Name: במבחנה Assay למדוד Phosphatidylethanolamine Methyltransferase פעילות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-05T13:00:01.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: למדו שיטה לכימות פעילות PEMT בתמציות תאים שלם מלישמניה. השיטה משתמשת בהעברת קבוצות מתיל רדיואקטיביות ללא צורך בניקוי אנזים, ומספקת תובנות למטבוליזם של ליפידים בטפילים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

עבודה זו נתמכה על ידי מענקי ה-NIH ARRA RO3 AI078145 ו-1SC3GM113743 ל-RZ.

הכנת תמצית 1. תא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול תאי שושנת יריחו בבקבוק סטרילי פלסטיק האטומים עם כובע הדוק אוויר ב 26 מעלות צלזיוס במדיום עשוי 1x M199 בתוספת 20 מ&quot;מ HEPES pH7.4, 100 U / פניצילין מיליליטר, 100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין, 5 מיקרוגרם / מיליליטר heme , 0.35 גר &#39;/ L Naco 2 H, 0.1 אדנין מ&quot;מ, ו -2 מיקרוגרם / מיליליטר biopterin בלי ללחוץ. קציר התאים על ידי צנטריפוגה ב 1500 גרם במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס, כאשר הם מגיעים צפיפות תאים של 1-2 x 10 7 / מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant עם טפטפת ולשטוף את התאים על ידי resuspending התא גלולה עם pipet סרולוגיות במחצית של תרבות הנפח של פוספט הקר שנאגרו (137 מ&quot;מ NaCl, 2.7 מ&quot;מ KCl, 10 מ&quot;מ Na 2 4 HPO, 1.8 מ&quot;מ KH 2 4 PO, pH7.4). השלך supernatants תא לפי הנחיות בטיחות BL2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי צנטריפוגה שוב ב 1500 גרם במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. בטל supernatant עם טפטפת. המשך to השלב הבא או הצמד להקפיא את התא גלולה בחנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך ב -80 מעלות צלזיוס (עד שלושה חודשים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מאגר תמוגה 2x (0.5 M סוכרוז, 0.1 מ &#39;TrisHCl, pH7.5, 2 מ&quot;מ EDTA, ומעכב פרוטאז 2x קוקטייל) ולשמור אותו על 4 מעלות צלזיוס על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התא גלולה (טרי או קפוא) בנפח שווה של חיץ תמוגה 2x. להוסיף נפח 1x של חרוזי זכוכית. וורטקס במרץ ב 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 כרכים של חיץ תמוגה 1x ומערבבים. תמציות תא צנטריפוגה ב 1500 XG ב 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות עד גלולה תאים וגרעינים רצופים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את supernatant עם pipet לתוך צינור צנטריפוגות מגניב טרי ולשמור תמציות תא על קרח עד להשלמת הניסוי. </li></ol> 2. לקבוע את ריכוז החלבון של תמצית הנייד באמצעות ערכת הערכת חלבון כמו Bicinchoninic החומצה Assay <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון להכין את חומצת bicinchoninic (BCA) (1 מיליליטר / צינור) על ידי ערבוב BCA והנחושת (II) שלulfate ביחס של 49: 1 (V / V). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הסטנדרטים החלבון של 0, 10, 20, 30, 40, 50, ו -60 מיקרוגרם / מיליליטר ידי דילול 10 מ&quot;ג / פתרון מניות אלבומין בסרום שור (BSA) מיליליטר לתוך 1 מיליליטר aliquots של פתרון BCA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 μl של תמציות תאים ב 1 מיליליטר של פתרון BCA בכפילויות. דגירה סטנדרטים ודגימות חלבון במשך 10 דקות באמבט מים C מראש חימם 60 °. