Name: איסוף דם חוזרים ונשנים לבדיקות דם בדג הזברה למבוגרים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 17 s
Description: למד שיטה לא פולשנית לאיסוף דם חוזר מדג זברה מבוגר לניתוח ביוכימיה דם ומטבוליזם גלוקוז. שיטה זו מאפשרת דגימות חוזרות מאותו פרט ומשפרת רווחת בעלי חיים במחקר.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

עבודה זו נתמכה על ידי מענק JSPS KAKENHI מספר 25860294 ו-25590073. ברצוננו להודות לגב' יואי נאמי על האיור המצויר ביד, ולמר קושי קטאוקה ולגב' סאיורי איצ'יקאווה על הסיוע בתחזוקת דג הזברה.

נהלי כל החיה אושרו על ידי ועדת האתיקה של אוניברסיטת מ.י., ובוצעו על פי תקנת רווחת בעלי החיים יפנית &quot;חוק על רווחה וניהול של בעלי חיים &#39;(משרד לאיכות הסביבה של יפן) ועמדו בהנחיות בינלאומיות. 1. הכנת המחט הערה: כל הניסויים בוצעו בהרדמה, וכל המאמצים שנעשו כדי למזער את הסבל. להמתת חסד, דגים היו שקועים באמבט קרח-מים (5 חלקים מים חלק קרח / 1 ב- C ° ≤4) ל≥20 דקות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את מחטי microcapillary זכוכית על ידי משיכת נימי זכוכית 1.0 מ&quot;מ חיצוני בקוטר עם חולץ מחט (איור 1 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את קצות המחטים בעקיפין באמצעות מספריים קנס (איור 1). קוטר הקצה האידיאלי צריך להיות כ 100 - 200 מיקרומטר (איור 1 ג). אם diamete הקצהr הוא צר מדי, דם לא ייכנס למחט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים הפרין במלח בריכוז של 5 מ&quot;ג / מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח מחט חתוכה בסוף מזנקים של הרכבה צינור aspirator ולהחזיק את השופר בפה, או לחבר את המחט למתקן הנורה. לטבול את קצה המחט לתוך פתרון הפרין, וheparinize המחט על ידי שאיבה ונושב הפתרון (איור 1D ו1E). הערה: ההרכבה צינור aspirator שמשה במשך הקפאת זרע דג הזברה 16. צינור גומי ארוך יכול לעצור את כל דם עף לתוך פה. הגדרת מסנן באמצע הדרך של הצינור יכולה למנוע את הסכנות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את מחטי heparinized בצלחת פטרי 10 סנטימטרים ואוויר יבש במשך שעה לפחות 1. מספר גדול של מחטים יכול להיות מוכן מראש. </li></ol> 2. הרדמה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרון ההרדמה במקרה פלסטיק קטן על ידי ערבוב 200 מיליליטר של מים דגים עם של 2-פנוקסיתנול 100 μl (2-pe). ריכוז סופי של ההרדמה הוא 500 עמודים לדקה. זהירות! יש 2-PE השפעה מהירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מספר רצוי של דגים (זן א.ב.) ממערכת הדם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש ברשת כדי להעביר את הדגים להרדמה 1 - 2 דקות (איור 1F). שימו לב לדגים לשחות בהדרגה, להפיץ את סנפירי החזה אופקי, התנשפות, ויש לי תנועות operculum מהירות בתוך דקות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ככל שהזמן עובר, להתבונן הדגים נחו על הקרקעית של המקרה ולבסוף להפסיק לשחות. המטוס של הרדמה כירורגית יגיע כאשר הדגים מפסיק לנשום בכבדות ותנועות operculum הן איטיות. בשלב זה, דגים מוכנים לאיסוף דם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות רחפן להרים את הדגים בהרדמה מ2-PE ובעדינות מניח אותו על מגבת נייר ספוגה בהרדמה (איור 1G). לכסות את הראש של הדג בנייר טישו רך גם ספוג בפתרון 2-PE כדי למנוע