Name: שיבוש אנטי-ארסי של Biofilms פתוגניים באמצעות Lactonases תכנון הנדסי Quorum-מרווה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: חקור שיבוש ביופילמים חיידקיים באמצעות אנזימי quorum-quenching מעוצבים הנדסית. שיטה זו מאפשרת הערכה כמותית של השפעת Lactonases על A.baumannii S1 ומסייעת בפיתוח טיפולים אנטי-חיידקיים חדשים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מקרן המחקר האקדמי של משרד החינוך, והמועצה הלאומית למחקר רפואי והקרן הלאומית למחקר בסינגפור.

1. קריסטל ויולט Quantitation של ההיווצרות biofilm בא baumannii S1 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול תרבות 5 מיליליטר של א &#39; baumannii S1 במרק Lysogeny (LB) (tryptone 10 גרם / L, 5 גר &#39;/ L תמצית שמרים) על 30 מעלות צלזיוס בחממה רועדת (220 סל&quot;ד) במשך 16 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את התרבות של א &#39; baumannii S1 לOD רצוי 600 של 0.8. שימוש בצלחת 96-היטב, לחסן תרבות חיידקים (1: 100 דילול) לLB טרי המכילה 10 μl של אנזים GKL מטוהר (40 מ&quot;ג / מיליליטר); הנפח הסופי של התרבות החדשה הוא 100 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תרבות שליטה, כמו גם; זה לא יכיל כל אנזים. חזור על תנאים דומים ללהניב את המספר הרצוי של משכפל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסה את הצלחת עם מכסה ומניח אותו לתוך מיכל פלסטיק 10 ליטר אטום. דגירה את הצלחת על 30 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות לפני בעדינות הסרת התקשורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף בינוני LB הטרי עוד 100 μl להיטב דגירה הצלחת במשך 21 שעות על 30 מעלות צלזיוס. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר התקופה השנייה של דגירה, בעדינות להסיר את כל אמצעי התקשורת. שטוף את תא חיידקי פלנקטון עם מים סטריליים 200 μl. ודא שיש הפרעה מינימאלית בלבד לתאים במהלך כביסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 1% פתרון סגול גביש 100 μl לכל היטב דגירה במשך 15 דקות ב RT. הסר את הפתרון סגול גביש על ידי שטיפה היטב עם מים סטריליים 200 μl. חזור על לשטוף לעוד פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 33% חומצה אצטית 100 μl לכל היטב דגירה למשך 15 דקות עם רעד עדין; זה יהיה לפזר את הצבע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת את כמות biofilm נוצרה על ידי מדידת הספיגה של סגול קריסטל ב 600 ננומטר. כמות סגולה גביש היא פרופורציונלית לסכום של biofilm נוצר. </li></ol> 2. Confocal סריקת לייזר מיקרוסקופית של א &#39; baumannii S1 Biofilm <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול תרבות 5 מיליליטר של א &#39; baumannii S1 בLB על 30 מעלות צלזיוס בחממה רועדת (220 סל&quot;ד) במשך 16 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוֹדָעָהרק התרבות של א &#39; baumannii S1 לOD רצוי 600 של 0.8. באמצעות μ-צלחת עם תחתית זכוכית 35 מ&quot;מ, לחסן תרבות חיידקים (1: 100 דילול) לLB טרי המכילה 30 μl של אנזים GKL מטוהר (40 מ&quot;ג / מיליליטר); הנפח הסופי של התרבות החדשה הוא 1 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסה את μ-הצלחת עם מכסה ומניח אותו במכל פלסטיק אטום 10 ליטר. דגירה μ-הצלחת על 30 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות לפני בעדינות הסרת התקשורת. הוסף 30 μl של אנזים GKL מטוהר ובינוני טריים, הבאתו להיקף כולל של 1 מיליליטר. דגירה עבור שעות 21 נוספות על 30 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 2.3 ודגירת μ-התבשיל לשעה עוד 24 על 30 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, להסיר את המדיה בעדינות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl של 5 מיקרוגרם / מיליליטר 488 מצומדות- agglutinin אלכס Fluo נבט חיטה (WGA) מומס בתמיסת מלח המאוזן של האנק (HBSS) לμ-הצלחת ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות; זה יהיה כתם biofilm נוצר. הסר את הפתרון מכתים ולשטוף tהוא μ-צלחת עם 2 מיליליטר של HBSS. חזור על השלב לשטוף עוד פעם אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl של פורמלדהיד 3.7% מומסים בHBSS ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות; זה יהיה לתקן את biofilm על μ-הצלחת. לשטוף את μ-צלחת פעם אחת עם 2 מיליליטר של HBSS ולאחר מכן להסיר את הפתרון לחלוטין. קבוע עם biofilm μ-הצלחת ניתן לאחסן בחושך על 4 מעלות צלזיוס לפני ההדמיה CLSM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדמיה CLSM וניתוח, להשתמש 63 הגדלת פעמים כדי ליצור 97 ערימות לכל תמונה עם מרווח של 0.21 מיקרומטר לערימה. </li></ol>

