Name: תפוקה גבוהה Danio rerio Assay הוצאה אנרגיה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-27T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: למד שיטת סקר תפוקה גבוהה למדידת קצב מטבולי בזברה דגים באמצעות resazurin. שיטה זו מאפשרת זיהוי שינויים קטנים בייצור NADH2 ומיושמת בחקר השמנת יתר ובדיקת תרופות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצים להודות לד"ר רוג'ר קון וצ'או ז'אנג על תרומתם לאימות היישום של מבחן זה כפי שפורסם בעבר. עבודה זו נתמכה על ידי NIH 1F32DK082167-01 (BJR).

הערה: פרוטוקול זה כדלקמן הנחיות מאוניברסיטת אריזונה משרד להתנהגות אחראית של מחקר ואושר על ידי ועדת הטיפול ושימוש בבעלי חיים המוסדיים 1. גידול דג הזברה ותחזוקת העובר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן בינוני עובר E3 8. כדי להפוך את פתרון מניות 60x, לפזר 34.8 גרם NaCl, 1.6 גר &#39;KCl, CaCl 5.8g 2 ● 2H 2 O, וגרם 9.78 MgCl 2 ● 6H 2 O ב1.95 L ddiH 2 O. התאם ל- pH 7.2 באמצעות NaOH וHCl התאם נפח 2 ליטר באמצעות ddiH 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין מדיום עובר 1x E3, לדלל 16.5 מיליליטר 60x המניה ב 1 L ddiH20. הוספה 100 μl 1% מתילן כחול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רבייה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זכר הבית והמנייה נקבה להרהר (7-18 חודשים של גיל) בנפרד על מנת למקסם את הפוריות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את האורות 1 - 2 שעות לפני היום לפני ביצים הרצויות. הזדווגות להגדיר (זכר 1 ו1 - 2 נקבות) בגכלובי רוסינג כפי שתוארו קודם לכן 9. כלובי חצייה לאפשר לביצים לברוח טריפה כשהם עוברים דרך הבסיס המחורר של להכניס את הטנק שבו הדגים הבוגרים מתקיימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופציונאלי:. לרבייה מתוזמן, (כפי שניתן היו דרוש למחקרים שכלל הזרקת morpholino), להפריד את הזכר ונקבת דג על ידי מחלק פלסטיק שקוף, הסר זה בבוקר כדי לגרום הנחת מתוזמן של הביצים והפריה. לmorpholino לימודים, לבצע חישובי כוח להעריך את מספר הדגים עובריים הנדרשים לטיפול. ללא הערכה של גודל אפקט או וריאציה, משפט ראשוני ניתן להפעיל עם n = 8. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את הביצים מהכלוב מעבר לצלחת פטרי (100 - צלחת פטרי 150 עוברים / 10 סנטימטרים). לאפשר את הביצים להתיישב לתחתית הצלחת ויוצקים את המים. הסר את כל מים שנותרו בעזרת פיפטה העברה חד פעמית טיפ נאה. להוסיף בחזרה בינוני עובר E3 שנעשה בשלב 1.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך AFפיפטה הצולעת המלוטשת חד פעמית לביצת עתיד והעברת דגים. בעזרת מספריים, לחתוך פיפטה העברה חד פעמית סיימה בסיום 0.25 מיליליטר. כדי להסיר את קצוות גסים, פולני להבת קצה החתך מעל מבער בונזן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על דגים עובריים עד 4 ימים לאחר הפריה (DPF) ב -10 סנטימטרים בצלחות פטרי במדיום עובר E3 דג הזברה על 28.5 ○ ג פעמיים בכל יום, להשתמש בלהבה מלוטשת סיימה פיפטה העברה חד פעמית כדי להסיר כל ביצים מופרות או עוברים מתים (מראה אטום לבן). ברגע שכל יום, להחליף בינוני עובר E3. יוצקים את מדיום עובר E3, להסיר נוזל שנותר בעזרת פיפטה העברה חד פעמית טיפ נאה, ולהוסיף גב בינוני מחומם מראש (28.5 ○ C) E3 עובר. </li></ol> 2. הכן Assay פתרון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרון assay לפי טבלת 1. פתרון assay סינון סטרילי באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר. לפני assay ייזום, לחמם את פתרון assay סטרילי ב28.5 ○ גאמבטיית מים. </li></ol><table fo:keep-together.within-page="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מַרכִּיב </td><td> % מסך הכל </td><td> נפח (μl / 10 מיליליטר) </td></tr><tr><td> העובר בינוני 60x E3 </td><td> 1.667 </td><td> 166.7 </td></tr><tr><td> deionized זוגי H (DDI) 2 0 </td><td> 96.233 </td><td> 9,623.3 </td></tr><tr><td> Alamar הכחול </td><td> 1 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 400 מ&quot;מ NaOH </td><td> 1 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> 0.1 </td><td> 10 </td></tr></tbody></table> טבלת 1. Assay בינוני .3 בצע Assay <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את עוברי דג הזברה 3 פעמים עם מדיום עובר סטרילי המסונן E3. מערבבים את כל עוברי דג הזברה קיימא מהמצמד לתוך כוס. סינון סטרילי 75 מיליליטר בינוני עובר E3. בעזרת פיפטה העברה חד פעמית טיפ נאה, מחדשלהעביר כמה שיותר מבינוני עובר E3 מעוברי דג הזברה ככל האפשר. להוסיף חזרה 20 מיליליטר בינוני עובר סטרילי מסונן E3. להסיר ולהחליף בינוני עובר E3 3 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת דגים 1 לכל 93 בארות של שחור 96-גם צלחת צדדית ברור תחתונה. מעבירים את הדג לצלחת העוברי על ידי בנפרד לכידת עובר בתוך להבה מלוטשת סיימה פיפטה העברת פלסטיק חד פעמית (שלב 1.5) ובעדינות ולהוציא לתוך הבאר. העבר את מדיום עובר E3 נלקח מהכוס המכילה דגים שטפו לתוך 3 הבארות ריקות. הדבר מבטיח כי בארות ריקות נחשפו לאותו מים כבארות המכילות דגים. שתי הבארות המכילות דגים ובארות ריקות צריכה להיות לפחות חצי מלאה (200 μl) בסיומו של שלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף בינוני עובר E3 עם פתרון assay בכל 96 הבארות, כולל בארות ריקות. צעד זה צריך להתבצע בטור 1 בזמן לכל אחד מ -12 העמודים בצלחת גם 96. שימוש בטיפ נאה טרנס חד פעמיפיפטה FER, להסיר בינוני עובר E3 מכל טוב בטור אחד של הצלחת (8 בארות). יש להיזהר שלא לגעת בעובר דג הזברה. להוסיף 300 μl של פתרון assay היטב כל אחד מהמים שהוסרו. חזור על הסרת בינונית עובר E3 והחלפה עם פתרון assay לכל 12 העמודים של הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופציונאלי: כדי לבדוק את שינוי קצב חילוף חומרים בתגובה למתחם, להפוך את פתרון שהוא פי 100 (100X) ריכוז הטיפול הרצוי. ראוי לציין, להבטיח כי הפתרון 100x אינו עולה על 10% DMSO להגביל את ריכוז DMSO הסופי ללא יותר מ -0.1%. הוסף 3 μl של פתרון 100x לכל אחד מבארות הטיפול. הערה: לבצע חישובי כוח להעריך את מספר בארות טיפול. עם זאת, ללא אומדן הגודל של תגובה או וריאציה, משפט ראשוני ניתן להפעיל במתחם 8 טופל ו8 בארות שליטה ברכב שטופל המכילות דגים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 3 μl של שליטה ברכב לביקורת (ללא DRUטיפול ז) בארות המכילות דגים. כדי להבטיח שתגובת הניאון למתחם היא תוצאה של פעולות בתוך הדגים, חלים טיפולים תרופתיים ורכב עד 3 בארות ריקות בצלחת גם 96. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קראו צלחת מלאה דגים על קורא צלחת ניאון עם גל עירור ב530 ננומטר ואורך גל פליטה ב590 ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת מקום לחממת humidified מוגדרת 28.5 ○ C (לשמור על צלחת בחושך לאורך assay כדי למנוע photobleaching של פתרון assay). Assay ניתן להפעיל לתקופות הזמן שנעו בין שעות 1 עד 24 שעות. משך assay תלוי במטרה של המחקר. לבדיקת התגובה למתחם קצר משחק שאינו יציב זמן קצר עשוי להיות מתאים ביותר. עם זאת, לבדיקות יציבה מתחם או בדיקות של השפעות גנטיות, למקסם את משך assay עדיף לנצל את היתרונות הקשורים לאות המצטברת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בנקודת זמן שנקבע מראש (ראה שלב 3.6 כדי לקבוע עיתוי)לקרוא הקרינה של צלחת מלא דגים שוב עם אותן ההגדרות כמו שלב 3.5. </li></ol> 4. להעריך את השינוי היחסי בקרינה הקשורים לטיפול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב שינוי בקרינה של כל אחד גם על ידי הפחתת הקרינה בזמן 0 מהקרינה בסיומו של המחקר. ולס ללא דגים (חסר) צריך להיות ערכים ליד 0, הרבה מתחת לערכים מבארות המכילות דגים. שינוי בקרינה = הקרינה במסקנה - הקרינה בזמן 0 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לברר את השינוי היחסי בקרינה, לחשב את השינוי הממוצע בקרינה לבארות שליטה אז לחלק את השינוי בקרינה של כל אחד גם על ידי השינוי הממוצע בקרינה של בארות השליטה. ראוי לציין, בקרות יכולות להיות גם בקרות רכב או בקרות גנטיות. <img alt="משוואת 1" src="/files/ftp_upload/53297/53297eq1.jpg" /></li></ol>

