דור של גזע תאים המושרה pluripotent מתאי T ההיקפיים אנושיים באמצעות וירוס סנדאי בתנאים ללא מזין

המטרה הכוללת של הליך זה היא ליצור תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים או IPCs מתאי T היקפיים אנושיים בתנאים ללא מזין. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הרפואה הרגנרטיבית, כולל כיצד ניתן ליישם תאי IPS לשימוש קליני. היתרון העיקרי בטכניקה זו הוא שניתן לרפא תאי IPS ללא הכללת גורם נזק אפשרי, מה שמפחית את הסיכון לפתוגניות.

ההשלכה של טכניקה זו מרחיבה את הטיפולים מבוססי תאי IPS הרלוונטיים מבחינה קלינית בעולם בגלל דגימת תאים פולשנית זו בשילוב עם הפחתת הסיכון לחשיפת תאי IPS להתפתחות לפתוגנים לא מוגדרים. כך ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי הטיפול הקליני בשירות IPS. ניתן ליישם אותו גם בתחומים אחרים כגון מצבי מודלים של מחלות.

התחל להכין תאי T אנושיים מופעלים על ידי דילול 10 מיליליטר של דם מלא הפריני עם 10 מיליליטר פיפטה DPBS. 15 מיליליטר תמיסת פול לתוך צינור חרוטי של 50 מיליליטר. פיפטה איטית את הדם המדולל הזורם לאורך הדופן הפנימית של הצינור כדי להניח שכבה על גבי התמיסה.

היזהר לא להפריע לממשק. צנטריפוגה את הצינור ב -400 פעמים G למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הצנטריפוגה, התבוננו בשלוש שכבות, כולל שכבה שקופה תחתונה, שכבה לבנה דקה המכילה תאים חד-גרעיניים ושכבת פלזמה חלבית עליונה.

העבר את שכבת התא החד-גרעיני לצינור חרוטי חדש של 50 מיליליטר מבלי להעביר שום תמיסת חור מתאים. לאחר מכן, הוסף DPBS כדי להביא את הנפח הכולל ל-10 מיליליטר. צנטריפוגה את הצינור ב -200 פעמים G למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.

השליכו את הסופרנטנט, שטפו את התאים עם 10 מיליליטר צנטריפוגה DPBS את הצינור ב -200 פעמים G למשך חמש דקות והוציאו את הסופרנטנט. לאחר מכן הוסף מיליליטר אחד של מדיום KBM 5 0 2 לתאים וספור באמצעות ציטומטר המו להכנת צלחת תרבית התא מצפים את הבארות של צלחת שש בארות ב-10 מיקרוגרם למיליליטר של תמיסת CD אנטי אנושית שלושה נוגדנים ב-PBS. דגרו את הצלחת בחום של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני למשך 30 דקות לפחות.

לאחר הדגירה, הסר את תמיסת הנוגדנים מהצלחת שמונה ושטוף פעם אחת עם זרעי PBS את התאים החד-גרעיניים בצפיפות של 2.5 פעמים 10 עד חמישי תאים לסנטימטר רבוע בנפח כולל של שני מיליליטר של KBM 5 0 2 מדיום בשש לוחות הבאר המצופים דוגרים על התאים במשך שלושה עד שבעה ימים מבלי לשנות את המדיום, בנקודה זו תא ה-T אמור להגיע לשטף לאחר שלושה עד שבעה ימים. העבירו את תאי ה- T המופעלים עם מדיום לצינור חרוטי של 15 מיליליטר וצנטריפוגה ב -200 פעמים G למשך חמש דקות. הסר את ה- SNAT והוסף מיליליטר אחד של KBM 5 0 2 בינוני טרי.