<ol><li>Alanis, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistance+to+antibiotics%3A+are+we+in+the+post-antibiotic+era%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+medical+research%22%5BJournal%5D)">Resistance to antibiotics: are we in the post-antibiotic era?</a> Archives of medical research. 36, 697-705 (2005).</li>
<li>Cegelski, L., Marshall, G. R., Eldridge, G. R., Hultgren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+and+future+prospects+of+antivirulence+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The biology and future prospects of antivirulence therapies.</a> Nature reviews. Microbiology. 6, 17-27 (2008).</li>
<li>LaSarre, B., Federle, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploiting+quorum+sensing+to+confuse+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+molecular+biology+reviews+%3A+MMBR%22%5BJournal%5D)">Exploiting quorum sensing to confuse bacterial pathogens.</a> Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 77, 73-111 (2013).</li>
<li>Waters, C. M., Bassler, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quorum+sensing%3A+cell-to-cell+communication+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Quorum sensing: cell-to-cell communication in bacteria.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 21, 319-346 (2005).</li>
<li>Rasko, D. A., Sperandio, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-virulence+strategies+to+combat+bacteria-mediated+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Drug+discovery%22%5BJournal%5D)">Anti-virulence strategies to combat bacteria-mediated disease.</a> Nature reviews. Drug discovery. 9, 117-128 (2010).</li>
<li>Lazar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quorum+sensing+in+biofilms--how+to+destroy+the+bacterial+citadels+or+their+cohesion%2Fpower%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Anaerobe%22%5BJournal%5D)">Quorum sensing in biofilms--how to destroy the bacterial citadels or their cohesion/power?</a> Anaerobe. 17, 280-285 (2011).</li>
<li>Costerton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+Biofilms%3A+A+Common+Cause+of+Persistent+Infections%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bacterial Biofilms: A Common Cause of Persistent Infections.</a> Science. 284, 1318-1322 (1999).</li>
<li>Perez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+challenge+of+multidrug-resistant+Acinetobacter+baumannii%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Global challenge of multidrug-resistant Acinetobacter baumannii.</a> Antimicrob Agents Chemother. 51, 3471-3484 (2007).</li>
<li>Tay, S. B., Yew, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+quorum-based+anti-virulence+therapeutics+targeting+Gram-negative+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+molecular+sciences%22%5BJournal%5D)">Development of quorum-based anti-virulence therapeutics targeting Gram-negative bacterial pathogens.</a> International journal of molecular sciences. 14, 16570-16599 (2013).</li>
<li>Igarashi, J., Suga, H. Ch. 19. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aIgarashi%2C+J+%22Quorum+Sensing%22">Quorum Sensing</a>. Rumbaugh, K. P. 692, Methods in Molecular Biology. Humana Press. 265-274 (2011).</li>
<li>Ng, F. S., Wright, D. M., Seah, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+phosphotriesterase-like+lactonase+from+Sulfolobus+solfataricus+and+its+immobilization+for+disruption+of+quorum+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+environmental+microbiology%22%5BJournal%5D)">Characterization of a phosphotriesterase-like lactonase from Sulfolobus solfataricus and its immobilization for disruption of quorum sensing.</a> Applied and environmental microbiology. 77, 1181-1186 (2011).</li>
<li>Stacy, D. M., Welsh, M. A., Rather, P. N., Blackwell, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuation+of+quorum+sensing+in+the+pathogen+Acinetobacter+baumannii+using+non-native+N-Acyl+homoserine+lactones%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">Attenuation of quorum sensing in the pathogen Acinetobacter baumannii using non-native N-Acyl homoserine lactones.</a> ACS chemical biology. 7, 1719-1728 (2012).</li>
<li>Chow, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+a+thermostable+quorum-quenching+lactonase+from+the+amidohydrolase+superfamily%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of a thermostable quorum-quenching lactonase from the amidohydrolase superfamily.</a> The Journal of biological chemistry. 285, 40911-40920 (2010).</li>
<li>Chow, J. Y., Yang, Y., Tay, S. B., Chua, K. L., Yew, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+biofilm+formation+by+the+human+pathogen+Acinetobacter+baumannii+using+engineered+quorum-quenching+lactonases%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Disruption of biofilm formation by the human pathogen Acinetobacter baumannii using engineered quorum-quenching lactonases.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58, 1802-1805 (2014).</li>
<li>Pour, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+formation+by+Acinetobacter+baumannii+strains+isolated+from+urinary+tract+infection+and+urinary+catheters%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+immunology+and+medical+microbiology%22%5BJournal%5D)">Biofilm formation by Acinetobacter baumannii strains isolated from urinary tract infection and urinary catheters.</a> FEMS immunology and medical microbiology. 62, 328-338 (2011).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

