Microperfusion טכניקה לחקירת הסדרת כלי דם קטן חדירות בחולדה לפדר
12 בספטמבר 2015
טכניקת לנדיס המותאמת מאפשרת מדידה זוגית של המוליכות ההידראולית של מיקרו-כלים בודדים במזנטריה של חולדות רגילות וחולדות מהונדסות גנטית בתנאי בקרה ובדיקה באמצעות טכניקות מיקרו-פרפוזיה. הוא מספק שיטה נוחה להערכת מנגנונים המווסתים את חדירות המיקרו-כלי דם וחילופי כלי דם בתנאים פיזיולוגיים.
המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לאפשר מדידות חוזרות של המוליכות ההידראולית או חדירות המים של דפנות מיקרו-כלי דם בקיבה של חולדה במעטרה (mesentery) תחת תנאים ניסויים מבוקרים. דבר זה מושג על ידי קנולציה של מיקרו-כלי דם כדי לאפשר את קביעת הלחצים האונקוטיים וההידרוסטטיים בתוך הלומן, ולהאפשר בקרה מדויקת של ההרכב הכימי של נוזל הפרופוזיה (perfuse) והסביבה. לאחר מכן, כלי הדם נחסם, וניתן להבחין בתאי דם אדומים התלויים בנוזל הפרופוזיה, המשמשים כסמני זרימה, נעים בתוך הלומן כאינדיקטורים לחילוף נוזלים טראנס-ווסקולרי.
לאחר מכן, המיקום והמהירות של תאי הסמן האדומים נרשמים, בין אם לכיוון אתר החסימה ובין אם הרחק ממנו. לבסוף, החסימה משוחררת וחוזרת לצורך מדידות נוספות, או שהכלי נחזר לקנולציה והמדידות חוזרות תחת תנאים שונים.
בסופו של דבר, ניתן לבצע מדידות זוגיות של מוליכות הידראולית בתנאי ביקורת ובתנאי ניסוי כדי לאפשר את החקירה הישירה ביותר של הגורמים המסדירים את חדירות כלי הדם המיקרוסקופיים. יתרון של טכניקת Landis המעודכנת לחקירת הבקרה על חדירות נימיות הוא שלב הפרפוזיה. פרפוזיה מיקרוסקופית מאפשרת למדוד את חדירות דופן כלי הדם המיקרוסקופיים בתנאים שבהם הרכב נוזל הפרפוזיה, שטח הפנים להחלפה והלחץ בכלי הדם המיקרוסקופיים נשלטים כולם באופן ישיר.
שיטה זו יכולה לענות על שאלות הנוגעות למכניזמים תאיים ומולקולריים של בקרה על חדירות בכלי דם זעירים המייצגים איברים שלמים, והיא יכולה לספק השוואה לתוצאות משכבות מונואלייר של תאי אנדותל בתרבית, המשמשות לעיתים קרובות לחקר הפרטים של מכניזמים מולקולריים. מדגימה את הפרוטוקול שלנו היא ג'ויס קלארק, מנהלת המעבדה שלנו. ג'ויס הייתה אחראית לרבות מהשיפורים בפרוטוקול זה במהלך תקופת עבודתה כאן כמנהלת המעבדה.
لتחילת התהליך, השתמשו במותח אלקטרוני כדי לעצב מספר צינורות קפילריים נקיים מזכוכית בורוסיליקטית לחצאים מחודדים, כאשר לכל אחד מהם קצה באורך של כסנטימטר אחד, באמצעות גלגל השחזה המופעל על ידי אוויר ונייר שריריר של 0.5 מיקרון טבול במים, ומחזיק מיקרו-פיפטות המוגדר בזווית של 30 מעלות מהשיפוע האופקי של המיקרו-פיפטות. לאחר שטיפה וייבוש של המיקרו-פיפטות בהתאם לפרוטוקול הכתוב, בחרו מיקרו-פיפטות עם פתח באורך של כ-50 מיקרון ויחס בין אורך השיפוע לרוחבו שבין 3.1 ל-3.5. עליהם להיות בעלי חוד מחודד מאוד, המסייע בחדירה דרך סיבי הקולגן העמידים במזנטרים (mesentery).