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעברת דגימות קרח במשך 3 דקות. מדוד את הספיגה של הסטנדרטים ודגימות החלבון עם ספקטרופוטומטר באורך גל של 562 ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשב את ריכוז החלבון של תמציות התא באמצעות התקן כהתייחסות כמתואר בפרוטוקול של היצרן BSA. לדלל תמציות תא לריכוז חלבון של 10 מ&quot;ג / מיליליטר עם חיץ תמוגה 1x. </li></ol> 3. אנזימתי Assay ב200 μl לכל צינור הערה: קח את השלבים הבאים במנדף כימי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק כל דגימה בשני עותקים ב15 מיליליטרצינור חרוטי. הכן 20 μl 1 M TrisHCl pH 7.5 לכל צינור ולשמור אותו על קרח. להכין 2 מיליליטר של כלורופורם / מתנול (1: 1 (V / V); עצירת פתרון) ב RT עבור כל צינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipet 20 μl של 1 M TrisHCl pH 7.5 בכל צינור חרוטי 15 מיליליטר על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פעל לפי הנחיות בטיחות קרינה מכאן והלאה. הוסף את המקבילה של 0.06 מיקרומטר (0.2 μCi) S - [Methyl- H 3] adenosyl-L-מתיונין ו -50 מיקרומטר SAM הקר לכל צינור לסך של 50.06 מיקרומטר של SAM. להוסיף x μl של מים קרים שבו x = 200 (20 (לחיץ) + 20 (לתמציות תא) + נפח של SAM הקר ורדיואקטיבי) לכל צינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את כל צינור חרוטי לאמבטית מים 30 מעלות צלזיוס מראש חימם. הוסף לכל צינור 20 μl של תמציות תא (שווה ערך של 200 מיקרוגרם של חלבון) כדי להתחיל את התגובה. דגירה לזמן הרצוי (0-45 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעצור את התגובה על ידי הוספת 2 מיליליטר של כלורופורם / מתנול (1: 1; / V V; פתרון עצירה) על צינור אחד. העבר את צינור חרוטי לRT (20-256; ג). </li></ol> 4. שומנים הפקה הערה: קח את השלבים הבאים במנדף כימי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 700 μl של מים לכל צינור המכיל מדגם התגובה האנזימטית. וורטקס במרץ למשך 30 שניות. צנטריפוגה ב 1500 XG במשך 5 דקות על RT להפריד אורגנית מהשלב המים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את השלב האורגני הנמוך לתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר חדש עם טפטפת. הוסף 1 מיליליטר של מים לכל &quot;שלב תחתון&quot; המכיל צינור ומערבולת במרץ למשך 30 שניות. צנטריפוגה שוב ב 1500 XG במשך 5 דקות להפריד אורגנית מהשלב המים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את השלב האורגני הנמוך לתוך צינור נצנץ עם טפטפת. דגימות יבשים תחת זרם של N 2. השלך שלבי מים המכילים SAM-רדיואקטיבי שולב אינו וצינורות חרוטי רדיואקטיבי לפי הנחיות קרינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מיליליטר / שפופרת של נוזל נצנץ. מדוד את הרדיואקטיביות שולבה עם cou נצנץnter על פי הפרוטוקול של היצרנים והשימוש של המכשיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את הפעילות האנזימטית בnmol / חלבון מ&quot;ג באמצעות המשוואה הכללית הבאה: [ריכוז מוחלט (רדיואקטיבי וקר) של SAM (מ&quot;מ)] ערך לדקה x 10 x 3 x 5 פעילות ספציפית של SAM רדיואקטיבי (Ci / mmol) x [הריכוז של SAM רדיואקטיבי (מ&quot;מ)] הערה: הפרוטוקול לעיל ניתן לשנות לריכוז תלוי SAM או assay PEMT תלוי חלבון. עבור assay האנזימטית התלוי ריכוז SAM, הזמן נשמר (15 דקות, שהוא בטווח ליניארי) קבועות וכמויות שונות של SAM הקר מתווספים assay ואילו עבור assay החלבון התלוי PEMT, ריכוז SAM (בחרנו 0.05 מ&quot;מ) וזמן נשמרים (15 דקות) קבועות. גם את ה- pH של המאגר ניתן לשנות בהתאם לצורך, אם יש לי כמה אנזימים PEMT ערך ה- pH אופטימלי שונה. </li></ol>

