במבחנה הדור של תאי דנדריטים Murine Plasmacytoid מנפוצים הלימפה אבות באמצעות מערכת מזין AC-6

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לספק שיטה יעילה להפקת תאי דנדריטים פלסמציטואידיים (PDCs) לצורך חקר התפתחותם. שיטה זו יכולה לסייע במענה על שאלות מפתח בתחום האימונולוגיה, כגון כיצד מווסת התפתחותם של PDCs. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת להשתמש במספר קטן של תאי פרוגניטור כדי להפיק ביעילות כמויות גדולות של PDCs.

להשלכות של טכניקה זו יש פוטנציאל לטיפול במחלות אוטואימוניות הקשורות ל-PDC, כגון לופוס מערכתי, אתטוזה ופסוריאזיס. הדגמת הפרוצדורה כיום תהיה תרומה גדולה לסטודנטים במעבדה. ביום שלפני קצירת תאי מחיתיים, זרעו תאי קו תאי סטרומלי AC6 בריכוז של 5.9 × 10⁴ תאים לבאר בבארים נפרדות של פלטות 12 באריים, והדגרימו את הפלטות בטמפרטורה של 37 °C ו-5% carbon dioxide למשך הלילה. למחרת בבוקר, הקרינו את תאי ה-AC6 בקרינת גמא במינון של 3000 rad והחליפו את מצע התרבית ב-1 mL של מצע מלא.

לאחר מכן, הניחו את המספר המתאים של עכברי C 57 black six בוגרים מסוג פרא (wild type) במגש ניתוח ועקרו את בעלי החיים ב-70% ethanol. לאחר מכן, העבירו את המגש למנדף חצי-סטרילי ובצעו חתכים במרכז הבטן של כל בעל חיים; הסירו את העור מהחלקים הדיסטליים, כולל הגפיים התחתונות, כדי לחשוף את ה-femurs וה-tibiae. גזרו את ה-femur מעל את מפרקי הברכיים ואת ה-tibiae מתחתיהם, והשתמשו במספריים כדי להפריד את השרירים מהעצמות תוך כדי איסופן. הניחו את העצמות בצלחת פטרי של 6 cm המכילה 5 mL של RPMI מלא, והעבירו את צלחת הפטרי למנדף תרבית סטרילי.

כעת מלאו מזרק של שלושה מיליליטר המצויד במחט Gauge 27 ב-RPMI מלא, והשתמשו במספריים כדי לחתוך את שני הקצוות של כל עצם. הכניסו את המחט לכל עצם ושטפו את המחית בעזרת הזרקה עדינה של RPMI מלא פעם אחת מכל קצה. לאחר מכן, ללא המחט, בצעו שאיבה והזרקה עדינה של התאים שלוש עד חמש פעמים בתוך כלי התרבית כדי ליצור סספנסיה של תאים בודדים.

לאחר סבוב של התאים בצנטריפוגה, יש לליית את כדוריות הדם האדומות עם מיליליטר אחד של CK buffer, ולהפסיק את התגובה באמצעות 10 נפחים של RPMI מלא. לאחר דקה אחת, יש להמתין חמש דקות עד שגושי התאים המתים וההסכמה ישקעו, ולאחר מכן למזוג בזהירות את הנוזל העליון לשפופרה חדשה. לאחר מכן, לאחר סבוב נוסף של התאים בצנטריפוגה, נשעה את כל תאי מחית העצם ב-100 microliters של fax buffer כדי לנתח את התאים הקדם-לימפואידיים הנפוצים (CLPs) באמצעות ציטומטריית זרימה.

בשלב הבא, חסמו את התאים באמצעות anti CD 16 to 32 למשך דקה עד שתיים, ולאחר מכן בצעו צביעה סימולטנית של התאים עם תערובת הנוגדנים המתאימה. לאחר 15 דקות על קרח, שטפו את התאים בשלושה מיליליטר של תמיפת fax buffer והשעיו שוב את המשקע ב-300 microliters של תמיפת fax buffer טרייה. לאחר מכן, סננו את תמיחת התאים דרך מסנן של 40 micrometer ומיינו את התאים באופן מיידי במכשיר flow cytometer תוך שימוש במסננים ובמתחים המתאימים.

