Name: במבחנה הדור של תאי דנדריטים Murine Plasmacytoid מנפוצים הלימפה אבות באמצעות מערכת מזין AC-6 (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-23T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 18 s
Description: למדו שיטה יעילה ליצירת תאי דנדריטים פלסמציטואידים (pDCs) באמצעות מערכת מאכלי AC-6 עם ליגנד Flt3. השיטה מאפשרת ייצור כמויות גדולות מתאי מקור מועטים לחקר אימונולוגיה ומחלות אוטואימוניות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

אנו מודים לבני זוג. מרקוס מנז ואירווינג וייסמן למתן חומרים כימיים. אנחנו גם מכירים את השירות הניתן על ידי Cytometric ניתוח הזרימה ותא מתקן המיון Core הראשון והמעבדה הליבה השנייה בלאומית טייוואן אוניברסיטת קולג &#39;של בית חולים לרפואה וNTU, בהתאמה. עבודה זו נתמכה על ידי משרד המדע והטכנולוגיה, טייוואן (רוב 102-2,320-B-002-030-MY3) ומכוני מחקר הבריאות הלאומי, טייוואן (NHRI-EX102-10256SI וNHRI-EX103-10256SI).

/ 6 עכברי wild-type C57BL נרכשו מהמרכז הלאומי בעלי החיים במעבדה (NLAC), טייוואן. כל העכברים התרבו וכל זמן תחת תנאי הפתוגן ללא ספציפיים. פרוטוקולים ונהלי שימוש בבעלי החיים היו נבדקו ואושרו על ידי ועדת הטיפול ושימוש בבעלי חיים המוסדיים של לאומית טייוואן המכללה לרפואה של האוניברסיטה (הרשאה מס &#39;: 20,120,075). בנוסף, חוקרים עשו כל מאמץ כדי לצמצם את הפוטנציאל לכאב, לסבל, או מצוקה בבעלי החיים בעת ביצוע ניסויים. כל ההליכים המתוארים בוצעו ב RT בכפפות. 1. הכנת AC-6 תאי מזין הערה: AC-6.21 (AC-6 בקיצור) שורת תאי סטרומה 18 (המסופקת על ידי י &#39;וייסמן, אוניברסיטת סטנפורד) יש לשמור בRPMI בתוספת 15% בסרום חום מומת שור עוברי (FBS). לשמש כתאים מזינים, AC-6 תאים עם 3,000 rad (30Gy) יום אחד לפני שיתוף התרבות למניעת תפוצתם מוקרן γ. ה הערהבAC-6 תאים נוטים לאבד את היכולת לתמוך ב- ההתמיינות שלהם אם נותרו צפוף בתחזוקה, או אם מספר המעבר שלהם הוא מעל 20. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף AC-6 תאים פעם אחת עם 1 מיליליטר פוספט שנאגר מלוח של Dulbecco (DPBS) ולהסיר DPBS על ידי שאיפה. פנק את AC-6 תאים עם 0.8 מיליליטר פתרון טריפסין (טריפסין 0.05% ו -0.5 מ&quot;מ EDTA בDPBS) במשך 3-5 דקות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 ולאחר מכן לעצור את התגובה על ידי דילול זה עם 10 כרכים של מדיום תרבות להפוך את ההשעיה תא בודדת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרע AC-6 תאים ב5.9x10 4 תאים / גם לתוך 12 גם צלחות ולדגור על 37 מעלות צלסיוס, 5% CO 2 O / N. הערה: הצפיפות של AC-6 תאים היא מאוד חשובה כמו צפיפות נמוכה תעדיף דור ה- CDC. זריעה בצפיפות של 5.9x10 4 תאים / גם יאפשר AC-6 כדי להגיע confluency ידי למחרת, שהוא אופטימלי לגזירה של pDCs מCLPs. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכשיר את AC-6 תאים ב3,000 רד (30 Gy) באמצעות γ-irradiator. הערה: המינון שניתן ללהקרין AC-6 הוא מותאם כדי למנוע את התאים ממתרבים ועדיין לשמור אותם קיימא מספיק זמן כדי לספק את ציטוקינים ומגע תאי תאים דרושים להתמיינות של DCs מCLPs. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינוני לשאוב ולהחליף עם 1 מיליליטר מלא RPMI (RPMI עם FBS מומת חום 10%, 50 מיקרוגרם / מיליליטר gentamycin וβ-mercaptoethanol 50 מיקרומטר). </li></ol> 2. תאים בודד בע&quot;מ מעכברים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקריב עכברים על ידי CO 2 מחנק ונקע בצוואר הרחם. מניחים את העכברים על מגש לנתיחה ולעקר עם 70% אתנול. עושה חתך באמצע הבטן-ולהסיר את העור מחלקו האחורי של העכבר כולל העור מכסה את הגפיים התחתונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח עכברים במכסת מנוע חצי סטרילי. כדי לשחרר את עצם הירך וtibiae, קליפ עצם הירך מעל ומתחת tibiae מפרק הברך. לנתק את השרירים מהעצמות באמצעות מספריים ולמקם את העצמות בצלחת פטרי 6 סנטימטר המכילה 5 מ&quot;ל להשלים RPMI. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור למכסת מנוע תרבות סטרילית. ממלאי מזרק 3 מיליליטר מחובר למחט 27G עם RPMI השלם. חותך את שני הקצוות של העצמות באמצעות מספריים, ולהכניס את מחט 27G כדי לשטוף את מוח מהעצמות בעדינות על ידי הזרקת RPMI השלם פעם אחת מכל קצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן השעיה תא בודדת על ידי pipetting העדין התאים למעלה ולמטה 3-5 פעמים בצלחת התרבות באמצעות המזרק ללא המחט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה התאים 5 דקות בXG 500 ולמזוג supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי דם אדום Lyse עם חיץ 1 מיליליטר ACK (150 מ&quot;מ NH 4 Cl, 10 מ&quot;מ KHCO 3, 0.1 מ&quot;מ EDTA) דוגרים דקות 1 ולעצור את התגובה על ידי דילול עם 10 כרכים של RPMI השלם. לאפשר לתאים לעמוד במשך 5 דקות כדי גלולה למטה גושי תאים מתים ופסולת רקמות על ידי כוח