בשני הסטים של ניסוי, א baumannii S1 היה בתרבית בתקשורת LB ללא NaCl כריכוז מלח גבוה יכול להפחית את כמות biofilm נוצרה על ידי החיידקים 15. נוכחותו של חפץ כזה יכול לזלזל בסכום של biofilm נוצר, כמו גם את ההשפעות של אנזימי מרווה-מניין פני תנאי טיפול שונים. השימוש באנזים catalytically פעיל הוא חשוב כביקורת שלילית לחסל את ההשפעות אפשריות של תפיסת אנזים. איור מציג 1 שגם אם אנזימים פעילים לעקל מולקולות מניין, היווצרות biofilm לא תופרע. ...

אפשרויות טיפול במחלות זיהומיות כבר מסובכות על ידי הגידול המהיר בחיידקים עמיד multidrug כי הם חסינים מפני מגוון רחב של תרופות אנטיביוטיות 1. עם תחלואה גבוהה ושיעורי תמותה מזיהומים בתיווך חיידקים עמידים, יש צורך להסלים תהליכי פיתוח תרופות ו / או לחקור חלופות אנטי בקטריאלי טובים יותר כדי לשפר את האפשרויות טיפוליות. בזמן האחרון, הגישה האנטי-האלימות היא צוברת ריבית נתון את הפוטנציאל שלה במניעת אלימות באמצעות שיטות לא-bactericidal, ומכאן מקלים הסיכונים של מנגנוני התנגדות 2. מניין החישה היא &quot;מתג ראשי&quot; בארסיות ושיבוש תופעת איתות זה חיידקים הוא שיטה אנטי-אלימות נגד מבטיחה פתוגנזה 3. תחילתה של אלימות דורשת ההצטברות של מולקולות מניין בסביבה תאית לאחר שהגיעה לצפיפות אוכלוסיית חיידקים קריטית. כקווהמולקולות רום מפוזרות בחזרה לתוך המטריצה ​​תאית, מחייב עם קולטנים המקור שלהם מובילה להפעלה של גורמים ארסי כמו גם גנים הקשורים לעמידות לאנטיביוטיקה והיווצרות biofilm 4. בשיבוש כללי, מניין חישה כרוך עיכוב מולקולת מניין ואינטראקציה קולט מבלי להשפיע על מסלולי מטבוליים עיקריים. מכאן, שאין לה שום השלכה ישירה על צמיחה סלולרית. מאז כושר לא נפגעים, יש לחץ בחירה מינימאלי לחיידקים להתפתח ולהשיג התנגדות נגד טיפולים כגון 5. בנוסף, הפרעה מניין חישה יכולה להפריע למנגנוני הגנת חיידקים טבועים, כמו במקרה של היווצרות biofilm, המספקת הגנה מפני חומרים אנטי-בקטריאלי ויארח את תגובה חיסונית. הערכה היא כי 99% מחיידקים על פני כדור הארץ קיימים במטריצות כמו biofilm-מורכבות, המקנות יתרונות הישרדות חיוניות למיקרואורגניזמים שחיים בתוך המבני ESE 6. יותר מכך, היווצרות של תחומים נייחים אלה היא הסיבה לזיהומים נרכשים בבית חולים מתמשכים והכרוניים ביותר 7. Acinetobacter baumannii היא אחד מגורמי המחלה האנושיים הגדולים שמזוהה עם זיהומים נרכשים בבית חולים העולמיים והארסיות שלה מיוחסת במידה רבה למניין חישה היווצרות biofilm תיווך 8. אנזימים-מרווה מניין שימשו בהצלחה בשיבוש העברת אותות בתיווך מניין על ידי מיקוד קבוצה של תרכובות המכונית lactones -acyl N homoserine (AHLs) המיוצרים על ידי חיידקים גראם-שלילי 9. גם מספר מחקרים הרחיבו את השימוש באנזימים אלה כדי לחסום פתוגנזה של חיידקים באמצעות הפחתת מספרי ביטוי גורם ארסיות ותא בbiofilms 10,11. למרבה הצער, יש עדיין חוסר ההפגנה מוחשית של השימוש היעיל של אנזימי מרווה-מניין נגד היווצרות biofilm ידי חיידקים פתוגנים.מחדש נעשו ניסיונות להשתמש מעכבי מניין (אנלוגים AHL), במקום אנזימי מרווה-מניין, לשבש א היווצרות biofilm baumannii 12. למרות ששיטה זו של שימוש במעכבי מולקולות קטנות היא גישה חוקית, שמירה על הזמינות הביולוגית שלה בשימושים translational יכולה להיות אתגר. להיפך, השימוש באנזימי מרווה-מניין קטליטי יכול לעקוף את הבעיה הזמינות הביולוגית כאנזימים הם נוחים יותר לחוסר תנועה על משטחים של מכשירים ביו-רפואיים להשפעות טיפוליות. כאן אנו מתארים הערכה של ההשפעות של lactonases מרווה-מניין מהונדס מkaustophilus Geobacillus (GKL) 13 על היווצרות biofilm חיידקים, באמצעות מכתים סגול גביש ומיקרוסקופיה confocal סריקת לייזר (CLSM). מחקר זה הוא ההפגנה המוצלחת הראשונה של שיבוש biofilm בא רלוונטי קליני זן baumannii S1 באמצעות אנזימי מרווה-מניין. השיטות שתוארובמחקר זה הם שימושיים להערכת יעילותם של אנזימי מרווה-מניין אחרים במאמצי פיתוח טיפוליים שלאחר מכן נגד חיידקים גראם שלילית פתוגניים.

<table><tbody><tr><td>טריפטון&nbsp;</td><td>תמצית</td> שמרים BD <td>211705</td><td></td></tr><tr><td></td><td>BD</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>צלחת 96 בארות</td><td>Costar</td><td>3596</td><td></td></tr><tr><td>קריסטל סגול</td><td>סיגמא-אולדריץ</td>' <td>C6158</td><td></td></tr><tr><td>סריקת מעבדה</td><td>חומצה אצטית</td><td>PLA00654X</td><td>זהירות: דליק</td></tr> <tr><td>&mu;-צלחת</td><td>Ibidi</td><td>80136</td><td></td></tr><tr><td>Alex Fluo 488-מצומד WGA</td><td>Invitrogen</td><td>W11261</td><td></td></tr><tr><td>האנק' תמיסת מלח מאוזנת&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>141475095</td><td></td></tr><tr><td>פורמלדהיד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>F8775</td><td>זהירות: מאכל&nbsp;</td></tr><tr><td>Synergy HT Microplate Reader</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1X-81 מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך</td><td>אולימפוס</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

שיבוש אנטי-ארסי של biofilms פתוגניים באמצעות lactonases תכנון הנדסי quorum-מרווה

Anti-virulent Disruption of Pathogenic Biofilms using Engineered Quorum-quenching Lactonases