יובש בעיניים ולהשתמש אחר נייר טישו רך ויבש, לעדינותלייבש את פני השטח הגוף. </li></ol> אוסף 3. דם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח מחט heparinized בסוף מזנקים של ההרכבה צינור aspirator (או מנפק הנורה) והחזק את סוף שופרו של ההרכבה צינור aspirator בפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחוז בסוף מזנקים והמחט יחד, ולהסיר בזהירות את הכף מפריעה לקצה המחט. הכנס את המחט ב30 - זווית ° 45 לאתר איסוף דם. הימנע לנקב של מערכת העיכול (איור 1H). במקרה של שימוש במתקן הנורה, לחץ על הנורה עם אגודל ואצבע אמצעית, ולחסום את החור בקצה של הנורה עם האצבע ראשונה, ולאחר מכן להכניס את המחט כפי שתואר לעיל. הערה: האתר לאיסוף דם הוא לאורך ציר הגוף והאחורי לטבעת באזור של אב העורקים הגב. אב העורקים הגב (DA) ווריד הקרדינל האחורי (PCV) הם רק הגחון לעמוד השדרה (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תתחיל למצוץשופר סוף ההרכבה צינור השאיפה כאשר המחט הרגישה נגיעה בעמוד השדרה. אם הדם לא עולה, להזיז את קצה המחט בעדינות ביד כדי לעודד את זרימת דם. שים לב שברגע שהדם עולה למחט, מייד הפסיק לרעוד ולמצוץ בעדינות (איור 1 ט). במקרה של שימוש במתקן הנורה, לשחרר את הלחץ של הנורה כדי לשאוב הדם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב לדם יעלה לאט לתוך המחט באופן pulsatile ללא יניקה, אשר צפוי בגלל לחץ דם עורקים. לפיכך, אין זה הכרחי למצוץ אם המחט חודרת בצורה נכונה את העורק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפסיק יניקה לאחר הנפח המתאים של דם נאסף. הסר את המחט מהדגים ולחץ על האתר לנקב באמצעות נייר טישו רך כדי לעצור כל דימום. שים לב לעצירת הדימום לאחר כ 10 - 20 שניות של לחץ אצבע (איור 1J). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדימום נעצר, להעביר את הדגים מייד חזרה לCLEמים חמים (~ 28 מעלות צלזיוס) טנק. עזרה הדגים להתאושש על ידי בעדינות מתערבל מים לכיוון הזימים עד שהוא מתחיל לשחות. הערה: שמור עד 5 דגי postsampling בטנק 2 L ולחבר את הטנק למערכת זרימת חמצן לדגים. תוספת של אנטיביוטיקה למים דגים אינה הכרחית. לשמור על הדגים עם דיור והאכלה רגילים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגרש את הדם מהמחט על אזור נקי של חתיכה (איור 1 יא) של parafilm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד סוכר בדם באמצעות כל Glucometer כף יד מסחרי (איור 1 ליטר). הערה: Glucometer משתמש אלקטרודה dinucleotide גלוקוז פלבין-דהידרוגנז אדנין ודורש נפח דגימה של 0.6 μl. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס מקלון בדיקה לחלוטין למטר וישירות לגעת בטיפת הדם. שים לב לתיקו הדם לתוך רצועת הבדיקה באופן אוטומטי ולקבל שניות הגלוקוז בדם תוצאת 5 על שטח התצוגה. רשום את התוצאה ולהשליך את רצועת הבדיקה. להשתמש במקלון בדיקה חדשה לכל מדידה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (שלב אופציונאלי) קח כמויות מדויקות של דם על ידי pipetting ולהעביר את הדם לצינור microcentrifuge לניתוחים נוספים (המוגלובין, triacylglycerol (TG), כולסטרול כללי, וכו &#39;). במידת צורך, לדלל את כל הדם מדג אחד עם מי מלח. צנטריפוגה דגימות הדם במשך 3 דקות ב 680 XG ב RT ולקצור את הפלזמה. העבר את הפלזמה לתוך צינור חדש. בשלב זה, הוא מוכן לשימוש בניתוחים ביוכימיים. </li></ol>