<ol><li>Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+multiplex+biallelic+zebrafish+genome+editing+using+a+CRISPR+nuclease+system%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system.</a> PNAS. 110, 13904-13909 (2013).</li>
<li>Kimura, Y., Hisano, Y., Kawahara, A., Higashijima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+knock-in+transgenic+zebrafish+carrying+reporter%2Fdriver+genes+by+CRISPR%2FCas9-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of knock-in transgenic zebrafish carrying reporter/driver genes by CRISPR/Cas9-mediated genome engineering.</a> Sci. Rep. 4, 6545(2014).</li>
<li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+human+disease%3A+zebrafish+swim+into+view%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nat. Rev. Genet. 8, 353-367 (2007).</li>
<li>Brand, M. D., Couture, P., Else, P. L., Withers, K. W., Hulbert, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+energy+metabolism.+Proton+permeability+of+the+inner+membrane+of+liver+mitochondria+is+greater+in+a+mammal+than+in+a+reptile%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Evolution of energy metabolism. Proton permeability of the inner membrane of liver mitochondria is greater in a mammal than in a reptile.</a> Biochem. J. 275 (Pt 1), 81-86 (1991).</li>
<li>Renquist, B. J., Zhang, C., Williams, S. Y., Cone, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+assay+for+high-throughput+energy+expenditure+monitoring+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Development of an assay for high-throughput energy expenditure monitoring in the zebrafish.</a> Zebrafish. 10, 343-352 (2013).</li>
<li>Livingston, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+volumetric+respirometer+for+long-term+studies+of+small+aquatic+animals%5BTitle%5D)+AND+%22J.Mar.+Biol.+Assoc.+U.K%22%5BJournal%5D)">A volumetric respirometer for long-term studies of small aquatic animals.</a> J.Mar. Biol. Assoc. U.K. 48, 485-497 (1968).</li>
<li>Makky, K., Duvnjak, P., Pramanik, K., Ramchandran, R., Mayer, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+whole-animal+microplate+assay+for+metabolic+rate+using+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">A whole-animal microplate assay for metabolic rate using zebrafish.</a> J. Biomol. Screen. 13, 960-967 (2008).</li>
<li>E3 medium (for zebrafish embryos) Cold Spring Harb. Protoc. , <a target="_blank" href="http://cshprotocols.cshlp.org/citmgr?gca=protocols%3B2011%2F10%2Fpdb.rec66449">http://cshprotocols.cshlp.org/citmgr?gca=protocols%3B2011%2F10%2Fpdb.rec66449</a> (2011).</li>
<li>Nasiadka, A., Clark, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+breeding+in+the+laboratory+environment%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+J%22%5BJournal%5D)">Zebrafish breeding in the laboratory environment.</a> ILAR J. 53, 161-168 (2012).</li>
<li>Brand, M., Granato, M., Nusslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBrand%2C+M+%22Zebrafish%2C+A+practical+approach%22">Zebrafish, A practical approach</a>. Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. , Oxford University Press. (2002).</li>
<li>Fry, F. E. J., Hart, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cruising+speed+of+goldfish+in+relation+to+water+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Fish.+Res.+Board+Can%22%5BJournal%5D)">Cruising speed of goldfish in relation to water temperature.</a> J. Fish. Res. Board Can. 7, 169-175 (1948).</li>
<li>Oka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diet-induced+obesity+in+zebrafish+shares+common+pathophysiological+pathways+with+mammalian+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+physiol%22%5BJournal%5D)">Diet-induced obesity in zebrafish shares common pathophysiological pathways with mammalian obesity.</a> BMC physiol. 10 (21), (2010).</li>
<li>Song, Y., Cone, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creation+of+a+genetic+model+of+obesity+in+a+teleost%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Creation of a genetic model of obesity in a teleost.</a> FASEB J. 21, 2042-2049 (2007).</li>
<li>Maddison, L. A., Joest, K. E., Kammeyer, R. M., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+insulin+resistance+in+zebrafish+induces+alterations+in+beta-cell+number+and+glucose+tolerance+in+an+age+and+diet+dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+physiol.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle insulin resistance in zebrafish induces alterations in beta-cell number and glucose tolerance in an age and diet dependent manner.</a> Am. J. physiol. Endocrinol. , (2015).</li>
<li>Flynn, E. J. 3rd, Trent , C. M., Rawls, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ontogeny+and+nutritional+control+of+adipogenesis+in+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+lipid+res%22%5BJournal%5D)">Ontogeny and nutritional control of adipogenesis in zebrafish (Danio rerio).</a> J. lipid res. 50, 1641-1652 (2009).</li>
<li>Shimada, Y., Hirano, M., Nishimura, Y., Tanaka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+fluorescence-based+assay+system+for+appetite-regulating+gene+and+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">A high-throughput fluorescence-based assay system for appetite-regulating gene and drug screening.</a> PloS one. 7, e52549(2012).</li>
<li>Tingaud-Sequeira, A., Ouadah, N., Babin, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+obesogenic+test%3A+a+tool+for+screening+molecules+that+target+adiposity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+lipid+res%22%5BJournal%5D)">Zebrafish obesogenic test: a tool for screening molecules that target adiposity.</a> J. lipid res. 52, 1765-1772 (2011).</li>
</ol>

