Name: כימות של מוטציות בתאי גזע המעי הגס (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: למדו כיצד לכמת מוטציות סומטיות בתאי גזע המעי הגס לאחר חשיפה לסוכנים גנוטוקסיים. השיטה משתמשת בגן G6PD ובהבדלה צבעונית כדי לזהות קריפטות מוטנטיות במיקרוסקופ אור.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

יש הסופרים לא תודות.

הפרוצדורות והטיפול אתי בבעלי החיים אושרו על ידי אוניברסיטת פיטסבורג IACUC (פרוטוקול # 1,104,674). 1. הכנת תערובת מכתים G6PD הערה: ודא שהריכוז הסופי של כל ריאגנטים הוא כדלקמן; 5 מ&quot;מ glucose-6-פוספט (G6P); 2 מ&quot;מ NADP, 5 מ&quot;מ MgCl 2, 0.35 סולפט 1 מ&quot;מ-methoxy-5-מתיל methylphenazinium (MMPMS) ו0.8 מ&quot;מ NBT. 1,8,9 לכל מגיב הריכוז הראשוני נגזר ל40 מיליליטר נפח סופי. פתרונות היו מוכנים טריים ומשמשים בכל יום. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מיליליטר של 200 מ&quot;מ 7.4 חיץ pH פוספט (PB) ל -35 מיליליטר של מדיום אוקטובר בצינור 50 מ&quot;ל ולנער במרץ. ודא עם נייר pH שהפתרון הוא ~ pH 7.4. אם לא לבטל את הפתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 61 G6P מ&quot;ג מומס ב0.94 מיליליטר של 200 מ&quot;מ PB, 61 מ&quot;ג NADP מומס ב0.94 מיליליטר של 200 מ&quot;מ PB, ו -41 מ&quot;ג MgCl 2 מומס ב0.96 PB מיליליטר של 100 מ&quot;מ. לאשרר שpH הוא ~ 7.4 שנינותנייר pH שעות. אם לא ~ 7.4, לבטל את הפתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 מ&quot;ג של MMPMS מומס ב0.25 מיליליטר של 200 מ&quot;מ PB (pH 7.4). במרץ לנער את תערובת תגובה וכתוצאה מכך ליצור homogenate אדום כהה ברור. אם הפתרון הוא עכור, צריכה להיות מושלכת התערובת. הצינור המכיל תערובת התגובה הוא עטוף בנייר כסף כדי למזער את החשיפה לאור. אחסן את תערובת התגובה ב RT ואילו הרכיב הסופי, NBT, מוכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן בנפרד פתרון 5 מ&quot;מ NBT על ידי הוספת 0.4 מיליליטר פוראמיד דימתיל נטול מים (DMF) ו -0.4 מיליליטר אתנול נטול מים ל- 164 מ&quot;ג של NBT בצינור 2 מיליליטר עם מכסה O-טבעת. לסגור את המכסה באופן רופף (לא סגור היטב) ולהביא את הפתרון לרתיחה באמבטית שמן עד NBT הוא בפתרון. 8 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר NBT solubilized להתקרר לRT ולאחר מכן להוסיף את כל הפתרון לתערובת תגובת OCT ולנער במרץ כדי להשיג פתרון ברור. שים לב לשינוי בצבע פתרון מכתום-אדום ראשונית לאדום כהה או purpצבע le לאורך זמן. זה נורמלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את תערובת כתמי G6PD הסופית בC חדר חם 37 מעלות במשך שעה 1 לפני השימוש. </li></ol> 2. בעלי חיים טיפול ואוסף רקמות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פנק את עכברי זכרים 6 שבועות בן C57Bl / 6 עם סוכן מזיק DNA, למשל, 10 מ&quot;ג / קילוגרם azoxymethane (AOM) בהיקף של 200 μl PBS על ידי הזרקת IP. פנק את עכברי שליטה עם 200 μl של PBS על ידי הזרקת IP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 90 יום, להרדים עכברים על ידי CO 2 מחנק ואחריו נקע בצוואר הרחם כפי שאושר על ידי פרוטוקול IACUC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפתוח בניתוח בחלל הבטן מבדיוק מעל פי הטבעת לבסיס של עצם החזה. הזז את המעי הדק מתוך חלל הגוף אבל לא לכרות אותו. בלו המעי התחתון, ממש מתחת לcecum לפי הטבעת. 10 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פורס בזהירות בצד אחד של המעי הגס באמצעות מספריים מיקרו לנתיחה ולהסיר צואה מהמעי הגס נפתח על ידי שטיפה עם PBS סטרילי הנקי. רול שוויצרי הבלומעי גס ד עם צד luminal פונה החוצה, והמקום בעובש רקמה. 10 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלוטין לטבול את המעי הגס בתבנית בינונית ומקום אוקטובר בדיואר המכיל נוזל N 2. להחזיק את התבנית כך שבסיס הפלסטיק הוא רק במגע עם הנוזל N 2 עד בינוני אוקטובר קפוא מוצק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את גוש הרקמה הקפוא ב -80 עד חיתוך חלקים קפואים. אין להשתמש בכל מקבע, אשר יביא לאיון של אנזים G6PD. </li></ol> 3. הכנת סעיפים קפואים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך קטעי רקמה קפוא בעובי של 7 מיקרומטר באמצעות cryostat ב-25 מעלות צלזיוס. חותך 4 7 מיקרומטר סעיפים רצופים ומקום שניהם על אותו השקופית (איור 1). הכן 2 שקופיות, או ארבעה 7 מיקרומטר סעיפים רצופים לייצג רמה אחת של המעי הגס (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור לרמה הבאה עם מרחק מינימאלי של&gt; 50 מיקרומטר מהחלק האחרון של יחסי הציבוררמת evious. מרחק זה הבטיח כי מאורות העריכו לכל רמה לא לשכפל אחד לשני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעתים קרובות לנגב את להב cryostat עם 100% אתנול להסיר את שאריות אוקטובר שמצטברת במהלך חיתוך. לפני חתך יתחדש, הלהב היבש ניגב עם גיליון מייבש אנטי-סטטית להתפוגג מטען סטטי שנצבר. שקופיות חנות עם החלקים קפואים ב -80 o C. </li></ol> 4. הכתמה של רקמה קפואה סעיף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את תגובת היסטוכימיה האנזים בחדר חם 37 ° C עם לחות גבוהה. הערה: ניסיון התגובה האנזימטית בתנור דגירה או על חם שקופית הובילה לצביעת G6PD עניה ועולה בקנה אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבנות בארות מכתים רקמות באמצעות שני 1.5 סנטימטרים X מנקי פלדה 0.15 סנטימטר (גובה X הקוטר פנימי) שמחובר יחד באמצעות גריז סיליקון (איור 1). חותך את parafilm כדי להתאים את הבסיס של היטב עם המרכז לגזור והמקום גםד על קטע הרקמה בשקופית. הערה: parafilm על החלק התחתון של מכונת הכביסה יוצרת חותם בין השקופיות ומכונת הכביסה ששומרת את תערובת כתמי G6PD צמיגה בסעיף הרקמה. מבנה זה נותן גם עם 0.4-0.5 מיליליטר נפח, כך שכל קטע רקמה במחקר מקבל את אותו הנפח של תערובת כתמי תגובת G6PD. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה שקופיות רקמה קפוא ב 37 o C בחדר חם למשך 10 דקות. על 37 מעלות צלזיוס, להוסיף את תערובת התגובה מכתימה G6PD היטב כל אחד קטע רקמה (2 סעיפים לכל שקופית) ל45-50 דקות. הסר שקופיות מחדר חם, ולהרים בזהירות את בארות נירוסטה מהשקופיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שקופיות הגדר בקצה הארוך שלהם כדי לאפשר את מדיום התגובה לניקוז. מגלשות מקום ב100 מ&quot;מ PB (pH 7.4) במשך 30-60 דקות להסיר את תערובת התגובה מכתימה G6PD מהרקמה מבלי להפריע צביעת הרקמות. לצלול שקופיות במים מזוקקים למשך 5-10 דקות כדי להסיר מלחי PB </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותם את הרקמה על ידי תוספתing fluoro-ג&#39;ל מטפטף על הרקמות ומחכים ~ 30 דקות לייבוש. למנוע בועות שיכולים לבלבל את זיהוי של מאורות שעברו מוטציה. הערה: אם בועות טופס, ההליך ניתן לחזור לאחר הסרת fluoro-ג&#39;ל על ידי שריה במים מזוקקים. אין להשתמש בתלושי כיסוי כפי שהם נוטים בועות אוויר מלכודת. </li></ol> 5. קביעת מאורות Mutant G6PD ותדירות המוטציה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח שקופיות עבור מאורות מוטציה G6PD תחת מיקרוסקופ אור. הערה: הקריטריונים המשמשים לזיהוי קריפטה מוטציה מלאה היו: (i) כל הכוך היה נטול צבע הכחול; (Ii) המבנה החיצוני של הכוך היה שלם, (iii) קריפטה המוטציה נצפתה על 7 מיקרומטר חלקים סמוכים ו, ​​(iv) שני משקיפים היו לזהות את אותו כוך כמוטציה. מוטציות שנצפו על 7 מיקרומטר סעיפים סמוכים נספרות כמוטציה אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונה כל קריפטה המוטציה G6PD ב40X הגדלה ולקטלג את התמונות באמצעות מצלמה 5.0 מגה פיקסל עםתוכנת הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת את המספר הכולל של מאורות נבחנו בעכבר על ידי בחירת סעיף נציג לכל עכבר מהרמה עם השטח הקטן ביותר פני השטח ותמונתו בהגדלה 10x (איור 1 ג). הערה: רמה מייצגת ארבעה 7 מיקרומטר סעיפים רצופים (איור 1D), אשר בשל הקרבה שלהם לעתים קרובות להראות מוטציה מאורות בסעיף אחד או יותר. הרמות מופרדות על ידי&gt; 50 מיקרומטר לדמיין מאורות מאזורים שונים של המעי הגס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפתוח כל קובץ תמונה וחזותי לספור את מספר מאורות ברמה על ידי ניתוח הקבצים (כפי שמוצגים בתיבות תרשים 1C). קבצי תמונות ישתנו במספר מאורות נצפו מנמוך כמו 20 עד&gt; 300 מאורות בקובץ אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכפל את המספר הכולל של מאורות מהרמה הנבחרת (איור 1 ג) לכל עכבר במספר הרמות הוקרנו למאורות מוטציה G6PD עבור כל מעי גס. לדוגמא, ספירה כוללת של1,250 מאורות לרמה שנבחרה מוכפלים 8 רמות הוקרנו למאורות מוטציה שווים ספירה כוללת של 10,000 מאורות. להעריך מינימום של 10,000 מאורות עבור כל מעי גס לניתוח סטטיסטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את מספר מוטציות שנצפו בכל בעלי החיים במספר הכולל של מאורות הוקרנו לחשב MF עבור כל טיפול. רמת MF תאי גזע רקע בעכברים שלא טופלו היא &lt;0.1x10 -4 (טבלת 1), שהוא קרוב לזה שדווח בעבר בC57Bl / 6 עכברים. 11 </li></ol>