הופעתם המהירה של חיידקים עמידים לתרופות מרובות האיצה את הצורך בגישות טיפוליות חדשות כדי להתמודד עם זיהומים מסכני חיים. התמדה של זיהום חיידקי קשורה לעתים קרובות להיווצרות ביופילם בתיווך חישת מניין. לפיכך, השיבוש של מעגל איתות זה מציג אסטרטגיה אטרקטיבית נגד אלימות. לקטונאזות מרוות מניין דווחו כמשבשים יעילים של מעגלי חישת מניין. עם זאת, היו מעט מאוד דיווחים על שימוש יעיל באנזימים אלה בשיבוש היווצרות ביופילם חיידקים. פרוטוקול זה מתאר שיטה לשיבוש היווצרות ביופילם בזן A. baumannii S1 רלוונטי מבחינה קלינית באמצעות שימוש בלקטונאז מהונדס מרווה מניין. Acinetobacter baumannii הוא פתוגן אנושי עיקרי המעורב בזיהומים חמורים הנרכשים בבתי חולים ברחבי העולם והאלימות שלו מיוחסת בעיקר לעקשנות הביופילם שלו. הטיפול המהונדס בלקטונאז השיג הפחתה משמעותית של ביופילם A. baumannii S1. מחקר זה הראה גם את האפשרות להשתמש באנזימים מהונדסים למרווה מניין בטיפול עתידי במחלות חיידקיות בתיווך ביופילם. לבסוף, ניתן להשתמש בשיטה כדי להעריך את כשירותם של אנזימים מבטיחים למרוות מניין.

בניסוי quantitation הסגול גביש, שני אנזימי מרווה-מניין שמשו כדי להדגים היתכנות בשיבוש היווצרות biofilm: פרא-הסוג GKL ומוטציה משופר GKL כפולה (E101G / R230C). שני האנזימים הוכחו להפגין פעילות lactonase נגד 3-הידרוקסי-decanoyl-L-homoserine לקטון (3-OH-C 10 -HSL), מולקולת המניין המרכזית בשימוש על ידי א &#39; baumannii S1 14. להערכה תקפה של שיבוש biofilm, האנזימים שלהם בהתאמה catalytically לא פעילים (הראו בעבר שלא לעקל li...

אנזימים מרווה מניין הם אפשרויות אנטי-אלימות ואנטי-בקטריאליות שיכולות להפחית פתוגנזה ללא סיכון ליצירת עמידות, על ידי מניעת ביטוי של גורמי אלימות וגנים הקשורים לעמידות לאנטיביוטיקה והיווצרות ביופילם. במחקר זה, אנו מדווחים על שיטה המדגימה את יעילותם של אנזימים מרווים מניין בשיבוש ביופילם חיידקי.

שיבוש אנטי-ארסי של Biofilms פתוגניים באמצעות Lactonases תכנון הנדסי Quorum-מרווה

The rapid emergence of multi-drug resistant bacteria has accelerated the need for novel therapeutic approaches to counter life-threatening infections. The ...