<ol><li>Keogh, M. R., Courtney, P. D., Kinney, A. J., Dewey, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+of+phospholipid+N-.methyltransferases+from+Arabidopsis+and+soybean%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Functional characterization of phospholipid N-.methyltransferases from Arabidopsis and soybean.</a> J Biol Chem. 284 (23), 15439-15447 (2009).</li>
<li>Geiger, O., Lopez-Lara, I. M., Sohlenkamp, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidylcholine+biosynthesis+and+function+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Phosphatidylcholine biosynthesis and function in bacteria.</a> Biochim Biophys Acta. 1831 (3), 503-513 (2013).</li>
<li>Gao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+lipogenesis+in+white+adipose+tissue+contributes+to+the+resistance+to+high+fat+diet-induced+obesity+in+phosphatidylethanolamine+N-.methyltransferase-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Decreased lipogenesis in white adipose tissue contributes to the resistance to high fat diet-induced obesity in phosphatidylethanolamine N-.methyltransferase-deficient mice.</a> Biochim Biophys Acta. 1851 (2), 152-162 (2015).</li>
<li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+phosphatidylethanolamine+N-.methyltransferase+alters+plasma+VLDL+phospholipids+and+attenuates+atherosclerosis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Lack of phosphatidylethanolamine N-.methyltransferase alters plasma VLDL phospholipids and attenuates atherosclerosis in mice.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 29 (9), 1349-1355 (2009).</li>
<li>Vance, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipid+methylation+in+mammals%3A+from+biochemistry+to+physiological+function%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Phospholipid methylation in mammals: from biochemistry to physiological function.</a> Biochim Biophys Acta. 1838 (6), 1477-1487 (2014).</li>
<li>Nishimaki-Mogami, T., Suzuki, K., Takahashi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+phosphatidylethanolamine+methylation+in+the+secretion+of+very+low+density+lipoproteins+by+cultured+rat+hepatocytes%3A+rapid+inhibition+of+phosphatidylethanolamine+methylation+by+bezafibrate+increases+the+density+of+apolipoprotein+B48-containing+lipoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">The role of phosphatidylethanolamine methylation in the secretion of very low density lipoproteins by cultured rat hepatocytes: rapid inhibition of phosphatidylethanolamine methylation by bezafibrate increases the density of apolipoprotein B48-containing lipoproteins.</a> Biochim Biophys Acta. 1304 (1), 21-31 (1996).</li>
<li>Noga, A. A., Zhao, Y., Vance, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+unexpected+requirement+for+phosphatidylethanolamine+N-.methyltransferase+in+the+secretion+of+very+low+density+lipoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">An unexpected requirement for phosphatidylethanolamine N-.methyltransferase in the secretion of very low density lipoproteins.</a> J Biol Chem. 277 (44), 42358-42365 (2002).</li>
<li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+repression+of+phosphatidylethanolamine+N-.methyltransferase+%28PEMT%29+in+BRCA1-mutated+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Epigenetic repression of phosphatidylethanolamine N-.methyltransferase (PEMT) in BRCA1-mutated breast cancer.</a> Oncotarget. 5 (5), 1315-1325 (2014).</li>
<li>Cui, Z., Houweling, M., Vance, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+rat+hepatoma+cell+growth+by+expression+of+phosphatidylethanolamine+N-.methyltransferase-2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Suppression of rat hepatoma cell growth by expression of phosphatidylethanolamine N-.methyltransferase-2.</a> J Biol Chem. 269 (40), 24531-24533 (1994).</li>
<li>Cui, Z., Shen, Y. J., Vance, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inverse+correlation+between+expression+of+phosphatidylethanolamine.N-.methyltransferase-2+and+growth+rate+of+perinatal+rat+livers%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Inverse correlation between expression of phosphatidylethanolamine.N-.methyltransferase-2 and growth rate of perinatal rat livers.</a> Biochim Biophys Acta. 1346 (1), 10-16 (1997).</li>
