Name: ניטור הומאוסטזה סידן endoplasmic reticulum שימוש Gaussia לוציפראז SERCaMP (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: למד ניטור הומאוסטזה סידן ברשתיתיתית פנימית בכבד באמצעות SERCaMP ו-Gaussia לוציפראז. שיטה זו מאפשרת מעקב מינימלי פולשני לאורך זמן בנוזלי גוף.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית המחקר הפנימי במכון הלאומי לשימוש בסמים. אנו מודים לדאג הווארד, כריס ריצ'י, לוולה פורטונו וג'וש הינקל על תרומתם לפיתוח שיטה זו.

<ol><li>Sitia, R., Braakman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quality+control+in+the+endoplasmic+reticulum+protein+factory%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Quality control in the endoplasmic reticulum protein factory.</a> Nature. 426 (6968), 891-894 (2003).</li>
<li>Burdakov, D., Petersen, O. H., Verkhratsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraluminal+calcium+as+a+primary+regulator+of+endoplasmic+reticulum+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Intraluminal calcium as a primary regulator of endoplasmic reticulum function.</a> Cell Calcium. 38 (3-4), 303-310 (2005).</li>
<li>Fu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+lipid+metabolism+disrupts+calcium+homeostasis+causing+liver+endoplasmic+reticulum+stress+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Aberrant lipid metabolism disrupts calcium homeostasis causing liver endoplasmic reticulum stress in obesity.</a> Nature. 473 (7348), 528-531 (2011).</li>
<li>Micaroni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+calcium+in+intracellular+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">The role of calcium in intracellular trafficking.</a> Curr Mol Med. 10 (8), 763-773 (2010).</li>
<li>Mekahli, D., Bultynck, G., Parys, J. B., De Smedt, H., Missiaen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoplasmic-reticulum+calcium+depletion+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Endoplasmic-reticulum calcium depletion and disease.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (6), (2011).</li>
<li>Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Chemical calcium indicators.</a> Methods. 46 (3), 143-151 (2008).</li>
<li>Whitaker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+probes+for+measurement+of+intracellular+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded probes for measurement of intracellular calcium.</a> Methods Cell Biol. 99, 153-182 (2010).</li>
<li>Tang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+application+of+a+class+of+sensors+to+monitor+Ca2%2B+dynamics+in+high+Ca2%2B+concentration+cellular+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Design and application of a class of sensors to monitor Ca2+ dynamics in high Ca2+ concentration cellular compartments.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (39), 16265-16270 (2011).</li>
<li>Palmer, A. E., Jin, C., Reed, J. C., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl-2-mediated+alterations+in+endoplasmic+reticulum+Ca2%2B+analyzed+with+an+improved+genetically+encoded+fluorescent+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Bcl-2-mediated alterations in endoplasmic reticulum Ca2+ analyzed with an improved genetically encoded fluorescent sensor.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (50), 17404-17409 (2004).</li>
<li>Suzuki, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intraorganellar+Ca2%2B+at+subcellular+resolution+using+CEPIA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Imaging intraorganellar Ca2+ at subcellular resolution using CEPIA.</a> Nat Commun. 5, 4153(2014).</li>
<li>Rehberg, M., Lepier, A., Solchenberger, B., Osten, P., Blum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+non-disruptive+strategy+to+target+calcium+indicator+dyes+to+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">A new non-disruptive strategy to target calcium indicator dyes to the endoplasmic reticulum.</a> Cell Calcium. 44 (4), 386-399 (2008).</li>