<ol><li>Lieschke, G., Currie, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+human+disease%3A+zebrafish+swim+into+view%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nat Rev Genet. 8 (5), 353-367 (2007).</li>
<li>Penberthy, W. T., Shafizadeh, E., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+as+a+model+for+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">The zebrafish as a model for human disease.</a> Front Biosci. 7, d1439-d1453 (2002).</li>
<li>Stachura, D. L., Traver, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+dissection+of+zebrafish+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cellular dissection of zebrafish hematopoiesis.</a> Methods Cell Biol. 101, 75-110 (2011).</li>
<li>Jagadeeswaran, P., Sheehan, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+blood+coagulation+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Cells+Mol+Dis%22%5BJournal%5D)">Analysis of blood coagulation in the zebrafish.</a> Blood Cells Mol Dis. 25 (3-4), 239-249 (1999).</li>
<li>Jagadeeswaran, P., Sheehan, J. P., Craig, F. E., Troyer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+zebrafish+thrombocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of zebrafish thrombocytes.</a> Br J Haematol. 107 (4), 731-738 (1999).</li>
<li>Lieschke, G. J., Oates, A. C., Crowhurst, M. O., Ward, A. C., Layton, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphologic+and+functional+characterization+of+granulocytes+and+macrophages+in+embryonic+and+adult%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Morphologic and functional characterization of granulocytes and macrophages in embryonic and adult.</a> Blood. 98 (10), 3087-3096 (2001).</li>
<li>Iwanami, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+a+model+for+understanding+the+evolution+of+the+vertebrate+immune+system+and+human+primary+immunodeficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Hematol%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as a model for understanding the evolution of the vertebrate immune system and human primary immunodeficiency.</a> Exp Hematol. 42 (8), 697-706 (2014).</li>
<li>Babin, P. J., Goizet, C., Raldua, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+models+of+human+motor+neuron+diseases%3A+advantages+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Zebrafish models of human motor neuron diseases: advantages and limitations.</a> Prog Neurobiol. 118, 36-58 (2014).</li>
<li>Seth, A., Stemple, D. L., Barroso, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+use+of+zebrafish+to+model+metabolic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Mod+Mech%22%5BJournal%5D)">The emerging use of zebrafish to model metabolic disease.</a> Dis Mod Mech. 6 (5), 1080-1088 (2013).</li>
<li>Eames, S. C., Philipson, L. H., Prince, V. E., Kinkel, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+sugar+measurement+in+zebrafish+reveals+dynamics+of+glucose+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Blood sugar measurement in zebrafish reveals dynamics of glucose homeostasis.</a> Zebrafish. 7 (2), 205-213 (2010).</li>
<li>Moss, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+the+pancreas+in+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Regeneration of the pancreas in adult zebrafish.</a> Diabetes. 58 (8), 1844-1851 (2009).</li>
<li>Oka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diet-induced+obesity+in+zebrafish+shares+common+pathophysiological+pathways+with+mammalian+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Physiol%22%5BJournal%5D)">Diet-induced obesity in zebrafish shares common pathophysiological pathways with mammalian obesity.</a> BMC Physiol. 10 (21), (2010).</li>
<li>Chu, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+Akt1+enhances+adipogenesis+and+leads+to+lipoma+formation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Overexpression of Akt1 enhances adipogenesis and leads to lipoma formation in zebrafish.</a> PLoS One. 7 (5), e36474(2012).</li>
<li>Velasco-Santamaría, Y. M., Korsgaard, B., Madsen, S. S., Bjerregaard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bezafibrate%2C+a+lipid-lowering+pharmaceutical%2C+as+a+potential+endocrine+disruptor+in+male+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Aquat+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Bezafibrate, a lipid-lowering pharmaceutical, as a potential endocrine disruptor in male zebrafish (Danio rerio).</a> Aquat Toxicol. 105 (1-2), 107-118 (2011).</li>
<li>Zang, L., Shimada, Y., Nishimura, Y., Tanaka, T., Nishimura, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel%2C+reliable+method+for+repeated+blood+collection+from+aquarium+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">A novel, reliable method for repeated blood collection from aquarium fish.</a> Zebrafish. 10 (3), 425-432 (2013).</li>