הכבידה. הערה: אל תעמוד יותר מ 5 דק &#39;כמו זה יגרום באובדן תא עקב שיקוע של תאי קיימא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> supernatant המכיל תא לאט למזוג לפסולת צינור עוזבת חדשהמאחורי בצינור המקורי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגות במשך 5 דקות ב XG 500 לגלולת התאים, ולאחר מכן להסיר ולבטל את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend כולל תאים בע&quot;מ (בדרך כלל 4-6 x 10 7 BM תאים מתקבלים מעכבר אחד) ב -100 μl חיץ FACS (1x PBS + 2% + 1 המ&quot;מ EDTA FBS). </li></ol> 3. FACS ניתוח ומיון של CLPs <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף אנטי-CD16 / 32 (2.4G2 שיבוט supernant hybridoma, 50 μl / תגובה או 1-2 מיקרוגרם / תגובה) לתאים במאגר FACS (שלב 2.9) במשך 1-2 דקות כדי לחסום קולטני Fc. הערה: אנטי-CD16 / 32 גם נקרא בלוק FC, אשר מתווסף למניעה מחייבת הלא ספציפית של נוגדנים לתאים לבטא קולטנים Fc כוללים גרנולוציטים, מונוציטים, ולימפוציטים מסוג B. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקביל להכתים תאים עם הנוגדנים הבאים ניאון שכותרתו צבע (ל4x10 7 תאים) במשך 15 דקות על קרח, הימנעות אור הסביבה. נוגדנים: סמני שושלת PE-מצומדת (0.2 מיקרוגרם לכל אחד) כולל אנטי-CD3 (17 א2), אנטי-CD8 (53-6.7), אנטי-B220 (RA3-6B2), אנטי-CD19 (eBio1D3), אנטי-CD11b (M1 / 70), אנטי-Gr-1 (RB6-8C5), אנטי Thy1.1 (HIS51), אנטי-NK1.1 (PK136), אנטי-TER119 (TER-119), ואנטי-MHC-II (נימר-4), 0.2 מיקרוגרם אנטי-ג-קיט-PerCP-Cy5.5 (2B8), 1 מיקרוגרם אנטי SCA-1-FITC (D7), 0.4 מיקרוגרם אנטי-M-CSFR-APC (AFS98), ושל 0.2 מיקרוגרם אנטי-IL-7Rα-PE-Cy7 (A7R34). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את תאים עם FACS חיץ 3 מיליליטר, וצנטריפוגות במשך 5 דקות ב 500 x גרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תאי 300 FACS μl חיץ ותאי סינון דרך מסננת תא 40 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את הצינור עם חיץ FACS 100 μl נוסף להתאושש כל תאים הנותרים ולסנן לFACS סטרילי מיון צינור תוך שימוש באותה מסננת תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע ניתוח התזרים cytometric מייד לאחר הצביעה באמצעות מסננים ומתחים מתאימים לגילוי אות. השתמש 488 ננומטר לייזר כדי לזהות את הנוגדנים שכותרת PerCP-Cy5.5 FITC-,, 561 ננומטר לייזר כדי לזהות פטרוביץ, ונוגדני PE-labelded-Cy7 ואס 633 ננומטראה לזהות את הנוגדן שכותרתו APC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיין את CLPs פי הסמנים הבאים לין - SCA-1 int M-CSFR int c-kit - IL-7Rα + (כמוכתם בשלב 3.2) באמצעות סדרן תא. לאסוף תאים הממוינים בצינור 15 מיליליטר המכיל 8 מיליליטר של RPMI מלא ככרית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשום את המספר המוחלט של תאים ממוינים, כפי שמוצג על ידי סדרן התא בסוף הריצה. בדרך כלל, ניתן להשיג 5x10 4 CLPs מBM של עכבר אחד. </li></ol> 4. CLPs וCoculture AC-6 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה תאים הממוינים מצעד 3.7 במשך 10 דקות ב 500 XG, להסיר את supernatant וresuspend התא גלולה עם מספיק RPMI השלם כדי להשיג צפיפות תאים סביב 5x10 מיליליטר / 4 תאים. תאי זרע 500 / גם לתוך הצלחת 12-המכילה גם תאים מזינים מוכנים בשלב 1.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 ng / ml FL 19 (הו-Flt3L איג שנוצר בבית באמצעות מערכת ביטוי הניתנת על ידי מ &#39;מנז, Universiטאי החולים ציריך, שווייץ) ולדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 עם ניטור חזותי תקופתי של פיתוח DC תחת מיקרוסקופ. הערה: FL האנושי רקומביננטי ניתן להשיג בחנויות או עכבר פלורידה יכולה לשמש כתחליף לhu-Flt3L איג לתמוך בפיתוח DC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את התאים בsupernatant ביום 12 ולשטוף את הבארות פעם אחת עם 0.5 מ&quot;ל להשלים בינוני RPMI שילוב supernatants וכתוצאה מכך. הוסף 0.5 מיליליטר בינוני טרי וגרוטאות התאים חסיד עם מגרד תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את המדיום המכיל תאים משני החלקים וצנטריפוגות במשך 5 דקות ב 500 x גרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי supernatant ו resuspend למזוג במאגר FACS 50 μl. להוסיף אנטי-CD16 supernatant 50 μl / 32 hybridoma דגירה במשך 1-2 דקות כדי לחסום קולטני Fc. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למנות ולהכתים את כל התאים עם הנוגדנים הבאים (0.05 מיקרוגרם לכל אחד) נגד CD11c-APC (N418), אנטי-CD11b-FITC, ואנטי-B220-PE. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף ו צנטריפוגות התאים כמו לתארד בשלב 3.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תאי 100 μl FACS חיץ, שער ב+ CD11c ולנתח לcDCs (CD11c + CD11b + B220 -) וpDCs (CD11c + CD11b - + B220) 17. </li></ol>