כדי להכין מחסומים (restrainers), החזק לזמן קצר קפילרה מזכוכית שנמשכה ללא קצה משופע ליד להבה זעירה כדי ליצור קצה קהה. חזור על הפעולה כדי להכין מספר מחסומים ואחסן אותם בקופסה נקייה מאבק. לאחר מכן, הכן חוסמי מיקרו (micro occludes) על ידי החזקת צינור קפילרה שנמשך ללא קצה משופע בזווית תחת להבה זעירה, והשתמש במתאם צינורית או במיקרו-פיפט שבור כדי לכופף בעדינות את הצינור במרחק של כ-4 mm מהקצה, בזווית הקרובה ל-120 מעלות.
בכל הנוגע לצנרת, חשוב שקצה הצנרת לא יהיה חסום כתוצאה מהחשיפה ללהבה ולא שבור. לאחר הרדמת חולדה וסידור רקמת המסנתר (mesentery) והמעי בהתאם לפרוטוקול הכתוב, מקמו את מגש בעל החיים עלבמת המיקרוסקופ כך שהמסנתר יהיה גלוי דרך העיניות. מקמו קו טפטוף מזין בכוח הכבידה של תמיסת Ringer עבור יונקים לצורך השקיה רציפה.
לאחר מכן, השתמשו ברפידות גזה כדי להחזיק את המעי במקומו, לסייע בשמירה על הלחות ולספוג עודפי محلול Ringer מהפני השטח, כווננו את הזרימה ושאבו את הנוזל היוצא כדי לשמור על שכבה קבועה של סרוגאט, זהו מיקרו-כלי דם יעד, שהם מקטעים לא מסועפים במורד זרימה מתכנסת ואחד או שני ענפים רחוקים יותר מקפילריים אמיתיים. מצאו כלי דם לא מסועף בעל זרימת דם מהירה וללא תאי דם לבנים הדבקים לדופן כלי הדם. מקמו את מיקרו-כלי הדם לבדיקה במרכז שדה המיקרוסקופ והביאו את המייצב למקומו בקרבת אתר הקנולציה שנבחר.
כדי למלא את המיקרו-פיפט, שאבו שמונה תאי דם אדומים שוטפים לתוך מזרק שהוכן בהתאם לפרוטוקול הכתוב, וודאו שאין בועות בצינורית. החדירו את הצינורית אל הקצה הרחב של המיקרו-פיפט עד שתגעה באזור המצומצם. הפעילו לחיצה עדינה ומהירה על בוכנת המזרק כדי למלא את קצה המיקרו-פיפט.
זרם קטן או טיפה יופיעו בקצה כאשר הוא מלא. בעת הוצאת הפואל (tubing), לחץ בעדינות על הבוכנה כדי למלא את גוף המיקרו-פיפט. לאחר מכן, הסר בועות קטנות מגוף הפיפט באמצעות נקישה עדינה.
לאחר מכן, מקמו את המיקרו-פיפט בתוך מחזיק פיפט בעל פתח צד המאפשר חיבור נוזלי רציף למנומטר מים. ודאו כי המחזיק, המחובר להנעה הידראולית ולמיקרו-מניפולטור, מכוון בזווית אופקית קלה כך שקצהו של קוני המיקרו-פיפט לא יפגע במעי או במגש. באמצעות מזרק או נורית גומי מלאה במים, כווננו את הלחץ ההידרוסטטי המופעל על הנוזל במיקרו-פיפט על ידי שינוי גובה הנוזל בעמוד המים של המנומטר לכ-40 סנטימטרים של מים מעל הקרום (mesentery).
לפני מיקום המיקרו-פיפט המלא תחת המיקרוסקופ, לחצו בעדינות את המקבע על הרקמה בסמוך לכלי הדם המיקרוסקופיים, תוך הפעלת כוח מספיק לאחיזה ברקמה, משכו את המקבע מעט לאחור, כך שהרקמה תימתח בקו אחד עם כלי הדם המיקרוסקופיים וסימני המתיחה בסיבי הקולגן של הקרום המזנטרי (mesenteric collagen fibers) יהיו מיושרים עם כלי הדם. יישרו את המיקרו-פיפט עם כלי הדם והורידו אותו לשדה הראייה דרך העיניות. מקמו את הקצה מעט במעלה הזרם מאתר הקניולציה הנבחר והורידו אותו על הרקמה כך שיחסום חלקית את הזרימה בתוך כלי הדם, אך לא יסגור אותה לחלוטין.