<ol><li>Griffiths, D. F., Davies, S. J., Williams, S., Williams, G. T., Williams, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demonstration+of+somatic+mutation+and+colonic+crypt+clonality+by+X-linked+enzyme+histochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Demonstration of somatic mutation and colonic crypt clonality by X-linked enzyme histochemistry.</a> Nature. 333 (6172), 461-463 (1988).</li>
<li>Griffiths, D. F., Sacco, P., Williams, G. T., Williams, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clonal+origin+of+experimental+large+bowel+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">The clonal origin of experimental large bowel tumours.</a> Br. J. Cancer. 59 (3), 385-387 (1989).</li>
<li>Kuraguchi, M., Thomas, G. A., Williams, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+mutation+of+the+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+%28g6pd%29+gene+in+colonic+stem+cells+and+crypt+restricted+loss+of+G6PD+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">Somatic mutation of the glucose-6-phosphate dehydrogenase (g6pd) gene in colonic stem cells and crypt restricted loss of G6PD activity.</a> Mutat. Res. 379 (1), (1997).</li>
<li>Van Noorden, C. J., Vogels, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyvinyl+alcohol+and+other+tissue+protectants+in+enzyme+histochemistry%3A+a+consumer%E2%80%99s+guide%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem.+J%22%5BJournal%5D)">Polyvinyl alcohol and other tissue protectants in enzyme histochemistry: a consumer’s guide.</a> Histochem. J. 21 (7), 373-379 (1989).</li>
<li>Giardina Rosenberg, D. W., C,, Tanaka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+for+the+study+of+colon+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Mouse models for the study of colon carcinogenesis.</a> Carcinogenesis. 30 (2), 183-196 (2009).</li>
<li>Tanaka, T., Kohno, H., Suzuki, R., Yamada, Y., Sugie, S., Mori, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+inflammation-related+mouse+colon+carcinogenesis+model+induced+by+azoxymethane+and+dextran+sodium+sulfate%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Sci%22%5BJournal%5D)">A novel inflammation-related mouse colon carcinogenesis model induced by azoxymethane and dextran sodium sulfate.</a> Cancer Sci. 94 (11), 965-973 (2003).</li>
<li>Suzuki, R., Kohno, H., Sugie, S., Tanaka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dose-dependent+promoting+effect+of+dextran+sodium+sulfate+on+mouse+colon+carcinogenesis+initiated+with+azoxymethane%5BTitle%5D)+AND+%22Histol.+Histopathol%22%5BJournal%5D)">Dose-dependent promoting effect of dextran sodium sulfate on mouse colon carcinogenesis initiated with azoxymethane.</a> Histol. Histopathol. 20 (2), 483-492 (2005).</li>
<li>Frederiks, W. M., Vreeling-Sindalarova, H., Van Noorden, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+peroxisomes+causes+oxygen+insensitivity+of+the+histochemical+assay+of+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+activity+to+detect+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Loss of peroxisomes causes oxygen insensitivity of the histochemical assay of glucose-6-phosphate dehydrogenase activity to detect cancer cells.</a> J. Histochem. Cytochem. 55 (2), 175-181 (2007).</li>
<li>Hisada, R., Yagi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((1-Methoxy-5-methylphenazinium+methyl+sulfate%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem%22%5BJournal%5D)">1-Methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate.</a> Biochem. 82 (5), 1469-1473 (1977).</li>
<li>Whittem, C. G., Williams, A. D., Williams, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+Colitis+modeling+using+Dextran+Sulfate+Sodium+%28DSS%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Murine Colitis modeling using Dextran Sulfate Sodium (DSS).</a> J Vis Exp. (35), (2010).</li>
<li>Kuraguchi, M., Cook, H., Williams, E. D., Thomas GA, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+susceptibility+to+colonic+stem+cell+somatic+mutation+in+three+strains+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Differences in susceptibility to colonic stem cell somatic mutation in three strains of mice.</a> J. Pathol. 193 (4), 517-521 (2001).</li>
<li>Whetstone, R. D., Gold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-Cells+Enhance+Stem+Cell+Mutagenesis+in+the+Mouse+Colon%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">T-Cells Enhance Stem Cell Mutagenesis in the Mouse Colon.</a> Mutat. Res. 744, 1-5 (2015).</li>
<li>Van Noorden, C. J., Vogel, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histochemistry+and+cytochemistry+of+glucose-6-phosphate+dehydrogenase%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Histochemistry and cytochemistry of glucose-6-phosphate dehydrogenase.</a> Prog. Histochem. Cytochem. 15 (4), 1-85 (1985).</li>
<li>Van Noorden, C. J., Vogels, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+cytochemical+staining+method+for+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+activity+in+individual+erythrocytes.+II.+Further+improvements+of+the+staining+procedure+and+some+observations+with+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Haematol%22%5BJournal%5D)">A sensitive cytochemical staining method for glucose-6-phosphate dehydrogenase activity in individual erythrocytes. II. Further improvements of the staining procedure and some observations with glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency.</a> Br. J. Haematol. 60 (1), 57-63 (1985).</li>
<li>Cook, H. A., Williams, D., Thomas, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crypt-restricted+metallothionein+immunopositivity+in+murine+colon%3A+validation+of+a+model+for+studies+of+somatic+stem+cell+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Crypt-restricted metallothionein immunopositivity in murine colon: validation of a model for studies of somatic stem cell mutation.</a> J. Pathol. 191 (3), 306-312 (2000).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

