournal%5D)">Label-free detection of single nanoparticles and biological molecules using microtoroid optical resonators.</a> Light: Science and Applications. , (2016).</li>
<li>Knight, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKnight%2C+A+%22Single+molecule+biology%22">Single molecule biology</a>. , Elsevier/Academic. (2009).</li>
<li>Jonsson, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+biospecific+interaction+analysis+using+surface+plasmon+resonance+and+a+sensor+chip+technology%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Real-time biospecific interaction analysis using surface plasmon resonance and a sensor chip technology.</a> BioTechniques. 11, 620-627 (1991).</li>
<li>Vollmer, F., Arnold, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whispering-gallery-mode+biosensing%3A+label-free+detection+down+to+single+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Whispering-gallery-mode biosensing: label-free detection down to single molecules.</a> Nat. Methods. 5, 591-596 (2008).</li>
<li>Armani, D. K., Kippenberg, T. J., Spillane, S. M., Vahala, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-high-Q+toroid+microcavity+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultra-high-Q toroid microcavity on a chip.</a> Nature. 421, 925-928 (2003).</li>
<li>Vahala, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+microcavities%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Optical microcavities.</a> Nature. 424, 839-846 (2003).</li>
<li>Arnold, S., Khoshsima, M., Teraoka, I., Holler, S., Vollmer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shift+of+whispering-gallery+modes+in+microspheres+by+protein+adsorption%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Shift of whispering-gallery modes in microspheres by protein adsorption.</a> Opt. Lett. 28, 272-274 (2003).</li>
<li>Vollmer, F., Arnold, S., Keng, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+virus+detection+from+the+reactive+shift+of+a+whispering-gallery+mode%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Single virus detection from the reactive shift of a whispering-gallery mode.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 20701-20704 (2008).</li>
<li>He, L., Ozdemir, S. K., Zhu, J., Kim, W., Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+single+viruses+and+nanoparticles+using+whispering+gallery+microlasers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Nano%22%5BJournal%5D)">Detecting single viruses and nanoparticles using whispering gallery microlasers.</a> Nat Nano. 6, 428-432 (2011).</li>
<li>Dantham, V. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+detection+of+single+protein+using+a+nanoplasmonic-photonic+hybrid+microcavity%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Label-free detection of single protein using a nanoplasmonic-photonic hybrid microcavity.</a> Nano Lett. 13, 3347-3351 (2013).</li>
<li>Baaske, M. D., Foreman, M. R., Vollmer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+nucleic+acid+interactions+monitored+on+a+label-free+microcavity+biosensor+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Single-molecule nucleic acid interactions monitored on a label-free microcavity biosensor platform.</a> Nat Nanotechnol. 9, 933-939 (2014).</li>
<li>Su, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-Free+Single+Exosome+Detection+Using+Frequency-Locked+Microtoroid+Optical+Resonators%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Photonics%22%5BJournal%5D)">Label-Free Single Exosome Detection Using Frequency-Locked Microtoroid Optical Resonators.</a> ACS Photonics. (9), 1241-1245 (2015).</li>
<li>Åström, K. J., Murray, R. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3a%C3%85str%C3%B6m%2C+KJ+%22Feedback+systems+%3A+an+introduction+for+scientists+and+engineers%22">Feedback systems : an introduction for scientists and engineers</a>. , Princeton University Press. (2008).</li>
<li>Kerssemakers, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+dynamics+of+microtubules+at+molecular+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Assembly dynamics of microtubules at molecular resolution.</a> Nature. 442, 709-712 (2006).</li>
<li>Su, T. -T. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Label-free+detection+of+single+biological+molecules+using+microtoroid+optical+resonators%22">Label-free detection of single biological molecules using microtoroid optical resonators</a>. , California Institute of Technology. (2014).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

כחלקיקים נקשר, גל התהודה (λ) של עליות toroid. אם חלקיק מסיר את חבלים מעל, גל התהודה יורד בהתאמה (אירוע צעד למטה). קוטר החלקיקים (ד) ניתן לקבוע באמצעות היסטוגרמות של משרעת של כל שלב אורך גל. הגובה של כל שלב אורך גל משתנה בהתאם לשינויים בגודל של החלקיקים הכבולים ובשל המיקום על microtoroid בי החלקיקים נקשר. השינוי המרבי באורך גל תהודה (גובה צעד) מתרחש כאשר חלקיקים לאגד בקו המשווה של microtoroid שבו השדה החשמלי (E 0, מקסימום) היא מקסימאלי...

