ניטור הומאוסטזה סידן endoplasmic reticulum שימוש

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לנטר שיבוש בוויסות הסידן ברשתית התוך-פלזמית (ER) לאורך זמן באמצעות חלבון דגישה (reporter protein) מופרש. דבר זה מושג על ידי טרנסגנזה של הרקמה המטרה, ובאופן ספציפי הכבד, באמצעות וקטור ויראלי. בדוגמה זו עם הדיווחן Gai luciferase circa, נאסף נוזל ביולוגי סמוך, כגון דם, כדי למדוד את כמות ה-circa שהופרשה מהרקמה, לאחר מכן מתווסף סובסטרט של לוקיפראז לדגימות הפלזמה ונמדדת לומינסנציה כדי לקבוע את מידת דלדול הסידן ב-ER.

התוצאות מראות הפרעה בוויסות הסידן ב-ER כפי שמעידים רמות מוגברות של cAMP בפלזמה. ניתן לנטר את ההומאוסטזיס של הסידן ב-ER לאורך פרקי זמן ממושכים באמצעות דגימות חוזרות של נפחים קטנים של נוזלים ביולוגיים. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון צבעי סידן בעלי זיקה נמוכה או אינדיקטורים לסידן המקודדים גנטית, הוא שניתן לנטר את ההומאוסטזיס של הסידן ב-ER באופן in vivo לאורך זמן באמצעות הליך עם פולשנות מינימלית. קיימים שני נתיבי טיפול עבור טכניקה זו.

הגישה הראשונה היא לסרוק תרופות שיכולות לשמר או להחזיר את הומיאוסטזיס הסידן ב-ER למצב פיזיולוגי נורמלי. הגישה השנייה היא לשנות חלבון טיפולי כך שיהפוך ל-amps טיפוליים, שבהם ההפרשה מתרחשת בתגובה לדלדול סידן ב-ER. שיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי הפרות בויסות הסידן ב-ER בכבד.

ניתן ליישם זאת גם על מערכות איברים אחרות כגון המוח, הלב, השרירים או הלבלב. לאחר הרדמה של חולדה מסוג sprat dolly, בהתאם לפרוטוקול הכתוב, מרחו משחה אופתלמית ובצעו צביטה בזנב כדי לוודא את ההרדמה; גלחו את אזור הבטן, מעט מתחת לצלעות ועד לאזור מרכז הבטן, וקרצפו את שטח הניתוח שלוש פעמים, לסירוגין עם Betadine ו-70% ethanol. לאחר מכן, הניחו את החולדה במצב שכיבה גב (supine) על שטח ניתוח סטרילי וכסו בסדיני ניתוח סטריליים; דללו a v gluc samp לריכוז המותאם למשתמש.

במקרה זה, השתמשנו ב-7.6 × 10⁹ גנומים נגיפיים למיליליטר וערבבנו על ידי הפיכת המבחנה. לאחר מכן, העבירו בפיפט 105 µL של ה-AAV המדולל לכלי סטרילי והשתמשו במחט בקוטר 30 gauge כדי לאסוף את הנגיף למזרק. סמנו את אתר החתך המיועד לחשיפת הכבד לצורך ההזרקה באמצעות סקאלפל.

בצעו חתך אופקי באורך של כשני עד שלושה סנטימטרים מתחת לכלוב הצלעות. בצעו דיסקציה קהה כדי להפריד את רקמת החיבור מההיפודרמיס. חתכו את שרירי הבטן כדי לחשוף את האונה המדיאלית הימנית של הכבד.

בשלב הבא, הניחו את החיה תחת מיקרוסקופ כירורגי וכוונו אותו כך שהאונה האמצעית הימנית של הכבד תהיה בשדה הראייה. לאחר מכן, בעזרת המזרק, הזריקו שליש מהנפח הכולל של הווירוס לשלושה אתרים בתוך הפארנכימה של האונה האמצעית הימנית, והשאירו את המחט ברקמה למשך 5 עד 10 שניות לאחר ההזרקה כדי להבטיח את העברתו של כל נפח ההזרקה. תפרו את שריר הבטן ואת החתך, והשתמשו במקלון צמר להנחת Neosporin. הניחו את החולדה בתא התאוששות עד להסכמה מלאה ויכולת לשמור על עמידה זקופה, לפני החזרת החיה לכלוב ביתי בבית ייחוד.

ארבעה עד שבעה ימים לאחר ההזרקה. הכינו מבחנות לאיסוף דם על ידי סימון ושקילה מוקדמת שלהן. לאחר מכן, הוסיפו 50 µL של 1000 units per milliliter של heparin לכל מבחנה.