לעתים קרובות השפעת genotoxic של מתחם נקבעה על ידי יכולתה לשנות DNA. זה נעשה בדרך כלל על ידי בידוד הרקמות ומדידת הרמה הגלובלית של adducts DNA. לAOM, זה יהיה כרוך בכימות O 6 -methylguanine adducts במעי הגס. שימוש במידע בגישה זו על נזק בתוך סוגי תאים ספציפיים, כגון בנישת תאי גזע, הולך לאיבוד. בנוסף, adduct DNA הוא לא אותו הדבר כמו מוטציה מאז קבוצה קטנה בלבד של adducts מומרות סופו של דבר למוטציות קבועות. 12 אנו מספקים במסמך הפרטים לכמת מוטציות בתאי גזע reproducib...

הוא חשב לסרטן מעי גס לערב חשיפה לגורמים סביבתיים ורכיבים תזונתיים שיכול לגרום נזק לדנ&quot;א ולייצר הפעלת מוטציות סומטיות באונקוגנים (למשל, SS-קטנין) או inactivating מוטציות בגנים מדכאי סרטן (למשל, APC). הנחה היא כי המוטציות קריטיות הללו מתרחשות בתאי גזע במעי הגס. בגלל ארכיטקטורת קריפטה הייחודית של האפיתל המעי הגס, אפשר למדוד מוטציות בתאי גזע במעי הגס לאחר חשיפת בעלי חיים לכימיקלים הקשורים לסרטן מעי גס. אנזימים צמודים X כמה יכולים לשמש כמדדים למוטציות המתרחשות בתאי גזע, כמו המוטציות תהיה נוכחת בכל התאים בתוך כוך. בעבר, הליך פורסם הוכחה כי כימיקלים שגורמים לגידולים במעי הגס בעכברים גם נוצרו מוטציות בתאי גזע סומטיים במעי הגס באמצעות ניתוח של מוטציות בdehydrogenase גלוקוז-6-פוספט צמוד X הגן (G6PD). 1-3השיטה מכמתת את השכיחות של מוטציות סומטיות אקראיות בתאי גזע במעי הגס ללא כל לחץ בחירה. ההליך כרוך הייצור של חלקי מעי גס קפוא מבולבל מעכברים שטופלו ובקרה וזיהוי של מאורות חסרי תאים המייצרים פעילות G6PD פונקציונלית. מאורות אלה שעברו מוטציה, אשר מופיעים לבן, מצביעים על כך שהמוטציה התרחשה בתאי גזע שהולידו צאצאים גם מחסה גן שעבר מוטציה G6PD. בassay האנזימטית, מאורות המוטציה deficient G6PD לא יכולים לחמצן גלוקוז 6-פוספט, אשר נדרש להפחתת tetrazolium ניטרו הכחול (NBT). כאשר אנזים G6PD הוא פונקציונלי, NBT בתערובת הכתמים מצטמצם formazan ומשקעים לא מסיסים, צבירה במיקום של האנזים ותאים &quot;הכתמה&quot; כחולים. תאים שמוטציות G6PD להישאר לבנבן בניגוד למאורות סוג כחולים מוכתמים פראיים. שיטה זו מודדת מוטציות שיש פנוטיפ &quot;null&quot;. בגלל enzymes, כגון G6PD, יכול לפזר את התאים בסעיף רקמה מבולבל אם החלקים ממוקמים בתמיסה מימית, יש צורך לייצב את האנזים בסעיפי הרקמות להיות מנותחים. 4 הייצוב של האנזים ב רקמה אסור להפריע לדיפוזיה של מולקולות מגיב קטנות נחוצות לתגובה האנזימטית G6PD. עשינו מספר השינויים המשמעותיים בהליך המקורי. הבינוני לצביעה האנזימטית הקריטית השתנה מאלכוהול פוליוויניל למתחם אופטימלי טמפרטורת חיתוך (אוקטובר), המאפשר שליטת pH וsolubilization של הרכיבים המשמשים assay. הצביעה מתבצעת באמצעות 0.4-0.5 מיליליטר בארות עשויות מנקי פלדה, כך שכל קטע רקמה קיבל את אותו הנפח של תערובת תגובת G6PD. הליך פותח כדי להעריך את מספר מאורות בסעיף הדמיה המספק דגימה גדולה של רקמת המעי הגס מבלילספור ידני&gt; 10 5 מאורות עבור כל מעי גס. הניתוח של 7 מיקרומטר סעיפי רקמות סמוכים מאפשר הדמיה של קריפטה מוטציה בשקופית אחד או יותר, אשר מפחיתה חפצים מכתים פוטנציאליים. שינויים אלה הופכים את ההליך יעיל יותר ושחזור. שימוש בפרוטוקול מתוקן זה, יש לנו לכמת את תדירות המוטציה בתאי גזע במעי הגס לאחר החשיפה של C57Bl / 6 עכברים לazoxymethane, סרטן מעי גס ידוע במכרסמים. 5-7