<li>Carmichael, C., Westerfield, M., Varga, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+and+in+vitro+fertilization+at+the+zebrafish+international+resource+center%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation and in vitro fertilization at the zebrafish international resource center.</a> Methods Mol Biol. 546, 45-65 (2009).</li>
<li>Thorson, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+partitioning+of+body+water+in+Osteichthyes%3A+phylogenetic+and+ecological+implications+in+aquatic+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Bull-US%22%5BJournal%5D)">The partitioning of body water in Osteichthyes: phylogenetic and ecological implications in aquatic vertebrates.</a> Biol Bull-US. 120, 238-254 (1961).</li>
<li>Conte, F. P., Wagner, H. H., Harris, T. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+blood+volume+in+the+fish+%28Salmo+gairdneri+gairdneri%29%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Measurement of blood volume in the fish (Salmo gairdneri gairdneri).</a> Am J Physiol. 205, 533-540 (1963).</li>
<li>Diehl, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+good+practice+guide+to+the+administration+of+substances+and+removal+of+blood%2C+including+routes+and+volumes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Toxicol%22%5BJournal%5D)">A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes.</a> J Appl Toxicol. 21 (1), 15-23 (2001).</li>
<li>Nahas, K., Provost, J. -P., Baneux, P. H., Rabemampianina, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+acute+blood+removal+via+the+sublingual+vein+on+haematological+and+clinical+parameters+in+Sprague-Dawley+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">Effects of acute blood removal via the sublingual vein on haematological and clinical parameters in Sprague-Dawley rats.</a> Lab Anim. 34 (4), 362-371 (2000).</li>
<li>Curado, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+targeted+cell+ablation+in+zebrafish%3A+a+new+tool+for+regeneration+studies%5BTitle%5D)+AND+%22DevDyn%22%5BJournal%5D)">Conditional targeted cell ablation in zebrafish: a new tool for regeneration studies.</a> DevDyn. 236 (4), 1025-1035 (2007).</li>
<li>Andersson, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenosine+signaling+promotes+regeneration+of+pancreatic+beta+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Adenosine signaling promotes regeneration of pancreatic beta cells in vivo.</a> Cell Metab. 15 (6), 885-894 (2012).</li>
<li>Hiramitsu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eriocitrin+ameliorates+diet-induced+hepatic+steatosis+with+activation+of+mitochondrial+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep-UK%22%5BJournal%5D)">Eriocitrin ameliorates diet-induced hepatic steatosis with activation of mitochondrial biogenesis.</a> Sci Rep-UK. 4, 3708(2014).</li>
<li>Zang, L., Shimada, Y., Kawajiri, J., Tanaka, T., Nishimura, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Yuzu+%28Citrus+junos+Siebold+ex+Tanaka%29+peel+on+the+diet-induced+obesity+in+a+zebrafish+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Funct+Foods%22%5BJournal%5D)">Effects of Yuzu (Citrus junos Siebold ex Tanaka) peel on the diet-induced obesity in a zebrafish model.</a> J Funct Foods. 10, 499-510 (2014).</li>
<li>Schlegel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+non-alcoholic+fatty+liver+disease+with+zebrafish%3A+a+confluence+of+optics%2C+genetics%2C+and+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Studying non-alcoholic fatty liver disease with zebrafish: a confluence of optics, genetics, and physiology.</a> Cell Mol Life Sci. 69 (23), 3953-3961 (2012).</li>
<li>Stoletov, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+lipid+accumulation%2C+lipoprotein+oxidation%2C+and+macrophage+lipid+uptake+in+hypercholesterolemic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Vascular lipid accumulation, lipoprotein oxidation, and macrophage lipid uptake in hypercholesterolemic zebrafish.</a> Circ Res. 104 (8), 952-960 (2009).</li>
<li>Thomas, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutrient+balance+and+energy+expenditure+during+ad+libitum+feeding+of+high-fat+and+high-carbohydrate+diets+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Clin+Nutr%22%5BJournal%5D)">Nutrient balance and energy expenditure during ad libitum feeding of high-fat and high-carbohydrate diets in humans.</a> Am J Clin Nutr. 55 (5), 934-942 (1992).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