ניסויי זיהוי מולקולה בודדים הם שימושיים להפחתת כמות אנליטי המשמשת בחיישנים, לגילוי מוקדם של מחלה, ולבדיקת התכונות הבסיסיות של מולקולות 3. ניסויים כאלה בדרך כלל מבוצעים באמצעות תוויות, לעומת זאת, תוויות לא תמיד ניתן להשיג לחלבון מסוים, להגדיל את העלות, יכול להפריע האירועים הנחקרים, ויכולות להיות לא נוח, במיוחד בזמן אמת באתר ניסויים או נקודה-של- אבחון טיפול. תקן הזהב הנוכחי לbiosensing ללא תווית הוא תהודת plasmon פני השטח 4, עם זאת יש לי מערכות תהודת plasmon פני השטח המסחרית בדרך כלל גבול תחתון אופייני לזיהוי על סדר ננומטר. לאחרונה, תהודה אופטית צמחה כטכנולוגיה מבטיחה לbiodetection מולקולה בודדת ללא תווית 5. בהתבסס על הטווח הארוך (NS) תהודה עבודה אופטית כליאה של 6,7 אור. האור הוא evanescentlyבשילוב למכשירים אלה בדרך כלל באמצעות סיב אופטי. כאשר אורך הגל של האור עובר הסיבים תואם את אורך גל התהודה של המהוד, להדליק יעילות זוגות למהוד. אור שילוב זה לגמרי פנימי משקף בתוך החלל של מהוד יצירת שדה חלוף בקרבת ההיקף של המהוד. כחלקיקים להיכנס לתחום ולאגד חלוף למהוד, גל התהודה של שינויי המהוד באופן יחסי להיקף החלקיקים 8. במונחים של יכולת איתור, תהודה microsphere שקודם לכן שימשה לזיהוי שפעת יחידה חלקיקי נגיף (100 ננומטר) 9,10. לאחרונה, תהודה אופטית microsphere plasmonically משופר כבר משמשת לאיתור סרום שור יחיד אלבומין מולקולות 11 וoligonucleotides 8-Mer 12, לעומת זאת גישה זו מגבילה את האזור ללכוד חלקיקי 0.3 מיקרומטר 2 לדהסְגָן. חיישנים גדולים יותר באזור ללכוד הם אידיאליים למקסם את הסיכוי לגילוי חלקיקים. טכנולוגיות נוכחית מבוסס פתרון ללא תווית biosensing עם אזורי לכידה (&gt; 100 מיקרומטר 2) גדולים היו מוגבלות לגילוי חלקיקי פוליסטירן ≥ 25 ננומטר. פיתחנו מערכת ללא תווית biosensing המבוססת על טכנולוגית מהוד אופטית הידוע בתדר נעילה אופטי לוחש חלוף מהוד (פרח) 13 (איור 1), כי הוא מסוגל זיהוי של מולקולות בודדות בפתרון הזמן נפתרה. פרח משתמש החיים פוטון הארוכים של תהודה אופטית microtoroid בשילוב עם בקרת תדר נעילת משוב, זיהוי מאוזן, וסינון חישובית לאיתור חלקיקים קטנים עד מולקולות חלבון בודדות. השימוש בנעילת תדר מאפשרת המערכת תמיד לעקוב אחר תהודת ההסטה של ​​microtoroid כחלקיקים לאגד, ללא הצורך לטאטא או לסרוק את אורך גל הלייזר עלטווחים גדולים. העקרונות של פרח יכולים לשמש כדי לשפר את יכולות זיהוי של טכניקות אחרות, כוללים שיפור plasmonic. בדברים שלהלן, ההליכים לביצוע פרח מתוארים.