<table><tbody><tr><td>ריאגנטים</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ניטרובלו טטרזוליום</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NADP</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>גלוקוז-6-פוספט</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-מתוקסי-5-מתילפנאזיניום מתיל סולפט</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>דימתיל פורממיד</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>פוספט בופר (pH 7.4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>תרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT)&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ אור ציוד</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מצויד במצלמה</td><td></td><td></td><td></td>5 מגה פיקסל</tr><tr><td>קריוסטט</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>חדר חם&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

כימות של מוטציות בתאי גזע המעי הגס

Quantification of  Colonic Stem Cell Mutations

היכולת למדוד מוטציות בתאי גזע היא כלי רב עוצמה כדי לכמת באוכלוסיית תאים קריטית אם, ובאיזו מידה, כימי יכול לגרום למוטציות שעלולות לגרום לסרטן. השימוש בassay האנזימטית לכמת מוטציות בתאי גזע בגן dehydrogenase גלוקוז-6-פוספט צמוד X כבר דווח בעבר. 1 שיטה זו דורשת ההכנה של חלקים ודגירה קפוא של הרקמה מחולק עם תערובת תגובה כי תשואות צבע כחול אם התאים לייצר אנזים פונקציונלי dehydrogenase גלוקוז-6-פוספט (G6PD). אם לא, התאים להופיע לבנבן. יש לנו שונה תערובת התגובה באמצעות מדיום אופטימלי מתחם טמפרטורת חיתוך (אוקטובר) במקום של אלכוהול פוליוויניל. זה מקל על מדידת pH, מגביר solubilization של רכיבי צביעת G6PD ומגביל דיפוזיה של אנזים G6PD. על מנת להוכיח כי מוטציה התרחשה בתאי גזע, כל קריפטה חייבת חסר אנזימטי G6PDפעילות. רק אם תאי גזע נמלי מוטציה G6PD פנוטיפי כל הצאצאים בקריפטה תחסר פעילות האנזימטית G6PD. לזהות מאורות עם מוטציה בתאי גזע, ארבעה חלקים רצופים סמוכים קפוא (רמה) נחתכו ב 7 מיקרומטר עוביים. גישה זו של ביצוע חתכים סמוכים מספקת קונפורמציה שכוך היה מוטציה באופן מלא מאז אותו קריפטה מוטציה יקויימו בחלקים סמוכים. שקופיות עם דגימות רקמה שהיו בהפרש של יותר מ -50 מיקרומטר היו מוכנות להעריך כולל של&gt; 10 4 מאורות לכל עכבר. תדירות המוטציה היא מספר מאורות הנצפים מוטציה (לבן) ÷ במספר סוג בר מאורות (כחולים) בקבוצת טיפול.

