תפוקה גבוהה Danio rerio Assay הוצאה אנרגיה
27 בינואר 2016
דג הזברה הוא אורגניזם מודל חשוב לחקר הומאוסטזיס אנרגטי. על ידי שימוש במחוון חמצון חיזור רגיש NADH2, alamar Blue, פיתחנו בדיקה המודדת את קצב חילוף החומרים של זחלי דג הזברה בפורמט צלחת של 96 בארות וניתן ליישם אותה לגילוי תרופות או גנים.
המטרה הכוללת של בדיקה פלואורומטרית מבוססת רזזורין בתפוקה גבוהה היא לנטר את ההשפעה של מניפולציות גנטיות או פרמקולוגיות על ייצור NADH2, שהוא מדד לקצב חילוף החומרים. שיטה זו יכולה לעזור לנו לענות על שאלות מפתח בתחום ההשמנה, כגון ההשפעה של תרופה או גן נתון על קצב חילוף החומרים. בנוסף, ניתן ליישם בדיקה זו כדי לסנן אינטראקציות פוטנציאליות בין תרופות או תרופות-גנים במערכת של בעלי חיים שלמים.
היתרון העיקרי של בדיקה זו, ביחס למבחני צריכת חמצן, הוא התפוקה הגבוהה והצטברות האות לאורך זמן, מה שמאפשר למשתמש לזהות הבדלים קטנים בקצב חילוף החומרים. מי שתדגים את ההליך הזה תהיה קרוליין פוי, סטודנטית לתואר שני במעבדה שלי. לאחר הכנת תמיסת מלאי 60X של מדיום E3 על פי פרוטוקול הטקסט, הכינו מדיום 1X E3 על ידי דילול 16.5 מיליליטר מלאי וליטר מים מזוקקים כפולים.
לאחר מכן מוסיפים 100 מיקרוליטר של 1% מתילן כחול. כדי להכין פיפטה חד פעמית לק להבה להעברת ביצים ודגים, השתמש במספריים כדי לחתוך פיפטה חד פעמית מדורגת בסיום של 0.25 מיליליטר. לאחר מכן, כדי להסיר את הקצוות המחוספסים, השתמש במבער בונסן כדי להליט את הקצה החתוך.
לאחר הקמת מעברי דג זברה ואיסוף ביצים, הניחו לביצים להתיישב לתחתית המנה, ושפכו את המים. השתמש בפיפטה חד פעמית בעלת קצה דק כדי להסיר את שאריות המים. לאחר מכן הוסף בחזרה את מדיום E3.
דגרו על הדג העוברי בטמפרטורה של 28.5 מעלות צלזיוס עד ארבעה ימים לאחר ההפריה, או DPF. פעמיים ביום השתמש בפיפטה חד פעמית מדורגת מלוטשת להבה כדי להסיר ביציות לא מופרות או עוברים מתים. ואז פעם ביום שפכו את מדיום E3.
השתמש בפיפטה בעלת קצה דק כדי להסיר את כל המדיום שנותר, והחלף ב-E3 טרי שחומם מראש ל-28.5 מעלות צלזיוס. כדי לבצע את בדיקת הוצאות האנרגיה, הכן את פתרון הבדיקה, לפי טבלה זו. השתמש במסנן של 0.22 מיקרומטר כדי לסנן לעקר את התמיסה, ולחמם ל -28.5 מעלות צלזיוס באמבט מים לצורך הבדיקה.
בצלחת פטרי, שלבו את כל עוברי דג הזברה הקיימים מהמצמד. לאחר עיקור מסנן של 75 מיליליטר של מדיום E3, השתמש בפיפטה חד פעמית בעלת קצה דק כדי להסיר כמה שיותר ממדיום E3 מצלחת הפטרי. הוסף בחזרה 20 מיליליטר E3 סטרילי. לאחר מכן הסר והחלף את ה- E3 הסטרילי פעמיים נוספות.