לאחר הרדמת החולדה בהתאם לפרוטוקול הכתוב, בצעו צביטה בזנב כדי לוודא את רמת הסדציה, ובעזרת מספריים סטריליים, גזרו את קצה הזנב במרחק של כ-1 עד 2 מילימטרים מהקצה. אספו יותר מ-100 µL של דם בטפטוף לתוך מבחנה המלאה מראש בהפרין כדי לעצור את הדימום.

השתמש במקלון צמר גפן רטוב כדי למרוח אבקת STIC על הזנב. השתמש בפד אתנול כדי לנגב את המספריים ובצע סטריליזציה בעזרת להבה (bead sterilize) בין איסוף לדגימה. אחסן את מבחנות הדם בטמפרטורה של 4 °C.

במקרה של איסוף דגימות נוספות, שקלו את מבחנות האיסוף והתאימו את כמות ההפרין כדי להשיג יחס של שניים לאחד של דם להפרין. שלב זה ינרמל את כמות ההפרין בכל דגימה. סבבו את המבחנות בצנטריפוגה ב-2000 ×g ובטמפרטורה של 4 °C למשך חמש דקות.

העבר את עליון הפלזמה למבחנה נקייה ואחסן בטמפרטורה של 4°C למשך עד 72 שעות, או ב-80°C- לאחסון לטווח ארוך, לצורך ביצוע בדיקת לוסיפראז (luciferase assay) כדי להגיש את thaa garin כביקורת חיובית. דלל באתנול לריכוז סופי של 2.5 mg/mL. לאחר מכן, הזרק במינון של 1 mg/kg בתוך הצפק (intraperitoneal) בחלק התחתון של הבטן.

דגמו את דגימת הדם הראשונה 24 שעות לאחר ההזרקה כפי שתואר לעיל. למדידת לומינסנציה, הכינו את תסבסב העבודה selen ezine בהתאם לפרוטוקול הכתוב והדגירו בטמפרטורת החדר במיגון מאור למשך 30 דקות.

בינתיים, הפשיר את כל הדגימות על קרח והעבר 10 µL של פלזמה ללוחית בעלת דפנות אטומות לאור, באמצעות קורא לוחות המסוגל לנטר ביולומינצנציה ומצויד במזרק לסובסטרט. בצע ה priming לקווי ההזנה עם הסובסטרט. הזרק 100 µL של סובסטרט לתוך באער.

נער במהירות בינונית למשך חמש שניות ומדוד את פליטת האור עבור דגימות in vitro. בצע אינטגרציה של פליטת האור למשך 0.5 שניות עבור שלב הקריאה, ועבור דגימות in vivo, בצע אינטגרציה למשך חמש שניות בשלב הקריאה להערכת הומיאוסטזיס של סידן ב-er. באמצעות שיטת Gluc SAR Camp, ניתן לכלול מספר בקרות, כגון רפורטר המופרש באופן קבוע, ובמקרה זה Gluc Noag.

עלייה ברמות החוץ-תאיות הן של GLUC SAR camp והן של Gluc noag בתגובה לתנאים ניסיוניים תיחשב לתוצאה מעומעמת. עם זאת, עלייה בהפרשת gluc SAR camp ללא תגובה של gluc noag תומכת באירוע תלוי סידן מהרשת האנדופלזמית (ER). ניתן להשתמש במודולטורים פרמקולוגיים של מאגר הסידן ב-ER כדי לאשר את תרומתו של סידן מה-ER לשחרור SAR camp בפרדיגמות חדשות.

לדוגמה, כפי שמוצג כאן, dantrolene, אנטגוניסט של קולטן INE המייצב סידן ב-ER, מעכב את שחרור SAR camp בתגובה ל-thic argon. במחקרים in vitro המשתמשים ב-SAR camp מבוסס gluc, את התגובה המושרה על ידי הטיפול מומלץ להעריך לאורך ציר הזמן. באמצעות מעקב אחר שינויים בתגובה היחסית בתוך פלטה אחת לעומת ביקורות, לא מומלץ להשוות ערכים גולמיים בין פלטות שונות, שכן התפרקות של סובסטרט עלולה להוביל לשינויים בערכים הגולמיים. במחקרים in vivo, יש להעריך את הנתונים באופן עצמאי עבור כל חיה, כאשר כל חיה משמשת כביקרת קדם-טיפול עבור עצמה.

דבר זה נחוץ כדי להביא בחשבון שונות בהעברה ובביטוי של הגן הזר בין בעלי החיים. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להשתמש בטכנולוגיית sircam כדי לחקור את ויסות הסידן במיטוכונדריה (er) במודלים של מכרסמים למחלות כבד. זכרו כי עבודה עם וקטורים ויראליים עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון לבישת ציוד מגן אישי מתאים, בעת ביצוע הליך זה.