באמצעות ההנעה ההידראולית, בצעו קניולציה של כלי הדם על ידי דחיפה איטית של קצה הפ pipette אל תוך לומן כלי הדם, תוך הקפדה לא לדחוף את הקצה דרך הצד השני של כלי הדם. עם כניסת המיקרו-pipette ללומן, נוזל הפרפוזיה ישטוף במהירות את הדם מתוך לומן כלי הדם ויחדור למחזור הדם. הפחיתו את לחץ הפרפוזיה על ידי כיוונון המנומטר עד שתאי הדם האדומים יתנדנדו בעדינות בתוך לומן כלי הדם.
שלב זה קובע את לחץ האיזון, המודד את הלחץ ההידרוסטטי בכלי דם זעירים או את ה-PC בקצה הדיסטלי של מקטע כלי הדם הזעירים. יש לשמור על פרפוזיה של כלי הדם מעל לחץ איזון זה כדי לבצע חסימה זעירה (micro occlusion). מקמו את החוסם מעל כלי הדם המופעז, סמוך לקצה התחתון של שדה הראייה של המיקרוסקופ, תוך שימוש בווידאו ובשמע.
הקליטו בעל פה את מיקום נקודת החסימה כפי שנראית ב-I piece red. נקודת החסימה היא 57 כאשר קצה החוסם ממוקם בדיוק מעל המיקרו-כלי. השתמשו בבקרת Z העדינה של המיקרו-מניפולטור כדי להוריד בעדינות את החוסם עד שהזרימה בכלי תיחסם.
השתמשו באודיו כדי לרשום את הלחץ במנומטר. הלחץ הוא 50. לאחר מכן, בצעו חסימה (occlusion) למשך שלוש עד 10 שניות ושחררו.
כדי להחזיר את הפרופוזיה החופשית, העבירו את נקודת החסימה במעלה כלי הדם לכיוון קצה הפיפטה בצעדים של 5 עד 10 מיקרון, תוך ביצוע לא יותר מ-3 עד 5 חסימות בכל מיקום כדי למנוע נזק לדופן כלי הדם בנקודת החסימה. נתחו את הנתונים בהתאם לפרוטוקול הכתוב. מסלול זמן זה מודד את השינויים במוליכות ההידראולית או ב-LP, בכלי דם מיקרוסקופיים של חולדה שבוצע בהם קנולציה מוצלחת עם ארבעה perfuse eights.
העוצמה של LP בלחץ קבוע שימשה למדידת שינויים בכלי דם מיקרוסקופיים. חדירות הדופן נמדדה בעת ביצוע פרפוזיה עם 1%BSA כביקורת, לעומת 10 molar של הגורם הדלקתי Brady Kinin או bk. כפי שמוצג כאן, BK גרם לעלייה זמנית ב-LP שחזרה לרמות הביקורת בתוך 10 עד 15 דקות.
לאחר כינון מחדש של רמות הבסיס עם 1%BSA 10 nanomolar, בוצע reperfusion של BK יחד עם one micromolar של pH scene one phosphate או S one P. התוצאות מצביעות על כך שה-S one P הנמיך באופן משמעותי את התגובה ל-bk. עבור תכנוני ניסוי מסוימים, חשוב להעריך הן את מקדם הרפלקסיה של הממס (solut reflection coefficient) עבור מקרו-מולקולה והן את ה-lp.
ניתן להשיג זאת בצורה הטובה ביותר על ידי מדידת JV בלחצים מרובים בכל אחד מכלי הדם המיקרוסקופיים הבודדים. ניסוי זה העריך הן את ה-LP והן את הלחץ האונקוטי האפקטיבי של 5% albumin ב-PERFUSE eight כאשר לא היה albumin ברקמה המקיפה את כלי הדם המיקרוסקופיים. JV חלקי S נמדד בשלושה לחצים שונים וסורטט כאן.
ה-LP הוא השיפוע של הקשר בין JV מעל S לבין הלחץ, והנקודה שבה הגרף חותך את ציר הלחץ היא הפרש הלחץ האונקוטי האפקטיבי לאורך דופן כלי הדם. בשילוב עם טכניקות אחרות כגון סימון אימונופלואורסצנטי ומיקרוסקופיה קונפוקלית, או אפילו מיקרוסקופיית אלקטרונים חודרת (TEM), מיקרו-פרופוזיה מספקת ניתוח עוצמתי של תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים ותפקודם באמצעות כלי דם בעלי חדירות ידועה. לאחר צפייה בסרטון זה, תגייעו להבנה טובה של אופן ביצוע מדידות חוזרות של המוליכות ההידראולית או חדירות המים של מיקרו-כלי דם בנימיות במעי של חולדה (rat mesentery) תחת תנאים ניסיוניים מבוקרים.