איסוף התאים הרלוונטיים למבחנה בנפח 15 מיליליטר, המכילה שמונה מיליליטר של RPMI מלא. כדי להפיק אוכלוסיית PDCM מועשרת מאוד, זהו שלב קריטי למיין את אוכלוסיית ה-CLPs הנכונה מתאי מחול השומן שנאספו לצורך תרבית in vitro שלהם עם מערכת הזנה מסוג Z six. בסיום המיון, יש לסובב את התאים בצנטריפוגה ולסבב מחדש את משקע תאי ה-CLP בכמות מספיקה של RPMI מלא כדי להגיע לצפיפות תאים של כ-5 × 10⁴ תאים למילליליטר.

בשלב הבא, זרע 500 תאים לכל באר בתוך פלטת 12 הבארים המכילה את תאי המזינים AC six, והסב את תרביות המשותפות עם 100 nanograms per milliliter של ליגנד FL three; לאחר מכן, דגור את התאים בטמפרטורה של 37 degrees Celsius ו-5% carbon dioxide עם ניטור ויזואלי תקופתי של התפתחות התאים הדנדריטיים או ה-DC תחת מיקרוסקופ. ביום ה-12, קצור את התאים מנוזל העל של התרבית המשותפת ושטוף כל באר פעם אחת עם half a milliliter של מצע RPMI מלא, תוך איסוף של נוזל העל והשטיפות שנוצרו. לאחר מכן, הוסף half a milliliter של מצע טרי לכל באר והשתמש במגרד תאים כדי לנתק את התאים הדבקים.

שלבו את התאים שהסתרו עם התאים הצפים וסובבו בצנטריפוגה את תרחיף התאים שהתקבל. השעיו את המשקע ב-50 microliters של באפר fax. לאחר מכן, ספרו את התאים וצבעו אותם להערכת ביטוי של CD 11 C, CD 11 b ו-B two 20 לאחר חסימת FC.

כפי שהודגם זה עתה, ניתן לנתח את תאי התרבית המשותפת לנוכחות של אוכלוסיות DC מסוג conventional CD11c positive CD11b positive B220 negative ו-plasmacytoid CD11c positive CD11b negative B220 positive, בסך כולל של 4-6 × 10⁷. תאי מחול השתבץ מבודדים בדרך כלל מהפמורום (ירך) ומהטיבייה (שוק) של עכבר wild type C57BL/6 בן 6-8 שבועות, כאשר 5 × 10⁴ CLPs מתקבלים בדרך כלל מעכבר C57BL/6 אחד. לאחר מיון באמצעות פלוו-ציטומטריה כפי שהודגם זה עתה, בימים 3-4 של תרבית משותפת עם תאי מאכיל AC6, תאים יוצרי אזורי רצפות (cobblestone area forming cells) מתחילים להופיע, כאשר Plasmacytoid DC בעלי צורה עגולה מופיעים תלויים מעל התאים יוצרי אזורי הרצפות.

עד ליום השמיני, מספר ה-plasmacytoid DC מגיע לשיאו בסביב הימים 12 עד 14, נקודה שבה התאים מתחילים לעבור אפופטוזיס לאחר התפתחותם המלאה ומספרם מתחיל לרדת בהדרגה. מושבות של Conventional DC מופיעות מאוחר יותר, ביום השישי עד השמיני, והן הדבקות עם מורפולוגיה גדולה יותר בעלת צורה של ציר. ניתוח של פלואו-ציטומטריה מראה כי התרביות המשותפות מורכבות מ-91% CD11c positive, CD11b negative, B220 positive plasmacytoid DC, ו-6% CD11c positive, CD11b positive, B220 negative conventional DC, מה שמעיד על הרחבה של פי 100 במספר ה-plasmacytoid DC מאוכלוסיית ה-CLP המקורית בשיטה זו.

בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לוודא שתא ה-a c six נמצא במצב תקין ושהצפיפות של ה-C נכונה לפני הוספת ה-clp לאחר פיתוח. טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בביולוגיה של DC להתגבר על המגבלה של שימוש במספר קטן של מקרנים כדי לחקור את התפתחות ה-DC ממקרנים שונים. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובהB לגבי האופן שבו מייצרים PCs in vitro מתוך CLP באמצעות מערכת C six BEAT.