Question 1

מהם מורפולינוס ובמה הם שונים מ-DNA?

Accepted Answer

מורפולינוס (Morpholinos) הם מולקולות סינתטיות המורכבות מ-25 אוליגונוקלאוטידים המחוברים על ידי שלד בעל מטען ניטרלי. בניגוד ל-DNA, מורפולינוס מכילים טבעות מורפולין במקום קבוצות הסוכר הנמצאות בשלד הפוספט-סוכר. הבדל מבני זה מגביר את יציבות המורפולינוס בתאים ומפחית את עלות ייצורם, מה שהופך אותם לכלים יעילים וחסכוניים להשתקת גנים במחקר התפתחותי.

Question 2

כיצד פועלים באופן שונה מורפולינוים חוסמי-שחזור (splice-blocking) ומורפולינוים חוסמי-תרגום (translation-blocking)?

Accepted Answer

מורפולינוס חוסמי שחבור (Splice-blocking morpholinos) נקשרים לצמתים ספציפיים ומעכבים עיבוד תקין של התמלול, בעוד שמורפולינוס חוסמי תרגום (translation-blocking morpholinos) נקשרים בתוך האזור ה-5' שאינו מתורגם (untranslated region) בסמוך לאתר תחילת התרגום ומונעים את הרכבת הריבוזום. שני הסוגים מפחיתים את הביטוי של חלבוני מטרה תפקודיים, אך הם משיגים השתקה גנטית באמצעות מנגנונים מולקולריים נפרדים הפועלים בשלבים שונים של ביטוי הגנים.

Question 3

מדוע השימוש במורפולינוס בלתי תלויים הוא חשוב עבור תכנון הניסוי?

Accepted Answer

שימוש במורפולינוים בלתי תלויים שאינם חופפים, המשלימים לאותו גן, מבטיח כי השינויים הפנוטיפיים שנצפו נובעים מהשתיקה (knockdown) של גן המטרה ולא מהשפעות חוץ-מטרה (off-target effects). מכיוון שכל מורפולינו נתון עלול להיקשר לרצפים ספציפיים בגנים שונים, שימוש במספר מורפולינוים מאשר את הספציפיות ומחזק את התקפות של טכניקות ויישומים של גנטיקה התפתחותית.

Question 4

מתי ובאיזה מיקום מזריקים בדרך כלל מורפולינוס לעוברים של דגי זברה?

Accepted Answer

בדרך כלל מזריקים מורפולינוס לעוברים של דגי זברה בין שלב התא הבודד לשלב ארבעת התאים, אל תוך החלמון או לתוך הציטופלזמה של התא. קשרים ציטופלזמיים בין תאי העובר מאפשרים דיפוזיה מהירה והפצה נרחבת של מורפולינוס מסיסי מים בכל רחבי האורגניזם. כדי למנוע תמותה או השפעות לא רצויות מחוץ למטרה (off-target effects), משתמשים במינון הנמוך ביותר המייצר פנוטיפ מוגדר ואמין ב-50% עד 75% מהעוברים המוזרקים.

Question 5

כיצד נעשה שימוש בהצלה של RNA (RNA rescue) כדי לאשר את ספציפיות המטרה של המורפולינו?

Accepted Answer

בעקבות השתקה (knockdown) של mRNA אנדוגני באמצעות מורפולינו, מזריקים mRNA סינתטי המקודד לאותו חלבון אך חסר את רצף המטרה של המורפולינו. אם RNA מוזרק זה מחזיר את הפנוטיפ של סוג הפרא (wild-type), ניתן להסיק כי הפנוטיפ שנצפה בעקבות המורפולינו נובע באופן ספציפי מהשתקת גן המטרה. שלב תיקוף זה מאשר כי אפקט השתיקה של הגן הוא אמיתי ולא נגרם כתוצאה מאינטראקציות שאינן במטרה (off-target interactions).

Question 6

מהם היישומים המעשיים של מורפולינוס במחקר של התפתחות חולייתים?

Accepted Answer

מורפולינוס משמשים לחקר תהליכי התפתחות מוקדמים, כגון זרימת נוזלים הנוצרת על ידי ריסונים (cilia) בשקיק קופפר (Kupffer's vesicle), השולט בדפוס הסימטריה של צד ימין ושמאל בדגי zebrafish. הם משמשים גם למידול מחלות גנטיות אנושיות על ידי שחזור פנוטיפים של אובדן תפקוד (loss-of-function) ובדיקה מהירה של מוטציות פתוגניות. בנוסף, הזרקה מיקרוסקופית של מורפולינוס לרקמות ספציפיות מאפשרת לחוקרים ללמוד על רגנרציה של רקמות באמצעות תאי גזע סומטיים ועל יצירת איברים בדגי zebrafish בוגרים.

Question 7

מדוע דגי זברא (zebrafish) מתאימים במיוחד למחקרי השתקה גנטית מתווכת מורפולינו?

Accepted Answer

דגי זבrafish (Zebrafish) אידיאליים למחקר באמצעות מורפולינו (morpholino) בשל התפתחותם החיצונית המהירה, שקיפותם והקלות שבה ניתן לצפתם באמצעות מיקרוסקופיית שדה בהיר (brightfield) או פלואורסצנציה. פנוטיפים הנגרמים על ידי מורפולינו מזוהים בדרך כלל בתוך שלושת הימים הראשונים לאחר ההפריה ונשארים יעילים עד היום החמישי. בנוסף, לדגי זבrafish יש לעיתים קרובות שני עותקים של גן כתוצאה מאירוע של שחזור גנומי מלא (whole-genome duplication), דבר המצריך השתקה (knockdown) של שני הגנים כדי לדמות מחסור בחלבונים אנושיים.

השתקת גנים עם מורפולינוס - חידון הערכה