ניתן להשתמש בגישה זו במודלים של חולדות הזמינים כיום, אך אני מעוניין במיוחד באפשרות להשתמש בה בחולדות חדשות שעברו שינוי גנטי שיהיו זמינות הודות לטכנולוגיית CRISPR Cas nine, ואני מקווה שהיא תורחב באופן זה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה עושה שימוש בטכניקת Landis המשופרת כדי למדוד את המוליכות ההידראולית של מיקרוכלי דם בודדים במסרק של חולדה. השיטה מאפשרת תנאים ניסויים מבוקרים להערכת חדירות מיקרוכלי דם וחילוף טרנס-וסקולרי.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי העצבים
- פיזיולוגיה של כלי דם זעירים
- ביולוגיה ניסויית
רקע
- המוליכות ההידראולית של מיקרו-כלי דם היא קריטית להבנת חילופי נוזלים ברקמות.
- שיטות קודמות היו חסרות דיוק במדידת תכונות של כלי דם בודדים.
- טכניקת Landis המעודכנת נותנת מענה למגבלות אלו.
- הבנת התנהגות מיקרו-כלי דם יכולה לסייע למחקרים על בריאות כלי דם ומחלות וסקולריות.
מטרת המחקר
- לאפשר מדידות חוזרות של מוליכות הידראולית בכלי דם זעירים.
- להעריך את ההשפעות של לחצים אונקוטיים והידרוסטטיים על חדירות כלי דם זעירים.
- לחקור חילופי נוזלים טרנסווסקולריים תחת תנאים מבוקרים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- קנולציה של מיקרו-כלי דם בקישרי המעי (mesentery) של חולדה.
- קביעת לחצים אונקוטיים והידרוסטטיים בתוך חלל כלי הדם.
- שימוש בתאי דם אדומים כסמני זרימה לצפייה בחילופי נוזלים.
- תיעוד המיקום והמהירות של סמני הזרימה במהלך הניסויים.
תוצאות עיקריות
- מדידה מוצלחת של מוליכות הידראולית תחת תנאים שונים.
- הדגמת השפעת הגדרות הלחץ על שיעורי חילוף נוזלים.
- אספקת תובנות לגבי הדינמיקה של חדירות מיקרו-כלי דם.
- מתן אפשרות למדידות חוזרות לצורך איסוף נתונים איתן.
מסקנות
- טכניקת Landis המשופרת יעילה לחקר תכונות של מיקרו-כלי דם.
- הממצאים תורמים להבנת התפקוד המיקרו-וסקולרי.
- ניתן ליישם שיטה זו במגוון מחקרים פיזיולוגיים ופתולוגיים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
טכניקת המיקרו-פרפוזיה מאפשרת מדידה מדויקת וחזרתית של מוליכות הידראולית בכלי דם זעירים בודדים תחת לחצים הידרוסטטיים ואונקוטיים מבוקרים. הדבר מגשר בין מנגנונים מולקולריים הנצפים בשכבות בודדות של תאי אנדותל לבין חדירות תפקודית במיטות כלי דם שלמות, ובכך תומך בתיקוף מטרות במסלולי אנגיוגנזה ודלקת. השיטה מספקת נתונים כמותיים הניתנים לשחזור לצורך הפחתת סיכונים במטרות של חדירות כלי דם בשלב הגילוי הפרה-קליני.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן השערות טיפוליות באמצעות מדידת תגובות ישירות של מיקרו-כלי דם לסוכנים ואסואקטיביים כגון bradykinin ו-S1P תחת תנאי לחץ מבוקרים.
- ערך תפעולי: מאפשר השוואות מזווגות בתוך אותו כלי דם, מה שמפחית את השונות הביולוגית ומגביר את העוצמה הסטטיסטית למחקרי מעורבות מטרה (target engagement).
- ערך ניבוי: תומך בהפחתת סיכונים מכניסטית על ידי בידוד השפעתו של מתווכים ספציפיים על חדירות כלי דם, ובכך מסייע בקבלת החלטות go/no-go בתוכניות של ביולוגיה וסקולרית.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר מדידות כמותיות של מוליכות הידראולית (LP) המשמשות כמדדים תפקודיים לסריקת תרכובות בבדיקות חדירות כלי דם.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של פרוטוקולי פרפוזיה וחסימה לאורך ניסויים שונים, המאפשרת ביצועי בדיקה הניתנים לשחזור בסביבות גילוי.