אנו מציגים כאן פרוטוקול מפורט לקבלת סדרתי דם מדג הזברה מבוגרת. שיטה זו היא פשוטה לביצוע ואנחנו משתמשים בו במעבדה על בסיס יומי. שיטת איסוף דם זה מבוססת על החדרת מחט נימי זכוכית לתוך אב העורקים הגב של דג הזברה. במהלך הליך זה, זה קריטי להיות זהיר כדי לא לקטוע את עמוד השדרה כי זה הקריטריון לחיפוש לאב עורקי הגב. צמצום הפגיעה בעמוד השדרה ישפר את שיעור ההישרדות. למרות שטכניקה זו היא פשוטה וקלה להורים, יש שיטות הטובות ביותר שיכול להבטיח הצלחה גבוהה ושיעורי הישרדות. חוקר מיומן ייקח 1-2 דקו...

דג הזברה צוברת פופולריות גוברת כמודל ערך של מחלות בבני אדם משום שהאיברים והגנטיקה שלהם דומים לאלה של בני אדם 1,2. בתחום הביולוגיה התפתחותית, מחקרים רבים הראו כי דג הזברה ומופע אנושי מסומנות דמיון בhematopoiesis 3, עצירת הדימום 4,5, וmyelopoiesis 6. דג הזברה מבוגרת משמש גם ללימוד חיסוני 7, 8 ניווניות ומחלות הקשורות להשמנה 9 כי מניות אורגניזם מודל זה מסלולים משותפים עם אלה שיבשו במחלות בבני אדם. להשמנת יתר ומחלות הקשורות להשמנת יתר (סוכרת, הכבד וsteatosis steatohepatitis נטול אלכוהול וטרשת עורק), רמת סוכר בדם ורמות שומני דג הזברה נחקרו ביסודיות במספר דגמי השמנה מהונדס ומושרה דיאטה 10-13. דגימת דם חוזרת ונשנית של בעלי חיים פרט להפחית את השימוש בבעלי חי ודצמrease הבדלי interindividual. עם זאת, אוסף מדגם חוזר ונשנה הוא קשה מבחינה טכנית בבעלי חיים קטנים כמו דג הזברה בגללם קטן יחסית נפח הדם וחוסר כלי נגישים בקלות. כמה שיטות לחד פעמי איסוף דם מדג הזברה פותחו, למרות שיש לי שיטות אלה חסרונות שלהם, כולל קטלני, נזק לרקמות קשורות ומוגבל נפח דם. לדוגמא, 1-5 דם μl ניתן לקצור מחתך רוחב של כ -0.3 סנטימטר באורך באזור של אב העורקים גב 5. עריפת ראש במספריים על ידי חיתוך דרך חגורת החזה יכול לאסוף 5-10 μl דם 10. שיטת דגימת דם נוחה נוספת היא אבלציה זנב 14. לנקב לב הוא שיטה חלופית פוטנציאלית אחד לאיסוף דם חוזר ונשנה של אותו דג, אבל הכמות קטנה מאוד שהושגה (כ 50 NL) עם הליך זה מגביל את מספר הניתוחים שיכולים להיות performed 11. בהתאם לכך, יש צורך בפרוטוקול חדש שיאפשר דגימה החוזרת ונשנית לא קטלנית דם, אשר תהיה מראש קריטי הכרחיות לאורגניזם זה להיות אורגניזם מודל סטנדרטי למחלות בבני אדם. טכניקה זו תאפשר לבדיקת תגובה תרופתית, גילוי של סמנים מולקולריים לאבחון, קביעת פרוגנוזה, והניטור של מחלות שונות, כגון מחלות מטבוליות, מחלות ניווניות וסוגים שונים של גידולים ממאירים. לפיכך, אנו פיתחנו שיטה זעיר פולשנית לקבלת דם מדג הזברה סדרתי 15. כאן אנו מדגימים את הליך בחינה ויזואלית ולספק פרוטוקול מפורט לטכניקה זו. באמצעות שיטה זו, הערך הנורמלי המסתמך על פרמטרים שונים, בין המוגלובין, צום רמת סוכר בדם, ושומנים בדם של דג הזברה מבוגר בריאה הוערכו. בנוסף, אנחנו גם הערכנו האם שיטה זו מתאימה ללימודים שדורשים דגימות סידורי על ידי מ &#39;onitoring השינויים זמניים ברמות סוכר בדם במהלך ניסויי האכלת יתר.

