זיהוי של ביטוי גנים בתאים תאיים חיים של Murine, אדם וחזירי מקור באמצעות חלקיקים שכותרתו פלואורסצנטי
13 בנובמבר 2015
כתב יד זה מתאר טכניקה חדשה המאפשרת זיהוי ביטוי גנים תוך תאי לאחר אנדוציטוזיס של ננו-חלקיקים המסומנים בפלואורסצנטיות ישירות בתאים חיים. השיטה אינה דורשת מניפולציה של התאים ואינה מוגבלת ביחס לגן או למין המטרה.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לנתח ביטוי גנים תוך-תאי ישירות בתאים חיים באמצעות יישום של ננו-חלקיקים פלואורסצנטיים ספציפיים לגן. הדבר מושג תחילה על ידי הגדרת רצפי המטרה המתאימים בגן הנחקר. השלב השני הוא ייצור ננו-חלקיקים בעלי גדילי לכידה וגדילי דיווח ספציפיים.
בשלב הבא, מוסיפים את הננו-חלקיקים ישירות למצע התרבית של התא החי. השלב האחרון הוא דגירה של התאים עם הננו-חלקיקים למשך לילה בטמפרטורה של 37 °C ו-5% CO2 באטמוספירה מלחחית. לבסוף, נעשה שימוש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית כדי להדמיות של פלואורסצנציה ספציפית לגן בתאי מטרה חיים, בעוד שניתוח בציטומטריה של זרימה משמש לכימות מספר התאים הפלואורסצנטיים.
היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כגון אימונוהיסטוכימיה, מולקולרי ביקוןס (molecular beacons) או אנליזת PCR, הוא שניתן לצפות בביטוי גנים באופן ויזואלי בתאים חיים ללא כל מניפולציה של תרבית התאים. את הפרוצדורה תדגים מרטינה תרזה, ביולוגית וסטודנטית לדוקטורט מהמעבדה שלנו; את הזרימה הציטומטרית תדגים לינט הנקל. לאחר קביעת רצפי המטרה, הזמינו ננו-חלקיקי זהב ליפיליזים ממקורות זמינים מסחרית.
חלקיקים אלו מורכבים מחלקיק זהב מרכזי הקשור באופן קוולנטי לגדיל לכידה, שקשור לגדיל דוח. כאשר ה-mRNA מטרה נקשר לגדיל הלכידה, גדיל הדוח והפלואורופור הקשור אליו משתחררים לתמיסה, מה שמאפשר ל-Fluor four להפיק פלואורסצנציה. לפני השחזור.
יש לשמור את הננו-חלקיקים בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס בחושך בתוך קופסת קרטון. כדי להחזיר את הננו-חלקיקי הזהב למצב פעיל, יש להוסיף 20 µL של מים מזוקקים פעמיים, מה שיביא לריכוז סופי של 100 nM. ניתן לשמור את הננו-חלקיקים לאחר השחזור בטמפרטורת החדר בחושך למשך שנה אחת לפחות.
ביום היישום, דללו את תמיסת המקור של ננו-חלקיקי הזהב לתמיסת עבודה בריכוז 20x ב-PBS. הוציאו פלטה בעלת 24 בארות המכילה תאי HEK 2 93 מהמדגרה לתרביות תאים, שאבו את המצע ולאחר מכן הוסיפו 237.5 µL של מצע גידול טרי. לאחר מכן, טפטפו באמצעות פיפט 12.5 µL של תמיסת העבודה של הננו-חלקיקים לכל בארה שהוכנה, וסובבו את הפלטה כדי להבטיח פיזור אחיד של הננו-חלקיקים. דגרו את התאים למשך לילה בטמפרטורה של 37 °C וב-5% CO2 באטמוספירה עם לחות. למחרת.
נתחו את תרביות התאים למדידת פלואורסצנציה באתר ספציפי לגן 3 באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטנדרטי כדי להכין את התאים לציטומטריית זרימה. שטפו פעם אחת את תאי ה-HEK 2 9 3 המראים פלואורסצנציה מושרית באתר 3 עם PBS והוסיפו מיליליטר אחד של 0.05% trypsin EDTA. דגרו את התאים למשך שלוש דקות ב-37 °C וב-5% CO2. לאחר הדגירה, הוסיפו 0.5 מיליליטר של מצע CO ובצעו פיפטורה למעלה ולמטה.
לאחר מכן, העבירו את התאים לפרונטה של 15 מיליליטר. הוסיפו שלושה מיליליטרים של מצע גידול וסובבו את הפרונטה למשך חמש דקות ב-300 ×g. לאחר מכן, הסירו את העילג והשעיקו מחדש את התאים ב-200 מיקרוליטר של FACS buffer קר בקרח. העבירו את התאים לפרונטה של 1.5 מיליליטר ואחסנו אותם בקרח ובחושך עד לביצוע האנליזה.