למחברים אין אינטרסים פיננסיים מתחרים לחשוף.

זיהום בחיידקים או פטריות יגביל מאוד יישום של assay זה. מתילן הכחול במדיום עובר E3 מגביל את האפשרות של זיהום פטרייתי. לאורך עובר גידול זה קריטי, כי הטיפול נלקח כדי להסיר עוברים מתים פעמיים בכל יום. בנוסף, זה חיוני כדי לשטוף ביסודיות את העוברים עם מדיום עובר E3 סטרילי ביום החניכה assay. 2 שלבים הבאים להגביל את הפוטנציאל לזיהום חיידקים של העוברים. ההכללה של בארות ריקות המתוארות בשלב 3.2 מאפשרת זיהוי של כל זיהום חיידקים. זיהום חיידקים שמניב אות מדידה הוא נדיר. עם זאת, אם אתה עושה את ה...

העכבר הוא כיום המודל הדומיננטי למחקר השמנה. מרווח הדור הקצר וכלים גנטיים זמינים בעכבר היו אח ורע עד כה. עם זאת, דג הזברה יש גם מרווח קצר דור (3 - 4 חודשים) ועולה אפילו העכבר בקלות המניפולציה גנטית 1,2. דג הזברה שומרת כמעט 90% מהגנים של יונקים, ואילו עלה בהרבה על העכבר במספר הצאצאים והפוטנציאל לשימוש במסכים גנטיים וסמים 3. כדי לנצל את הפוטנציאל של מודל דג הזברה ללימודים בהשמנה יתר, מבחני חייבים להיות מפותחים כדי לחקור גורמים המשפיעים על ויסות משקל גוף, כוללים הוצאה אנרגיה. כמעובדים מטבוליטים באמצעות β-חמצון וחמצן מחזור חומצת tricarboxylic הוא נצרך וNADH 2 מיוצר. לפיכך, NADH 2 הוא מדד ישיר לשטף של מטבוליטים דרך מסלולים מטבוליים (חמצון המטבוליט). בpoikilotherms, H + לדלוף דרך הממברנה של המיטוכונדריה הפנימית, שuncouples NADH 2 חמצון מסינתזת ATP, היא 4 - 5 פי נמוך יותר מאשר בhomeotherms 4. בהתאם לכך, בNADH דג הזברה 2 קשורים מאוד הדוק לייצור ATP באמצעות זרחון חמצוני. בזאת, אנו מתארים assay המודד NADH 2 ייצור בדג הזברה זחל כמדד להוצאת האנרגיה 5. צריכת חמצן היא תקן הזהב למדידת הוצאות אנרגיה. ובכל זאת, כדי לנצל את פוטנציאל תפוקה הגבוה של דג הזברה הטוב ביותר, מבחני של הוצאה האנרגיה חייבים להיות נוחים לתפוקה גבוהה. מערכות צריכת חמצן שתלוי בחדר סגור במחזור המערכת מוגבלות בתפוקה במספר התאים זמינים 6. O האוויר הפתוח 2 הצריכה / CO 2 מבחני הפקה גם יושמו ב5,7 דג הזברה. בסיס צלחת אלה באוויר פתוח 96-היטבמערכות ד נוחות לתפוקה גבוהה. למרבה הצער, חילוף גזים עם הסביבה מגביל את רגישות של מבחני אלה. לאחרונה פרסמו את היישום של assay המנטר NADH 2 באמצעות מחוון חיזור alamarBlue 5. assay זה מתגבר על המגבלות בתפוקה וברגישות משותפת לניתוחים של צריכת חמצן בדג הזברה. דג הזברה הופכת מודל חשוב יותר ויותר ללימודים של הומאוסטזיס אנרגיית גוף כולו. בחלקו, כי דג הזברה הם נוחים לשימוש במסכים גנטיים קדימה ומסכי סמים. יתר על כן, ממוקד מניפולציה גנטית, כולל מציאה ולדפוק ב, יכול להיות מיושם במהירות. הראינו בעבר כי assay זה יכול להיות משולב עם יישום תרופת אמבטיה ומציאה גנטית או נוקאאוט לזהות תרכובות וגנים שמשנים את קצב חילוף חומרים 5. יתר על כן, assay זה נועד לנצל את היתרונות הגלומים לתפוקה הגבוהה דג הזברה. </p&gt;