<table><tbody><tr><td>נימי זכוכית עם נימה</td><td>Narishige</td><td>GD-1</td><td>קוטר חיצוני 1.0 מ"מ.</td></tr><tr><td>חולץ מחט</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td>לייצור המחטים</td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>081-00136</td><td>להפריניזציה</td></tr><tr><td>מכלול צינור שואב</td><td>דראמונד</td><td>2-040-000</td><td>לאיסוף דם</td></tr><tr><td>מתקן נורה</td><td>Drummond</td><td>1-000-9000</td><td>לאיסוף דם</td></tr><tr><td>2-פנוקסיאתנול</td><td>Wako תעשיות כימיות טהורות</td><td>163-12075</td><td>להרדמת הדגים</td></tr><tr><td>DRI-CHEM3500V</td><td>Fujifilm-למדידת</td><td></td> <td>המוגלובין</td></tr><tr><td>DRI-CHEM שקופיות</td><td>Fujifilm</td><td>Hb-WII</td><td>למדידת המוגלובין</td></tr><tr><td>Glutest Neo Super</td><td>Sanwa Kagaku Kenkyusho-למדידת</td><td></td> <td>גלוקוז bood</td></tr><tr><td>Wako ערכת TG מסוג</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>464-44201</td><td>עבור TG מדידה</td></tr><tr><td>ערכת CHO מסוג Wako L</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>460-44301</td><td>למדידת כולסטרול כולל</td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Alcan Packaging</td><td>PM996</td><td>כדי להוציא את הדם על</td></tr></tbody></table>

איסוף דם חוזרים ונשנים לבדיקות דם בדג הזברה למבוגרים

Repeated Blood Collection for Blood Tests in Adult Zebrafish

איסוף דם חוזרים ונשנים הוא אחת הטכניקות הנפוצות ביותר שבוצעו בחיות מעבדה. עם זאת, פרוטוקול לא קטלני לאיסוף דם מדג הזברה לא הוקם. השיטות הקודמות לאיסוף דם מדג הזברה הן קטלניות, כגון חתך לרוחב, עריפת ראש והזנב אבלציה. כך פיתחנו שיטה חדשה &quot;חזר&quot; איסוף דם, ובהווה כאן פרוטוקול מפורט המתאר הליך זה. שיטה זו היא פולשנית ותוצאות בשיעור תמותה נמוכה מאוד (2.3%) לדג זברה, ובכך לאפשר דגימת דם חוזרת ונשנית של אותו אדם. הנפח המרבי של דגימת דם תלוי במשקל גוף של הדג. נפח דגימת דם חוזר ונשנה במרווחים צריך להיות ≤0.4% ממשקל גוף בכל שבוע או ≤1% כל 2 שבועות, שהוערכו על ידי מדידות של המוגלובין בדם. בנוסף, המוגלובין,, triacylglycerol צום סוכר בדם הפלזמה (TG) וג הכוללרמות holesterol בדג זברה מבוגרת זכר ונקבה נמדדו. אנחנו גם מיושמים בשיטה זו כדי לחקור את חוסר הוויסות של חילוף חומרים של הגלוקוז בהשמנה יתר הנגרם דיאטה. שיטת איסוף דם זה תאפשר יישומים רבים, כולל גלוקוז וחילוף חומרים של שומנים ומחקרים המטולוגיות, אשר יגדילו את השימוש בדג הזברה כאורגניזם מודל מחלה אנושי.