<li>Minder, A. C., de Rudder, K. E., Narberhaus, F., Fischer, H. M., Hennecke, H., Geiger, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidylcholine+levels+in.Bradyrhizobium+japonicum.+membranes+are+critical+for+an+efficient+symbiosis+with+the+soybean+host+plant%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Phosphatidylcholine levels in.Bradyrhizobium japonicum. membranes are critical for an efficient symbiosis with the soybean host plant.</a> Mol Microbiol. 39 (5), 1186-1198 (2001).</li>
<li>Kodaki, T., Yamashita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+phosphatidylethanolamine+methylation+pathway.+Cloning+and+characterization+of+two+distinct+methyltransferase+genes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Yeast phosphatidylethanolamine methylation pathway. Cloning and characterization of two distinct methyltransferase genes.</a> J Biol Chem. 262 (32), 15428-15435 (1987).</li>
<li>Tanaka, Y., Amano, F., Maeda, M., Nishijima, M., Akamatsu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+properties+of+phosphatidyl-N-.monomethylethanolamine+N-.methyltransferase%2C+the+enzyme+catalyzing+the+second+and+the+third+steps+in+the+phosphatidylethanolamine+N-.methyltransferase+system%2C+from+mouse+liver+microsomes%5BTitle%5D)+AND+%22Jpn+J+Med+Sci+Biol%22%5BJournal%5D)">Purification and properties of phosphatidyl-N-.monomethylethanolamine N-.methyltransferase, the enzyme catalyzing the second and the third steps in the phosphatidylethanolamine N-.methyltransferase system, from mouse liver microsomes.</a> Jpn J Med Sci Biol. 43 (3), 59-73 (1990).</li>
<li>Bibis, S. S., Dahlstrom, K., Zhu, T., Zufferey, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Leishmania+major+phosphatidylethanolamine+methyltransferases+LmjPEM1+and+LmjPEM2+and+their+inhibition+by+choline+analogs%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biochem+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Characterization of Leishmania major phosphatidylethanolamine methyltransferases LmjPEM1 and LmjPEM2 and their inhibition by choline analogs.</a> Mol Biochem Parasitol. 196 (2), 90-99 (2014).</li>
<li>deRudder, K. E., Thomas-Oates, J. E., Geiger, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhizobium+meliloti.+mutants+deficient+in+phospholipid+N-.methyltransferase+still+contain+phosphatidylcholine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Rhizobium meliloti. mutants deficient in phospholipid N-.methyltransferase still contain phosphatidylcholine.</a> J Bacteriol. 179 (22), 6921-6928 (1997).</li>
<li>Aktas, M., Narberhaus, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+characterization+of+the+enzyme+properties+of+the+phospholipid+N-.methyltransferase+PmtA+from+Agrobacterium+tumefaciens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">In vitro characterization of the enzyme properties of the phospholipid N-.methyltransferase PmtA from Agrobacterium tumefaciens.</a> J Bacteriol. 191 (7), 2033-2041 (2009).</li>
<li>Ridgway, N. D., Vance, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidylethanolamine+N-.methyltransferase+from+rat+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Phosphatidylethanolamine N-.methyltransferase from rat liver.</a> Methods Enzymol. 209, 366-374 (1992).</li>
<li>Gaynor, P. M., Carman, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidylethanolamine+methyltransferase+and+phospholipid+methyltransferase+activities+from+Saccharomyces+cerevisiae.+Enzymological+and+kinetic+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Phosphatidylethanolamine methyltransferase and phospholipid methyltransferase activities from Saccharomyces cerevisiae. Enzymological and kinetic properties.</a> Biochim Biophys Acta. 1045 (2), 156-163 (1990).</li>
<li>Arondel, V., Benning, C., Somerville, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+functional+expression+in+Escherichia+coli.+of+a+gene+encoding+phosphatidylethanolamine+methyltransferase+%28EC+2.1.1.17%29+from+Rhodobacter+sphaeroides%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Isolation and functional expression in Escherichia coli. of a gene encoding phosphatidylethanolamine methyltransferase (EC 2.1.1.17) from Rhodobacter sphaeroides.</a> J Biol Chem. 268 (21), 16002-16008 (1993).</li>
