מיון תא של תאי גזע ועצביים ממבוגרי עכבר Subventricular האזור וחי-הדמיה של Dynamics תא המחזור שלהם

המטרה הכוללת של הליך זה היא לעקוב אחר התקדמות מחזור התא של תאי גזע עצביים ממוינים וצאצאיהם המבודדים מהאזור התת-חדרי של מחזור תא ubiquitination פלואורסצנטי טרנסגני המכונה עכברי FCI. זה מושג על ידי ניתוח תחילה של האזור התת-חדרי של מוחות עכברים בוגרים טרנסגניים. השלב השני הוא פירוק הרקמה העצבית לתרחיף תא בודד באמצעות טיפול בפפאיה.

לאחר מכן, אוכלוסיות התאים הנוירוגניים השונות של האזור התת-חדרי מסומנות באמצעות נוגדנים על מנת לזהות תאי גזע עצביים שקטים, תאי גזע עצביים מופעלים, תאים מגבירי מעבר ונוירובלסטים לא בשלים כמו גם נודדים. השלב האחרון הוא להשתמש בעובדות כדי למיין את התאים ישירות למדיום תרבית טרי לפני ציפויים על צלחות מצופות פולי D ליזין. בסופו של דבר, מיקרוסקופ וידאו רציף של זמן-lapse משמש לחקר התקדמות מחזור התא של התאים המצופים כאשר התאים הטרנסגניים השונים זוהרים בנקודות זמן שונות במהלך מחזור התא שלהם.

שילוב טכניקת מיון התאים עם טכנולוגיית פוג'י מאפשר הדמיה ובידוד של אוכלוסיות התאים השונות מהאזור התת-חדרי, ומאפשר לחקור את התכונות והדינמיקה במוח התנועה של הבוגר. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בהקשר של הזדקנות ופתולוגיות מוח יום לפני הניסוי. בכ-200 מיקרוליטר של תמיסת פולי ליזין D של 10 מיקרוגרם למיליליטר לכל באר של צלחת סטרילית שחורה עם דופן של 96 בארות כדי לצפות את תחתית הבארות לכסות ולדגור את הצלחת למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס למחרת.

הסר את תמיסת הפולי D ליזין ושטוף את הבארות שלוש פעמים במים מזוקקים סטריליים לפני שתאפשר לצלחת להתייבש במכסה המנוע תחת זרימה למינרית למשך שעתיים לפחות. אם לא משתמשים מיד. אחסן את הצלחת המצופה המיובשת בארבע מעלות צלזיוס עד שבעה ימים.

לאחר מכן, הכינו את תמיסת הדיסוציאציה של פפאין ועיקרו אותה על ידי העברת התערובת דרך פילטר 0.2 מיקרון. מחממים את התמיסה ל -37 מעלות צלזיוס לפני השימוש בה. כמו כן, הכינו תמיסת מעכב פרוטאז על ידי הוספת 0.7 מיליגרם למיליליטר טריפסין במעכב מסוג 2 ל-TM F 12 סטרילי בינוני

מסננים את התמיסה באמצעות פילטר 0.2 מיקרון ומחממים את התמיסה ל -37 מעלות צלזיוס לפני השימוש בה. מניחים את האזור התת-חדרי הטרי שנותח ממוח עכבר אדום פוצ'י בוגר לצלחת פטרי המכילה 0.6% גלוקוז ב-PBS טוחנים את הרקמה עד שלא נשארות חתיכות גדולות. ואז העבירו הכל לצינור של 15 מיליליטר וצנטריפוגה ב -200 פעמים G למשך חמש דקות.

לאחר שהרקמה הושלכה, השליכו את החטיפה והחזרה. השעו את הרקמה במיליליטר אחד של פפאין חם מראש, בתוספת 0.01 מיליגרם למיליליטר DNA. אחד. דוגרים את התערובת למשך 10 דקות באמבט מים בחום של 37 מעלות צלזיוס.

ואז שוב צנטריפוגה ב -200 פעמים G למשך חמש דקות והשליכו את החטיף. הוסף מיליליטר אחד של תמיסת Prewarm OVO MOID כדי לעצור את העיכול האנזימטי. לאחר מכן, השתמש בקצה מיקרו פיפטה P 1000 כדי לפיפטה בעדינות למעלה ולמטה 20 פעמים כדי לפרק מכנית את הרקמה הטחונה לתרחיף תא בודד בזמן הפיפטה.

הימנע מהכנסת בועות אוויר לתערובת שיגרמו ללחץ נוסף על התאים. העבירו את מתלה התא דרך פילטר סטרילי של 20 מיקרון בצינור חדש של 15 מיליליטר. שטפו את מסנן התאים עם שני מיליליטר PBS המכילים 0.15% BSA כדי למנוע אובדן תאים.

ואז צנטריפוגה את תרחיף התאים ב -200 פעמים G למשך 10 דקות. השליכו את הסופרנטנט. בצע את צביעת העובדה על ידי השעיית התאים מכל עכבר ל-100 מיקרוליטר PBS המכילים 0.15% BSA.

השתמשו בעשירית מהתאים של אחד העכברים כדי להכין כל אחד מארבעת הפקדים כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה. הוסיפו את הנוגדנים העיקריים המפורטים כאן לכל אחד מהצינורות המשמשים למיון תאים ודגרו על התערובות למשך 20 דקות בחושך בארבע מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה עם הנוגדנים הראשוניים, שטפו את התאים במיליליטר אחד של PBS המכיל 0.15% BS, A, ולאחר מכן צנטריפוגה את התאים ב-200 פעמים G למשך 10 דקות.