<li>Henderson, M. J., Wires, E. S., Trychta, K. A., Richie, C. T., Harvey, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SERCaMP%3A+a+carboxy-terminal+protein+modification+that+enables+monitoring+of+ER+calcium+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">SERCaMP: a carboxy-terminal protein modification that enables monitoring of ER calcium homeostasis.</a> Mol Biol Cell. 25 (18), 2828-2839 (2014).</li>
<li>Henderson, M. J., Richie, C. T., Airavaara, M., Wang, Y., Harvey, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesencephalic+astrocyte-derived+neurotrophic+factor+%28MANF%29+secretion+and+cell+surface+binding+are+modulated+by+KDEL+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor (MANF) secretion and cell surface binding are modulated by KDEL receptors.</a> J Biol Chem. 288 (6), 4209-4225 (2013).</li>
<li>Shipman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+4-%282-hydroxyethyl%29-1-piperazine%C3%ABthanesulfonic+acid+%28HEPES%29+as+a+tissue+culture+buffer%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Soc+Exp+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Evaluation of 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineëthanesulfonic acid (HEPES) as a tissue culture buffer.</a> Proc Soc Exp Biol Med. 130 (1), 305-310 (1969).</li>
<li>Zigler, J. S., Lepe-Zuniga, J. L., Vistica, B., Gery, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+cytotoxic+effects+of+light-exposed+HEPES-containing+culture+medium%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of the cytotoxic effects of light-exposed HEPES-containing culture medium.</a> In Vitro Cell Dev Biol. 21 (5), 282-287 (1985).</li>
<li>Howard, D. B., Powers, K., Wang, Y., Harvey, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tropism+and+toxicity+of+adeno-associated+viral+vector+serotypes+1%2C+2%2C+5%2C+6%2C+7%2C+8%2C+and+9+in+rat+neurons+and+glia+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Tropism and toxicity of adeno-associated viral vector serotypes 1, 2, 5, 6, 7, 8, and 9 in rat neurons and glia in vitro.</a> Virology. 372 (1), 24-34 (2008).</li>
<li>Smeets, E. F., Heemskerk, J. W., Comfurius, P., Bevers, E. M., Zwaal, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thapsigargin+amplifies+the+platelet+procoagulant+response+caused+by+thrombin%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Thapsigargin amplifies the platelet procoagulant response caused by thrombin.</a> Thromb Haemost. 70 (6), 1024-1029 (1993).</li>
<li>Tannous, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gaussia+luciferase+reporter+assay+for+monitoring+biological+processes+in+culture+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Gaussia luciferase reporter assay for monitoring biological processes in culture and in vivo.</a> Nat Protoc. 4 (4), 582-591 (2009).</li>
<li>Sobrevals, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV+vectors+transduce+hepatocytes+in+vivo+as+efficiently+in+cirrhotic+as+in+healthy+rat+livers%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">AAV vectors transduce hepatocytes in vivo as efficiently in cirrhotic as in healthy rat livers.</a> Gene Ther. 19 (4), 411-417 (2012).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+highly+efficient+transduction+by+double-stranded+adeno-associated+virus+vectors+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Rapid and highly efficient transduction by double-stranded adeno-associated virus vectors in vitro and in vivo.</a> Gene Ther. 10 (26), 2105-2111 (2003).</li>
<li>Seppen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+vector+serotypes+mediate+sustained+correction+of+bilirubin+UDP+glucuronosyltransferase+deficiency+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus vector serotypes mediate sustained correction of bilirubin UDP glucuronosyltransferase deficiency in rats.</a> Mol Ther. 13 (6), 1085-1092 (2006).</li>
<li>Hareendran, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+%28AAV%29+vectors+in+gene+therapy%3A+immune+challenges+and+strategies+to+circumvent+them%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Med+Virol%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus (AAV) vectors in gene therapy: immune challenges and strategies to circumvent them.</a> Rev Med Virol. 23 (6), 399-413 (2013).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