<table><tbody><tr><td>לייזר דיודה מתכוונן</td><td>Newport</td><td>TLB-6300</td><td></td></tr><tr><td>בקר לייזר</td><td>Newport</td><td>TLB-6300-LN</td><td></td></tr><tr><td>בקר משוב נעילת תדרים</td><td>Toptica Photonics</td><td>Digilock 110</td><td></td></tr><tr><td>מקלט פוטו מאוזן אוטומטית</td><td>Newport</td><td>דגם 2007</td><td></td></tr><tr><td>בקר קיטוב מקוון</td><td>General Photonics</td><td>PLC-003-S-90</td><td></td></tr><tr><td>כרטיס רכישת נתונים 24 סיביות</td><td>National Instruments</td><td>NI-PCI-4461</td><td></td></tr><tr><td>אינטרלוקין אנושי רקומביננטי-2</td><td>פירס ביוטכנולוגיה</td><td>R201520</td><td></td></tr><tr><td>חרוזי פוליסטירן 20 ננומטר</td><td>Thermo Scientific</td><td>3020A</td><td></td></tr><tr><td>NanoCube XYZ Piezo Stage</td><td>Physik Instrumente</td><td>P-611.3</td><td></td></tr><tr><td>שולחן אופטי</td><td>ניופורט</td><td>VH3660W-OPT</td><td></td></tr><tr><td>עדשת אובייקטיבית לעמודת הדמיה</td><td>Navitar Machine Vision</td><td>1-60228</td><td></td></tr><tr><td>עמודת הדמיה (צינור מתאם)</td><td>Navitar Machine Vision</td><td>1-60228</td><td></td></tr><tr><td>מצלמת CCD ברזולוציה גבוהה לעמודת הדמיה</td><td>Edmund Industrial Optics</td><td>NT39244</td><td></td></tr></tbody></table>

ללא תווית מולקולה בודדת איתור באמצעות תהודה אופטית microtoroid

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

יש גילוי ריכוזים קטנים של מולקולות עד לגבול המולקולה הבודד השפעה על תחומים כגון גילוי מוקדם של מחלה, ומחקרים בסיסיים בהתנהגות של מולקולות. שיטות לזיהוי מולקולה בודדות נפוצות לנצל תוויות כגון תגי ניאון או נקודות קוונטיות, לעומת זאת, תוויות לא תמיד זמינות, להגדיל את העלות ומורכבות, ויכולות להפריע האירועים נחקר. תהודה אופטית צמחה כאמצעי מבטיח לזהות מולקולות בודדות ללא השימוש בתוויות. נכון לעכשיו החלקיקים הקטנים ביותר שזוהו על ידי מערכת שאינה plasmonically משופרת חשופה אופטית מהוד בפתרון הוא תחום פוליסטירן 25 ננומטר 1. פיתחנו טכניקה המכונית תדר נעילה אופטי לוחש חלוף מהוד (פרח) שיכול לעלות ממגבלה זו ולהשיג זיהוי מולקולה בודד ללא תווית בתמיסה מימית 2. כעוצמת אות מאזניים עם חלקיקי נפח, העבודה שלנו מייצגת improveme 100x&gt;NT ביחס האות לרעש (SNR) על המצב הנוכחי של האמנות. כאן הנהלים מאחורי הפרחים מוצגים במאמץ להגדיל את השימוש שלה בתחום.

