כימות של מוטציות בתאי גזע המעי הגס

המטרה הכוללת של הליך זה היא לכמת מוטציות סומטיות פנוטיפיות בגלוקוז שש פוספט דהידרוגנאז או בגן G 6 PD בתאי גזע של המעי הגס. לאחר טיפול בבעלי חיים עם חומרים גנוטוקסיים משוערים, זה מושג על ידי טיפול ראשון בבעלי חיים עם החומר הממתין פרק זמן מתאים כדי לאפשר לצאצאים של תא גזע הנושא מוטציה G 6 PD לאכלס קריפטה מלאה, להקריב את החיה, להסיר את המעי הגס וליצור אותו לגליל שוויצרי ולהקפיא את הרקמה בחנקן נוזלי. השלב השני הוא הכנת חלקים קפואים בעובי שבעה מיקרון על שקופיות מהמעי הגס באמצעות קריוסטט.

הרקמה מחוממת ל-37 מעלות צלזיוס ולאחר מכן נבנות בארות לכל צביעת רקמה סביב חלקי הרקמה. השלב האחרון הוא לדגור את חלקי הרקמה עם תערובת הצביעה G six PD ולאחר מכן לנתח את החלקים תחת מיקרוסקופ אור תאים עם פעילות G 6 PD צבועים בכחול, בעוד אלה עם מוטציות פנוטיפיות נראים לבנבן. בסופו של דבר, הכימות של קריפים מוטנטיים משמש לקביעת תדירות המוטציות.

טכניקה זו מודדת מוטציות סומטיות של גלוקוז שש פוספט דהידרוגנאז בתאי גזע, וזוהי אוכלוסיית התאים הקריטית בסרטן המעי הגס. על ידי זיהוי מוטציות בתאי גזע סומטיים, ניתן לתאם את תדירות המוטציות לאירועי סרטן המעי הגס בבעלי חיים שטופלו. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי מוטציות בתאי גזע במעי הגס, ניתן ליישם אותה גם על אורגניזמים או מערכות איברים אחרים.

אם ניתן לזהות נישה של תאי גזע, בדרך כלל אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו בהכנת תמיסת ה-MBT. ממיס. פתרון ה-MBT דורש תשומת לב קפדנית להוראות מפורטות. להתחיל להכין את תמיסת הצביעה ההיסטולוגית בשני מיליליטר של pH 7.4 מאגר פוספט ל-35 מיליליטר של טמפרטורת חיתוך אופטימלית, או מדיום OCT בשפופרת של 50 מיליליטר ולנער במרץ לשילוב באמצעות נייר pH.

אישר שהתמיסה היא בערך pH 7.4. לאחר מכן בגלוקוז שש פוספט ותמיסת DP ומגנזיום כלוריד מומסים במאגר פוספט כפי שמצוין בפרוטוקול הטקסט ושוב, אישרו כי ה-pH של התמיסה נשאר כ-7.4. הוסף תמיסת M-M-P-M-S וערבב במרץ.

זה אמור לגרום להומוגנאט אדום כהה שקוף לעטוף את התמיסה בנייר כסף כדי למזער את החשיפה לאור. אם התמיסה הופכת עכורה, יש להשליך אותה בזמן שאמבט שמן מתחמם. בנפרד, הכינו תמיסת אוליאום ניטרו כחול לטראז או MBT של חמישה מילי-מולרית על ידי ערבוב של 0.4 מיליליטר של דימתילפורממיד, 0.4 מיליליטר של אתנול נטול מים ו-MBT בצינור של שני מיליליטר עם מכסה טבעת O, אטמו את הצינור באופן רופף והביאו אותו לרתיחה נמרצת באמבט השמן עד להמסת ה-MBT.