פרוטוקול זה מדגיש במבחנה ובשירות vivo של GLuc-SERCaMP לפקח דלדול סידן ER. למרות שינוי החלבון כדי ליצור SERCaMP מופיע להכליל לחלבוני כתב אחרים 12, בחרנו בלוציפראז Gaussia לפליטת האור שלו חזק (200-1,000 הגדול יותר פי) בהשוואה לluciferases האחר 18. אנו מדגימים שחרור GLuc-SERCaMP זיהוי מושרה thapsigargin על פני מגוון מינון של פי 100 של וירוס GLuc-SERCaMP נמסר לנוירונים עכברוש עיקרי בקליפת המוח, תאי SH-SY5Y, וכבד חולדה (איורים 3 ו -4).</s...

Reticulum endoplasmic (ER) פונקציות רבות יכולות סלולריות כוללים קיפול חלבונים, הפרשת חלבון, שומנים הומאוסטזיס, ואיתות תאית 1. מרכז לתפקוד נורמלי ER הוא שמירת ריכוזי סידן luminal ב ~ 5000 פעמים אלה שנמצאו בציטופלסמה 2-4. תהליך עתיר אנרגיה זה מוסדר על ידי ATPase סידן Sarco / reticulum endoplasmic (SERCA), משאבה שזז יוני סידן לחדר המיון. זרימה של סידן מחדר המיון מתווכת בעיקר על ידי ryanodine (RyR) וקולטני אדנוזין אינוזיטול (IP3R). בגלל תהליכי מיון רבים תלויים בסידן, לשבש את החנות יכולה להוביל ללחץ ER ומוות של תאי סופו של דבר. ER חוסר ויסות הסידן נצפה במחלות כולל קרדיומיופתיה, סוכרת, אלצהיימר, פרקינסון ושל 5. בשל הפרוגרסיביות של מחלות אלו, זה כבר מאתגר להתוות סיבה והתוצאה מחדשlationship בין פתוגנזה ושינויים בחנות סידן ER. מספר הטכנולוגיות איפשר להתקדמות משמעותית בהבנה של דינמיקת סידן ER, כוללים צבעים ואינדיקטורים מקודדים גנטיים סידן (GECIs) שלנו. צבעים נמוכים זיקת סידן, המגדילים בקרינה כאשר חייב Ca 2 +, ניתן לטעון לתאים לבחון תאי subcellular עם ריכוזים גבוהים של סידן 6. GECIs, כגון D1ER ותופס לאפשר ניטור של תנודות סידן עם שליטה מדויקת יותר של לוקליזציה subcellular 7-9. לאחרונה, סוג אחר של GECIs נקראים אינדיקטורים למדידת סידן בפח אברון חלבון (CEPIA) תוארו 10. גישה שלישית המשלבת גנטיקה וכימיה מולקולה קטנה הוא טעינת צבע הממוקד-אסטראז (TED), אשר מנצל carboxylesterase מקודדים גנטי (ממוקד לחדר המיון) עם צבע סידן מבוסס אסתר 11. בעוד המגייסיש גישות ementioned נקודות חוזק וחולשה טבועים, הם יכולים לספק תובנה חשובה דינמיקת סידן ER באמצעות מדידות של הקרינה אקוטיות. הם, לעומת זאת, לא אופטימליים למחקרים ארוכי טווח לעתים קרובות נדרשו לחקור את התקדמות מחלה. במטרה להמציא שיטה לעקוב אחר דינמיקת סידן על פני תקופות זמן ארוכות, זיהינו ופיתחנו שינוי חלבון ליצירת חלבוני סידן מופרש ER ניטור (SERCaMPs) 12. SERCaMP עוקף כמה מגבלות הקשורות לשיטות אחרות, על ידי מתן גישה פולשנית לחקור חנות סידן ER שוב ושוב. אנחנו הוכחנו בעבר כי ASARTDL carboxy מסוף פפטיד (אלאנין-סרין-אלאנין-ארגינין-תראונין-אספרטית חומצה-לאוצין) מספיק כדי לקדם את שימור ER; עם זאת, בתנאים שגורמים לירידות בסידן ER, רצף הפפטיד הוא כבר לא מסוגל לשמור על localizatio ERn והחלבון מופרש 13. בסיס טכנולוגית SERCaMP הוא התוספת של ASARTDL לcarboxy-הסופית של חלבון מופרש (לוציפראז למשל Gaussia, או GLuc) כך שההפרשה מופעלת על ידי דלדול סידן ER, ובכך ליצור כתב חזק של חוסר ויסות הסידן ER 12. הביטוי של GLuc-SERCaMP באמצעות שיטות מהונדסים מאפשר נוזלים ביולוגיים כוללים תרבית תאים בינוני ופלזמה להיות מנותח לשינויים בפעילות GLuc כאינדיקטור של הומאוסטזיס סידן ER. יש שיטת בקשות למחקר האורך של שינויים הדרגתיים בחנות סידן ER הן במבחנה in vivo. הפרוטוקול הבא נכתב כמתווה כללית לשימוש SERCaMP מבוסס GLuc ללמוד הומאוסטזיס סידן ER, אבל הפרוטוקול יכול לשמש כמדריך לSERCaMPs כתב חלופי.