חלקיקים מחייבים אירועים נראים בבירור כשינויי צעד כמו באורך גל התהודה של microtoroid לאורך הזמן (איור 2 א). הגבהים של צעדים אלה מוצגים כהיסטוגרמה באיור 2. איורים 2-4 להראות עקבות נציג המחייב של exosomes (nanovesicles), חרוזים סיליקה 5 ננומטר, ואינטרלויקין -2 מולקולות אנושיות אחת, בהתאמה. העובדה שאירועי צעד כמו בקנה מידה עם גודל חלקיקים מראה כי הטכניקה שבוצעה כהלכה. זה עשוי להיות מנותח על ידי יצירת היסטוגרמה של גבהים צעד (אי...

פיתחנו מערכת חישה ביולוגית נטולת תוויות המבוססת על טכנולוגיית תהודה אופטית הידועה בשם Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) המסוגלת לזהות מולקולות בודדות בתמיסה. כאן מתוארים ומוצגים הנהלים מאחורי עבודה זו.

ללא תווית מולקולה בודדת איתור באמצעות תהודה אופטית Microtoroid

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לזהות מולקולות בודדות וננו-חלקיקים זעירים במיוחד ללא שימוש בסימונים, באמצעות טכניקה המבוססת על טכנולוגיית רזונטור אופטי ונעילה תדרית. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחומים ביוכימיים כגון קיפול חלבונים וקינטיקה של קישור. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שאין צורך לסמן את מולקולת המטרה כדי לזהותה.ההכנה לטכניקה זו כוללת חיבור של שבב micro OID לסיב אופטי. ראשית, השג שבב micro OID. זהו שבב סיליקון בגודל של כ-6.5 מילימטר על 5.5 מילימטר, שבו מיוצר micro OID.כפי שמוצג בתמונה זו, ל-micro OID יש קוטר ראשי של 80 עד 100 מיקרומטרים וקוטר משני של שני מיקרומטרים. כעת, הניחו את השבב בצד והכינו את הסיב לצורך חיבור לשבב. עבדו עם סיב במצב יחיד (single mode fiber) על גליל, ופרסו כמעט מטר אחד מהסיב.השתמשו במקלפי חוטים ובערך במרכז הסיב הפרוש. השתמשו בהם כדי להסיר מקטע של 2.5 סנטימטרים של ציפוי הפולימר מהסיב. אזור זה, לאחר הסרת הציפוי, הוא אזור הצימוד של הסיב.לאחר קילוף הסיב, השתמשו במטלית ללא סיבים ובאלכוהול איזופרופנול כדי לנקות את האזור שקולף. לאחר מכן, השתמשו במחזיק סיבים עם תופסנים מגנטיים כדי לקבע את החלק הנקי במקומו. לשלב הבא, הכינו מנועי צעד המסודרים למשיכת הסיב לכיוונים מנוגדים.מקם את מחזיק הסיב כך שניתן יהיה לחבר את מנועי הפסעות (stepper motors) לסיב משני צדי האזור שהוסר ממנו הבידוד. בנוסף, חבר לייזר לקצה אחד של הסיב כדי שישמש כמקור אור. הפעל את מנועי הפסעות לתנועה בכיוונים מנוגדים כדי למתוח את הסיב, והשתמש בלקוי מימן כדי להמיס את חלקו של הסיב שהוסר ממנו הבידוד.יש לעקוב באופן רציף אחר האור הנפזר לצדדים מהסיב. הבהוב מעיד על כך שההסעה של האור דרך הסיב משתנה ויש להמשיך בדילול. כאשר ההבהוב פסק, יש להפסיק את החימום ואת משיכת הסיב, אשר עוביו יגיע לכ-500 nanometers.לאחר שסיב האופטי דומם, נתקו את מקור האור והסירו את הסיב ואת תושבת התפס המגנטי שלו מהמנועים. לאחר מכן, העבירו את הסיב לשולחן עבודה המבודד פנימטית ומצויד בבמת מיקום. הניחו את הסיב בתושבת התפס המגנטי שלו על גבי בלוק תמיכה לפני שבב הדגימה.במת השמיכה היא במת מיקום ננומטרית בעלת שלושה צירים המונחת על גבי מיקרומטר בעל שלושה צירים. בנוסף לבמת המיקום הננומטרית, קיימות עמודי דימיון לתצפית מלמעלה ומצד כדי לסייע בכיול. המשיכו לעבוד עם הסיב תוך כדי וידוא שחלקו המקולף נמצא בקרבת במת המיקום.הכינו את הקצה החופשי של הסיבים להחדרה למערכת המדידה. לאחר חיתוך הקצה החופשי, הכניסו אותו למתאם סיבים חשופים. השתמשו במתאם כדי לחבר את הסיב לכניסה של מקלט פוטו-מאוזן אוטומטית המחובר לאוסילוסקופ.כעת התמקדו בקצה השני של הסיב. ראשית, חברו קצה זה למצמד אופטי. לאחר מכן, חברו את הסיב למוצא של מקטב טורי (inline polarizer), אשר מקבל קלט ממפיל קרן (beam splitter) של 50 50 ומלייזר דיודה כיוון של ATT.