המטרה הכללית של ניסוי זה היא להדגים את היעילות של אנזימים למעכבי תواصل בין-חיידקי (quorum-quenching) בפירוק של ביופילם חיידקי. שיטה זו תסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הטיפולים האנטי-בקטריאליים, ותעזור להבין את ההשפעה של לקטונזות מעכבות תواصل על חיידקים פתוגניים בתוך סביבת ביופילם. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן להוסיף לקטונזות מעכבות תواصل באופן ישיר בסביבה של in vitro.כך, ניתן לכמת בקלות את השפעתו על פירוק הביופילם. טרנס טיי, טכנאי במעבדתנו, מדגים הליך זה. לתחילת הפעולה, גדלו תרבית של 5 mililiter של A.baumannii S1 ב-LB בטמפרטורה של 30 degrees Celsius באינקובטור עם ניעור למשך 16 שעות.כוונן את התרבית לצפיפות אופטית (OD 600) של 0.8. לאחר מכן, השתמש במצע LB טרי המכיל 4 mg/mL של אנזים GKL מופק כדי לדלל את התרבית ביחס של 1:100. הוסף 100 µL לבארים של פלטת 96 באריים.השתמשו במכסים כדי לכסות את הפלטות, והניחו אותן בתוך מיכל פלסטיק של 10 liter. אטמו את המיכל והדגירו בטמפרטורה של 30 °C למשך שלוש שעות, לפני הסרה עדינה של המצע. הוסיפו 100 µL נוספים של מצע LB טרי לבארים, והדגירו את הפלטה בטמפרטורה של 30 °C למשך 21 שעות.לאחר הסרה עדינה של המצע, השתמש ב-200 µL של מים סטריליים כדי לשטוף בעדינות את תאי החיידקים הפלנקטוניים. מקם את קצה הפפיטה בתחתית הבאר והסר בזהירות את המצע הנוזלי כדי להבטיח הפרעות מינימליות לביופילם שנוצר בין הממשק של האוויר לנוזל. לאחר מכן, הוסף 100 µL של תמיסת crystal violet בריכוז 1% לכל באר, והדกร ל-15 דקות בטמפרטורת החדר.הסיר את תמיסת ה-crystal violet על ידי שטיפת הבארות שלוש פעמים עם 200 µL של מים סטריליים. הוסף 100 µL של 33% acetic acid לכל בארה והדגר עם ניעור עדין למשך 15 דקות כדי להמיס את הצבע. קבע כמותית את כמות הביופילים על ידי מדידת הבליעה של ה-crystal violet באורך גל של 600 nm.כמות הקריסטל סגול (crystal violet) פרופורציונלית לכמות הביופילם שנוצר. לצורך ביצוע מיקרוסקופיית סריקה בלייזר קונפוקלית, או CLSM, של ביופילמים של A.baumannii S1, גדלו תרבית של 5 מיליליטר של A.baumannii S1 במדיום LB בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס באינקובטור עם ניעור למשך 16 שעות. התאימו את תרבית ה-A.baumannii S1 לערך OD 600 של 0.8.לאחר מכן, השתמש במצע LB טרי המכיל 1.2 mg/mL של אנזים GKL מופרש כדי לדלל את התרבית ביחס של 1:100, והוסף 1 mL למיקרו-צלחת עם תחתית זכוכית בנפח 35 mL. כס את המיקרו-צלחת במכסה, הנח אותה בתוך מכל פלסטיק בנפח 10 L ואטום אותו לפני דגירה של הצלחת בטמפרטורה של 30 °C למשך שלוש שעות. לאחר הסרה עדינה של המצע, הוסף 1 mL של מצע טרי המכיל 30 µL של אנזים GKL מופרש, ולאחר מכן דגור בטמפרטורה של 30 °C למשך 21 שעות נוספות.הסר בעדינות את המצע פעם שנייה והחלף אותו ב-1 mL נוסף של אנזים GKL במצע טרי. דגרא ב-30 °C למשך 24 שעות. לאחר הדגירה, הסר בעדינות את המצע והוסף 500 µL של wheat germ agglutinin המשורשר ל-Alexa Fluor 488 בריכוז של 5 µg/mL המומס ב-HBSS.