בידוד של המיטוכונדריה מכמויות מינימליות של שרירי שלד עכבר למדידות תפוקה גבוהה microplate נשימה

המטרה הכוללת של מאמר וידאו זה היא לבודד מיטוכונדריה באיכות גבוהה מכמויות קטנות של שרירי שלד עכבר לשימוש במבחני טריקים מבוססי מיקרו-פלטות. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח במחקר ביו-רפואי, כגון תיאור כיצד תרופות וחלבונים מסוימים מווסתים את שרירי השלד, צריכת החמצן המיטוכונדריאלית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לבודד מיטוכונדריה באיכות גבוהה מכמויות קטנות יותר של שרירי שלד עכבר ממה שדווח בעבר.

לבצע המתת חסד של העכבר בהתאם להנחיות המוסד. לאחר מכן מקם את העכבר על צדו והשתמש במספריים עדינים כדי לבצע חתך בעור. כיסוי האפיקונדיל הרוחבי של עצם הירך.

קלף את העור לכיוון העכבר, ולאחר מכן הסר את כרית השומן הממוקמת מעל נקודת המוצא של הארבע ראשי. לאחר מכן, חותכים את גיד הארבע ראשי המחובר לפיקה. חתוך לאט את נוירוזה האפו בין העצם לארבע ראשי תוך הימנעות מעורק הירך.

לאחר מכן חותכים את הגיד בנקודת המוצא על עצם הירך כדי לשחרר את שריר הארבע ראשי ולהניח את שריר הארבע ראשי לתוך PBS צונן. הסר כל רקמת שומן גלויה מעל הארבע ראשי באמצעות מספריים. לאחר הניקוי, הפוך את הארבע ראשי כך שחלק השריר שכיסה את עצם הירך פונה כלפי מעלה.

פתח את שריר הארבע ראשי בעזרת מלקחיים בתנועת מניפה. הסר את שני חלקי השריר האדומים הנראים לעין מכל אונה והניח אותם בכוס המכילה חמישה מיליליטר של מיטוכונדריה צוננת. מאגר בידוד.

לאחר מכן, חותכים את העור מעל גיד אכילס במספריים עדינים ומקלפים את העור לכיוון העכבר. חותכים את גיד אכילס החשוף ומקלפים את השריר לכיוון גוף העכבר. חותכים את הגיד בקונדיל הצדדי והמדיאלי של עצם הירך כדי לשחרר את הגסטרוקנמיוס ומניחים את הגסטרוקנמיוס המחובר לגידים שלו בצלחת מלאה ב-PBS צונן.

הפוך את הגסטרוקנמיוס וקילף את שריר הסוליה. הכניסו את שריר הסוליה לכוס המכילה חמישה מיליליטר של מיטוכונדריה צוננת. מאגר בידוד.

מאוורר אחד הבא פתח את הגסטרוק והוציא את שלושת חלקי השריר האדומים החזותיים. יהיו שני חלקים רוחביים ורצועה אדומה שטחית מדיאלית אחת. לאחר הבידוד, העבירו את השריר האדום לכוס המכילה חמישה מיליליטר של מיטוכונדריה צוננת.

מאגר בידוד אחד. הסר עוד 75 עד 100 מיליגרם של שריר אדום מהרגל השנייה של העכבר. חזרה על התהליך שזה עתה הוצג.

הנח את השריר המנותח מהרגל השנייה לתוך צינור מיקרו צנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר עם קוקטייל מעכב הפרוטאז והפוספטאז ומאגר ליזיס תאים שהוכן כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה. הבזק מיד, הקפיא את הדגימה השנייה בחנקן נוזלי לשימוש בכתמים מערביים. הניחו משטח פלסטיק שטוח שנרפא מראש על קרח בדלי גדול.

לאחר מכן שפכו טיפה של חוצץ בידוד מיטוכונדריה על משטח הפלסטיק, והשתמשו בפינצטה כדי למקם את כל השריר האדום המחולק לתוך טיפת בידוד. מאגר. טחנו את רקמת השריר במשך שתי דקות בעזרת סכיני גילוח חד קצה, החליפו לסכין גילוח חד חדש כל 40 שניות. מעבירים את הרקמה הטחונה לכוס חדשה עם חמישה מיליליטר מיטוכונדריה טרייה.

מאגר בידוד אחד. לאחר מכן קח את התמיסה ונקז אותה דרך מסננת תאים של 100 מיקרון, המונחת על צינור חרוטי של 50 מיליליטר. כתם את הרקמה במגב משימה עדין, ולאחר מכן העביר אותה לחמישה מיליליטר של תמיסת טריין של 0.05%.

השתמש בפינצטה כדי להסיר את כל הרקמה שנותרה ממגב המשימה ולהוסיף אותה לטריפסין. דגרו את רקמת השריר בתמיסת הטריפסין על קרח למשך 30 דקות. לאחר מכן צנטריפוגה את הדגימה ב-200 פעמים G למשך שלוש דקות בארבע מעלות צלזיוס.