להלן תרשים של החיבורים שבוצעו עד כעת. שימו לב כי המוצא השני של מפליג האלומה עובר דרך מקטב בטור (inline polarizer) ומשמש כרפרנס עבור מקלט הפוטו-דיודות המאוזן-אוטומטית. השלב הבא הוא ההכנה להרכבת שבב ה-micro OID באמצעות מחזיק דגימות מפלדת אל חלודה.השתמשו בסרט דביק דו-צדדי כדי להצמיד את השבב למחזיק הדגימה. לאחר מכן, הניחו את המיקרו-שבב על גבי מחזיק הדגימה. כעת, התקינו את מחזיק הדגימה עם השבב שמעליו על במה למיקום ננומטרי (nano positioning stage).כאן המחזיק והשבב ממוקמים על במת המיקום עם מיקרומטר X המשולש. בצעו מיקום גס של שבב הדגימה ביחס לסיב. כאן מוצגים השבב והסיב לאחר השלמת המיקום הגס.בשלב הבא, כווננו את המיקוד באופן נוסף והשתמשו בעמודי הדמיות כדי ליישם את השבב במקביל לסיב האופטי. באמצעות micro OID עם אורך גל של לייזר, תמונה זו היא של סיב ו-microt. לאחר שלב המיקום העדין, המדבקה העגולה הסמוכה למרכז שדה הראייה משמשת כעזר למיקום. כעת עברו לחיפוש אורך הגל של התהודה של ה-micro.צור אות מתח בצורת גל משולש כדי לווסת את אורך הגל של הלייזר לסביבות 635 nanometers פלוס או מינוס 2.5 nanometers. כעת סרוק את אורכי הגל כדי לחפש תהודה. צפה בתמסירה דרך הסיב באוסצילוסקופ.שימו לב שבאורך גל התהודה, התמסירות יורדת. בנקודה זו, עבדו כדי להתאים את הקיטוב של אור הלייזר. כווןו את בקרי הקיטוב המובנים (inline polarization controllers) כדי למקסם את קיטוב אור הלייזר בסיב האופטי.צפה בפלט של קולט הפוטואלקטרונים באמצעות האוסצילוסקופ וכוון את הקיטוב עד שצניחת התמסורה הנמדדת תיראה כצרה ביותר. לאחר אופטימיזציה של הקיטוב, בני תא דגימה על במה הדגימה.התא מורכב מזכוכית כיסוי המודבקת באמצעות אפוקסי לחלקית של זכוכית מיקרוסקופ. הזכוכית משמשת כמקריב המאפשר לזכוכית הכיסוי להבלוט מעל השבב והסיב. הגדירו משאבת מזרק של one milliliter וצינורית להחדרת דגימות הניסוי אל תוך התא בקצב של one milliliter לדקה.בשלב הבא, השג דגימה בנפח של one milliliter שהגיעה לטמפרטורת החדר כדי להטעין אותה אל תוך המשאבה. במקרה זה, מדובר בתמיסה עם silica beads בגודל של five nanometer. לאחר ההטענה, עקוב אחר תא הדגימה והזרק את הדגימה. כאשר התא מלא, הפסק את הזרקת הדגימה לתא זה, אשר מלא כעת בתמיסה המכילה silica beads בגודל של five nanometer.לאחר המתנה של 30 שניות כדי למזער את השפעת הרעידות, חפש את אורך גל התהודה של המיקרו. שוב, צפה בירידה ובמעבר דרך הסיב בתהודה באמצעות האוסצילוסקופ. זוהי סכימה של המערך הניסיוני בנקודה זו, כולל בקר הפרופורציונלי-אינטגרלי-דיפרנציאלי או בקר ה-PID.האינטגרטור והדיתר (dither). הפעילו את הבקר במצב נעילה אוטומטי (auto lock) עם נעילה לראש השיא. הגדירו את תדר הדיתר לשני קילו-הרץ ואת אמפליטודת תנודת אורך הגל ל-19 femto meters.לאחר מציאת הגדרות ה-PID באופן אמפירי, נעול אוטומטית את אורך הגל של הלייזר לאורך הגל של תהודה (resonance) של המיקרו-חלול. אסוף נתונים על ידי הקלטת הפלט של בקר המשוב. להלן עקומות מייצגות של הסטת תהודה בפמטומטרים לעומת זמן בשניות, שהופקו באמצעות פרוטוקול המשתמש בשלושה חלקיקי קישור שונים, מסודרים לפי גודלם.החלקיקים הם אקסוזומים או ננו-שלפוחיות. חרוזי סיליקה בגודל חמישה ננומטר ומולקולות אנושיות של interleukine two. שימו לב לקניי המתרחקים השונים, הן בציר האנכי והן בציר האופקי, בכל מערך נתונים.הסקאלות השונות בנתונים עבור גדלי חלקיקים שונים מעידות על כך שהטכניקה בוצעה בצורה נכונה. כאשר חלקיק נקשר ל-oid, אורך גל הרזוננס של ה-OID עולה, מה שגורם למדרגה כלפי מעלה בעקומה. כאשר חלקיק נפרד, אורך גל הרזוננס יורד, מה שמוביל למדרגה כלפי מטה.הגובה של כל שלב באורך הגל נקבע על ידי גודל החלקיק ומיקומו על ה-micro oid. מקרי הזמן נקבעים על ידי דינמיקת ה-OID של החלקיק. לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו בכשלוש שעות אם היא מבוצעת נכון. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לשמור על הכל נקי ככל האפשר וללא אבק.