<li>Wessel, M., Klusener, S., Godeke, J., Fritz, C., Hacker, S., Narberhaus, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virulence+of+Agrobacterium+tumefaciens.+requires+phosphatidylcholine+in+the+bacterial+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Virulence of Agrobacterium tumefaciens. requires phosphatidylcholine in the bacterial membrane.</a> Mol Microbiol. 62 (3), 906-915 (2006).</li>
<li>Klusener, S., Aktas, M., Thormann, K. M., Wessel, M., Narberhaus, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+physiological+relevance+of+Agrobacterium+tumefaciens.+phosphatidylcholine+biosynthesis+genes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Expression and physiological relevance of Agrobacterium tumefaciens. phosphatidylcholine biosynthesis genes.</a> J Bacteriol. 191 (1), 365-374 (2009).</li>
<li>Henderson, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+the+gene+encoding+Leishmania+donovani.S.-adenosylhomocysteine+hydrolase%2C+a+potential+target+for+antiparasitic+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biochem+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Cloning of the gene encoding Leishmania donovani.S.-adenosylhomocysteine hydrolase, a potential target for antiparasitic chemotherapy.</a> Mol Biochem Parasitol. 53 (1-2), 169-183 (1992).</li>
<li>Koszalka, G. W., Krenitsky, T. A. 5'-Methylthioadenosine (MTA) phosphorylase from promastigote of Leishmania donovani. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKoszalka%2C+GW+%22Purine+and+Pyrimidine+Metabolism+in+Man+V%2C+Adv+Exp+Med+Biol%22">Purine and Pyrimidine Metabolism in Man V, Adv Exp Med Biol</a>. Nyhan, W. L., Thompson, L. F., Watts, R. W. E. 131, Springer US. 559-563 (1986).</li>
<li>Biastoff, S., Teuber, M., Zhou, Z. S., Dräger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorimetric+activity+measurement+of+a+recombinant+putrescine+N.-methyltransferase+from+Datura+stramonium%5BTitle%5D)+AND+%22Planta+Med%22%5BJournal%5D)">Colorimetric activity measurement of a recombinant putrescine N.-methyltransferase from Datura stramonium.</a> Planta Med. 72 (12), 1136-1141 (2006).</li>
<li>Hendricks, C. L., Ross, J. R., Pichersky, E., Noel, J. P., Zhou, Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enzyme-coupled+colorimetric+assay+for+S.-adenosylmethionine-dependent+methyltransferases%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">An enzyme-coupled colorimetric assay for S.-adenosylmethionine-dependent methyltransferases.</a> Anal Biochem. 326 (1), 100-105 (2004).</li>
<li>Cannon, L. M., Butler, F. N., Wan, W., Zhou, Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stereospecific+colorimetric+assay+for+%28S.%2CS.%29-adenosylmethionine+quantification+based+on+thiopurine+methyltransferase-catalyzed+thiol+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A stereospecific colorimetric assay for (S.,S.)-adenosylmethionine quantification based on thiopurine methyltransferase-catalyzed thiol methylation.</a> Anal Biochem. 308 (2), 358-363 (2002).</li>
<li>Hoffman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatographic+analysis+of+the+chiral+and+covalent+instability+of+S.-adenosyl-L-methionine%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Chromatographic analysis of the chiral and covalent instability of S.-adenosyl-L-methionine.</a> Biochemistry. 25 (15), 4444-4449 (1986).</li>
<li>Wu, S. E., Huskey, W. P., Borchardt, R. T., Schowen, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chiral+instability+at+sulfur+of+S.-adenosylmethionine%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Chiral instability at sulfur of S.-adenosylmethionine.</a> Biochemistry. 22 (12), 2828-2832 (1983).</li>
<li>Dorgan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enzyme-coupled+continuous+spectrophotometric+assay+for+S.-adenosylmethionine-dependent+methyltransferases%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">An enzyme-coupled continuous spectrophotometric assay for S.-adenosylmethionine-dependent methyltransferases.</a> Anal Biochem. 350 (2), 249-255 (2006).</li>
</ol>