היכולת למדוד מוטציות בתאי גזע במעי הגס בבעלי חיים מספקת דרך ייחודית, כדי לקשר בין מוטציות גיוס הסרטן. בדרך כלל, ההנחה היא כי הצעד הקריטי בהיווצרות הסרטן כרוך הפעלת מוטציות באונקוגנים ו / או inactivating מוטציות בגנים מדכאי סרטן. אנחנו הזרקנו C57Bl / 6 עכברים עם 200 μl של PBS או 10 מ&quot;ג / קילוגרם AOM ב200 μl של PBS. AOM הוא חומר מסרטן מעי גס ידוע. 5-7 בימים 90 הנקודות של נותחו למוטציות בתאי גזע. הפעם נדרש כדי לאפשר לתאי גזע לאכלס קריפטה באופן מלא, ורק כאשר כל קריפטה ...

אנו מדווחים על שיפורים משמעותיים במדידה הניתנת לשחזור של מוטציות בתאי גזע סומטיים במעי הגס לאחר חשיפה של עכברים לגורמים פוטנציאליים המזיקים ל-DNA.

The ability to measure stem cell mutations is a powerful tool to quantify in a critical cell population if, and to what extent, a chemical can induce ...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא לכמת מוטציות סומטיות פנוטיפיות בגן glucose six phosphate dehydrogenase או G6PD בתאי גזע של המעי הגס. לאחר טיפול של בעלי חיים בחומרים גנוטוקסיים משוערים, הדבר משיג על ידי טיפול ראשוני בבעלי החיים בחומר, המתנה לפרק זמן מתאים כדי לאפשר לצאצאים של תא גזע הנושא מוטציה ב-G6PD לאכלס באופן מלא קריפט, הקרבת בעל החיים, הוצאת המעי הגס, עיצובו בצורת "Swiss roll" והקפאת הרקמה בחנקן נוזלי. השלב השני הוא הכנת חתכים קפואים בעובי של 7 מיקרון על שקופיות מהמעי הגס באמצעות קריוסטט.מחממים את הרקמה ל-37 °C ולאחר מכן יוצרים בארות לצביעת רקמה מסביב לחתכי הרקמה. השלב הסופי הוא דגירה של חתכי הרקמה עם תערובת הצביעה ל-G6PD ולאחר מכן ניתוח של החתכים תחת מיקרוסקופ אור; תאים בעלי פעילות G6PD נצבעים בכחול, בעוד שתאים עם מוטציות פנוטיפיות נראים לבנновиים. לבסוף, הכמות של הקריפסים (crips) המוטנטיים משמשת לקביעת תדירות המוטציה.טכניקה זו מודדת מוטציות סומטיות של glucose six phosphate dehydrogenase בתאי גזע, ואלו הם אוכלוסיות התאים הקריטיות בקרצינוגנזה של המעי הגס. על ידי זיהוי מוטציות סומטיות בתאי גזע, ניתן להקריב את שכיחות המוטציות למקרי סרטן המעי הגס בבעלי חיים שעברו טיפול. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי מוטציות של תאי גזע במעי הגס, ניתן ליישמה גם באורגניזמי מודל או במערכות איברים אחרות.אם ניתן לזהות נישה של תאי גזע, בדרך כלל אנשים שאינם בקיאים בשיטה זו יתקשו בהכנת תמיסת ה-MBT. המסת החומר. תמיסת ה-MBT דורשת תשומת לב קפדנית להוראות מפורטות. כדי להתחיל בהכנת תמיסת הצביעה ההיסטולוגית, הוסיפו 2 mL של בופר פוספט ב-pH 7.4 ל-35 mL של מדיום OCT (Optimal Cutting Temperature) בשפופרת של 50 mL ונערנערו בעוצמה כדי לערבב, תוך שימוש בנייר pH.יש לוודא שהתמיסה היא ב-pH של בערך 7.4. לאחר מכן, יש להוסיף glucose six phosphate ו-ADP ותמיסת magnesium chloride המומסים בבופר פוספט כפי שצוין בפרוטוקול הכתוב, ושוב, לוודא ש-pH של התמיסה נשאר בערך 7.4. יש להוסיף תמיסת M-M-P-M-S ולערבב בעוצמה.תוצאה זו צריכה להיות הומוגנאט בצבע אדום כהה וצלול; יש לעטוף את התמיסה בנייר אלומיניום כדי למזער את החשיפה לאור. אם התמיסה הופכת עכורה, יש להשליכה. בזמן שבן מרחץ השמן מתחמם, הכין בנפרד תמיסת nitro blue to teraz oleum או MBT בריכוז 5 mM על ידי ערבוב של 0.4 milliliters של dimethylformamide, 0.4 milliliters של ethanol ללא מים ו-MBT בשפופרת של 2 milliliters בעלת מכסה עם O-ring; סגור את השפופרת בצורה רפויה והבא אותה לרתיחה נמרצת בבן מרחץ השמן עד להמסת ה-MBT.