<ol><li>Hartwig, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fcgamma+receptor-mediated+antigen+uptake+by+lung+DC+contributes+to+allergic+airway+hyper-responsiveness+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Fcgamma receptor-mediated antigen uptake by lung DC contributes to allergic airway hyper-responsiveness and inflammation.</a> Eur. J. Immunol. 40, 1284-1295 (2010).</li>
<li>Merad, M., Sathe, P., Helft, J., Miller, J., Mortha, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dendritic+cell+lineage%3A+ontogeny+and+function+of+dendritic+cells+and+their+subsets+in+the+steady+state+and+the+inflamed+setting%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The dendritic cell lineage: ontogeny and function of dendritic cells and their subsets in the steady state and the inflamed setting.</a> Annu. Rev. Immunol. 31, 563-604 (2013).</li>
<li>Mildner, A., Jung, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+Function+of+Dendritic+Cell+Subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Development and Function of Dendritic Cell Subsets.</a> Immunity. 40, 642-656 (2014).</li>
<li>Swiecki, M., Colonna, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+the+functions+of+plasmacytoid+dendritic+cells+during+viral+infections%2C+autoimmunity%2C+and+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Unraveling the functions of plasmacytoid dendritic cells during viral infections, autoimmunity, and tolerance.</a> Immunol. Rev. 234, 142-162 (2010).</li>
<li>Liu, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IPC%3A+professional+type+1+interferon-producing+cells+and+plasmacytoid+dendritic+cell+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">IPC: professional type 1 interferon-producing cells and plasmacytoid dendritic cell precursors.</a> Annu. Rev. Immunol. 23, 275-306 (2005).</li>
<li>Merad, M., Manz, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cell+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Dendritic cell homeostasis.</a> Blood. 113, 3418-3427 (2009).</li>
<li>Ghosh, H. S., Cisse, B., Bunin, A., Lewis, K. L., Reizis, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+expression+of+the+transcription+factor+e2-2+maintains+the+cell+fate+of+mature+plasmacytoid+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Continuous expression of the transcription factor e2-2 maintains the cell fate of mature plasmacytoid dendritic cells.</a> Immunity. 33, 905-916 (2010).</li>
<li>Karsunky, H., Merad, M., Cozzio, A., Weissman, I. L., Manz, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flt3+ligand+regulates+dendritic+cell+development+from+Flt3%2B+lymphoid+and+myeloid-committed+progenitors+to+Flt3%2B+dendritic+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Flt3 ligand regulates dendritic cell development from Flt3+ lymphoid and myeloid-committed progenitors to Flt3+ dendritic cells in vivo.</a> J. Exp. Med. 198, 305-313 (2003).</li>
<li>Manz, M. G., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L., Akashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cell+potentials+of+early+lymphoid+and+myeloid+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Dendritic cell potentials of early lymphoid and myeloid progenitors.</a> Blood. 97, 3333-3341 (2001).</li>
<li>D'Amico, A., Wu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+early+progenitors+of+mouse+dendritic+cells+and+plasmacytoid+predendritic+cells+are+within+the+bone+marrow+hemopoietic+precursors+expressing+Flt3%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">The early progenitors of mouse dendritic cells and plasmacytoid predendritic cells are within the bone marrow hemopoietic precursors expressing Flt3.</a> J. Exp. Med. 198, 293-303 (2003).</li>
<li>Sathe, P., Vremec, D., Wu, L., Corcoran, L., Shortman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convergent+differentiation%3A+myeloid+and+lymphoid+pathways+to+murine+plasmacytoid+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Convergent differentiation: myeloid and lymphoid pathways to murine plasmacytoid dendritic cells.</a> Blood. 121, 11-19 (2013).</li>
<li>Shigematsu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmacytoid+dendritic+cells+activate+lymphoid-specific+genetic+programs+irrespective+of+their+cellular+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Plasmacytoid dendritic cells activate lymphoid-specific genetic programs irrespective of their cellular origin.</a> Immunity. 21, 43-53 (2004).</li>