שיטת איסוף דם זה גורם לפגיעה מינימאלית לדג זברה (&lt;לנקב 1 מ&quot;מ; איור 1J) ומניבה שיעור תמותה נמוך מאוד של 2.3%. בחנו את הנפח המרבי של דם שיכול להיות שנאסף מדג אחד והעריך את הקשר למשקל הגוף שלה (איור 3). מצאנו שמרבית הדם שנאסף הנפח היה מתואם באופן ליניארי עם משקל גוף (R = .813). הנפח הגדול של דם שנאסף מדג בודד (משקל גוף = 1.071 ז) היה 25 μl, והנפח הקטן ביותר היה 1.3 μl מדגים במשקל של 0.115 g. הדבר מצביע על כך הנפח המרבי של דם שנאסף תלוי במשקל ...

דגימת דם חוזרת היא הכרחית וחשובה במחקר בבעלי חיים. פיתחנו שיטה חדשנית, לא קטלנית ואמינה לאיסוף דם חוזר מדגי זברה בוגרים, ויישמנו שיטה זו לחקר הביוכימיה של הדם, כולל מטבוליזם של גלוקוז.

Repeated blood collection is one of the most common techniques performed on laboratory animals. However, a non-lethal protocol for blood collection from ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבצע איסוף דגימות דם בגישה זעיר-פולשנית מדג zebrafish בוגר, באופן המאפשר איסופים חוזרים מאותו פרט. דבר זה מושג תחילה על ידי משיכה וחיתוך של קצותיהם של מחטי מיקרו-קפילריה מזכוכית. בשלב השני, המחטים עוברות הפריניזציה וייבוש באוויר.לאחר מכן, מחט מוחדרת לאתר איסוף הדם והדם נשאב לקצה המחט. בשלב הסופי, הדם נדחף מהמחט אל תוך כלי קיבול מתאים לצורך אנליזה בהמשך התהליך. לבסוף, ניתן למדוד את רמות הגלוקוז של דגימות הדם באמצעות מד גלוקוז ידני.היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון קטיעת זנב או דקירה לבבית, הוא ששיטת איסוף דם זו היא מינימלית פולשנית ומאפשרת דגימות חוזרות מאותו פרט של דג זברה. שיטה זו מקלה על השגת הערכה מהירה ומדויקת של סמנים בדם דג הזברה, ובכך מספקת תובנות לגבי הפרעות מטבוליות ופרמטרים אחרים בדם, כגון טוקסיקולוגיה ופרמקוקינטיקה של תרופות ספציפיות שמעניינות את החוקר. כדי להכין את מחטי מיקרו-קפילריה הזכוכית לאיסוף דם, התחילו במשיכת קפילריה מזכוכית בעלת קוטר חיצוני של 1 mm באמצעות מכשיר למשיכת מחטים.לאחר מכן, בעזרת מספריים עדינים, גזרו את קצה המחט באופן אלכסוני. קוטר הקצה האידיאלי הוא כ-100 עד 200 microns. לאחר מכן, הכניסו את המחטים שנגזרו אחת אחת לקצה של חלק האף של מכלול צינור השאיבה, והניחו את פיית הפה בתוך הפה.טבלו את קצה המחט בתמיסת

repeated-blood-collection-for-blood-tests-in-adult-zebrafish

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

כאן אנחנו מראים איך לעשות רטרו מסלולית הזרקת דג הזברה מבוגר.

רטרו מסלולית הזרקה של דג הזברה למבוגרים

מאמר זה מציג שיטה לאיסוף הדם באבי העורקים הגב של דג הזברה. כמו כן, מספק הוראות להשגת סרום לשימוש בניתוחים ביוכימיים, כגון בדיקות לקביעת רמות כולסטרול וטריגליצרידים.