בשלב הבא, יש להמתין עד שתמיסת ה-MBT תתקרר לטמפרטורת החדר ולאחר מכן להוסיף אותה לתערובת התגובה של ה-OCT. צבע התמיסה עשוי להשתנות עם הזמן מכתום-אדום ראשוני לאדום כהה או סגול. לאחר טיפול בבעלי החיים והכנת חתכים קפואים כפי שפורט בפרוטוקול הטקסט, יש לבנות בארות לצביעת רקמות באמצעות שתי שייבות פלדה המחוברות ביניהן בעזרת גריס סיליקון, להצמיד אותן לבסיס השייבה ולגזור את המרכז שבו תמוקם התמיסה.חממו מראש את נשיי הרקמות הקפואים בחדר לח בעל טמפרטורה של 37 °C למשך 10 דקות. לאחר מכן, הניחו את הבארים על השקופית כך שיקיפו את חיתוכי הרקמה, והוסיפו לבאר של כל חיתוך רקמה כ-0.5 mL מתמיסת הצביעה G6PD שהוכנה מראש, והדגרירו למשך 45 עד 50 דקות. הוציאו את השקופיות מהחדר החם והסירו בזהירות את הבארים מפלדת אל-חלד מהשקופיות.הניחו את השקופיות על הצד הארוך ונקזו את תערובת התגובה, ולאחר מכן בצעו שטיפה של 30 עד 60 דקות בבופר פוספט 100 millimolar. כדי להסיר את השאריות האחרונות של תמיסת הצביעה G six PD, שטפו את השקופיות במים דה-יונליזים למשך חמש עד 10 דקות להסרת שאריות בופר הפוספט. לבסוף, אטמו את הרקמה על ידי הוספת fluoro gel בטיפות על השקופית והמתינו לייבוש למשך 30 דקות לצורך רכישת תמונות לניתוח מאוחר יותר.הניחו את הזקיקה תחת מיקרוסקופ אור וכוון אותו להגדלה של 4X. לאחר מכן, צלמו את חתך הרקמה הצבוע באמצעות מצלמה בעלת רזולוציה של 5.0 מגה-פיקסל כדי להעריך את המספר הכולל של הקריפטות שנבחנו. עבור כל עכבר, בחרו חתך מהמישור בעל שטח הפנים הקטן ביותר וצלמו אותו בהגדלה של 10x.ספרו את מספר הקריפטות (crypts) המוטנטיות. על פי הקריטריונים הבאים, הקריפטה כולה נטולת צבע כחול, ומבנהה החיצוני שלם.המוטנט נצפה בחתכים סמוכים של שבעה מיקרון, ושני צופים מזהים את אותה הקריפטה כמוטנטית. ספרו באופן חזותי את מספר הקריפטות בחתך זה והכפילו במספר הרמות שנסרקו עבור כל מעי גס. דוגמאות לקריפטות מוטנטית שנצפו בעכברים שטופלו בחומר הפוגע ב-DNA, azoxymethane, ניתן לראות כאן; משמאל אתם רואים מבט אנכי או מבט מלמעלה של קריפטה מוטנטית.בעוד שמימין מוצגת תצפית אופקית או תצפית מהצד, כדי שקריפטה (crypt) תוכרז כמיטנטית, על כל התאים בתוך הקריפטה להישאר. קריפטות לבנות עם כמות קטנה של לבן נובעות מייצור ריר על ידי תאי גובלט (goblet cells). תדירות המוטציות מחושבת כמספר המוטנטים שנצפו חלקי מספר הקריפטות הכולל שנסרקו ללא מוטציה.Crips נצפו במעי הגס של עכברי ביקורת, מה שמעיד על תדירות מוטציות של פחות מ-1 times 10 to the minus fifth, בעוד שעכברים שטופלו באזוקסימתאן הראו תדירות מוטציות בתאי גזע של 4.44 times 10 to the minus four בעקבות הליך זה. ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון ניתוח גנטי של סוג המוטציות ב-glucose x phosphate dehydrogenase, כדי להשיב על שאלות נוספות, כגון האופן שבו החומר הכימי גורם לקוד שגוי המוביל למוטציה. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן למדוד מוטציות של תאי גזע סומטיים בעכברים שטופלו בתרכובות פוטנציאליות מוטגניות ומסרטנות.

quantification-of-colonic-stem-cell-mutations

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

ביטוי מופחת / נעדרים של Pms2 ו / או ERCC1 ב מאורות כולו הוא אירוע שכיח בטווח של 10 ס"מ בכל צד של אדנוקרצינומות הגס, סביר להניח בסיס פגם שדה עם הניוון גבוה להתפתחות סרטן. מחסור Ku86 או CcOI הרבה פחות תכופים פגמים אלה בשדה.

