שיבוש אנטי-ארסי של Biofilms פתוגניים באמצעות Lactonases תכנון הנדסי Quorum-מרווה

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא להדגים את יעילותם של אנזימים מרווים מניין בשיבוש ביופילם חיידקי. שיטה זו תעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הטיפולים האנטי-בקטריאליים, ולסייע בהבנת ההשפעה של לקטונאזות מרוות מניין על חיידקים פתוגניים בסביבת ביופילם. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן להוסיף לקטונאזות מרוות מניין ישירות בסביבת מבחנה.

לפיכך, השפעתו על שיבוש ביופילם ניתנת לכימות בקלות. מדגים את ההליך הזה הוא טרנס טיי, טכנאי במעבדה שלנו. כדי להתחיל, גדל תרבית של 5 מיליליטר של A.baumannii S1 ב-LB ב-30 מעלות צלזיוס באינקובטור רועד למשך 16 שעות.

התאם את התרבית ל-OD 600 של 0.8. לאחר מכן השתמש ב-LB טרי המכיל 4 מיליגרם למיליליטר של אנזים GKL מטוהר כדי לדלל את התרבית מאחד ל-100. ולהוסיף 100 מיקרוליטר לבארות של צלחת של 96 בארות.

השתמש במכסים כדי לכסות את הצלחות, והניח אותם בכלי פלסטיק של 10 ליטר. אוטמים את המיכל ודוגרים בחום של 30 מעלות צלזיוס למשך שלוש שעות, לפני שמסירים בעדינות את המדיום. מוסיפים לבארות עוד 100 מיקרוליטר של מדיום LB טרי, ומדגרים את הצלחת בחום של 30 מעלות צלזיוס למשך 21 שעות.

לאחר הסרת המדיום בעדינות, השתמש ב-200 מיקרוליטר מים סטריליים כדי לשטוף בעדינות את תאי החיידקים הפלנקטוניים. מקם את קצה הפיפטה בתחתית הבאר והסר בזהירות את המדיום הנוזלי כדי להבטיח הפרעות מינימליות על הביופילם הזר בין ממשק האוויר לנוזל. לאחר מכן מוסיפים 100 מיקרוליטר של תמיסת סגול קריסטל 1% לכל באר, ודוגרים למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.

הסר את תמיסת הקריסטל הסגולה באמצעות 200 מיקרוליטר מים סטריליים לשטיפת הבארות שלוש פעמים. מוסיפים 100 מיקרוליטר של חומצה אצטית 33% לכל באר ודוגרים בניעור עדין למשך 15 דקות להמסת הצבע. כמת את כמות הביופילם על ידי מדידת הספיגה של סגול גביש ב-600 ננומטר.

כמות הקריסטל סגול פרופורציונלית לכמות הביופילם שנוצר. כדי לבצע מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי, או CLSM, של ביופילמים של A.baumannii S1, גדל תרבית של חמישה מיליליטר של A.baumannii S1 ב-LB ב-30 מעלות צלזיוס באינקובטור רועד למשך 16 שעות. התאם את התרבית של A.baumannii S1 ל-OD 600 של 0.8.

לאחר מכן השתמש ב-LB טרי המכיל 1.2 מיליגרם למילטר של אנזים GKL מטוהר כדי לדלל את התרבית, אחד עד 100, והוסף מיליליטר אחד למיקרו-צלחת עם תחתית זכוכית של 35 מיליליטר. מכסים את המיקרוצלחת במכסה ומניחים אותה בכלי פלסטיק של 10 ליטר ואוטמים אותה לפני הדגירה של המנה בחום של 30 מעלות צלזיוס למשך שלוש שעות. לאחר הסרת המדיום בעדינות, הוסיפו מילטר אחד של מדיום טרי המכיל 30 מיקרוליטר של אנזים GKL מטוהר ואז דגרו בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך 21 שעות נוספות.

הסר בעדינות את המדיום בפעם השנייה והחלף במיליליטר אחר של אנזים GKL במדיום טרי. דגירה של 30 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. לאחר הדגירה, הסר בעדינות את המדיום והוסף 500 מיקרוליטר של חמישה מיקרוגרם למיליליטר של Alexa Fluor 488 נבט חיטה מצומד אגלוטינין מומס ב-HBSS.

דגרו את המיקרוצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי להכתים את הביופילמים. כדי לתקן את הביופילמים, הוסיפו 500 מיקרוליטר של 3.7% פורמלדהיד מומס ב-HBSS ודגרו ב-37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. השתמש בשני מיליליטר של HBSS כדי לשטוף את המיקרוצלחת פעם אחת, ואז הסר את התמיסה לחלוטין.

אחסן את המנה בחושך בארבע מעלות צלזיוס לפני הדמיית CLSM. להדמיה וניתוח CLSM, השתמש במטרה של פי 63 כדי ליצור 97 ערימות לתמונה במרווח של 0.21 מיקרון לערימה. בניסוי כימות סגול גבישי, GKL מסוג Wild ואנזים מרווה מניין כפול מוטנטי משופר GKL שימשו לפעילות לקטונאז כנגד שלושה הידרוקסידקנויל l הומוסרין לקטון או 3OHC10HSL, מולקולת המניין העיקרית המשמשת את A.baumanii S1.As המוצגת כאן, שני האנזימים הצליחו להפחית משמעותית את היווצרות הביופילמים ב-A.baumanii S1 מסוג Wild שטופל מראש. מידת ההפרעה לביופילם על ידי שני האנזימים אינה פרופורציונלית ליעילותם כנגד 3OHC10HSL.

כפי שניתן לראות בטבלה זו, קצב התחלופה של ה-GKL המוטנטי מהיר פי שישה מ-GKL מסוג Wild לעומת 3OHC10HSL. עם זאת, ההבדל במידת ההפרעה של ביופילמים בין האנזימים הוא כפול בלבד. בניסוי זה, האנזים המוטנטי המשופר GKL והאנזים הלא פעיל שלו שימשו להשוואה.

תמונת DIC זו מראה כי טיפול באנזים המוטנטי המשופר GKL הביא לירידה בגודל הביופילם בהשוואה לאנזים הלא פעיל. ניתוח תמונות הקרינה גילה גם כי חלה ירידה בשטח הפנים, בביומסה ובעובי הממוצע של ביופילמים, כאשר טופלו באנזים המוטנטי המשופר GKL. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שלוש עד ארבע שעות, לא כולל זמן הדגירה אם היא מבוצעת כראוי.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור למזער את ההסרה וההפרעה של הביופילם במהלך שלבי הכביסה. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו ספירת תאים ובדיקות יציבות אנזימים. זה יענה על שאלות נוספות כמו ההשפעות של לקטונאזות מרוות מניין על אוכלוסיית התאים בתוך הביופילם וכן משך הפעולה שלהם.

לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הטיפול במחלות זיהומיות לחקור את ההשפעות של לקטונאזות פוטנציאליות למרווה מניין בביופילם המיוצר על ידי חיידקים פתוגניים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד לכמת שיבוש ביופילם על ידי צביעה סגולה קריסטלית, ולהעריך שינויים מורפולוגיים בביופילם על ידי הדמיה קונפוקלית. אל תשכח שעבודה עם חומר פתוגני עלולה להיות מסוכנת ביותר.

יש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון שימוש במתקני הכלת סיכונים ביולוגיים נאותים בעת ביצוע הליך זה.