לאחר מכן, הניחו לתמיסת ה-MBT להתקרר לטמפרטורת החדר ולאחר מכן הוסיפו אותה לתערובת תגובת ה-OCT. התמיסה עשויה לשנות את צבעה מאדום כתום ראשוני לאדום כהה או סגול עם הזמן. לאחר טיפול בבעלי חיים והכנת חלקים קפואים כפי שמצוין בפרוטוקול הטקסט, בנה בארות להכתמת רקמות באמצעות שתי מנקי פלדה המחוברים יחד עם שומן סיליקון התאימו את הבושם לבסיס מכונת הכביסה וחתכו את המרכז שבו תוצב התמיסה מוחלפת.

לפני המלחמה הרקמה הקפואה מחליקה בחדר לח של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לאחר מכן, הניחו את הבארות על השקופית כדי להקיף את חלקי הרקמה בכחצי מיליליטר מתערובת הצביעה G six PD שהוכנה קודם לכן לכל קטע רקמה היטב ודגרו למשך 45 עד 50 דקות. הסר את המגלשות מהחדר החם והסר בזהירות את בארות הנירוסטה מהמגלשות.

מניחים את השקופיות על הקצה הארוך ומסננים את תערובת התגובה, ולאחר מכן שטיפה של 30 עד 60 דקות ומאגר פוספט של 100 מילי-מולרי. כדי להסיר את העקבות הסופיים של תמיסת הצביעה G six PD, שטפו את השקופיות והמים נטולי היונים למשך חמש עד 10 דקות כדי להסיר שאריות מאגר פוספט. לבסוף, אטמו את הרקמה על ידי הוספת פלואורו ג'ל טיפתי לשקופית וייבשו במשך 30 דקות כדי לקבל תמונות לניתוח מאוחר יותר.

הנח את השקופית על מיקרוסקופ אור והתאם להגדלה של ארבעה DX. לאחר מכן צלם תמונות של קטע הרקמה המוכתמת עם מצלמת 5.0 מגה-פיקסל כדי להעריך את המספר הכולל של הקריפטות שנבדקו. עבור כל עכבר, בחר מקטע מהרמה עם שטח הפנים הקטן ביותר וצלם אותו בהגדלה של 10x.

ספרו את מספר ה-crips המוטנטיים. על פי הקריטריונים הבאים, הקריפטה כולה נטולת צבע כחול. המבנה החיצוני של הקריפטה שלם.

המוטאנט נצפה על שבעה מקטעים סמוכים של שבעה מיקרון ושני צופים מזהים את אותה קריפטה כמו מוטאנט. ספרו חזותית את מספר הקריפטות בקטע זה והכפילו במספר הרמות המוקרנות עבור כל נקודתיים. דוגמאות לקריפס מוטנטי שנצפו בעכברים שטופלו בחומר המזיק ל-DNA, אזוקסימתאן ניתן לראות כאן משמאל אתה רואה מבט אנכי או מלמעלה למטה של קריפטה מוטנטית.

בעוד שבצד ימין יש מבט אופקי או צדדי, כדי שקריפטה תוכרז כמוטנטית, כל התאים בתוך הקריפטה חייבים להישאר. קריפטות לבנות עם כמות קטנה של לבן נובעות מייצור ריר מתאי גביע. תדירות המוטציות מחושבת כמספר המוטציות שנצפו חלקי המספר הכולל של קריפטות שלא נבדקו אף מוטציה.

קריפסים נצפו במעי הגס מעכברי ביקורת המייצגים תדירות מוטציה של פחות מ-1 כפול 10 למינוס 5 בעוד שעכברים שטופלו באזוקסימתאן הראו תדירות מוטציה של תאי גזע של 4.44 כפול 10 למינוס 4 בעקבות הליך זה. ניתן לבצע שיטות אחרות, כמו ניתוח גנטי של סוג המוטציות של גלוקוז x פוספט דהידרוגנאז על מנת לענות על שאלות נוספות כמו כיצד החומר הכימי מקודד באופן שגוי למוטציה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד למדוד מוטציות בתאי גזע סומטיים בעכברים שטופלו בתרכובות מוטגניות ומסרטנות פוטנציאליות.