ספרו את התאים והצלחת 1.5 כפול 10 לששת התאים בשני מיליליטר של KBM 5 0 2 מדיום לכל באר של אנטי CD שלושה נוגדנים מצופים שש בארות צלחת לאחר מכן הפשירו את תמיסות הנגיף OC שלוש SOX שתיים, KLF ארבע ו-C-M-Y-C-H, ו-L sendi על קרח בכל וירוס סנדאי מהונדס בנפרד לכל באר וריבוי זיהום של 10. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני למשך 24 שעות. לאחר מכן אוספים את התאים הנגועים בעזרת פיפטה ומעבירים אותם לצינור חרוטי של 15 מיליליטר.

צנטריפוגה של התאים ב -200 פעמים G למשך חמש דקות. הסר את הסופרנטנט והוסף שני מיליליטר של KBM 5 0 2 בינוני טרי. החלף את התאים בבארות של צלחת שש בארות ודגירה למשך 24 שעות בחממת תרבית תאים.

כדי לסגת מהתאים, יש להפשיר תחילה את תמיסת מטריצת קרום המרתף בארבע מעלות צלזיוס, למשך הלילה, להמיס 0.2 מיליליטר מתמיסת המחשבה ב -10 מיליליטר של DMM F 12, צלחת בינונית, חמישה מיליליטר מתמיסת מטריצת קרום המרתף לכלים של 100 מילימטר. השאירו את הצלחות בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות לפחות כדי לאפשר למטריצה לצפות את המנה לפני זריעת התאים. בינתיים, אספו את תאי ה-T הנגועים בנגיף ה-SAI בצינור חרוטי של 15 ליטר וצנטריפוגה ב-200 פעמים G למשך חמש דקות.

לאחר מכן השעו מחדש את החך במיליליטר אחד של מדיום KBM 5 0 2 טרי, וספרו את התאים באמצעות ציטומטר המו לאחר תקופת הדגירה של 30 דקות. הסר את תמיסת מטריצת קרום המרתף משתי הלוחות, ואז השהה מחדש פעם אחת 10 לתאים החמישיים ובנפרד פעם אחת 10 לששת התאים ל -10 מיליליטר של מדיום M-T-E-S-R טרי, מדיום תרבית ללא תאי הזנה עבור ipsc. פיפטה כל מתלה תא לצלחת נפרדת של 100 מילימטר.

דגרו את הצלחת בחממת תרבית תאים. החלפת המדיום כל יומיים לאחר 20 עד 30 יום. מושבות הדומות למושבות תאי גזע עובריים צריכות להופיע.

הכן שש לוחות קיר להרחבת IPSC על ידי דגירה של מיליליטר אחד של תמיסת מטריצת קרום המרתף בכל באר למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. בינתיים, צפו בלוחות תרבית המכילים מושבות IPSC תחת מיקרוסקופ סטריאו ובודדו מושבות בודדות על ידי גירודן עם פיפטה של 20 מיקרוליטר. מעבירים כל מושבה לבאר ולצלחת דופן 96 המכילה 20 מיקרוליטר מדיום M-T-E-S-R.

לאחר העברת המושבות, הוסף 200 מיקרוליטר של מדיום M-T-E-S-R לכל באר ופיפטה למעלה ולמטה כדי לשבש את המושבה. לאחר הסרת תמיסת מטריצת ממברנת הבסיס משש לוחות הבאר, העבירו תאים ממושבה בודדת לכל באר, ואז הוסיפו שני מיליליטר של מדיום M-T-E-S-R, דגרו על התאים בחממת תרבית תאים והחליפו את המדיום כל יומיים באמצעות תרבית ללא מזין ומדיה חופשית בסרום. צביעה אימונו-פלואורסצנטית חשפה ביטוי של סמני תאים פלוריפוטנטיים טיפוסיים, כולל ננו T שלוש ארבע SSEA ארבע, TRA אחד 60 ו-TRA 180 1.

בקווי IPSE נגזרים אלה. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לבצע את כל השלבים, תוך התחשבות בכל שיקולי הסטריליות והבטיחות הביולוגית החשובים.