דגרו את המיקרו-צלחת בטמפרטורה של 37 °C למשך 30 דקות כדי לצבוע את הביופילמים. כדי לקבע את הביופילמים, הוסיפו 500 µL של 3.7% formaldehyde המומס ב-HBSS ודגרו בטמפרטורה של 37 °C למשך 30 דקות. השתמשו ב-2 mL של HBSS כדי לשטוף את המיקרו-צלחת פעם אחת, ולאחר מכן הסירו את התמיסה לחלוטין.יש לאחסן את הצלחת בחושך בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס לפני הדמיית CLSM. לצורך הדמיה ואנליזה ב-CLSM, השתמש בעדשה אובייקטיבית 63X כדי להפיק 97 שכבות (stacks) לכל תמונה, במרווח של 0.21 מיקרון לכל שכבה. בניסוי הכמות של קריסטל ויולה, נעשה שימוש ב-GKL מסוג Wild-type ובאנזים quorum-quenching GKL משופר בעל מוטציה כפולה, לצורך פעילות לקטונאז נגד three hydroxydecanoyl l homoserine lactone או 3OHC10HSL, מולקולת ה-quorum המרכזית המשמשת את A.baumanii S1. כפי שמוצג כאן, שני האנזימים הצליחו להפחית באופן משמעותי את היווצרות הביופילמים ב-Wild-type A.baumanii S1 שעבר טיפול מקדים. מידת פירוק הביופילמים על ידי שני האנזימים אינה פרופורציונלית ליעילותם נגד 3OHC10HSL.כפי שניתן לראות בטבלה זו, קצב התחלופה של ה-GKL המוטנטי מהיר פי שישה מאשר GKL מסוג הפרא (Wild-type) כנגד 3OHC10HSL. עם זאת, ההבדל במידת פירוק הביופילם בין האנזימים הוא רק פי שניים. בניסוי זה, נעשה שימוש באנזים GKL המוטנטי המשופר ובאנזים הבלתי פעיל קטכולית שלו לצורך השוואה.תמונה זו ב-DIC מראה כי טיפול עם אנזים מוטנטי משופר של GKL הוביל להפחתה בגודל הביופילם בהשוואה לאנזים לא פעיל. ניתוח של תמונות הפלואורסצנציה חשף גם הפחתה בשטח הפנים, בביומסה וב עובי הממוצע של הביופילמים, כאשר הם טופלו באנזים המוטנטי המשופר של GKL. לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו בשלוש עד ארבע שעות, למעט זמן הדגירה, אם היא מבוצעת כהלכה.בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור למזער את הסרת הביופילם והשיבוש שלו במהלך שלבי השטיפה. לאחר ביצוע פרוצדורה זו, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון ספירת תאים ובדיקות יציבות אנזימטית. הדבר יענה על שאלות נוספות, כגון השפעת לקטונזים למניעת רצף (quorum-quenching lactonases) על אוכלוסיית התאים בתוך הביופילם, וכן על משך פעולתם.לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום הטיפול במחלות זיהומיות לבחון את השפעותיהם של לקטונאזות פוטנציאליות למשקיעת רצף (quorum-quenching) בביופילם המיוצר על ידי חיידקים פתוגניים. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה בידיכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לכמת פגיעה בביופילם באמצעות צביעה בקריסטל ויולט, ולהעריך שינויים מורפולוגיים בביופילם באמצעות דימיון קונפוקלי. אל תשכחו שעבודה עם חומרים פתוגניים עלולה להיות מסוכנת ביותר.יש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון שימוש במתקני בלימה של סיכונים ביולוגיים מתאימים, בעת ביצוע הליך זה.