אין ניגוד העניינים הצהיר

assay זה פשוט, מהיר PEMT מאפשר כימות של צורות מפוגלים של PE שנובע מהעברה של קבוצות מתיל רדיואקטיביים מSAM על PE באמצעות תמצית תא כולו כמקור חלבון. הוא מהיר, רגיש, לשחזור, ומתאים גם לאנזימים מטוהרים 17. ניתן להוסיף Monomethyl- או דימתיל-PE לassay אם methyltransferase של עניין הוא ספציפי למצעים אלה ולא לPE 12,13,18,19. אם נעשה שימוש באנזים PEMT מטוהר, ניתן להוסיף PE לassay. הגבלה של פרוטוקול זה היא שassay אינו מזהה את מוצרי תגובות (monomethyl-PE, דימתיל-PE, או ...

methyltransferase Phosphatidylethanolamine אנזימים (PEMT) לזרז את הקובץ המצורף קוולנטיים של קבוצות מתיל אחד או יותר באמצעות -adenosylmethionine S (SAM) כתורם קבוצה מתיל על PE, monomethyl-PE או דימתיל-PE לתת monomethyl-PE, דימתיל-PE ו / או phosphatidylcholine (PC). אנזימים אלה הם כמעט בכל מקום בתאים של בעלי חיים ופטריות. ניתן גם למצוא אותם בכמה צמחים 1 וכ -10% מחיידקים, במיוחד אלה שאינטראקציה עם אאוקריוטים 2. PEMTs רלוונטי לביולוגיה של התא לא רק על ידי תרומה לייצור של מחשב, אשר הוא ברמת שומנים בדם העיקרית בתאים של בעלי חיים, אלא גם על ידי מילוי תפקודים תאיים חשובים נוספים. ביונקים, PEMTs באים לידי ביטוי בעיקר בכבד שבו הם נדרשים להפרשה נורמלית של ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה מאוד, והם גם תורמים להשמנה יתר הנגרם דיאטה 3, טרשת עורקים 4, ואינסולין להתנגדאהה 5. בנוסף, PEMT יונקים גם באו לידי ביטוי בתאי שומן, אם כי לרמות נמוכות יותר, ולהשתתף בתצהיר שומן 6, 7. תפקיד PEMT בהתפתחות סרטן 8, 9 אפופטוזיס, ו- 10 צמיחת תאים גם הוכח. בחיידקים, אנזימי PEMT הוכחו להיות חשוב לצמיחה נורמלית של תאי 2, ארסיות 2, וסימביוזה עם צמח המארח 11. המטרה והרציונל של הפרוטוקול הנוכחי הוא למדוד פעילות PEMT מתמציות תא שלמות ללא הצורך לטהר את האנזים. שני פרוטוקולים שונים פותחו כדי למדוד את פעילות PEMT. אחד הראשון והנפוץ ביותר מודד את העברת קבוצה מתיל tritiated מSAM רדיואקטיבי על PE, אשר הוא הנושא של מאמר זה. פרוטוקול זה פותח במקור כדי למדוד את פעילות PEMT משמרים 12 ותאי יונקים (כבד) 13 כדי לקבל understanding של ביוסינתזה מחשב בתאים אלה, כמו גם כדי לקבוע את הספציפיות של אנזימים אלה. מאוחר יותר, בטכניקה זו יושמה לסוגי תאים אחרים, כגון חיידקים 2 (באמצעות ערך ה- pH בסיסי עבור assay למרות 15) וטפילי protozoan 14. טכניקה זו יכולה לשמש עם תמציות תא שלמות, כמו גם אנזים מטוהר, וניתן ליישם פוטנציאלי לכל מערכת תמצית תא. Assay רדיואקטיבי שאינו גם תוכנן שמסתמך על הכימות האנזימטית של -adenosylhomocysteine ​​S, מוצר transmethylation של SAM 16. Assay האחרון עשוי להיות נוח יותר כפי שהוא אינו כרוך בקרינה רדיואקטיבית, אבל זה מתאים רק לאנזימים מטוהרים.

<table><tbody><tr><td>S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine (פעילות ספציפית של 5-15 Ci/mMole)</td><td>Perkin Elmer</td><td>NET155050UC</td><td>Aliquot את המגיב והקפאה ב-20 מעלות; C; עקוב אחר הנחיות בטיחות הקרינה בעת השימוש</td></tr><tr><td>בקוקטייל מעכב פרוטאז</td> מגיב זה <td>Roche Life Sciences</td><td>11836170001</td><td>לדלל אותו טרי&nbsp;</td></tr><tr><td>חרוזי זכוכית, שטופים בחומצה, 425-600 מ"מ</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>G8772</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת חומצה ביקינצ'ונינית</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>B9643</td><td></td></tr><tr><td>נחושת (II) סולפט</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>C2284</td><td></td></tr><tr><td>מונה נצנוץ MicroBeta2 עם גלאי 1</td><td>פרקין אלמר&nbsp;</td><td>2450-0010</td><td></td></tr><tr><td>ספקטרופוטומטר Biomate 3</td><td>Thermo Scientific</td><td>840208300</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת מלאי BSA (10 מ"ג/מ"ל)</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>B9001S</td><td></td></tr><tr><td>נוזל נצנוץ&nbsp;</td><td>מוצר מחקר International Corp</td><td>111198</td><td></td></tr><tr><td>S-(5'-אדנוזיל)-L-מתיונין כלוריד (הידרוכלוריד)&nbsp;</td><td>קיימן כימיקלים</td><td>13956</td><td>מדללים את המגיב ב-20 מ"מ HCl ומקפיאים מינוטים ב-80 מעלות; C&nbsp;</td></tr></tbody></table>