<li>Reizis, B., Bunin, A., Ghosh, H. S., Lewis, K. L., Sisirak, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmacytoid+dendritic+cells%3A+recent+progress+and+open+questions%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Plasmacytoid dendritic cells: recent progress and open questions.</a> Annu. Rev. Immunol. 29, 163-183 (2011).</li>
<li>Inaba, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+large+numbers+of+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow+cultures+supplemented+with+granulocyte%2Fmacrophage+colony-stimulating+factor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor.</a> J. Exp. Med. 176, 1693-1702 (1992).</li>
<li>Naik, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+plasmacytoid+and+conventional+dendritic+cell+subtypes+from+single+precursor+cells+derived+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Development of plasmacytoid and conventional dendritic cell subtypes from single precursor cells derived in vitro and in vivo.</a> Nat. Immunol. 8, 1217-1226 (2007).</li>
<li>Onai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+clonogenic+common+Flt3%2BM-CSFR%2B+plasmacytoid+and+conventional+dendritic+cell+progenitors+in+mouse+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Identification of clonogenic common Flt3+M-CSFR+ plasmacytoid and conventional dendritic cell progenitors in mouse bone marrow.</a> Nat. Immunol. 8, 1207-1216 (2007).</li>
<li>Chen, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+type+I+IFN-Flt3+ligand+axis+augments+plasmacytoid+dendritic+cell+development+from+common+lymphoid+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">A type I IFN-Flt3 ligand axis augments plasmacytoid dendritic cell development from common lymphoid progenitors.</a> J. Exp. Med. 210, 2515-2522 (2013).</li>
<li>Whitlock, C. A., Tidmarsh, G. F., Muller-Sieburg, C., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow+stromal+cell+lines+with+lymphopoietic+activity+express+high+levels+of+a+pre-B+neoplasia-associated+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Bone marrow stromal cell lines with lymphopoietic activity express high levels of a pre-B neoplasia-associated molecule.</a> Cell. 48, 1009-1021 (1987).</li>
<li>Onai, N., Obata-Onai, A., Tussiwand, R., Lanzavecchia, A., Manz, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+Flt3+signal+transduction+cascade+rescues+and+enhances+type+I+interferon-producing+and+dendritic+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Activation of the Flt3 signal transduction cascade rescues and enhances type I interferon-producing and dendritic cell development.</a> J. Exp. Med. 203, 227-238 (2006).</li>
<li>Szilvassy, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukemia+inhibitory+factor+upregulates+cytokine+expression+by+a+murine+stromal+cell+line+enabling+the+maintenance+of+highly+enriched+competitive+repopulating+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Leukemia inhibitory factor upregulates cytokine expression by a murine stromal cell line enabling the maintenance of highly enriched competitive repopulating stem cells.</a> Blood. 87, 4618-4628 (1996).</li>
<li>Arcanjo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+characterization+of+heparan+sulfate+derived+from+murine+hemopoietic+stromal+cell+lines%3A+a+bone+marrow-derived+cell+line+S17+and+a+fetal+liver-derived+cell+line+AFT024%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Biochemical characterization of heparan sulfate derived from murine hemopoietic stromal cell lines: a bone marrow-derived cell line S17 and a fetal liver-derived cell line AFT024.</a> J. Cell. Biochem. 87, 160-172 (2002).</li>
<li>Onai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clonogenic+progenitor+with+prominent+plasmacytoid+dendritic+cell+developmental+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">A clonogenic progenitor with prominent plasmacytoid dendritic cell developmental potential.</a> Immunity. 38, 943-957 (2013).</li>
<li>Whitlock, C. A., Muller-Sieburg, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+B-lymphoid+cultures+from+murine+bone+marrow+establishment+and+cloning+by+using+stromal+cell+line+AC+6.21%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Long-term B-lymphoid cultures from murine bone marrow establishment and cloning by using stromal cell line AC 6.21.</a> Methods Mol. Biol. 75, 231-248 (1997).</li>
<li>Chen, Y. -L., Chang, S., Chen, T. -T., Lee, C. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Generation+of+Plasmacytoid+Dendritic+Cell+from+Common+Lymphoid+Progenitors+by+Flt3+Ligand%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Efficient Generation of Plasmacytoid Dendritic Cell from Common Lymphoid Progenitors by Flt3 Ligand.</a> PLoS ONE. 10 (8), e0135217(2015).</li>
</ol>