anti-virulent-disruption-pathogenic-biofilms-using-engineered-quorum

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

מקור: טיי, ס. ב. ואחרים. הפרעה אנטי-וירולנטית של ביופילמים פתוגניים באמצעות לקטונאזות מהונדסות לכיבוי קוורום.  J. Vis. Exp. (2016)הסרטון מדגים שיטה לכימות ביומסה ביופילמית בחיידק פתוגני, תוך השוואת מערכות ביקורת לא מטופלות לדגימות שטופלו באנזים שמדביר קווארום. האנזים משבש את איתות החיידקים במהלך הדגירה המוקדמת, ומפחית את ההיצמדות של התא. לאחר שטיפה והמשך דגירות, בארות הבקרה יוצרות ביופילמים צפופים, בעוד שבארות מטופלות מראות היווצרות מופחתת. צבע קטיוני משמש לצביעת הביופילם, ונמדד ספיגה להערכת...

כימות דיכוי ביופילם המושר על ידי אנזימים בחיידקים פתוגניים

מקור: טיי, ס. ב., et.al. הפרעה אנטי-וירולנטית של ביופילמים פתוגניים באמצעות לקטונאזות מהונדסות לכיבוי קוורום.  J. Vis. Exp. (2016)הסרטון הזה מדגים את תהליך עיכוב היווצרות ביופילם על ידי הכנסת אנזים שמפריע לאיתות תאי חיידקים. האנזים מונע מהחיידקים לייצר חומרים פולימריים חוץ-תאיים, ובכך מפחית את התפתחות הביופילם על מיקרודיסה עם תחתית זכוכית. לבסוף, מבנה הביופילם מוצג באמצעות לקטין פלואורסצנטי ומיקרוסקופ סורקת לייזר קונפוקלי.

הערכה מיקרוסקופית של עיכוב היווצרות ביופילם בתיווך אנזימים

מחקר זה מציג את הפיתוח של מתודולוגיות הניתנות לשחזור לחקר מעכבי ביופילם והשפעותיהם על Bacillus subtilis multicellularity.