במבחנה assay למדוד phosphatidylethanolamine methyltransferase פעילות

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

פוספטידיל-אתנולמין מתילטרנספראזות הם אנזימים ביו-סינתטיים המזרזים העברה של קבוצת מתיל אחת או יותר מ-S-אדנוזיל-L-מתיונין לפוספטידיל-אתנולמין, מונומתיל-פוספטידיל-אתנולמין או דימתיל-פוספטידיל-אתנולמין כדי לתת מונומתיל-פוספטידיל-אתנולמין, דימתיל-פוספטידיל-אתנולמין או פוספטידילכולין. אנזימים אלה נמצאים בכל מקום בתאי בעלי חיים, בפטריות, ונמצאים גם בכ-10% מהחיידקים. הם ממלאים פונקציות חשובות שונות בפיזיולוגיה של התא מעבר לתפקידם הישיר בחילוף החומרים של השומנים כגון עמידות לאינסולין, סוכרת, טרשת עורקים, צמיחת תאים או אלימות. כתב היד הנוכחי מדווח על בדיקה אנזימטית פשוטה ללא תאים המודדת את ההעברה של קבוצות מתיל טריטיות מ-S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine לפוספטידיל-אתנולמין תוך שימוש בתמציות תאים שלמים כמקור אנזימים. הצורות המתילציה המתקבלות של פוספטידיל-אתנולמין הן הידרופוביות ולכן, ניתן להפריד אותן מ-S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine מסיס במים על ידי מיצוי אורגני. ניתן ליישם בדיקה זו על כל סוגי תאים אחרים ולהשתמש בה לבדיקת מעכבים/תרופות ספציפיות לפוספטידיל-אתנולמין מתילטרנספראז מעניין ללא צורך בטיהור האנזים.

איור 1 מציג assay PEMT התלוי זמן, שבוצע עם תמצית כל תא שושנת יריחו כמקור אנזים באמצעות PE אנדוגני כמצע. כמות הרדיואקטיביות בשלב האורגני הייתה לכמת ידי ספירת נצנץ. מספרים וכתוצאה מכך נוצלו כדי לחשב את הסכום של קבוצות מתיל tritiated מועברות על גבי PE. פעילות PEMT הייתה ליניארי לכ 20 דקות. לאחר מכן הוא הגיע לרמה בסביבות 30 דקות, לאחר שזה נשאר קבוע לעוד 15 דקות. כצפוי, פעילות PEMT לא זוהתה כאשר אין תמציות תא נוספו לassay <stro...

הדו"ח הנוכחי מתאר בדיקה אנזימטית במבחנה למדידת פעילות פוספטידיל-אתנולמין מתילטרנספראז באמצעות תמציות תאי לישמניה. בדיקה זו מבוססת על העברה של קבוצת מתיל רדיואקטיבית מ-S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine על פוספטידיל-אתנולמין אנדוגני.

במבחנה Assay למדוד Phosphatidylethanolamine Methyltransferase פעילות

Phosphatidylethanolamine methyltransferases are biosynthetic enzymes that catalyze the transfer of one or more methyl group(s) from ...

המטרה הכללית של מתודולוגיה זו היא לכמת את הפעילות של פוספטידיל-אתנולמין מתילטרנספראז (PEMT) מתמרירי תאים שלמים. בשיטה זו אנו יכולים להשיב על שאלות מפתח בתחום מטבוליזם הליפידים, כגון חשיבותן של פוספטידיל-אתנולמין מתילטרנספראזות בביוסינתזה של פוספטידילכולין. היתרון המרכזי של פרוטוקול זה הוא שניתן למדוד את הפעילות מתמרירי תאים שלמים, ואין צורך בטיהור של האנזים.פרוטוקול זה יכול לספק תובנות לגבי האופן שבו הטפילים מסנתזים את הליפיד השכיח ביותר שלהם, phosphatidylcholine. ניתן להחיל פרוטוקול זה גם על סוגי תאים אחרים, כגון תאי יונקים וחיידקים. גידול של תאי Leishmania בבקבוק פלסטיק סטרילי האטום במכסה אטום לאוויר בטמפרטורה של 26 degree Celsius במצע M199 מועשר ללא ניעור.קצרו את התאים על ידי סנטריפוגציה ב-1500G למשך חמש דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס, כאשר הם מגיעים לצפיפות תאים של 10 עד 20 מיליון תאים למיליליטר. לאחר הסרת הנוזל העליון (supernatant) באמצעות פיפטה, שטפו את התאים על ידי השהיה מחדש (resuspension) של משקע התאים באמצעות פיפטה סרולוגית במחצית מנפח התרבית של phosphate buffered saline קר.סבב את התאים שוב בצנטריפוגה ב-1550G למשך חמש דקות בטמפרטורה של 4°C. השלך את העלייה (supernatant) באמצעות פיפטה. המשך לשלב הבא או בצע הקפאה מהירה (snap freeze) של משקע התאים בחנקן נוזלי לאחסון לטוו

in-vitro-assay-to-measure-phosphatidylethanolamine-methyltransferase

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

פרוטוקול זה מתאר את הכנת המצע tRNA סינתטי...