<table><tbody><tr><td>שפופרות 1.5 מ"ל</td><td>פישר&nbsp;</td><td>02-682-550</td><td></td></tr><tr><td>פתרון 10% NP-40&nbsp;</td><td>פירס</td><td>28324</td><td>לבדיקות GLuc תוך-תאיות</td></tr><tr><td>1 מ"ל מזרקי לואר-לוק</td><td>פישר</td><td>14-823-30</td><td></td></tr><tr><td>קצות סינון 200 מיקרוליטר</td><td>Rainin</td><td>RT-L200F</td><td></td></tr><tr><td>3-0 תפרים כירורגיים</td><td>פישר</td><td>NC9598192</td><td></td></tr><tr><td>30 גרם מחטים</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>14-821-13A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>יריעות איטום מיקרופלייט דביקות</td><td>תרמו</td><td>AB-0558</td><td></td></tr><tr><td>רפידות הכנה לאלכוהול</td><td>פישר</td><td>22-246-073</td><td></td></tr><tr><td>הרדמה מערכת זרימה אוטומטית</td><td>EZ הרדמה</td><td>EZ-AF9000</td><td></td></tr><tr><td>תא התאוששות בעלי חיים</td><td>ליון וטרינר</td><td>ICU-912-004</td><td></td></tr><tr><td>B27 תוסף</td><td>חיים טכנולוגיות</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת בטדין</td><td>Fisher</td><td>NC9386574</td><td></td></tr><tr><td>Bleach</td><td>Clorox</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>סרום גידול בקר</td><td>Thermo</td><td>SH30541.03</td><td></td></tr><tr><td>Coelenterazine, Native</td><td>Regis Technologies</td><td>1-361204-200</td><td></td></tr><tr><td>אפליקטורים עם קצה כותנה</td><td>Puritan</td><td>806-WC</td><td></td></tr><tr><td>מחטי חיתוך 3/8 תפרים מעגליים</td><td>WPI</td><td>501803</td><td></td></tr><tr><td>מנקה אולטראסקוני דיגיטלי</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>FS60D</td><td></td></tr><tr><td>DMEM גלוקוז גבוה, GlutaMAX, פירובט</td><td>Life Technologies</td><td>10569-010</td><td></td></tr><tr><td>סולם מסת DNA</td><td>Life Technologies</td><td>10496-016</td><td></td></tr><tr><td>Gaussia luciferase (חלבון רקומביננטי)</td> <td>Nanolight</td><td>321-100</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן Gaussia luciferase (עבור WB, ICC או IHC)</td><td>ניו אינגלנד ביולאבס</td><td>E8023S</td><td>1:2,000 (WB)</td></tr><tr><td>Germinator 500</td><td>CellPoint Scientific</td><td>DS-401</td><td></td></tr><tr><td>לוחות בדיקת גלוק (96 באר, אטום)</td><td>פישר</td><td>07-200-589</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת המלח המאוזנת של האנק</td><td>Life Technologies</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>הפרין</td><td>Allmedtech</td><td>63323-276-02</td><td></td></tr><tr><td>איזופלורן</td><td>באטלר שיין</td><td>29404</td><td></td></tr><tr><td>קטמין</td><td>הנרי שיין</td><td>995-2949</td><td></td></tr><tr><td>קוויק סטופ אבקת סטיפטיק</td><td>באטלר שיין</td><td>5867</td><td></td></tr><tr><td>L-גלוטמין</td><td>סיגמא</td><td>G8540</td><td></td></tr><tr><td>מתנול</td><td>פישר</td><td>a452-4</td><td></td></tr><tr><td>מיקרופוגה 22R צנטריפוגה</td><td>בקמן קולטר</td><td>368831</td><td></td></tr><tr><td>נאוספורין</td><td>פישר</td><td>19-898-143</td><td></td></tr><tr><td>טכנולוגיות חיים</td><td>בינוניות נוירובזאליות</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>Nikon סטריאוסקופ</td><td>ניקון</td><td>SMZ745T</td><td></td></tr><tr><td>ג'ל נוקלאוספין וניקוי PCR</td><td>Machery-Nagel</td><td>740609</td><td></td></tr><tr><td>P200 פיפט</td><td>Rainin</td><td>L-200XLS+</td><td></td></tr><tr><td>p24 ערכת טיטר מהירה Lenti-X</td><td>Clontech</td><td>632200</td><td></td></tr><tr><td>PCR חותם סרט</td><td>פישר</td><td>AB0558</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>קוקטייל מעכב פרוטאז</td><td>סיגמא</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>מיכל מסנן פחם ReFresh</td><td>EZ הרדמה</td><td>EZ-258</td><td></td></tr><tr><td>להבי אזמל, #10</td><td>Fine Science Tools Inc</td><td>10010-00</td><td></td></tr><tr><td>SD חולדות 150-200 גרם</td><td>נהר צ'ארלס</td><td>חולדות</td><td>שהוזמנו ב-150-200 גרם.&nbsp; ניתוח 5 ימים לאחר ההגעה</td></tr><tr><td>תגי אוזניים של בעלי חיים קטנים</td> National <td>Band and Tag co</td><td>1005-1</td><td></td></tr><tr><td>וילונות כירורגיים סטריליים</td><td>Braintree Scientific</td><td>SP-MPS</td><td></td></tr><tr><td>Synergy 2 קורא צלחות</td><td>BioTek</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Universal PCR Master Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4304437</td><td></td></tr><tr><td>Thapsigargin</td><td>Sigma</td><td>T9033</td><td>מזיק ל בריאות האדם</td></tr><tr><td>Virapower lentiviral אריזות תערובת Life</td><td>Technologies</td><td>K4975-00</td><td></td></tr><tr><td>מגיב Xfect Transfection</td><td>Clontech</td><td>631318</td><td></td></tr><tr><td>קסילזין</td><td>ואלי וטרינר</td><td>468RX</td><td></td></tr></tbody></table>