label-free-single-molecule-detection-using-microtoroid-optical

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

Biosensors ממשק עם סביבות מורכבות ביולוגיות ולבצע איתור ממוקד על ידי שילוב של חיישנים רגישים מאוד עם בדיקות ספציפיות ביותר המחוברים חיישן באמצעות שינוי פני השטח. הנה, אנחנו מדגימים functionalization פני השטח של חיישנים אופטיים עם סיליקה ביוטין באמצעות סוכני צימוד silane לגשר על חיישן את הסביבה הביולוגית.

הוספת בדיקות ביולוגיות Biosensors סיליקה אופטי באמצעות סוכני צימוד silane

אנו מתארים את השימוש בטכניקת לייזר פחמן דו חמצני reflow לייצר חללים סיליקה התהודה, כולל חופשית עומד microspheres ועל שבב microtoroids. שיטת reflow מסיר פגמים על פני השטח, מה שמאפשר חיים ארוכים פוטון בתוך המכשירים. המכשירים וכתוצאה מכך יש אולטרה גורמים באיכות גבוהה, מה שמאפשר יישומים החל התקשורת כדי biodetection.

ייצור של אולטרה סיליקה Microresonators באיכות גבוהה פקטור

סרטון זה מדגים הדמיית תהודה פלסמונית מקומית על פני השטח כדי לזהות הפרשות חלבונים מתא יחיד. באמצעות מערך מיקרופלואידי ושבב ננו-מבנה פלסמוני הקשור לפפטידים, שינויים בעוצמת האור המוחזר בזווית התהודה חושפים אינטראקציות עם חלבונים המופרשים מתא יחיד.