לסופרים אין מה לחשוף.

כאן אנו מתארים מערכת במבחנה תרבות לדור החזקה של DCS, וpDCs בפרט, ממספר קטן של CLPs. ייחודה של מערכת זו התרבות הוא עקב השימוש של AC-6 תאים, שורת תאי סטרומה, כהאכלה. גישה זו הוכחה לספק לא רק ציטוקינים, כגון IL-7, SCF, M-CSF ופלורידה 20, אלא גם את קשר תאי תאים 21 הדרוש כדי לתמוך בפיתוח DC. AC-6 תאים כבר השתמש בעבר כדי להקל על הלימוד במבחנה פיתוח DC מכמה אבות 8,16,22. מצאנו שזה קריטי לזרע צפיפות אופטימלית של תאי AC-6 מזין לתמוך בידול ...

תאים דנדריטים (DCS) הם תאי מציגי אנטיגן מקצועיים שמשחקים תפקיד חשוב בשליטה על תגובות 1 חיסונית. בעוד DCs הוא הטרוגנית, הם יכולים להיות מסווגים באופן כללי לשתי אוכלוסיות, DCS קונבנציונלי (cDCs) וDCs plasmacytoid (PDC) 2,3. בנוסף לאיברי הלימפה, cDCs וpDCs נמצאים גם ברקמות כוללים סרטן ריאות, מעי, ועור 2. המורפולוגיה של cDCs וpDCs שונה, עם cDCs מציג תחזיות כמו דנדריט-והצורה של pDCs להיות כמו תא-יותר פלזמה. בנוסף, סמן העכבר הנפוץ DC, CD11c, באה לידי ביטוי גבוה יותר על cDCs מאשר על pDCs. יתר על כן, cDCs ניתן לחלק עוד יותר לתוך CD11b + CD24 - cDCs וCD11b - CD24 + cDCs, אשר שניהם מבטאים רמות גבוהות יותר של כיתת MHC II ומולקולות costimulatory מאשר לעשות pDCs 2. pDCs מבוגרים, לעומת זאת, הוכח להביע Siglec-H וBST2 4 סלקטיבי. Functionally, cDCs הוא אנטיגן טוב יותר מאשר הצגת תאי pDCs; עם זאת, pDCs יכול לייצר כמות עצומה של סוג אני אינטרפרון על זיהום בנגיף או גירוי דלקתי 5. cDCs וpDCs שניהם קצרים, ולכן, חייב להתחדש כל הזמן מאבות במח העצם (BM) 6,7. העברת מאמצת של אבות משותפים מיאלואידית (CMPS) ואבות הלימפה נפוצים (CLPs) לעכברים קטלני-המוקרנים מוכיחה כי יכולים להיות שנוצרו cDCs וpDCs משני השושלות 8-10. עם זאת, יש קבוצת משנה של pDCs המבטא RAG1 / 2 ויש מגזרי DJ מחדש במוקד IGH 11,12. תאים אלה גם לשתף דמיון מולקולרי עם לימפוציטים מסוג B, כוללים ביטוי של סמן B220, קולטני חישת חומצות גרעין (TLR7 / TLR9), וגורמי שעתוק (Spib וBcl11a) 13, כולל את כל האמינו להיות חתימות של השושלת הלימפה. לכן, CLPים עשוי להיות בחירה טובה עבור דור במבחנה של pDCs בגלל דמיון שושלת. בעוד התדירות של שני cDCs וpDCs בבני אדם ועכברים היא מאוד נמוכה 6 פלורידה, DCS, במיוחד cDCs, יכול להיות שנוצר במבחנה מBM או אבות בנוכחות ציטוקינים, כגון GM-CSF 11,14 או יגנד FLT3 ( ) באמצעות מערכות ללא מזין 11,15,16. למרבה הצער, עם זאת, לא ניתן לייצר מספר גדול של pDCs במבחנה באמצעות FL 11,15,16. בעבר הראה כי pDCs יכול להיות שנוצר במבחנה ביעילות מCLPs באמצעות מערכת המזין AC-6 17. היתרון של שימוש בקו תא סטרומה AC-6 במערכת התרבות הוא שהיא מספקת מגע תאי תאים והפרשה של ציטוקינים התומכים בדור של מספר הגדול של pDCs מCLPs. למרות שייצור עם מערכת זו הוא די חזק, השכפול זהיר של ההליכים המתוארים להלן נדרש אניכדי n כדי להבטיח דור יעיל של pDCs.

