מיון תא של תאי גזע ועצביים ממבוגרי עכבר Subventricular האזור וחי-הדמיה של Dynamics תא המחזור שלהם

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לעקוב אחר התקדמות מחזור התאים של תאי גזע עצביים ממוינים וצאצאיהם, אשר בודדו מהאזור התת-וונטריקולרי (subventricular zone) של עכברים טרנסגניים בעלי סימון פלואורסצנטי של מחזור התאים המכונה FCI mice. זאת מושג תחילה על ידי נתיחה של האזור התת-וונטריקולרי ממוחות של עכברים בוגרים טרנסגניים. השלב השני הוא פירוק הרקמה הנורונלית לסספנסיית תאים בודדים באמצעות טיפול בפפאין.

בשלב הבא, אוכלוסיות התאים הנוירוגניות השונות של האזור הסוב-ונטריקולרי מסומנות באמצעות נוגדנים, וזאת כדי לזהות תאי גזע עצביים שקטים, תאי גזע עצביים מופעלים, תאי הגברה זמניים, וכן נוירובלסטים לא בשלים ומهاגרים. השלב הסופי הוא שימוש ב-FACS כדי למיין את התאים ישירות לתוך מצע תרבית טרי לפני זריעתם על צלחות מצופות ב-poly D lysine. לבסוף, נעשה שימוש במיקרוסקופיית וידאו בשיטת time-lapse רציפה כדי לחקור את התקדמות מחזור התא של התאים שנזרעו, כאשר התאים התראנסגניים השונים פולטים פלואורסצנציה בנקודות זמן שונות במהלך מחזור התא שלהם.

שילוב טכניקת מיון התאים עם טכנולוגיית ה-Fuji מאפשר להדמיות ובידוד של אוכלוסיות תאים שונות מהאזור הסוב-וונטריקולרי (sub ventricular zone), ובכך מאפשר את חקר התכונות והדינמיקה במוח הבוגר. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בהקשר של הזדקנות ופתולוגיות מוחיות. יום לפני הניסוי, יש להוסיף כ-200 µL של תמיסת poly D lysine בריכוז 10 µg/mL לכל באער של פלטת 96 באערים סטרילית בעלת דפנות שחורות כדי לצפות את תחתית הבאערים, לכסות ולהדגיר את הפלטה למשך הלילה בטמפרטורה של 37 °C. למחרת.

הסיר את תמיסת ה-poly D lysine ושטוף את הבארות שלוש פעמים במים מזוקקים סטריליים, לפני ייבוש הפלטה במכסה המטילה תחת זרימה למינרית למשך שעתיים לפחות. במידה והפלטה אינה בשימוש מיידי, יש לשמור את הפלטה המצופה והיבשה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך עד שבעה ימים.

בשלב הבא, הכינו את תמיסת הפירוק של Papain ועקרו אותה על ידי סינון התערובת דרך מסנן של 0.2 מיקרון. חממו מראש את התמיסה ל-37 °C לפני השימוש. כמו כן, הכינו תמיסת מעכבי פרוטאז על ידי הוספה של 0.7 mg/mL של trypsin in inhibitor type two למצע TM F 12 סטרילי.

סננו את התמיסה באמצעות מסנן 0.2 micron וחממו מראש את התמיסה ל-37 degrees Celsius לפני השימוש. העבירו את האזור הסוב-ונטריקולרי (sub ventricular zone) שחולץ זה עתה ממוח של עכבר בוגר מסוג fucci red אל צלחת פטרי המכילה 0.6%Glucose ב-PBS וקצצו את הרקמה עד שלא יישארו חתיכות גדולות. לאחר מכן, העבירו את כל התוכן למבחנה של 15 milliliter וסבבו בצנטריפוגה במהירות של 200 times G למשך חמש דקות.

לאחר שרקמת הרקמה הופרדה למשקע, יש להסיר את העליון ולבצע ריסוספנזיה. השהה את הרקמה ב-1 mL של פפאין שחומם מראש, בתוספת של 0.01 mg/mL של dna.One. דגירה של התערובת למשך 10 דקות במקלח מים בטמפרטורה של 37 °C.

לאחר מכן, סנטריפוגו שוב ב-200 ×g למשך חמש דקות והשליכו את העלייה (supernatant). הוסיפו 1 mL של תמיסת OVO MOID שחוממה מראש כדי לעצור את העיכול האנזימטי. לאחר מכן, השתמשו בקצה של מיקרופיפטה P 1000 כדי לבצע שאיבה ופליטה עדינה של הנוזל למעלה ולמטה 20 פעמים, על מנת לפרק מכנית את הרקמה הקצוצה לתליה של תאים בודדים (single cell suspension) תוך כדי הפיפטה.

הימנעו מהחדרת בועות אוויר לתערובת, דבר שעלול לגרום למעקה נוסף לתאים. העבירו את תרחיף התאים דרך מסנן סטרילי של 20 micron לשפופרת חדשה של 15 milliliter. שטפו את מסנן התאים עם שני milliliters של PBS המכיל 0.15%BSA כדי למנוע איבוד של תאים.

לאחר מכן, סנטריפוגו את תרחיף התאים ב-200 ×g למשך 10 דקות. השליכו את הנוזל העליון (supernatant). בצעו את הצביעה על ידי השעיה ראשונית של התאים מכל עכבר ב-100 µL של PBS המכיל 0.15% BSA.