ניטור הומאוסטזה סידן endoplasmic reticulum שימוש<em&gt; gaussia</em&gt; לוציפראז sercamp

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

Reticulum endoplasmic (ER) מכיל את הרמה הגבוהה ביותר של סידן תוך תאי, עם ריכוזים כ -5,000 פי יותר מרמות cytoplasmic. פיקוח הדוק על סידן ER הכרחי לקיפול חלבונים, שינוי וסחר. הפרעות לסידן ER יכולות לגרום להפעלה של תגובת החלבון מקופלת, מנגנון תגובת לחץ ER שלוש שיניים, ותורמות לפתוגנזה במגוון רחב של מחלות. היכולת לעקוב אחר שינויי סידן ER במהלך התפרצות מחלה והתקדמות חשובה בעיקרון, אך מאתגרת בפועל. שיטות זמינות כעת עבור סידן ER הניטור, כגון צבעי ניאון סידן תלוי וחלבונים, סיפקו תובנה דינמיקת סידן ER בתאים, אולם הכלים אלה אינם מתאימים ללימודים בvivo. המעבדה שלנו הוכיחה ששינוי לcarboxy-הסופית של לוציפראז Gaussia מקנה הפרשת הכתב בתגובה לדלדול סידן ER. השיטות לשימוש בלוציפראז מבוסס, חלבון ניטור סידן מופרש ER (SERCaMP) במבחנה וביישומי vivo מתוארות במסמך זה. וידאו זה מדגיש זריקות כבד, מניפולציה תרופתית של GLuc-SERCaMP, איסוף דם ועיבוד, ופרמטרי assay לניטור אורך של סידן ER.

שיטת GLuc-SERCaMP מאפשרת הערכה של הומאוסטזיס סידן ER על ידי דגימת נוזלים תאיים. ניתן לכלול מספר פקדים בעיצוב ניסיוני כדי לשפר את הפרשנות של תוצאות. ראשית, שימוש בכתב constitutively מופרש (למשל GLuc ללא ASARTDL C-המסוף או &quot;GLuc-אין תג&quot;) יכול להיות מועסק על מנת להעריך את ההשפעות של טיפולים ניסיוניים על מסלול ההפרשה (הפרשה סלולרית העולמית) וביטוי transgene. לדוגמא, עלייה ברמות תאי של שתי GLuc-SERCaMP וGLuc-אין תג תיחשב תוצאה חד משמעית. לחלופין, עלייה בהפרשת GLuc-SE...

הומאוסטזיס סידן ברטיקולום אנדופלזמי מופרע בפתולוגיות מגוונות. ניתן להשתמש במדווח חלבון ניטור סידן מופרש (SERCaMP) כדי לזהות שיבושים במאגר הסידן של ER. פרוטוקול זה מתאר את השימוש ב-Gaussia luciferase SERCaMP לבחינת הומאוסטזיס סידן ER במבחנה וב-vivo.

ניטור הומאוסטזה סידן endoplasmic reticulum שימוש<em&gt; Gaussia</em&gt; לוציפראז SERCaMP

The endoplasmic reticulum (ER) contains the highest level of intracellular calcium, with concentrations approximately 5,000-fold greater than cytoplasmic ...