<table><tbody><tr><td>AlamarBlue</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-230-103</td><td>מיוצר על ידי Thermo Scientific</td></tr><tr><td>Fine Tip חד פעמי העברת פיפטה</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>13-711-26</td><td>מיוצר על ידי Thermo Scientific</td></tr><tr><td>Fisherbrand בוגר העברה חד פעמית</td><td>פיפטה פישר סיינטיפיק</td><td>13-771-9AM</td><td>מיוצר על ידי Thermo Scientific</td></tr><tr><td>צלחות תחתון שקופות שחורות דופן 96 בארות</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>50-320-785</td><td>מיוצר על ידי E& קיי סיינטיפיק פרודקטס בע"מ</td></tr></tbody></table>

תפוקה גבוהה<em&gt; danio rerio</em&gt; assay הוצאה אנרגיה

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

דג הזברה הוא אורגניזם מודל חשוב עם יתרונות הגלומים שיש לו את הפוטנציאל להפוך את דג הזברה מודל מיושם באופן נרחב למחקר של הומאוסטזיס אנרגיה והשמנת יתר. גדליו הקטנים של דג הזברה מאפשר למבחנים בעוברים להתנהל במתכונת צלחת 96 או 384 גם, טכנולוגיות מבוססות Morpholino וCRISPR לקדם קלות המניפולציה גנטית, וטיפול תרופתי על ידי יישום אמבטיה הוא בת קיימא. יתר על כן, דג הזברה הן אידיאלי עבור מסכי גנטיים קדימה ומאפשרים לגילוי גנים חדש. בהתחשב בחידוש היחסי של דג הזברה כמודל להשמנה, יש צורך לפתח כלים שמנצלים באופן מלא את היתרונות הללו. בזאת, אנו מתארים שיטה למדידת הוצאה אנרגטית באלפי דג הזברה העוברית בו-זמנית. פיתחנו פלטפורמת microplate בעלי החיים שלמה שבו אנו משתמשים 96-גם צלחות לבודד את הדגים בודדים ואנו מעריכים NADH 2 ייצור מצטבר באמצעות כדאיות תרבית תאים הזמינות המסחרית מחדשסוכן alamarBlue. בpoikilotherms היחסים בין NADH 2 ייצור והוצאת אנרגיה קשור בחוזקה. assay ההוצאה אנרגיה זו יוצר פוטנציאל למסך במהירות מניפולציות תרופתיות או גנטיות הישירות לשנות הוצאה אנרגיה או לשנות את התגובה לתרופה שימושית (למשל רגישות לאינסולין).

פתרון assay אינו מגדיל הקרינה בהיעדר דגים עובריים (איור 1). עם זאת, assay הוא רגיש מאוד לשינויים קטנים בקצב חילוף חומרים בתוך הבאר. דגים יחידים בתוך היטב יוצרים אות שונה באופן משמעותי מבארות ריקות בתוך שעה 1 (P &lt;0.0001). איור 2 מספק ייצוג חזותי של אותות שנוצרו על ידי דגים עובריים לאחר 24 שעות של דגירה. לצורך תמונה זו בארות צדדיות ברורות היו בשימוש. ובכל זאת, בארות צדדיות שחורות הם העדיפו לביצועי assay כדי למנוע שטיפה של אות הניאון מבארות סמוכות...

דג הזברה הוא אורגניזם מודל חשוב לחקר הומאוסטזיס אנרגטי. על ידי שימוש במחוון חמצון חיזור רגיש NADH2, alamar Blue, פיתחנו בדיקה המודדת את קצב חילוף החומרים של זחלי דג הזברה בפורמט צלחת של 96 בארות וניתן ליישם אותה לגילוי תרופות או גנים.

תפוקה גבוהה<em&gt; Danio rerio</em&gt; Assay הוצאה אנרגיה

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of ...