השעו מחדש את התאים ב-200 מיקרוליטר של PBS המכילים 0.15% BSA למוח והעבירו אותם להשפעות מתאימות. צינורות מיון. הניחו את צינורות מיון התאים על קרח והוסיפו צבע חיוני כגון כתמים 3 3 2 5 8 בשני מיקרוגרם למיליליטר לתאים מיד לפני מיון התאים כדי להבחין בין תאים חיים לתאים מתים.

לאחר מכן, העבירו את התאים בצינור הבקרה השלילי דרך העובדות ובחרו את התאים באמצעות פרמטרים של פיזור צד ופיזור קדימה. אל תכלול את התאים המתים על ידי שער הווים בלבד לשבר שלילי והכפלות על ידי בחירת הדופק עם שבר שלילי. הפעל פקדים בצבע יחיד והתאם את מתח צינור מכפיל הצילום במידת הצורך.

בצע פיצוי צבע בחלון הפיצוי של התוכנה. הפעל את שלושת פקדי הקרינה מינוס אחד וצייר את שערי המיון. לאחר הגדרת כל השערים, מיין את התאים המסומנים ישירות ל-100 מיקרוליטר תרבית.

צלחת בינונית את התאים הממוינים הטריים בצפיפות של 1000 עד 3000 תאים לבאר על מצופה הפולי דה ליצין. 96 צלחות באר עם 300 מיקרוליטר של מדיום תרבית. דגרו את צלחות התרבות בחום של 37 מעלות צלזיוס ו -5% פחמן דו חמצני למשך שעה לפחות.

כדי לאפשר הידבקות תאים, הכינו מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי להדמיה על ידי חימום מוקדם של החדר מבוקר הטמפרטורה המצורף ל-37 מעלות צלזיוס תחת אטמוספירה של 5% פחמן דו חמצני. מקם את צלחת 96 הבארות בתוך תא המיקרוסקופ הקדם-חם והבא את הבאר הראשונה למיקוד. לאחר מכן פתח את תוכנת ההדמיה ולחץ באמצעות לחצן העכבר הימני בחלון הראשי כדי לבחור בקרות רכישה רכש ורכישת DEAC.

על מנת לפתוח את משטח ה-TI ולבחור את המטרה הבאה של תוכנית A PO VC 20 XDIC, לחץ על רכוש בקרות רכישה ולאחר מכן פתח את אפשרויות ה-Time-lapse. הגדר את המרכז של כל באר כמיקום במה ובחר באפשרות התמונה הגדולה לשבעה על שבעה מילימטרים בריבוע. התבוננו בתמונת פסיפס סביב מרכז כל אחד מהם.

ובכן הגדר את החפיפה לתמונת הפסיפס הגדולה ל -5% והגדר את התדירות כך שהתמונות יצולמו כל 20 דקות למשך 24 שעות. תחת הגדרות פלוס אחד, בחר את רמת המתח של צינור מכפיל הצילום עבור כל פלואורסצנטי המופיע בשורת התפריטים. בחר כדי להשיג תמונות באמצעות סורק תהודה במהירות גבוהה בפורמט של חמישה 12 על חמישה 12 פיקסלים והשתמש ב-DIC כדי לדמיין את התאים.

לאחר מכן בחר תיקיה לשמירת קבצי הנתונים. בחר בלחצן הפעל עכשיו בחלון רכישת ND כדי להתחיל ברכישה. עקוב אחר עבודת המחשב למשך לולאה אחת לפחות כדי להיות בטוח שהכל עובד כמו שצריך.

עכברים אדומים של פוג'י שימשו כדי לעקוב אחר שלב G אחד עם פלואורסצנטיות אדומה באמצעות מיקרוסקופ וידאו זמן-lapse. התאים המבודדים הם פלואורסצנטיים אדומים בשלב הגידול הראשון ורשימת הצבעים שלנו במהלך הסינתזה, שלב הגידול השני והמיטוזה. לקס חיובי eeg FR חיובי ו-eeg.

תאים חיוביים ל-FR מעכברים בוגרים צעירים ובגיל העמידה צופו ועקבו אחריהם באמצעות מיקרוסקופיה. אורך הפאזה S ו-G שני M לא הראה הבדל בין תאים חיוביים ל-EGFR חיוביים ל-EG בעכברים צעירים או בגיל העמידה. עם זאת, אורך שלב הגידול הבא מהחלוקה הראשונה ועד לכיבוי הפלואורסצנטי האדום נמצא ארוך יותר בתאים הישנים יותר עקב הגידול באורך הפאזה G.

נוירוספרות המתקבלות חמישה ימים לאחר הציפוי קטנות יותר בתאים חיוביים ל-EGFR חיוביים שהתקבלו מהעכברים המבוגרים. הפרוטוקול כולו לא יעלה על שלוש שעות לדיסקציה והכנת פקס ועוד שלוש שעות למיון תאים בעבודה עם 12 עכברים. זכור שהעבודה שלנו עם יותר מדי עכברים באותו יום תוביל להארכת משך מיון התאים ואולי תביא למוות מוגבר של תאים או להתמיינות תאים.