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לנטר שיבוש בוויסות הסידן ברשתית התוך-פלזמית (ER) לאורך זמן באמצעות חלבון דגישה (reporter protein) מופרש. דבר זה מושג על ידי טרנסגנזה של הרקמה המטרה, ובאופן ספציפי הכבד, באמצעות וקטור ויראלי. בדוגמה זו עם הדיווחן Gai luciferase circa, נאסף נוזל ביולוגי סמוך, כגון דם, כדי למדוד את כמות ה-circa שהופרשה מהרקמה, לאחר מכן מתווסף סובסטרט של לוקיפראז לדגימות הפלזמה ונמדדת לומינסנציה כדי לקבוע את מידת דלדול הסידן ב-ER.התוצאות מראות הפרעה בוויסות הסידן ב-ER כפי שמעידים רמות מוגברות של cAMP בפלזמה. ניתן לנטר את ההומאוסטזיס של הסידן ב-ER לאורך פרקי זמן ממושכים באמצעות דגימות חוזרות של נפחים קטנים של נוזלים ביולוגיים. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון צבעי סידן בעלי זיקה נמוכה או אינדיקטורים לסידן המקודדים גנטית, הוא שניתן לנטר את ההומאוסטזיס של הסידן ב-ER באופן in vivo לאורך זמן באמצעות הליך עם פולשנות מינימלית. קיימים שני נתיבי טיפול עבור טכניקה זו.הגישה הראשונה היא לסרוק תרופות שיכולות לשמר או להחזיר את הומיאוסטזיס הסידן ב-ER למצב פיזיולוגי נורמלי. הגישה השנייה היא לשנות חלבון טיפולי כך שיהפוך ל-amps טיפוליים, שבהם ההפרשה מתרחשת בתגובה לדלדול סידן ב-ER. שיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי הפרות בויסות הסידן ב-ER בכבד.ניתן ליישם זאת גם על מערכות איברים אחרות כגון המוח, הלב, השרירים או הלבלב. לאחר הרדמה של חולדה מסוג sprat dolly, בהתאם לפרוטוקול הכתוב, מרחו משחה אופתלמית ובצעו צביטה בזנב כדי לוודא את ההרדמה; גלחו את אזור הבטן, מעט מתחת לצלעות ועד לאזור מרכז הבטן, וקרצפו את שטח הניתוח שלוש פעמים, לסירוגין עם Betadine ו-70% ethanol. לאחר מכן, הניחו את החולדה במצב שכיבה גב (supine) על שטח ניתוח סטרילי וכסו בסדיני ניתוח סטריליים; דללו a v gluc samp לריכוז המותאם למשתמש.במקרה זה, השתמשנו ב-7.6 × 10⁹ גנומים נגיפיים למיליליטר וערבבנו על ידי הפיכת המבחנה. לאחר מכן, העבירו בפיפט 105 µL של ה-AAV המדולל לכלי סטרילי והשתמשו במחט בקוטר 30 gauge כדי לאסוף את הנגיף למזרק. סמנו את אתר החתך המיועד לחשיפת הכבד לצורך ההזרקה באמצעות סקאלפל.בצעו חתך אופקי באורך של כשני עד שלושה סנטימטרים מתחת לכלוב הצלעות. בצעו דיסקציה קהה כדי להפריד את רקמת החיבור מההיפודרמיס. חתכו את שרירי הבטן כדי לחשוף את האונה המדיאלית הימנית של הכבד.בשלב הבא, הניחו את החיה תחת מיקרוסקופ כירורגי וכוונו אותו כך שהאונה האמצעית הימנית של הכבד תהיה בשדה הראייה. לאחר מכן, בעזרת המזרק, הזריקו שליש מהנפח הכולל של הווירוס לשלושה אתרים בתוך הפארנכימה של האונה האמצעית הימנית, והשאירו את המחט ברקמה למשך 5 עד 10 שניות לאחר ההזרקה כדי להבטיח את העברתו של כל נפח ההזרקה. תפרו את שריר הבטן ואת החתך, והשתמשו במקלון צמר להנחת Neosporin. הניחו את החולדה בתא התאוששות עד להסכמה מלאה ויכולת לשמור על עמידה זקופה, לפני החזרת החיה לכלוב ביתי בבית ייחוד.ארבעה עד שבעה ימים לאחר ההזרקה. הכינו מבחנות לאיסוף דם על ידי סימון ושקילה מוקדמת שלהן. לאחר מכן, הוסיפו 50 µL של 1000 units per milliliter של heparin לכל מבחנה.