מתודולוגיות לימוד<em&gt; B. subtilis</em&gt; Biofilms כמודל לאפיון מולקולה קטנה Biofilm מעכבי

זיהומי ביופילם מראים סבילות גבוהה לכימותרפיה. אין בדיקה אחת שתופסת את המורכבות של ביופילמים. במקום זאת, יש צורך בבדיקות משלימות. אנו מציגים פלטפורמת סינון (שפותחה עבור S. aureus) המשלבת מבחני כדאיות, ביומסה ומטריצת ביופילם. זה מאפשר גילוי תרופות אנטי-ביופילם, כולל הערכה של השפעות כימותרפיות ארוכות טווח.

פלטפורמה של מבחנים אנטי biofilm המתאים לחקירת ספריות תרכובת טבעיות

שינויים אנטי-מיקרוביאליים בארכיטקטורת הביופילם Pseudomonas aeruginosa שונים בין מבודדים קליניים שגודלו בתרבית מחולים עם סיסטיק פיברוזיס וזיהום ריאתי כרוני. לאחר מיקרוסקופיה קונפוקלית, ניתן להשתמש בתוכנת COMSTAT כדי לכמת וריאציות בארכיטקטורת ביופילם (למשל, שטח פנים, עובי, ביומסה) עבור מבודדים בודדים כדי להעריך את היעילות של חומרים אנטי זיהומיים.

כימות ההשפעות של אנטי-מיקרוביאלים על ארכיטקטורת ביופילם במבחנה באמצעות תוכנת COMSTAT

פרוטוקול זה מציג מתודולוגיה לביצוע צמיחת ביופילם ומדידות ביומסה באמצעות התקני לוח PCR עמוקים בהרכבה עצמית עבור הקרנת ביופילם סטטית של מכסה 96-היטב.

ייצור ביופילם ביומסה חיידקית גדולה יותר באמצעות מכשירי מיקרופלאט עמוק באר עמוקה צלחת PCR

פרוטוקול זה מתאר גישה המשלבת שיטות סטטיות ודינמיות להערכת יעילותן של חומצות פרוקסי אורגניות למיגור ביופילמים בתעשיית החלב. גישה זו עשויה לשמש גם לבדיקת יעילותן של פורמולציות ביולוגיות או כימיות חדשות לשליטה בביופילמים.

הערכת יעילותן של חומצות פרוקסי אורגניות למיגור ביופילמים חלביים בגישה המשלבת שיטות סטטיות ודינמיות

תרכובות Thiophenesulfonamide הן מעכבים חזקים וספציפיים של ויסתי חישת Vibrio quorum LuxR/HapR החוסמים את פעילותם in vivo, ובכך מונעים שעתוק גנים לאלימות, תנועתיות וביופילמים. פרוטוקול זה מפרט כיצד תרכובות אלה מסונתזות, מעוצבות בסיליקו, ונבדקות in vivo לפעילות נגד LuxR/HapR.

סינתזה ובדיקה של מעכבי חישת מניין Vibrio

מטרת פרוטוקול זה היא לכמת את ייצור הוויולצאין על ידי Chromobacterium violaceum ATCC 12472 כפרוקסי להערכת עיכוב חישת מניין על ידי תרכובות ביו-אקטיביות.

כימות ויולאצין ב - Chromobacterium violaceum ועיכובו על ידי תרכובות ביו-אקטיביות

Biofilms חיידקים הם בדרך כלל מהווים ידי subpopulations שונים של תאים מיוחדים. מתא בודד ניתוח subpopulations אלה מחייב שימוש כתבים ניאון. כאן אנו מתארים את פרוטוקול לחזות ולפקח subpopulationswithin...

מתא בודד ניתוח בצילוס subtilis Biofilms באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ו cytometry זרימה

חקור שיבוש ביופילמים חיידקיים באמצעות אנזימי quorum-quenching מעוצבים הנדסית. שיטה זו מאפשרת הערכה כמותית של השפעת Lactonases על A.baumannii S1 ומסייעת בפיתוח טיפולים אנטי-חיידקיים חדשים.

שיבוש אנטי-ארסי של Biofilms פתוגניים באמצעות Lactonases תכנון הנדסי Quorum-מרווה

גלה סרטונים נוספים