<table><tbody><tr><td>נגד עכבר Ly6g/Ly6c (PE), שיבוט RB6-8C5</td><td>Biolegend</td><td>108408</td><td>סמן שושתן</td></tr><tr><td>נגד עכבר NK1.1 (PE), שיבוט PK136</td><td>Biolegend</td><td>108708</td><td>סמן שושין</td></tr><tr><td>נגד עכבר&nbsp; CD11b (PE), שיבוט M1/70</td><td>Biolegend</td><td>101208</td><td>סמן שושלת</td></tr><tr><td>נגד עכבר CD19 (PE), שיבוט eBio1D3</td><td>Biolegend</td><td>115508</td><td>סמן שושלת</td></tr><tr><td>נגד עכבר B220 (PE), שיבוט RA3-6B2</td><td>Biolegend</td><td>103208</td><td>סמן שושלת/FACS</td></tr><tr><td>נגד עכבר CD3 (PE), שיבוט 17A2</td><td>Biolegend</td><td>100308</td><td>סמן שושלת</td></tr><tr><td>נגד עכבר CD8a (PE), שיבוט 53-6.7</td><td>Biolegend</td><td>100707</td><td>סמן שושלת</td></tr><tr><td>נגד עכבר MHC-II (PE), שיבוט NIMR-4</td><td>Biolegend</td><td>107608</td><td>סמן שושנת</td></tr><tr><td>נגד עכבר Ter119 (PE), שיבוט TER-119</td><td>Biolegend</td><td>116208</td><td>סמן שושלת</td></tr><tr><td>נגד עכבר Thy1.1 (PE), שיבוט HIS51</td><td>eBioscience</td><td>12-0900-83</td><td>סמן שושנת</td></tr><tr><td>נגד עכבר M-CSFR (APC), שיבוט AFS98</td><td>Biolegend</td><td>135510</td><td>FACS</td></tr><tr><td>ערכת c-Kit נגד עכבר (PerCP/Cy5.5), שיבוט 2B8</td><td>Biolegend</td><td>105824</td><td>FACS</td></tr><tr><td>Anti-mouse Sca-1 (FITC), שיבוט D7</td><td>Biolegend</td><td>108106</td><td>FACS</td></tr><tr><td>נגד עכבר IL-7Ra (PE/Cy7), שיבוט A7R34</td><td>Biolegend</td><td>135014</td><td>FACS</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD11c (PerCP/Cy5.5), שיבוט N418</td><td>Biolegend</td><td></td><td>117328-FACS</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD11b (FITC), שיבוט M1/70</td><td>Biolegend</td><td>101206</td><td></td></tr><tr><td>FACS FACSAria III</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>צינור</td></tr><tr><td>מיון תאים FACS&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>FlowJo LLC</td><td></td><td>תוכנת ניתוח זרימה</td></tr></tbody></table>

במבחנה הדור של תאי דנדריטים murine plasmacytoid מנפוצים הלימפה אבות באמצעות מערכת מזין ac-6

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

תאים הדנדריטים Plasmacytoid (PDC) הם סוג חזק אני אינטרפרון תאים (IFN-I) ייצור המופעלים בתגובה לזיהום או בתגובות דלקתיות. למרבה הצער, מחקר של פונקצית PDC מתעכבת לפי התדירות הנמוכה שלהם באיברי הלימפה, ושיטות קיימות במבחנת דור DC בעיקר להעדיף הייצור של cDCs על pDCs. כאן אנו מציגים גישה ייחודית ליצירת יעילות pDCs מאבות הלימפה נפוצים (CLPs) במבחנה. באופן ספציפי, הפרוטוקול מתואר פרטים כיצד לטהר CLPs ממח עצם וליצור pDCs ידי coculturing עם AC-6 תאים מזינים מוקרן γ בנוכחות יגנד FLT3. מאפיין ייחודי של מערכת זו התרבות הוא שCLPs להעביר מתחת לAC-6 תאים ולהפוך לתאי יוצרי שטח מרוצפים, צעד קריטי להרחבת pDCs. DCs מורפולוגית המובהק, כלומר pDCs וcDCs, נוצרו לאחר כ -2 שבועות עם הרכב של 7pDCs 0-90% בתנאים אופטימליים. בדרך כלל, מספר pDCs שנוצר בשיטה זו הוא בערך פי 100 ממספר CLPs זרע. לכן, מדובר במערכת חדשנית שבה ליצירה וחסונה המספר הגדול של pDCs הנדרש כדי להקל על מחקרים נוספים להתפתחות והתפקוד של תאים אלה.