לאחר צנטריפוגה, שפכו את הטריפסין לתוך מיכל פסולת והשעו מחדש את הכדור עם שלושה מיליליטר של מאגר בידוד מיטוכונדריה קר כקרח. לאחר מכן העבירו את הרקמה לצינור הומוגנייזר זכוכית של 45 מיליליטר. שטפו את הצינור החרוטי של 15 מיליליטר עם עוד 1.5 מיליליטר של מאגר בידוד מיטוכונדריה אחד כדי לאסוף את כל הדגימה שנותרה ולהוסיף את זה לצינור ההומוגנייזר מזכוכית.

לאחר מכן, הניחו את צינור ההומוגנייזר מזכוכית לכוס או למיכל פלסטיק מלא באמצע הדרך בקרח. אז הומוגנייזר הזכוכית נע בצורה מינימלית בתוך הכוס. הומוגניזציה של הדגימה עם עלי פוליטטרפלואורואתילן המחובר לרקמה מונעת מוטורית.

הומוגנייזר עם 10 ב 80 סל"ד. החזק את החלק התחתון של כל מעבר למשך כשתי שניות. לאחר מכן העבירו את הרקמה להומוגנאט לצינור חרוטי חדש של 15 מיליליטר.

ושטפו את צינור ההומוגנייזר מזכוכית עם 6.5 מיליליטר של מאגר בידוד מיטוכונדריה אחד. יוצקים את המאגר לתוך הצינור החרוטי של 15 מיליליטר המכיל את שאר הרקמה. הומוגנאט. סובב את הדגימה ב-700 פעמים G למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס, ולאחר מכן שפך בעדינות את הסופינטה לתוך צינור צנטריפוגה מזכוכית בעל חוזק גבוה והשליך את הגלולה.

לאחר מכן, סובב את החטף ב 8, 000 פעמים G למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. כדי לגלול את המיטוכונדריה, הסר את החטף והשהה מחדש את הגלולה על ידי הוספה איטית של 500 מיקרוליטר של מאגר בידוד מיטוכונדריה שני, חתך את קצה קצה הפיפטה והומוגניזציה בעדינות של הגלולה במאגר בתנועות ערבוב וערבוב. לאחר מכן הוסיפו עוד 4.5 מיליליטר של בידוד מיטוכונדריה.

חוצץ שניים לתערובת לאחר שהגלולה מושעה לחלוטין, סובב את ההומוגנאט ב 8, 000 פעמים G למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי לגלול שוב את המיטוכונדריה. הסר את ה-S supernatant והשהה מחדש את הכדור בעדינות אך לחלוטין על ידי הוספת מרווחים של 25 מיקרוליטר של בידוד המיטוכונדריה. חוצץ שני, בעזרת קצה פיפטה כשחודו חתוך, מערבבים בעדינות ומערבבים את הכדור לאחר כל מהדורה של 25 מיקרוליטר חיץ.

בסיום, הניחו את ציר המיטוכונדריה הזה על קרח. הכינו שני דילולים נפרדים של אחד עד 20 דילולים של ציר המיטוכונדריה במים בטוהר גבוה. הוסף 0.1% של טריטון 100 x לדגימה אחת וסוניקט למשך 10 שניות בהגדרה נמוכה.

השאירו את הדילול השני על הקרח והחזירו את הדגימה הסוניקטיבית לקרח. לאחר סוניקציה, בצע בדיקת סינתאז ציטראט עם דילול מיטוכונדריאלי לא סוניקטיבי וסוניקציה באמצעות בדיקה פוטומטרית בטכניקות סטנדרטיות, קבע את אחוז ממברנות המיטוכונדריה השלמות באמצעות המשוואות המסופקות בפרוטוקול הטקסט הנלווה. סינדיקציה של המיטוכונדריה מביאה לעלייה מובהקת סטטיסטית בפעילות ציטראט סינטאז.

פעילות ציטראט סינטאז בדגימות מיטוכונדריות שאינן סוניקציה בהשוואה לדגימות סוניקטיביות מראה כי 92.5% מהמיטוכונדריה היו שלמות לאחר ביטוי הבידוד של ga. DH ו-COX 4 ניכרים בכל הרקמה ליזאט בביטוי המיטוכונדריה המבודד של קוקס ארבע. בעוד שרק רצועות חלשות של GA DH ניכרות, ממצאים אלה מצביעים על בידוד מיטוכונדריאלי טוב עם מעט זיהום מרכיבים שאינם מיטוכונדריאלים במהלך הליך הבידוד.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לטפל במלאי המיטוכונדריה בזהירות, לעולם לא לערבב אותו או לערבב אותו במרץ לאחר הליך זה. ניתן לבצע שיטות אחרות כמו מדידת ייצור מיני פעולה תגובתית על מנת לענות על שאלות נוספות כמו האם התערבות משפיעה על ייצור מיני חמצן תגובתיים במיטוכונדריה מבודדת.