המטרה הכללית של בדיקה פלואורומטרית זו בעלת תפוקה גבוהה המבוססת על רזאזורין היא לנטר את ההשפעה של מניפולציות גנטיות או פרמקולוגיות על ייצור NADH2, המהווה מדד לקצב המטבולי. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום ההשמנה, כגון השפעת תרופה או גן נתון על הקצב המטבולי. בנוסף, ניתן להשתמש בבדיקה זו לסריקה של אינטראקציות פוטנציאליות בין תרופה לתרופה או בין תרופה לגן במערכת של בעל חיים שלם.היתרון המרכזי של בדיקה זו, ביחס לבדיקות צריכת חמצן, הוא התפוקה הגבוהה והצטברות האות לאורך זמן, המאפשרים למשתמש לזהות הבדלים קטנים בקצב המטבולי. את ההליך תדגים קרוליין פוי, סטודנטית לתואר שני במעבדתי. לאחר הכנת תמיסת מלאי בריכוז 60X של מצע E3 בהתאם לפרוטוקול הכתוב, הכינו מצע E3 בריכוז 1X על ידי דילול של 16.5 מיליליטרים מתמיס המלאי בליטר אחד של מים מזוקקים פעמיים.לאחר מכן, הוסיפו 100 µL של מתילין בלו (methylene blue) בריכוז 1%. כדי להכין פניפט חד-פעמי שעבר ליטוש בלהבה להעברת ביצים ודגים, השתמשו במספריים כדי לחתוך פניפט העברה חד-פעמי מדורג בסימון של 0.25 mL. לאחר מכן, כדי להסיר את הקצוות המחוספסים, השתמשו במבער בנזן כדי לבצע ליטוש בלהבה לקצה החתוך.לאחר ביצוע ההכלאות של דגי הזבראפיש ואיסוף הביצים, יש להמתין עד שהביצים ישקעו לתחתית הצלחת ולשפוך את המים. השתמשו בפיפטת העברה חד-פעמית בעלת קצה דק כדי להסיר את שאריות המים. לאחר מכן, הוסיפו בחזרה את מצע ה-E3.דגרו את עוברי הדגים בטמפרטורה של 28.5 degrees Celsius עד לארבעה ימים לאחר ההפריה, או DPF. פעמיים ביום השתמשו בפיפטת העברה חד-פעמית מדורגת ומלוטשת בלהבה כדי להסיר ביצים שלא הופרו או עוברים מתים. לאחר מכן, פעם ביום, שפכו את מצע ה-E3.השתמשו בפיפט העברה בעל קצה דק כדי להסיר את שאריות המצע, והחליפו אותו ב-E3 טרי שחומם מראש ל-28.5 degrees Celsius. כדי לבצע את בדיקת הוצאת האנרגיה, הכינו את תמיסת הבדיקה בהתאם לטבלה זו. השתמשו במסנן של 0.22 micrometer כדי לעקר את התמיסה באמצעות סינון, וחממו אותה ל-28.5 degrees Celsius באמבט מים לצורך הבדיקה.בצלוחית פטרי, רכז את כל עוברי הזברה (zebrafish) החיוניים מהמOrCreate. לאחר סטריליזציה באמצעות סינון של 75 milliliters של מצע E3, השתמש בפיפטת העברה חד-פעמית בעלת קצה דק כדי להסיר כמה שיותר ממצע ה-E3 מצלוחית הפטרי. הוסף חזרה 20 milliliters של E3 סטרילי. לאחר מכן, הסר והחלף את ה-E3 הסטרילי פעמיים נוספות.בשלב הבא, באמצעות פיפטת העברה פלסטית חד-פעמית ומסומנת שעברה ליטוש בלהבה, העבירו דגי embryos של דגים בודדים לבארות של פלטת 96 בארות. בעבודה עם עמודה אחת בפלטה בכל פעם, הסירו את מצע ה-E3 משמונה הבארות של העמודה הראשונה, תוך הקפדה שלא לגעת ב-embryos עם פיפטת ההעברה. לאחר מכן, הוסיפו 300 µL של תמיסת בדיקה לכל בארה.חזור על הפעולה בכל 12 עמודי הפלטה. כדי לכלול טיפול תרופתי, לאחר הכנת תמיסה בריכוז 100X של התרכובת הרצויה, הוסף 3 µL לכל אחת מבארות הטיפול. לאחר מכן, הוסף 3 µL של בקרת vehicle לבארות הבקרה של הדגים.