כולל של 4-6x10 7 תאים BM מבודדים בדרך כלל מעצמות ירך וtibiae של C57BL / 6 עכבר אחד 6-8 WK-ישן, wild-type. כדי למיין את CLPs, הכולל תאי BM מגואלות נוגדני PE מצומדות נגד סמני שושלת (CD3, CD8, B220, CD19, CD11b, Gr-1, Thy1.1, NK1.1, TER119, וMHC-II), אנטי -c-קיט-PerCP / Cy5.5, אנטי SCA-1-FITC, אנטי-M-CSFR-APC ואנטי-IL-7Rα-PE / Cy7, ניתחו ומסודרים עם סדרן תא. אסטרטגית המיון לCLP מוצגת באיור 1. בדרך כלל, 5x10 4 CLPs מתקבל מC57BL אחד / 6 עכבר. כדי ...

במחקר זה אנו מציגים מערכת תרבית במבחנה שיכולה לייצר ביעילות pDCs על ידי תרבית משותפת של אבות לימפואידים נפוצים עם תאי הזנה AC-6 בנוכחות ליגנד Flt3.

במבחנה הדור של תאי דנדריטים Murine Plasmacytoid מנפוצים הלימפה אבות באמצעות מערכת מזין AC-6

Plasmacytoid dendritic cells (pDCs) are powerful type I interferon (IFN-I) producing cells that are activated in response to infection or during ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לספק שיטה יעילה להפקת תאי דנדריטים פלסמציטואידיים (PDCs) לצורך חקר התפתחותם. שיטה זו יכולה לסייע במענה על שאלות מפתח בתחום האימונולוגיה, כגון כיצד מווסת התפתחותם של PDCs. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת להשתמש במספר קטן של תאי פרוגניטור כדי להפיק ביעילות כמויות גדולות של PDCs.להשלכות של טכניקה זו יש פוטנציאל לטיפול במחלות אוטואימוניות הקשורות ל-PDC, כגון לופוס מערכתי, אתטוזה ופסוריאזיס. הדגמת הפרוצדורה כיום תהיה תרומה גדולה לסטודנטים במעבדה. ביום שלפני קצירת תאי מחיתיים, זרעו תאי קו תאי סטרומלי AC6 בריכוז של 5.9 × 10⁴ תאים לבאר בבארים נפרדות של פלטות 12 באריים, והדגרימו את הפלטות בטמפרטורה של 37 °C ו-5% carbon dioxide למשך הלילה. למחרת בבוקר, הקרינו את תאי ה-AC6 בקרינת גמא במינון של 3000 rad והחליפו את מצע התרבית ב-1 mL של מצע מלא.לאחר מכן, הניחו את המספר המתאים של עכברי C 57 black six בוגרים מסוג פרא (wild type) במגש ניתוח ועקרו את בעלי החיים ב-70% ethanol. לאחר מכן, העבירו את המגש למנדף חצי-סטרילי ובצעו חתכים במרכז הבטן של כל בעל חיים; הסירו את העור מהחלקים הדיסטליים, כולל הגפיים התחתונות, כדי לחשוף את ה-femurs וה-tibiae. גזרו את ה-femur מעל את מפרקי הברכיים ואת ה-tibiae מתחתיהם, והשתמשו במספריים כדי להפריד את השרירים מהעצמות תוך כדי איס

in-vitro-generation-murine-plasmacytoid-dendritic-cells-from-common

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

וידאו זה מדגים את נוהל המבדילים תאים דנדריטים מיאלואידית ממח העצם העכבר. בידוד של השוקה העכבר הירך, ועיבוד של מח העצם הם הפגינו. תמונות הוכחת מורפולוגיה תא לפני ואחרי בידול, דמויות המתארות פנוטיפ התא IL-12 בייצור התבגרות הבאות באמצעות CPG מוצגים.

התרבות של תאים דנדריטים מיאלואידית מ מבשרי מח עצם

מצגת Antigen באיברים הלימפה משני על ידי התאים הדנדריטים הוא קריטי עבור ייזום של תא T בתיווך תגובה חיסונית אדפטיבית. כאן אנו מדגימים את התרבות של מוח העצם נגזר תאים דנדריטים Murine, הפעלה, וסימון עבור הדמיה 2-פוטון.

הדור של מח עצם נגזר תאים דנדריטים Murine לשימוש 2-פוטון הדמיה

סרטון זה מתאר פרוטוקול ליצירת תאים דנדריטיים - תאים מציגי אנטיגן מרכזיים המפעילים תאי T - ממח העצם של עכבר בוגר.

יצירת תאים דנדריטיים שמקורם במח עצם: שיטה ליצירת תאים דנדריטיים ממח עצם עכבר

מקור: Cruz-Adalia, A., et al. תאי T לוכדים חיידקים על ידי זיהום מתאים דנדריטיים. J. Vis. Exp. (2016).סרטון זה מדגים טרנס-זיהום חיידקי באמצעות אינטראקציות ספציפיות לאנטיגן בין תאי T לתאים דנדריטיים. תאים דנדריטיים נגועים בחיידקים המציגים פפטיד אובאלבומין מודגרים עם תאי T, ישירות או מופרדים על ידי ממברנה. מגע ישיר מאפשר היווצרות סינפסות אימונולוגיות, המאפשרת העברת חיידקים, בעוד הממברנה מונעת אינטראקציה. לאחר מכן נעשה טיפול בגנטמיצין כדי לחסל חיידקים חוץ-תאיים.