הדם אוסף של ניתוח ביוכימי דג הזברה למבוגרים בלבד

השימוש הגובר של דג הזברה כמודל חיה דורש פיתוח שיטות יעילות לאספקה ​​של כמויות ידועות של תרכובות ופתרונות. ההליך המתואר להלן gavage מאפשר משלוח האוראלי של כמויות מדויקות של פתרון אמין, בטוח ויעיל לדג זברה מבוגר.

Gavaging דג הזברה למבוגר

השימוש בדגי זברה למחקר קרדיווסקולרי מתרחב למחקר על לבבות בוגרים. עבור יישומים אלה, בידוד מהיר ופשוט של רקמות לב הוא המפתח למניעת שינויים לאחר המוות ולהשגת מספר מספיק של דגימות. כאן, אנו מתארים שיטה מהירה וניתנת לשחזור לניתוח לבבות דגי זברה בוגרים.

שחזור של לבבות למבוגרים דג הזברה עבור יישומי תפוקה גבוהה

כאן, אנו נדון פרוטוקול השיטה אשר יאפשר ניתוח קל של להערכת רשתית דג זברה למבוגרים tg(fli:EGFP) כמו read-out מהירה בהגדרות של פתולוגיות וסקולרית לטווח ארוך קשורה neoangiogenesis ושינויים מבניים.

לומד סוכרת דרך העיניים של דג: Microdissection, ויזואליזציה, וניתוח tg(fli:EGFP) למבוגרים להערכת רשתית דג זברה

דג זברה שימשו לאחרונה מערכת מודל ויוו ללמוד תזמון שכפול ה-DNA במהלך הפיתוח. . זה מפורט הפרוטוקולים עבור שימוש דג זברה העוברים של פרופיל שכפול תזמון. פרוטוקול זה ניתן להתאים בקלות ללמוד שכפול תזמון מוטציות, סוגי תאים בודדים, מודלים המחלה ו מינים אחרים.

פרופיל תזמון שכפול ה-DNA באמצעות דג זברה כמערכת מודל In Vivo

כאן, אנו מציגים שיטה אמינה, פולשנית, וחסכונית כדי להקליט ולפרש אינהלטורים דג בוגרים מורדם.

ב אלקטרוקרדיוגרפיה למבוגרים בלבד Vivo

בדיקה זו היא שיטה פשוטה לכמת תאים hematopoietic בפיתוח זברה עוברית. תאי דם של דגי זברה מנותקים נתונים לניתוח ציטומטריה זרימה. זה מאפשר גילוי של מומים בדם בבעלי חיים מוטנטים ולאחר שינוי גנטי.

שימוש בציטומטריית זרימה כדי לזהות ולכמת היווצרות דם שהשתנתה בדגי הזברה המתפתחים

התחדשות שרירי השלד מונעת על ידי תאי גזע שריריים תושב רקמות, אשר לקויים במחלות שרירים רבות כגון ניוון שרירים, וזה גורם לחוסר היכולת של השריר להתחדש. כאן, אנו מתארים פרוטוקול המאפשר בדיקה של התחדשות שרירים במודלים של דגי זברה של מחלת שרירים.

בחינת התחדשות שרירים במודלים של דגי זברה של מחלת שרירים

פרוטוקול זה מתאר את ההליך להסרת האונה הגחונית של הכבד בדגי זברה בוגרים כדי לאפשר את המחקר של התחדשות הכבד.

כריתת הפטקטומיה חלקית בדגי זברה למבוגרים

למד שיטה לא פולשנית לאיסוף דם חוזר מדג זברה מבוגר לניתוח ביוכימיה דם ומטבוליזם גלוקוז. שיטה זו מאפשרת דגימות חוזרות מאותו פרט ומשפרת רווחת בעלי חיים במחקר.

איסוף דם חוזרים ונשנים לבדיקות דם בדג הזברה למבוגרים

גלה סרטונים נוספים