לפני ניתוח ב-fax, העבירו את התאים דרך מסנן של 30 מיקרומטר כדי למנוע התגבשות של תאים. לאחר מכן, הוסיפו לתאים propidium iodide בריכוז סופי של 2 µg/mL למשך שתי דקות לפחות, העבירו את התאים למערכת ה-flow cytometer באמצעות vortex וטענו את מבחורת הדגימה למכשיר. כדי לזהות תאי SI three חיוביים.
השתמשו בתאי ביקורת לא מטופלים כדי לקבוע את השערים ההיררכיים על תת-הקבוצה של פיזור קדמי (forward scatter) או שטח FSC לעומת פיזור צדי (side scatter) או שטח SSC, גובה FSC לעומת FSC עם תת-קבוצה, וגובה SSE לעומת SSE עם תת-קבוצה, זאת כדי להוציא פסדתיים תאיים ותאים שאינם מפוזרים. הסירו את התאים המתים מהניתוח בהתבסס על צביעה ב-propidium iodide על ידי הצגת ערוץ PE מול ערוץ PE Texas Red, ולאחר מכן בצעו את שער המיון הסופי על תאים חיוביים ל-PE באתר 3. זיהוי של GA dh.
ביטוי של גן בית (housekeeping gene) בעל ביטוי קבוע בוצע בתאי HEK 2 93 כדי לתקף את ההיתכנות הניסויית. ננו-חלקיקים של בקרת שלילה מסוג Scrambled מראים פלואורסצנציה מועטה או חסרה, בעוד שבקרת חיוביות לספיגה מראה פלואורסצנציה קבועה. הבקרות מראות אות חזק לאחר דגירה למשך לילה.
נננו-חלקיקים אלו הראו יכולת לזיהוי ספציפי של סמני תאי גזע פלוריפוטנטיים, ביטוי הגנים nano ו-GDF three, בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושראים (iPSCs) של בני אדם וחזירים. חשוב לציין כי סמנים אלו זוהו רק ב-iPSCs ולא בתאי הפיברובלסט ששימשו כשכבת תמיכה (feeder layer) במהלך תרבית תאי ה-iPS. הן ניתוח ויזואלי והן ניתוח כמותי באמצעות ציטומטריה של זרימה שימשו להערכת יעילות הסימון של ננו-חלקיקי GA DH, בריכוזים מדורגים של ננו-חלקיקים מאפס עד 1000.
ביצוע PICO molar בוצע עם תאי HEK 2 93, אשר הראו עלייה ברורה בתלות בריכוז של הפלואורסצנציה. לאחר מכן בוצע ניתוח כמותי בתאי גזע עובריים של עכברים, אשר הראו כ-40% תאים חיוביים ל-CY three בעקבות הוספה של 400 ננו-חלקיקי PICOMOLAR GA DH. ערכים דומים התקבלו עבור סמני הפלוריפוטנציה.
ברגע ששולטים בננו-חלקיקים וב-GDF three, ניתן לבצע טכניקה זו בתוך 16 שעות אם היא מבוצעת כהלכה. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להשתמש בננו-חלקיקים ספציפיים לגנים כדי לזהות ביטוי גנים תוך-תאי ישירות בתאים חיים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.
סקירה כללית
כתב יד זה מתאר טכניקה חדשנית לזיהוי ביטוי גנים תוך-תאי בתאים חיים באמצעות ננו-חלקיקים המסומנים בפלואורסצנציה. השיטה מאפשרת תצפית ישירה ללא מניפולציה של התאים, דבר ההופך אותה לוורסטילית עבור גנים וממינים שונים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- מיקרוסקופיה פלואורסצנטית
רקע
- שיטות קיימות לניתוח ביטוי גנים דורשות לעיתים קרובות מניפולציה של תאים.
- ננו-חלקיקים מסומנים בפלואורסצנציה יכולים לספק גישה לא פולשנית.
- טכניקה זו שואפת להמחיש את ביטוי הגנים בזמן אמת.
- ניתן ליישם אותה על סוגי תאים וגנים מטרות שונים.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה לניתוח ביטוי גנים בתאים חיים.
- שימוש בננו-חלקיקים פלואורסצנטיים ספציפיים לגנים לצורך ניתוח זה.
- הדגמת יעילותה של טכניקה זו בהשוואה לשיטות מסורתיות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הגדרת רצפי מטרה בגן הנחקר.
- ייצור ננו-חלקיקים עם גדילי לכידה ודיווח ספציפיים.
- דגירה של תאים חיים עם הננו-חלקיקים כדי לאפשר זיהוי של ביטוי גנים.
- שימוש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית ובציטומטריה של זרימה לצורך אנליזה.
תוצאות עיקריות
- מיקרוסקופיה פלואורסצנטית ויזואליזה בהצלחה ביטוי ספציפי לגנים בתאים חיים.
- ציטומטריה של זרימה כימתה את מספר התאים הפלואורסצנטיים.
- הודגם עלייה בפלואורסצנציה התלויה בריכוז עם ננו-חלקיקים.
- הושגה זיהוי ספציפי של סמני תאי גזע פלוריפוטנטיים.