זיהום חיידקי במבחנה של תאי T באמצעות היווצרות סינפסה אימונולוגית

סרטון זה מדגים בדיקת מבחנה ליצירת תאים דנדריטיים פלסמקיטואידים (pDCs) מתאי אב לימפואידים נפוצים (CLPs). לאחר תרבית משותפת של CLPs מטוהרים עם תאי הזנה מוקרנים γ בנוכחות ליגנד טירוזין קינאז-3 דמוי FMS (FL), CLPs מתמיינים ל-pDCs שאינם דבקים, שנוכחותם מאושרת באמצעות ציטומטריית זרימה.

דור חוץ גופי של תאים דנדריטיים פלסמציטואידים מאבות לימפואידים נפוצים

סרטון זה מדגים את יצירתם של תאים דנדריטיים לא בוגרים, בוגרים וסובלוגניים, או DCs, ממונוציטים אנושיים. הדגירה של מונוציטים עם גורמי גדילה וציטוקינים מובילה לייצור DCs לא בוגרים. בתגובה למולקולות ויסות חיסוניות, DCs לא בשלים מתמיינים ל-DCs סובלרוגניים ובוגרים.

יצירת תאים דנדריטיים לא בוגרים, בוגרים וסובלניים ממונוציטים

השיטה הנפוצה ביותר להפקת כמויות גדולות של תאים דנדריטים אוטולוגי (DCS) לשימוש באימונותרפיה גידול מתוארת. השיטה משתמשת IL-4 ו-GM-CSF להבדיל מDCs מונוציטים. את DCs הבוסר הוא גירוי לבוגרת ולאחר מכן נטען עם אנטיגנים לפני שהם מוזרקים חזרה לחולה.

הכנת תאים דנדריטים גידול Antigen טעון בוגרים לחיסוניים

פרוטוקול זה מתאר הפרוצדורות על מנת להעריך את ההתמיינות של תאים הדנדריטים plasmacytoid בתיקון של Peyer מאבות תא הדנדריטי משותפים, תוך שימוש בטכניקות הכוללות בידוד בתיווך FACS תא, העברת גנים הידרודינמית, וניתוח זרימה של תת חיסון בתיקון של Peyer.

הערכת התפתחותם של תאי Murine Plasmacytoid דנדריטים בתיקונים של Peyer באמצעות העברת מאמצת של אבות Hematopoietic

תת-קבוצות תאים דנדריטיות נפרדות קיימות כאוכלוסיות נדירות באיברי לימפה, ולכן הן מאתגרות לבידוד במספרים ובטוהר מספיקים לניסויים אימונולוגיים. כאן אנו מתארים שיטת יעילות גבוהה ותפוקה גבוהה לבידוד של כל תת-הקבוצות העיקריות הידועות כיום של תאים דנדריטיים של טחול עכבר.

שיטת תשואה יעילה גבוהה עבור בידוד של תת תא העכבר דנדריטים

ניתן להתמיין באופן סלקטיבי לתאים דנדריטיים טולרוגניים או בוגרים כדי לווסת את האיזון בין חסינות לסבילות. עבודה זו מציגה אמצעי ליצירת תאים דנדריטיים לא בשלים שמקורם במונוציטים (moDCs), moDCs טולרוגניים ובוגרים במבחנה הנבדלים זה מזה בפנוטיפים מטבוליים.

הדור של בוגר, בוגרת Tolerogenic דנדריטים תאים, עם שינוי פנוטיפים מטבולית

מאמר זה מתאר את השיטה הרומן לייצר אנטיגן הגידול-ספציפי המושרה ביותר תאים גזע מהגרים הרתי (iTE) על ידי תלת מימדי (3D) מערכת התרבות הרתי. iTE הינם תת-קבוצה הומוגנית של תאי T הקשורים היטב לתאי T תמימים עם יכולת התפשטות, היווצרות הזיכרון ודיכוי הגידול.

תלת מימדי הרתי תרבות מערכת לייצר Murine המושרה תא גזע Pluripotent-הגידול הנגזר אנטיגן-מהגרים ספציפיים הרתי

למדו שיטה יעילה ליצירת תאי דנדריטים פלסמציטואידים (pDCs) באמצעות מערכת מאכלי AC-6 עם ליגנד Flt3. השיטה מאפשרת ייצור כמויות גדולות מתאי מקור מועטים לחקר אימונולוגיה ומחלות אוטואימוניות.

במבחנה הדור של תאי דנדריטים Murine Plasmacytoid מנפוצים הלימפה אבות באמצעות מערכת מזין AC-6

גלה סרטונים נוספים