- יכולת הרחבה: מאפשר שימוש חוזר בפלטפורמה עם מודלים של חולדות שעברו שינוי גנטי באמצעות CRISPR/Cas9, ובכך תומך בקמפיינים ארוכים של תיקוף מטרות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: מקשר ממצאים אנדותליאליים in vitro לתפקוד מיקרו-כלי דם ex vivo, ובכך משפר את רמת הביטחון החזויה במערכות הרלוונטיות למחלה.
- תועלת למודלים פרה-קליניים: ישימה למודלים של חולדות עם מודיפיקציות גנטיות המשפיעות על מסלולים וסקולריים, מה שמאפשר מחקרים מכניסטיים של דליפה וסקולרית בדלקת, בספסיס או בפגיעת איסכמיה-רפרופוזיה.
- קידום מותאם סיכונים: מספק נתונים אמפיריים על שינויים בחדירות כדי לסייע בבחירת מינון ובקביעת שולי בטיחות בפיתוח טיפולים המכוונים למערכת הדם.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה דרך זיהוי מובילים ועד להערכה פרה-קלינית, ובמיוחד עבור מודולטורים של חדירות כלי דם וחומרים להגנה על מחסומים.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות של רגולטורים מולקולריים (למשל, bradykinin, S1P) על ידי מדידת השפעתם הישירה על חדירות מים בכלי דם זעירים תחת תנאים מבוקרים.
- סריקה: מספק תכשירי כלי דם זעירים סטנדרטיים ומוכנים לבדיקה עם תוצאי LP כמותיים להערכת השפעות של תרכובות על תפקוד מחסום כלי הדם.
- אנליטיקה: מייצר ניתוח שיפוע-נקודת חיתוך של שטף נוזלים מול לחץ להסקת מוליכות הידראולית ולחץ אונקוטי אפקטיבי, מה שמאפשר ניתוח השוואתי של תנאים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין מנגנונים מולקולריים להחלפת נוזלים ברמת הרקמה, ובכך תומך בהתאמת סמנים ביולוגיים במודלים של דליפה כלי דם.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה רב-פעמית של פרפוזיה ואוקלוזיה שניתן ליישם על מטרות כלי דם ומודלים של מחלות שונים במזנטריום של חולדה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ביעדים וסקולריים על ידי הפחתת העמימות המכניסטית באמצעות מדידות חדירות ישירות.
- ערך תפעולי: מבטיח שחזוריות באמצעות שלבי קנולציה, פרפוזיה וחסימה סטנדרטיים עם בקרות זוגיות פנימיות.
- ערך אסטרטגי: משפר את איכות קבלת ההחלטות לגבי המשך או הפסקת הפיתוח (go/no-go) על ידי אספקת נתונים פונקציונליים על חדירות וסקולרית בשלב מוקדם של הגילוי.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעודוף מותאם סיכון של משני חדירות וסקולרית בהתבסס על נתונים אמפיריים של תגובת מיקרו-כלי דם.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות במיקרוסקופיה אינטרא-ויטלית (intravital microscopy), מיקרו-קנולציה ודיסקציה של מיקרו-כלי דם.
- תלוי בציוד ייעודי הכולל הנעה הידראולית, מיקרו-מניפולטורים ומנומטר מים לבקרת לחץ.
- מחייב סטנדרטיזציה של הרכב הפרפוזאט, הכנת תאי דם אדומים ומסבי חסימה בין משתמשים ומעבדות שונות.
- מוגבל למקטעים ונולריים ישרים ללא הסתעפויות; היישום מוגבל על ידי האנטומיה הווסקולרית במינים או במודלים מסוימים.
- תלוי במיומנות טכנית כדי למנוע נזק לדופן כלי הדם במהלך מחזורי חסימה ופרפוזיה חוזרים.
שאלות נפוצות על ביופארמה
Chapters in this video
0:05
Title
2:36
Preliminary Fabrication of Micropipettes, Restrainers, and Blockers
4:11
Arranging Mesentery Tissue and Identification of Microvessel
5:28
Fill Micropipiette and Mount in Holder
6:55
Microcannulation and Microvascular Pressure Measurement
8:26
Microocclusion and Collection of Data
9:43
Results: Microvessel Permeability Measurements
11:36
Conclusion