השתמש בעשירית מכמות התאים של אחד העכברים כדי להכין כל אחת מארבעת הבקרות כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה. הוסף את הנוגדנים הראשוניים המפורטים כאן לכל אחת מהמבחנות המשמשות למיון תאים והדגרה את התערובות למשך 20 דקות בחושך בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס. לאחר ההדגרה עם הנוגדנים הראשוניים, שטוף את התאים עם מיליליטר אחד של PBS המכיל 0.15%BS, A, ולאחר מכן סבב את התאים בצנטריפוגה במהירות של 200 פעמים G למשך 10 דקות.

ששש את התאים ב-200 µL של PBS המכיל 0.15% BSA לכל מוח והעבר אותם למבחנות מיון מתאימות. הנח את מבחנות מיון התאים על קרח והוסף צבע חיוניות, כגון צבע hooked 3 3 2 5 8 בריכוז של 2 µg/mL לתאים מיד לפני מיון התאים, כדי להבדיל בין תאים חיים למתים.

שליב הבא, העבירו את התאים מתוך מבחנת הביקורת השלילית במכשיר ה-FACS ובחרו את התאים באמצעות פרמטרי side scatter ו-forward scatter. הסירו את התאים המתים על ידי הגדרת gate רק ל-negative fraction ואת הדובלטים על ידי בחירת ה-pulse עם negative fraction. הרצו ביקורות של צבע יחיד וכווןו את מתחי שפופרת מכפיל הפוטו (photo multiplier tube) במידת הצורך.

בצעו פיצוי צבע (color compensation) בחלון הפיצוי של התוכנה. הריצו את שלוש בקרות ה-fluorescence minus one וסמנו את שערי המיון (sorting gates). לאחר הגדרת כל השערים, מיינו את התאים המסומנים ישירות לתוך 100 µL של תרבית.

פרוס את התאים שמומינו זה עתה על צלחות 96 בארות מצופות ב-poly-D-lysine, בצפיפות של 1000 עד 3000 תאים לבאר, עם 300 µL של מצע גידול. דגור את צלחות התרבית בטמפרטורה של 37 °C וב-5% carbon dioxide למשך שעה אחת לפחות.

כדי לאפשר היצמדות של תאים, הכינו מיקרוסקופ סריקה לייזר קונפוקאלי (confocal laser scanning microscope) לצילום על ידי חימום מוקדם של תא הבקרה התרמית המחוברת ל-37 °C תחת אטמוספירה של 5% carbon dioxide. מקמו את פלטת 96 הבארים בתוך תא המיקרוסקופ שחומם מראש והביאו את הבאר הראשונה למיקוד. לאחר מכן, פתחו את תוכנת הצילום ולחצו קליק ימני בחלון הראשי כדי לבחור ב-acquire acquisition controls וב-DEAC acquisition.

כדי לפתוח את ה-TI pad ולאחר מכן לבחור בעדשה Plan A PO VC 20 XDIC, לחצו על acquire acquisition controls ולאחר מכן פתחו את אפשרויות ה-time-lapse. הגדירו את מרכזו של כל באר כמיקום במה (stage position) ובחרו באפשרות התמונה הגדולה של 7 על 7 מילימטרים רבועים. צפו בתמונת פסיפס (mosaic image) מסביב למרכז של כל אחד מהם.

כעת נקבע את החפיפה עבור תמונת הפסיפס הגדולה ל-5% ונכוון את התדירות כך שתמונות יילקחו מדי 20 דקות למשך 24 שעות. תחת הגדרות OnePlus, בחרו את רמת המתח של שפופרת מכפיל הפוטונים (PMT) עבור כל פלואורסצנציה המופיעה בסרגל התפריטים. בחרו ברכישת תמונות באמצעות סורק רזוננס מהיר בפורמט של 512x512 פיקסלים והשתמשו ב-DIC להדמיית התאים.

לאחר מכן, בחרו תיקייה לשמירת קבצי הנתונים. לחצו על כפתור run now בחלון הרכישה של ה-ND כדי להתחיל ברכישה. עקבו אחר פעולות המחשב למשך לפחות סבב אחד כדי לוודא שהכל עובד כראוי.

עכברי Fuji red שימשו למעקב אחר שלב G1 באמצעות פלואורסצנציה אדומה בעזרת מיקרוסקופיית וידאו של צילום רציף (time-lapse). התאים המבודדים הם פלואורסצנטיים באדום במהלך שלב הגדילה הראשון, ואורכי הגל שלנו משתנים במהלך הסינתזה, שלב הגדילה השני והמיטוזה. Lex חיובי eeg FR חיובי ו-eeg.

תאים חיוביים ל-FR מעכברים צעירים ומעכברים בגיל בינוני נזרעו ונמעקו באמצעות מיקרוסקופיה. אורך שלבי S ו-G2/M לא הראה הבדל בין תאים חיוביים ל-Lex וחיוביים ל-EGFR לבין תאים חיוביים ל-EGFR, הן בעכברים צעירים והן בעכברים בגיל בינוני. עם זאת, נמצא כי אורך שלב הגדילה הבא, מהחלוקה הראשונה ועד לכיבוי של הפלואורסצנציה האדומה, היה ארוך יותר בתאים המבוגרים עקב עלייה באורך שלב G1.

נוירוספירות שהתקבלו חמישה ימים לאחר הזריעה הן קטנות יותר בתאי Lex positive EGFR positive שהופקו מעכברים מבוגרים יותר. הפרוטוקול כולו לא אמור לחרוג משלוש שעות עבור הניתוח והכנת ה-fax ושלוש שעות נוספות עבור מיון התאים בעבודה עם 12 עכברים. יש לקחת בחשבון שעבודה עם מספר רב מדי של עכברים באותו יום תוביל להארכה של משך מיון התאים, מה שעלול להוביל לעלייה במוות של תאים או בדיפרנציאציה של תאים.