לאחר מכן, בעזרת פיפטת העברה חד פעמית מפלסטיק מדורגת מלוטשת להבה, העבירו דגים עובריים בודדים לבארות של צלחת בת 96 בארות. בעבודה עם עמוד אחד של הצלחת בכל פעם, הסר את מדיום E3 משמונה הבארות של העמודה הראשונה, הקפד לא לגעת בעוברים עם פיפטת ההעברה. לאחר מכן הוסף 300 מיקרוליטר של תמיסת בדיקה לכל באר.
חזור על הפעולה עם כל 12 עמודות הצלחת. כדי לכלול טיפול תרופתי, לאחר הכנת תמיסה פי 100 של התרכובת הרצויה, הוסף שלושה מיקרוליטר לכל אחת מבארות הטיפול. לאחר מכן הוסף שלושה מיקרוליטרים של בקרת רכב לבארות הבקרה של הדגים.
כדי להבטיח שתגובת הקרינה לתרכובת היא תוצאה של פעילות בתוך הדגים, הגדר טיפולי תרופות וכלי רכב לשלוש בארות ריקות כל אחת בצלחת של 96 בארות. כעת, באמצעות קורא לוחות פלואורסצנטי, עם אורכי גל עירור ופליטה של 530 ננומטר ו-590 ננומטר בהתאמה, קראו את הבארות של צלחת הדגים. מניחים את הצלחת בחממה לחה בטמפרטורה של 28.5 מעלות צלזיוס.
בהתאם לבדיקה וליציבות התרכובת הנבדקת, קרא שוב את הקרינה בנקודת זמן שנקבעה מראש. כדי להעריך את השינוי היחסי בקרינה, חשב את השינוי הממוצע בקרינה עבור בארות הבקרה. לאחר מכן חלקו את השינוי בקרינה של כל באר בשינוי הממוצע בקרינה של בארות הבקרה.
הנה דוגמה לשימוש בשני עמודים של צלחת 96 בארות. בארות עמודה A כוללות דג זברה שטופל ברכב, בעוד שבארות עמודה B כוללות דג זברה שטופל באינסולין. בטבלה A, הקרינה שנמדדה בזמן אפס מוצגת.
טבלה B מכילה את הקרינה שנמדדה 24 שעות לאחר מכן. בטבלה C, הקרינה בזמן אפס הופחתה מהפלואורסצנטיות ב-24 שעות כדי להעריך את השינוי בקרינה. לאחר מכן, חשב את השינוי הממוצע בקרינה בבארות בקרה.
טבלה D היא השינוי בקרינה של כל באר בודדת, חלקי השינוי הממוצע בבארות הבקרה. אתם יכולים לראות כאן שטיפול באינסולין ב-10 מיקרו-מולרי גרם לעלייה של פי 2.77 באות שנוצר על ידי דג הזברה במשך 24 שעות בערך P של פחות מ-0.0001. כפי שניתן לראות כאן, תמיסת הבדיקה אינה משנה צבע או רמות פלואורסצנטיות מוחלטות בהיעדר עוברים.
עם זאת, הבדיקה רגישה מאוד לשינויים קטנים בקצב חילוף החומרים בתוך הבאר. נתון זה מייצג אותות שנוצרו על ידי אמנון עוברי לאחר דגירה של 24 שעות. בארות ורודות מעידות על דגים עם קצב חילוף חומרים גבוה.
בארות סגולות מכילות דגים עם קצב חילוף חומרים מתון, והבארות הכחולות מייצגות קצב חילוף חומרים נמוך. זה גם מראה את הרבגוניות של הבדיקה והיישום הזה על פני מיני טלאוסט. מכיוון שההפחתה הנגרמת על ידי NADH2 של אלמר כחול אינה הפיכה, האות מצטבר עם הזמן, מה שמאפשר להגביר שינויים קטנים.
מוצג כאן השינוי היחסי בקרינה שנגרם על ידי דג אחד עד חמישה בשעה, שעתיים וארבע שעות. עם כל עלייה במספר הדגים, השינוי היחסי בקרינה גדל משמעותית עם הזמן, וככל שמספר הדגים גדול יותר, כך גדל גודל השינוי הקרינה עם הזמן. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו על עד 5,000 דגים עובריים ביום.
בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להקפיד להימנע מפגיעה בדג העוברי. לאחר ביצוע בדיקה זו, ניתן לבצע הליכים אחרים כמו מדידת אדום הנילוס של שומנים ניטרליים, או מדידת הנעה פאגית באמצעות צריכת פלואוראסיה המסומנת paramecium. זה מאפשר לנו להשוות את הקשר בין קצב חילוף החומרים לחילוף החומרים של השומנים, או קצב חילוף החומרים והדחף הפגי.
לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום חילוף החומרים האנרגטי ומחלות מטבוליות לחקור את הוצאת האנרגיה בדגי הזברה ללא מגבלות בתפוקה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשתמש במגיב הפלואורומטרי רזזורין כדי למדוד את ייצור NADH2 בדג הזברה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג בדיקה בתפוקה גבוהה המשתמשת באינדיקטור חמצון-חיזור הרגיש ל-NADH2, alamar Blue, למדידת קצב המטבוליזם של זחלי דג זברה. שיטה זו ישימה לגילוי תרופות או גנים בהקשר של מחקר על הומיאוסטזיס של אנרגיה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה
- מטבוליזם
רקע
- דגי זברה הם אורגניזם מודל מרכזי לחקר תהליכים מטבוליים.
- הבדיקה מתמקדת בניטור ייצור NADH2 כאינדיקטור לקצב המטבולי.
- היא נותנת מענה לשאלות חשובות במחקר על השמנה.
- השיטה מאפשרת סריקה בתפוקה גבוהה של השפעות גנטיות ופרמקולוגיות.
מטרת המחקר
- פיתוח בדיקה מהימנה למדידת קצבים מטבוליים בזריקים של דגי זברה.
- הערכת השפעותיהם של תרופות וגנים על חילוף החומרים.
- סיוע בסריקה של אינטראקציות בין תרופות ובין תרופה לגן.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת תמיסת מלאי בריכוז 60X של מצע E3.
- דילול של תמיסת המלאי ליצירת מצע E3 בריכוז 1X.
- שימוש במבחן פלואורומטרי מבוסס רזזורין (resazurin).
- ניטור ייצור NADH2 לאורך זמן לגילוי שינויים מטבוליים.
תוצאות עיקריות
- הבדיקה מאפשרת זיהוי של הבדלים קטנים בשיעורי חילוף החומרים.
- היא מהווה חלופה בעלת תפוקה גבוהה לבדיקות מסורתיות של צריכת חמצן.
- התוצאות יכולות לספק מידע על ההשפעות המטבוליות של התערבויות גנטיות ופרמקולוגיות שונות.
- הפרוטוקול מודגם על ידי סטודנט לתארים מתקדמים במסגרת מעבדה.
מסקנות
- בדיקה זו היא כלי בעל ערך למחקר מטבולי בדגי זברה.
- היא משפרת את היכולת לסרוק התערבויות טיפוליות פוטנציאליות.
- יכולת התפוקה הגבוהה (high throughput) של השיטה מהווה יתרון משמעותי.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית מרכזית
בדיקה זו למדידת הוצאה אנרגטית בדגי zebrafish בתפוקה גבוהה מאפשרת סריקה מהירה של התערבויות פרמקולוגיות וגנטיות על קצב חילוף החומרים, ובכך נותנת מענה לבקבוק קריטי במחקר על השמנה והומאוסטזיס אנרגטי. על ידי ניצול תגובת החימצון-חיזור של NADH2-alamarBlue בפורמט של 96 בארות, השיטה מספקת קריאות מטבוליות כמותיות ומצטברות לאורך זמן, התומכות בתיקוף מטרות ובזיהוי מועמדים בתוכניות למחקר מחלות מטבוליות. יכולת ההרחבה של הבדיקה לאלפי עוברים ביום מגבירה את הביטחון החזוי בשלבי הגילוי המוקדמים על ידי הפחתת מספר התוצאות השליליות השגויות בזיהוי פנוטיפ מטבולי.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות הקושרות גנים או תרכובות לייצור NADH2 משתנה כמדד (proxy) לקצב המטבולי.