כדי להבטיח שתגובת הפלואורסצנציה לתרכובת היא תוצאה של פעילות בתוך הדג, הגדירו טיפולים בתרופה ובחומר נשאי (vehicle) בשלושה בארות ריקות לכל טיפול בלוחית 96-בארות. כעת, באמצעות קורא לוחות פלואורסצנציה, עם אורכי גל עירור ופליטה של 530 nanometers ו-590 nanometers בהתאמה, קראו את הבארות בלוחית הדגים. הניחו את הלוחית באינקובטור לח בטמפרטורה של 28.5 degrees Celsius.בהתאם לבדיקה וליציבות התרכובת הנבדקת, קראו שוב את הפלואורסצנציה בנקודת זמן שנקבעה מראש. כדי להעריך את השינוי היחסי בפלואורסצנציה, חשבו את השינוי הממוצע בפלואורסצנציה עבור בארי הביקורת. לאחר מכן, חלקו את השינוי בפלואורסצנציה של כל באר בשינוי הממוצע בפלואורסצנציה של בארי הביקורת.להלן דוגמה לשימוש בשתי עמודות של פלטה בעלת 96 בארות. בארות בעמודה A כוללות דגי zebrafish שהוצעו כביקורת שטופלה ב-vehicle, בעוד שבארות בעמודה B כוללות דגי zebrafish שטופלו באינסולין. בטבלה A מוצגת הפלואורסצנציה שנמדדה בזמן אפס.טבלה B מכילה את הפלואורסצנציה שנמדדה לאחר 24 שעות. בטבלה C, הפלואורסצנציה בזמן אפס הופחתו מהפלואורסצנציה לאחר 24 שעות כדי להעריך את השינוי בפלואורסצנציה. לאחר מכן, חשבו את השינוי הממוצע בפלואורסצנציה בבארות הביקורת.טבלה D מציגה את השינוי בפלואורסצנציה של כל באער בנפרד, מחולק בשינוי הממוצע בבאערי הביקורת. ניתן לראות כאן שטיפול באינסולין בריכוז של 10 micromolar גרם לעלייה של 2.77 מ';ים באות שנוצרה על ידי דגי zebrafish במהלך 24 שעות, עם ערך P של פחות מ-0.0001. כפי שניתן לראות כאן, תמיסת הבדיקה אינה משנה את צבעה או את רמות הפלואורסצנציה המוחלטות בהיעדר עוברי דגים.עם זאת, הבדיקה רגישה מאוד לשינויים קטנים בקצב המטבולי בתוך הבאר. איור זה מייצג אותות שנוצרו על ידי עוברי tilapia לאחר דגירה של 24 שעות. בארות ורודות מעידות על דגים בעלי קצב מטבולי גבוה.בבארות הסגולות נמצאים דגים בעלי קצבי מטבוליזם בינוניים, והבארות הכחולות מייצגות קצב מטבוליזם נמוך. הדבר מדגים גם את הרב-גוניות של בדיקה זו ואת יישומה על מיני דגי גרמיים (teleost species). מכיוון שהחזרת alamar blue המושרה על ידי NADH2 אינה הפיכה, האות מצטבר עם הזמן, מה שמאפשר הגברה של שינויים קטנים.מוצג כאן השינוי היחסי בפלואורסצנציה המושרה על ידי דג אחד עד חמישה דגים לאחר שעה אחת, שעתיים וארבע שעות. עם כל עלייה במספר הדגים, השינוי היחסי בפלואורסצנציה עולה באופן משמעותי עם הזמן, וככל שמספר הדגים גדול יותר, כך גדל היקף השינוי בפלואורסצנציה לאורך זמן. לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו על עד 5,000 דגים עובריים ליום.בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להקפיד על הימנעות מפגיעה בדגים העובריים. לאחר ביצוע בדיקה זו, ניתן לבצע פרוצדורות אחרות, כגון מדידת ליפידים ניטרליים באמצעות Nile red, או מדידת דחף פגיבי (phagic drive) באמצעות בליעת paramecium המסומנים ב-fluorassay. הדבר מאפשר לנו להשוות את הקשר בין קצב המטבוליזם למטבוליזם של ליפידים, או בין קצב המטבוליזם לדחף הפגיבי.לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום מטבוליזם האנרגיה ומחלות מטבוליות ללמוד על הוצאת אנרגיה בדגי זברה ללא הגבלה בקצב העיבוד. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו משתמשים בריאגנט הפלואורומטרי resazurin כדי למדוד ייצור של NADH2 בדגי זברה.