מסקנות
- טכניקה זו מאפשרת תצפית בזמן אמת על ביטוי גנים בתאים חיים.
- היא מספקת יתרון משמעותי על פני שיטות מסורתיות.
- יישומים עתידיים עשויים לשפר את ההבנה של תפקוד גנים בהקשרים ביולוגיים שונים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
שיטה זו מאפשרת ויזואליזציה ישירה של ביטוי גנים תוך-תאי בתאים חיים ללא קיבוע או מניפולציה, ובכך היא תומכת בתיקוף מטרות בשלבים מוקדמים ובצמצום סיכונים מכניסטיים בתהליכי גילוי. באמצעות אספקת תוצאות כמותיות בזמן אמת באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית וציטומטריה של זרימה, היא מגבירה את הביטחון החזוי בהערכת תפקוד גנים במודלים של עכברים, בני אדם וחזירים. הגישה מקטינה את ההסתמכות על בדיקות נקודת-סוף ועל תרביות חוזרות, ובכך משפרת את היעילות בשלבי הסריקה וזיהוי המוליכים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בדיקה של היפותזות טיפוליות באמצעות זיהוי ביטוי של גנים פלוריפוטנטיים אנדוגניים (למשל, Nanog, GDF3) בתאי iPS חיים.
- ערך תפעולי: מבטל את הצורך בתרביות חוזרות ובקיבוע, ובכך משמר קלונים מאושרים עבור ניסויים המשכיים.
- ערך ניבוי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות תצפית ישירה על פעילות גנים מטרה במערכות הרלוונטיות למחלה.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- מוכנות הבדיקה: מייצרת אותי פלואורסצנציה כמותיים הפרופורציונליים לריכוז ה-mRNA של המטרה, מה שמאפשר ניתוח תגובה למינון.
- יכולת הרחבה: תואם לפורמטים של פלטות עם מספר בארות ולציטומטריה של זרימה עבור יישומי סריקה בthroughput גבוה.
- שחזוריות: מראה עלייה בפלואורסצנציה התלויה בריכוז, דבר התומך בתנאי בדיקה סטנדרטיים לאורך ניסויים שונים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: מזהה סמני פלוריפוטנציה שמורים במינים שונים בתאי iPS של עכברים, בני אדם וחזירים, ובכך תומך בתיקוף מטרות בין-מיני.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: מאשרת את ספציפיות ביטוי הגנים על ידי הצגת אות רק בתאי iPS, ולא בפיברובלסטים של שכבת המזינים (feeder layer).
- תמיכה בקבלת החלטות: מאפשרת העשרה של תאים חיוביים לגן באמצעות ציטומטריה של זרימה לצורך בדיקות תפקודיות המשך.
שילוב של תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
הטכניקה משתלבת ברצף הגילוי החל מתיקוף המטרה ועד לזיהוי מולקולות מובילות (leads), ומספקת נתונים על ביטוי גנים בתאים חיים המנחים החלטות מוקדמות של המשך או הפסקת הפיתוח (go/no-go).
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת השערות ובבירור מסלולים באמצעות ויזואליזציה של ביטוי גנים בזמן אמת בתאים חיים.
- סריקה: מספקת תוצאות כמותיות מבוססות פלואורסצנציה המתאימות לסריקת תרכובות ולמחקרים של מעורבות מטרה (target engagement).
- אנליזה: מספקת פלטים מדידים (עוצמת פלואורסצנציה, % תאים חיוביים) להשוואת תנאי ניסוי ומעקב אחר דינמיקה זמנית.
- מחקר תרגומי: מאפשרת מיון והעשרה של תאים המותאמים לסמנים ביולוגיים באמצעות פלוו-ציטומטריה לאחר סימון תאים חיים.
- שימוש חוזר ארגוני: ניתנת לשימוש חוזר במינים שונים ובגנים מטרה שונים עם התאמות מינימליות לפרוטוקול, ובכך מפחיתה את עלויות הפיתוח מחדש.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בחיזוי של תיקוף המטרה על ידי הפחתת עמימות מכניסטית באמצעות תצפית ישירה בתאים חיים.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות והסטנדרטיזציה באמצעות ייצור אותים מדידים המבוססים על ננוחלקיקים.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי הפחתת הצורך בתרביות חוזרות ובבדיקות נקודת סוף.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף מותאם סיכונים באמצעות הערכה כמותית מוקדמת של ביטוי גנים במודלים רלוונטיים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בתכנון גששים של חומצות גרעין ובטיפול בננו-חלקיקים.
- תלוי בגישה למיקרוסקופיה פלואורסצנטית ומכשור של ציטומטריה זרימה.
- מחייב סטנדרטיזציה של השחזור והמינון של הננו-חלקיקים בין מעבדות שונות.
- דורש אופטימיזציה עבור סוגי תאים ורצפי מטרה שונים, בהתבסס על נגישות ורמות ביטוי.
- מוגבל לתמלילים שניתן לזיהוים עם שפע מספיק ליצירת אות באמצעות ננו-חלקיקים מעל רמת הרקע.