- ערך תפעולי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות כימות של פנוטיפים מטבוליים במערכת של בעל חיים שלם הרלוונטית פיזיולוגית.
- ערך ניבוי: מסייע במיון תיקי פיתוח על ידי זיהוי מטרות או תרכובות בעלות השפעות משמעותיות על הוצאה אנרגטית בשלבים מוקדמים של הגילוי.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מספק קריאות מטבוליות סטנדרטיות הניתנות לשחזור באמצעות שינויים בעוצמת הפלואורסצנציה, דבר המאפשר הערכה מהימנה של תרכובות על פני ספריות גדולות.
- ערך תפעולי: תואם לתשתיות קיימות לסריקה בתפוקה גבוהה, כולל מערכות אוטומטיות לטיפול בנוזלים וקוראי פלטות פלואורסצנציה.
- יכולת הרחבה: מאפשר סריקה של עד 5,000 עוברים ליום, ובכך תומך במאמצי סריקה בהיקף של קמפיין במחלות מטבוליות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מספק פנוטיפ מטבולי רלוונטי למחלה בדגי זברה, מודל בעל מסלולים שמורים של הומאוסטזיס אנרגטי.
- ערך תפעולי: מאפשר רציפות מזיהוי פגיעות (hits) ועד לתיקוף פרה-קליני על ידי שמירה על קריאות מטבוליות עקביות לאורך תהליכי העבודה.
- צמצום סיכונים: מפחית עמימות מכניסטית באופטימיזציית מובילים (lead optimization) על ידי אישור השפעות מטבוליות on-target ב-in vivo.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
הבדיקה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה ועד לזיהוי מובילים (lead identification), ומספקת קריאה מטבולית פונקציונלית המגשרת בין סריקה פנוטיפית למעקב מכניסטי.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות על ידי מדידת שינויים בייצור NADH2 בתגובה להפרעות גנטיות או פרמקולוגיות.
- סריקה: מספק מוכנות לבדיקה באמצעות טיפול סטנדרטי בדגי zebrafish, הכנת ריאגנטים וכמותיות מבוססות פלואורסצנציה.
- אנליטיקה: מייצר מדדי fold-change כמותיים המנורמלים לבקרות, המאפשרים השוואה סטטיסטית של תגובות מטבוליות בין תנאים שונים.
- מחקר תרגומי: מקשר לעבודה פרה-קלינית על ידי אספקת קריאה שמורה של הוצאת אנרגיה הישמה בקרב מיני teleost.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמת סריקה מטבולית ניתנת לשימוש חוזר עבור תוכניות למחקר השמנה, סוכרת ומחלות מטבוליות קשורות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי בתיקוף המטרה על ידי הפחתת תוצאות שגויות שליליות באמצעות הצטברות אות לאורך זמן.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות והסטנדרטיזציה באמצעות שלבי התפתחות עובריים מוגדרים, סינון ריאגנטים ובקרות אינקובציה.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי מתן אפשרות לסריקה רחבת היקף עם צריכת ריאגנטים מינימלית לכל נקודת נתון.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בהחלטות קידום מותאמות סיכון על ידי אספקת סימנים מוקדמים של רעילות מטבולית או יעילות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בגידול דגי זברה, קביעת שלבי התפתחות עובריים ואופטימיזציה של בדיקות מבוססות פלואורסצנציה.
- תלוי בגישה לקוראי לוחות פלואורסצנציה עם מסנני עירור של 530nm ופליטה של 590nm ודגירה בבקרה טמפרטורית.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של נהלי טיפול בעוברים, הכנת ריאגנטים ונורמליזציה של נתונים.
- כולל שיקולי התאמה בעת הרחבה למינים אחרים של דגי סריגים (teleost) או לשלבי התפתחות שונים.
- מוגבל בשל אופיו הבלתי הפיך של אות ה-alamarBlue, המונע מדידות קינטיות בזמן אמת אך תומך במדידת הצבירה בנקודת הסיום (endpoint accumulation).