Pms2 לקוי, ERCC1, Ku86, CcOI ב פגמים שדה במהלך התקדמות סרטן המעי הגס

אנו תיאר הליך disaggregation של סרטן המעי (CRC) לייצר תאים בודדים קיימא, אשר נלכדים אז על microarrays נוגדן אישית הכרה אנטיגנים השטח (DotScan microarray CRC). תת אוכלוסיות של תאים חייב microarray ניתן צדודית על ידי ריבוב הקרינה באמצעות נוגדנים חד שבטיים מתוייגים עם צבעי ניאון.

סרטן המעי הגס Cell Surface חלבון פרופיל שימוש microarray ו ריבוב נוגדן פלואורסצנטי

כאן אנו מתארים in vivo assay mutagenesis למספר קטן של תאי hematopoietic מטוהרים באמצעות מודל עכבר המהונדס לאצי. גן האצים יכול להיות מבודד כדי לקבוע את התדירות, מיקום והסוג של מוטציות DNA באופן ספונטני קם או לאחר החשיפה לgenotoxins.

זיהוי מוטציות DNA בתאי גזע / אב המטוהר Hematopoietic

מתוארת מערכת משולבת לריצוף ממוקד של הדור הבא של דגימות אונקולוגיות. מערכת חוצת פלטפורמות זו מותאמת לביופסיות גידול באיכות נמוכה ובכמות נמוכה, מתאימה לתשומות DNA נמוכות, כוללת בקרות מרובות וריאנטים מאופיינות היטב, וכוללת מתקשר וריאנט חדש המבוסס על אמצעי בקרת איכות כמותיים טרום-אנליטיים.

אינטגרציה של Wet ותהליכי ספסל יבשים מבצעת אופטימיזציה ממוקד רצף הדור הבא של איכות נמוכה וביופסיות גידול נמוכה כמות

כאן, אנו מספקים תיאור מפורט של התקנה ניסיונית עבור ניתוח של ההערכה של שלמות ה-DNA בתאי גזע לפני השתלת תא.

הערכת תקינות ה-DNA בתאי גזע לטיפול תאי הלב

ערכת האבחון המוצגת חליל-DNA היא שיטת חיסכון בזמן וידידותי למשתמש כדי לקבוע את ההסתברות האמינה של נוכחות של נגעים סרטן המעי הגס.

הערכה של סרטן המעי הגס סיכון ושכיחות על ידי שרפרף DNA זיהוי שלמות

מאמר זה מתאר שיטה לזהות שינויים של שבטים ושבטים תת-שבטיים בין דגימות שונות ממטופל נתון. למרות שהניסויים המתוארים כאן מתמקדים בסוג גידול מסוים, הגישה ישימה באופן כללי לגידולים מוצקים אחרים.

ניתוח נגעים השוואתית באמצעות גישה ממוקדת רצף

הציג כאן הוא פרוטוקול כדי לגלות את הגנים המובעות יתר שמירה על התאים הקבועים גזע הסרטן נגזר מתאי HT29 המעי הגס. RNAseq עם ביואינפורמטיקה זמין בוצע כדי לחקור והמסך רשתות ביטוי גנים להבהיר מנגנון פוטנציאלי מעורב בהישרדות של תאים סרטניים ממוקד.

גילוי של גנים הנהג ב המעי הגס HT29-נגזר סרטן גזע כמו Tumorspheres

פרוטוקול זה מציג מערכת תרבות חדשנית, חזקה וניתן לשחזור כדי ליצור ולגדל ספרואידים תלת מימדיים מתאי אדנוקרצינומה של המעי הגס Caco2. התוצאות מספקות את הוכחת הרעיון הראשונה לצורך ההתאמה של גישה זו לחקר ביולוגיה של תאי גזע סרטן, כולל התגובה לכימותרפיה.

מודל תלת מימדי של ספרואידים לחקר תאי גזע סרטניים המעי הגס

פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה וחסכונית לחקור ולכמת מוות תאי באורגנואידים אנושיים של המעי הגס בתגובה להפרעות ציטוטוקסיות כגון ציטוקינים. הגישה משתמשת בצבע מוות פלואורסצנטי של תאים (SYTOX Green Nucleic Acid Stain), במיקרוסקופ פלואורסצנטי חי ובתוכנת ניתוח תמונות בקוד פתוח כדי לכמת תגובות אורגנואיד יחיד לגירויים ציטוטוקסיים.

כימות מוות תאי הנגרם על ידי ציטוקינים באורגנואידים של המעי הגס האנושי באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי חי

למדו כיצד לכמת מוטציות סומטיות בתאי גזע המעי הגס לאחר חשיפה לסוכנים גנוטוקסיים. השיטה משתמשת בגן G6PD ובהבדלה צבעונית כדי לזהות קריפטות מוטנטיות במיקרוסקופ אור.

כימות של מוטציות בתאי גזע המעי הגס

גלה סרטונים נוספים