לאחר הרדמת החולדה בהתאם לפרוטוקול הכתוב, בצעו צביטה בזנב כדי לוודא את רמת הסדציה, ובעזרת מספריים סטריליים, גזרו את קצה הזנב במרחק של כ-1 עד 2 מילימטרים מהקצה. אספו יותר מ-100 µL של דם בטפטוף לתוך מבחנה המלאה מראש בהפרין כדי לעצור את הדימום.השתמש במקלון צמר גפן רטוב כדי למרוח אבקת STIC על הזנב. השתמש בפד אתנול כדי לנגב את המספריים ובצע סטריליזציה בעזרת להבה (bead sterilize) בין איסוף לדגימה. אחסן את מבחנות הדם בטמפרטורה של 4 °C.במקרה של איסוף דגימות נוספות, שקלו את מבחנות האיסוף והתאימו את כמות ההפרין כדי להשיג יחס של שניים לאחד של דם להפרין. שלב זה ינרמל את כמות ההפרין בכל דגימה. סבבו את המבחנות בצנטריפוגה ב-2000 ×g ובטמפרטורה של 4 °C למשך חמש דקות.העבר את עליון הפלזמה למבחנה נקייה ואחסן בטמפרטורה של 4°C למשך עד 72 שעות, או ב-80°C- לאחסון לטווח ארוך, לצורך ביצוע בדיקת לוסיפראז (luciferase assay) כדי להגיש את thaa garin כביקורת חיובית. דלל באתנול לריכוז סופי של 2.5 mg/mL. לאחר מכן, הזרק במינון של 1 mg/kg בתוך הצפק (intraperitoneal) בחלק התחתון של הבטן.דגמו את דגימת הדם הראשונה 24 שעות לאחר ההזרקה כפי שתואר לעיל. למדידת לומינסנציה, הכינו את תסבסב העבודה selen ezine בהתאם לפרוטוקול הכתוב והדגירו בטמפרטורת החדר במיגון מאור למשך 30 דקות.בינתיים, הפשיר את כל הדגימות על קרח והעבר 10 µL של פלזמה ללוחית בעלת דפנות אטומות לאור, באמצעות קורא לוחות המסוגל לנטר ביולומינצנציה ומצויד במזרק לסובסטרט. בצע ה priming לקווי ההזנה עם הסובסטרט. הזרק 100 µL של סובסטרט לתוך באער.נער במהירות בינונית למשך חמש שניות ומדוד את פליטת האור עבור דגימות in vitro. בצע אינטגרציה של פליטת האור למשך 0.5 שניות עבור שלב הקריאה, ועבור דגימות in vivo, בצע אינטגרציה למשך חמש שניות בשלב הקריאה להערכת הומיאוסטזיס של סידן ב-er. באמצעות שיטת Gluc SAR Camp, ניתן לכלול מספר בקרות, כגון רפורטר המופרש באופן קבוע, ובמקרה זה Gluc Noag.עלייה ברמות החוץ-תאיות הן של GLUC SAR camp והן של Gluc noag בתגובה לתנאים ניסיוניים תיחשב לתוצאה מעומעמת. עם זאת, עלייה בהפרשת gluc SAR camp ללא תגובה של gluc noag תומכת באירוע תלוי סידן מהרשת האנדופלזמית (ER). ניתן להשתמש במודולטורים פרמקולוגיים של מאגר הסידן ב-ER כדי לאשר את תרומתו של סידן מה-ER לשחרור SAR camp בפרדיגמות חדשות.לדוגמה, כפי שמוצג כאן, dantrolene, אנטגוניסט של קולטן INE המייצב סידן ב-ER, מעכב את שחרור SAR camp בתגובה ל-thic argon. במחקרים in vitro המשתמשים ב-SAR camp מבוסס gluc, את התגובה המושרה על ידי הטיפול מומלץ להעריך לאורך ציר הזמן. באמצעות מעקב אחר שינויים בתגובה היחסית בתוך פלטה אחת לעומת ביקורות, לא מומלץ להשוות ערכים גולמיים בין פלטות שונות, שכן התפרקות של סובסטרט עלולה להוביל לשינויים בערכים הגולמיים. במחקרים in vivo, יש להעריך את הנתונים באופן עצמאי עבור כל חיה, כאשר כל חיה משמשת כביקרת קדם-טיפול עבור עצמה.דבר זה נחוץ כדי להביא בחשבון שונות בהעברה ובביטוי של הגן הזר בין בעלי החיים. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להשתמש בטכנולוגיית sircam כדי לחקור את ויסות הסידן במיטוכונדריה (er) במודלים של מכרסמים למחלות כבד. זכרו כי עבודה עם וקטורים ויראליים עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון לבישת ציוד מגן אישי מתאים, בעת ביצוע הליך זה.