הדמיית תהודה פלסמונית מקומית על פני השטח לאיתור הפרשות חלבונים מתא בודד

חיישני microcavity פלורסנט ליבות להעסיק גבוה ציפוי מדד קוונטים-dot בערוץ של סיליקה microcapillaries. שינויים במקדם השביר של נוזלים נשאבים לתוך סיבת ערוץ נימי המשמרות בספקטרום פלואורסצנטי microcavity שניתן להשתמש בו כדי לנתח את מדיום הערוץ.

סינתזה והפעלה של microcavities פלורסנט ליבות לחישת Refractometric

טכניקת התייחסות אינטרפרומטר, שנועד להסיר רעש להתעצבן לייזר רצוי לnanodetection, הוא מנוצל לחיטוט microcavity גורם איכות גבוהה במיוחד. הוראות להרכבה, התקנה, ורכישת נתונים מסופקות, לצד תהליך המדידה לציון גורם איכות החלל.

יישום של אינטרפרומטר הפניה לNanodetection

עירורים אופטו-מכניים פרמטריים הודגמו לאחרונה בניסוי בתהודה אופטומכנית מיקרופלואידית באמצעות לחץ קרינה אופטי ופיזור ברילואין מגורה. מאמר זה מתאר את הייצור של מהודים מיקרופלואידיים אלה יחד עם מתודולוגיות ליצירה ואימות של תנודות אופטומכניות.

ייצור ובדיקה של מתנדים optomechanical Microfluidic

יכולת ההרחבה והרזולוציה של טכניקות מניפולציה אופטיות קונבנציונליות מוגבלות על ידי עקיפה. אנו עוקפים את מגבלת העקיפה ומתארים שיטה להובלה אופטית של ננו-חלקיקים על פני שבב באמצעות משטח זהב בדוגמת נתיב של מהודים פלזמוניים בצורת C המרוחקים זה מזה.

ייצור ותפעול של מסוע ננו-אופטי

זיהוי פלואורסצנטי רב צבעוני במיקרופלואידיקה טיפתית כולל בדרך כלל מערכות גילוי מבוססות מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי מגושמות ומורכבות. כאן אנו מתארים ערכת זיהוי רב-צבעונית קומפקטית ומודולרית המשתמשת במערך של סיבים אופטיים כדי לקודד זמנית נתונים רב-צבעוניים שנאספו על ידי גלאי פוטו יחיד.

ססגוניות קרינת איתור עבור מיקרופלואידיקה אגל באמצעות סיבים אופטיים

ביוכימיה חזותית של מולקולה בודדת הנחקרת באמצעות תאים מיקרופלואידיים מקלה מאוד באמצעות קנה זכוכית, מזרקים אטומים לגז, חיבורים יציבים של צינורות לתאי זרימה, וחיסול בועות על ידי הצבת שסתומי מיתוג בין המזרקים והצינורות. הפרוטוקול מתאר מלכודות אופטיות כפולות המאפשרות הדמיה של עסקאות דנ"א ואינטראקציות בין-מולקולריות.

שימוש בפינצטה אופטית כפולה ומיקרופלואידיקה למחקרי מולקולות בודדות

מאמר זה עוקב אחר מחזור החיים של מהוד ממברנת סיליקון ניטריד, מתכנון דרך ייצור ועד אפיון.

ייצור ואפיון של מהודי ממברנת סיליקון ניטריד High-Q

למד זיהוי מולקולות בודדות ללא תווית באמצעות טכנולוגיית תהודה אופטית FLOWER. השיטה מאפשרת גילוי ננו-חלקיקים זעירים בפתרון ללא צורך בסימון, ומסייעת בחקר קינטיקת קיפול חלבונים וביוכימיה.

ללא תווית מולקולה בודדת איתור באמצעות תהודה אופטית Microtoroid

גלה סרטונים נוספים