high-throughput-danio-rerio-energy-expenditure-assay

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

דג זברה מייצג מודל חוליות חזקה שהיה תחת מנוצל למחקרים מטבוליים. כאן אנו מתארים את הדרך מהירה...

ניתוח פרופיל המטבולי של עוברי דג זברה

פרוטוקול מתואר לזיהוי in vivo של השפעות של מעכבי מיטוכונדריה באורגניזם המודל Caenorhabditis elegans ולזיהוי תרכובות משפרות פוטנציאליות. ניתן להשתמש בפרוטוקול זה כדי לסנן ספריות תרופות עבור תרכובות המווסתות את תפקוד המיטוכונדריה.

Screenable<em&gt; In vivo</em&gt; Assay עבור מיטוכונדריאלי מאפנני שימוש הטרנסגניים Bioluminescent<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

זוהי דיאטה שומן גבוהה האכלה פרוטוקול לזירוז ההשמנה דרוזופילה, דוגמנית על הבנת המנגנונים המולקולריים יסודי מעורב lipotoxicity. הוא גם מספק assay triacylglyceride של תפוקה גבוהה למדידת הצטברות שומן דרוזופילה ואת פוטנציאל אחרים מודלים (חרק) בתנאים תזונתיים, סביבתיים, גנטי או פיזיולוגיים שונים.

בשומן האכלה ואת וזמינותו Triacylglyceride תפוקה גבוהה בדרוזופילה Melanogaster

אנו מציגים פרוטוקול למדידת צריכת החמצן ואת acidification חוץ-תאית במוח זחל ומבוגרים melanogaster דרוזופילה . מנתח חילוף החומרים מנוצל עם פרוטוקול מותאם וממוטב. מיקרו-רקמת ריסון הינם המכריעים של פרוטוקול זה, היו עיצבת ויצרת במיוחד לשימוש שלהם ניתוח זה.

ניתוח מטבולית של melanogaster דרוזופילה Larval ושכל למבוגרים

טכניקה זו מתארת הקלטה בזמן אמת של צריכת החמצן ואת המחירים acidification חוץ-תאית ברקמות רשתית העכבר explanted באמצעות של מנתח השטף חוץ-תאית.

מדידה של חילוף החומרים האנרגיה ברקמת הרשתית Explanted באמצעות ניתוח השטף חוץ-תאית

נשימה מיטוכונדריאלי חיוני להישרדות organismal; לכן, קצב צריכת החמצן היא מדד מצוין של בריאות מיטוכונדריאלי. פרוטוקול זה, אנו מתארים את השימוש respirometer זמינים מסחרית כדי למדוד הבזליים, שיעורי צריכת חמצן מירבית חיים, שלמים, ולא תאי בחופשיות Caenorhabditis elegans.

מדידה של קצב הצריכה של חמצן בשלם Caenorhabditis elegans

כאן, אנו מאפיינים את התגובות הסלולר מדגיש התגובה התאית ב-נמטודות C. אלגיה על ידי מדידת ההפעלה של כתבים פלורסנט ההמרה ולומר רגישות ללחץ פיזיולוגי.

מדידות התגובות הפיזיולוגיות של הלחץ בג. אלגיה

מחקר זה מציג פרוטוקולים עבור שתי גישות ניתוח פעילות לוקומוטור חצי אוטומטי ב C. elegans קומפלקס I מחלות גז-1(fc21) תולעים, כלומר, ZebraLab (בדיקת תפוקה בינונית) ו- WormScan (בדיקה בעלת תפוקה גבוהה) ומספקים ניתוח השוואתי בין מגוון רחב של שיטות מחקר לכימות התנהגות נמטודה ותפקוד עצבי שרירי משולב.

ניתוח השוואתי של שיטות ניסיוניות לכימות פעילות בעלי חיים בקאנורבדיטיס אלגנס מודלים של מחלות מיטוכונדריאליות

מאכיל המיקרו-לוח מציע שיטה חסכונית ובעלת תפוקה גבוהה לכימות צריכת מזון נוזלי בדרוזופילה. התקן מודפס בתלת-ממד מחבר מיקרו-לוחית בעלת 96 באר שבה זבובים שוכנים למיקרו-לוחית בעלת 1536 בארות שממנה זבובים צורכים תמיסת הזנה עם צבע מעקב. ירידת נפח הפתרון נמדדת באופן ספקטרופוטומטרי.

מאכיל מיקרו-תפוקה גבוהה לבדיקה לכימות הצריכה בדרוסופילה

חיידקי מעיים עשויים להשפיע באופן חיובי או שלילי על בריאות המארח שלהם באמצעות מנגנונים ספציפיים או שמורים. Caenorhabditis elegans היא פלטפורמה נוחה לסינון עבור חיידקים כאלה. הפרוטוקול הנוכחי מתאר סינון בתפוקה גבוהה של 48 חיידקים מבודדים להשפעה על עמידות לעקה של נמטודה, המשמשים כפרוקסי לבריאות התולעים.

הקרנה בתפוקה גבוהה של מבודדים מיקרוביאליים עם השפעה על בריאות Caenorhabditis elegans

פרוטוקול זה מתאר בדיקה לכימות קצב ההזנה של Caenorhabditis elegans בהתבסס על מדידת פינוי החיידקים בתרבית נוזלית.

כימות צריכת המזון ב- Caenorhabditis elegans על ידי מדידת פינוי חיידקים

למד שיטת סקר תפוקה גבוהה למדידת קצב מטבולי בזברה דגים באמצעות resazurin. שיטה זו מאפשרת זיהוי שינויים קטנים בייצור NADH2 ומיושמת בחקר השמנת יתר ובדיקת תרופות.

תפוקה גבוהה

גלה סרטונים נוספים