monitoring-endoplasmic-reticulum-calcium-homeostasis-using-gaussia

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

פרוטוקול זה מתאר שיטה למדידת זמן אמת של והנתיבים סידן המיטוכונדריה ידי דימות פלואורסצנטי. השיטה מנצלת את חיישן YFP מבוססי permutated מעגלית סידן עירור כפול ratiometric (ratiometric pericam-MT) הביע סלקטיבי במיטוכונדריה.

ניטור שינויים דינמיים רמות הסידן מיטוכונדריאלי במהלך אפופטוזיס באמצעות חיישן סידן מקודד גנטית

Reticulum endoplasmic ממלא תפקיד מרכזי ב biogenesis חלבון ו הומאוסטזיס הסידן. הקמנו מערכת ניסויית המאפשרת לנו כתובת תפקידו של ערוצי Ca2 + לדלוף לאפיין את מנגנוני ויסות המתרברבים שלהם. מערכת זו כוללת בתיווך siRNA להשתקת הגן ואת תא חי Ca2 + הדמיה.

תא חי סידן הדמיה בשילוב עם השתקת siRNA מתווכת ג&#39;ין מזהה Ca 2 + ערוצי דליפה בקרום ER ו מנגנוני ויסות שלהם

הקרינה מבוסס מדידה הכניסה חנות המופעל הסידן בתאים חיים: מתא הסרטן תרבותי כדי סיב שריר שלד

מקור: Bannai, H., et. al., Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultures by Membrane-Targeted Ca2+ Indicators. J. Vis. Exp. (2019)הסרטון מדגים הדמיה פלואורסצנטית כדי לצפות בדינמיקת סידן ספונטנית ספציפית לתא באסטרוציטים על ידי ניטור רציף של חלבונים רגישים לסידן הממוקמים על קרום הפלזמה והרטיקולום האנדופלזמי.

הדמיית סידן ספונטנית עבור דינמיקה ספציפית לתא באסטרוציטים

ממוקד ולין מושרה טעינת צבע (טד) תומכת בניתוח של דינמיקת חנות סיד תאיות על ידי דימות פלואורסצנטי. השיטה מתבססת על המיקוד של Carboxylesterase רקומביננטי לreticulum endoplasmic (ER), שבו משפר את הסרת המסכות המקומית של סינטטי נמוכה זיקת...

הדמיה ישירה של סידן ER עם ממוקד esterase מושרה טעינת צבע (טד)

נכון לעכשיו, רוב מדדי הסידן הזמינים משמשים לכימות מעברי סידן ציטופלזמיים כמדדים עקיפים של סידן המשתחרר מהרטיקולום הסרקופלזמי בתאי שריר חלק מתורבתים. פרוטוקול זה מתאר את השימוש באינדיקטור ספציפי מבוסס FRET המאפשר מדידה ישירה של אותות סידן בתוך לומן הרטיקולום הסרקופלזמי.

מדידת תנודות סידן בתוך הרטיקולום sarcoplasmic של בתאי שריר חלק בתרבית באמצעות מבוססי סריג הדמיה Confocal

אנו מציגים פרוטוקולים ליישום של מחוון סידן מקודד גנטית ממוקד גנטית (GECI) Catcher + לניטור מהיר trans סידן ב reticulum endoplasmic / sarcoplasmic (ER / SR) של HEK293 ו שלד שריר תאים C2C12 באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי בזמן אמת. פרוטוקול למדידה באתרו K d וכיול נדון גם.

ניטור ER / SR סידן שחרור עם CA ממוקד<sup&gt; 2+</sup&gt; חיישן Catcher<sup&gt; +</sup

פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה לניתוח אותות סידן בצמחים שנוצר על ידי האכלה חרקים hemipteran, כגון כנימות. תודרנית לבנה טרנספורמציה עם החיישן סידן GFP GCaMP3 מאפשרים בזמן אמת אין ויוו ההדמיה של סידן דינמיקה עם רזולוציה טמפורלית, מרחבית גבוהה.

בזמן אמת In Vivo הקלטה של תודרנית סידן אותות שהאכילה חרקים באמצעות ביוסנסור פלורסנט

כאן אנו מציגים פרוטוקול עבור Ca2 + הדמיה של נוירונים ותאי גלייה, המאפשרת את הקרע של Ca2 + אותות ברזולוציה subcellular. תהליך זה הוא החלים על כל סוגי תאים לאפשר הביטוי של Ca מקודדים גנטית2 + מחוונים.

דיסקציה של Ca מקומי2 + אותות בתאים בתרבית על ידי קרום, ממוקדות Ca2 + אינדיקטורים

פרוטוקול זה מתאר גישה לביצוע הדמיית סידן באורגנואידים של מעיים אנושיים נגועים בנגיף, ומציע גישה לניתוח.

הדמיית סידן חיה של חד-שכבות אורגנואידים במעי אנושי נגועים בנגיף באמצעות מדדי סידן מקודדים גנטית

הקמנו בדיקת הרכבה מחדש של לוציפראז מפוצל כדי לפקח על המגעים האנדופלסמיים בין הרשתית למיטוכונדריה בתאים חיים. באמצעות בדיקה זו, אנו מתארים פרוטוקול למדידה כמותית של רמת הצימודים הבין-אברונים הללו בתאי HEK293T, בתנאי של טיפול כימי.

בדיקת הרכבה מחדש של Split-Luciferase למדידת מגעים אנדופלסמיים בין הרשתית למיטוכונדריה בתאים חיים

למד ניטור הומאוסטזה סידן ברשתיתיתית פנימית בכבד באמצעות SERCaMP ו-Gaussia לוציפראז. שיטה זו מאפשרת מעקב מינימלי פולשני לאורך זמן בנוזלי גוף.

ניטור הומאוסטזה סידן endoplasmic reticulum שימוש

גלה סרטונים נוספים