ב Assay tRNA מתילציה במבחנה עם histolytica Entamoeba דנ&quot;א Dnmt2 tRNA methyltransferase (Ehmeth) אנזימים

סרטון זה מדגים בדיקת אנזים מבוססת כרומטוגרפיה בשכבה דקה כדי לקבוע את פעילות פירופוספוקינאז באמצעות נוקלאוטידים בעלי תווית רדיו. השיטה מספקת תובנות לגבי סינתזת נוקלאוטידים ותגובות פוספוטרנספורט.

בדיקת פעילות אנזימים מבוססת כרומטוגרפיה בשכבה דקה: טכניקה לקביעת פעילות פירופוספוקינאז במבחנה באמצעות כרומטוגרפיה של שכבה דקה

אנו מתארים פרוטוקול בסיסי לכימות פעילות ATPase במבחנה. ניתן לבצע אופטימיזציה של פרוטוקול זה על סמך רמת הפעילות והדרישות עבור ATPase מטוהר נתון.

מדידה<em&gt; במבחנה</em&gt; פעילות ATPase עבור אנזימתי אפיון

ליפאזות (פוספו)ליפאזות חזויות רבות מאופיינות בצורה גרועה מבחינת הספציפיות של הסובסטרט והתפקודים הפיזיולוגיים שלהן. כאן אנו מספקים פרוטוקול לייעול פעילות האנזימים, חיפוש אחר סובסטרטים טבעיים ומציעים פונקציות פיזיולוגיות לאנזימים אלה.

הגדרת מצע ספציפי עבור מועמדי lipase ו פוספוליפאז

יש דרישה לעשות ניסויים פרה-קליניים של בדיקות עבור מחלקה הרומן של תרופות היתום"בשם מלווים תרופתי לשחזור, מהיר ויעיל. פיתחנו assay המבוסס על תרבות של תאים פשוטים מאוד מתוקננת, תכליתי למסך המטופלים זכאים, כמו גם רומן המלווה תרופתי סמים.

במבחנה אנזים המדידה לנקודת מבחן תגובתיות המלווה תרופתי פאברי, מחלת הפומפה

כאן, אנו מתארים שיטה לטיהור מתויג היסטידין pyrophosphokinase אנזימים וניצול כרומטוגרפיה שכבה דקה של סובסטרטים radiolabelled ומוצרים כדי assay עבור פעילות אנזימטי בתוך חוץ גופית. וזמינותו פעילות האנזים ישימה בהרחבה על כל קינאז, נוקלאוטיד cyclase או התגובה פוספור-העברת מנגנון אשר כולל נוקלאוטיד טריפוספט הידרוליזה.

ב חוץ גופית Assay פעילות עבור ppGpp (p) המעביר מ Clostridium difficile וטיהור

כאן, אנטי נוגדן בתוך שימוש בלתי מתורבת לניתוח ישיר של פעילות מmethyltransferase על סינתטי או בתוך מבחנה מלאכותית המועתק RNA מתואר.

טיפול ללא נוגדנים עבור RNA מתילטרנספראז ניתוח פעילות

Palmitoylation כרוך התאגדות של 16-פחמן palmitate moiety לשקעי ציסטאין של חלבונים היעד בצורה הפיכה. כאן, אנו מתארים גישה ביוכימית, השינוי של ה-acyl-PEGyl משמרת ג'ל, כדי לחקור את מצב הפלמיטלציה של כל חלבון של עניין במוח העכבר ליסביטים.

Acyl-PEGyl החליפין ג'ל שינוי שיטת להגדרה כמותית של פלמילציה של חלבונים קרום המוח

מוצג כאן מבחן פלואורסצנטי רגיש לניטור פעילות אפוליפופרוטאין N-אצילטרנספראז באמצעות פפטיד דיאצילגליצריל ואלקין-פוספוליפידים כמצעים עם כימיה של קליקים.

בדיקה פלואורומטרית מבוססת קליק-כימיה עבור אפוליפופרוטאין N-אצילטרנספראז מאיפיון אנזים ועד סינון תפוקה גבוהה

היכולת להעריך מעורבות היעד על ידי מעכבי מועמד בתאים שלמים היא קריטית לגילוי סמים. פרוטוקול זה מתאר 384 גם פורמט התא סלולרי תרמי shift assay כי אמין מזהה מעורבות היעד הסלולרי של מעכבים מיקוד SHP2 מסוג פראי או גרסאות oncogenic שלה.

הערכת מעורבות יעד סלולרי על ידי SHP2 (PTPN11) מעכבי פוספטאז

מתיל-טרנספראזות דנ"א הן מטרות פוטנציאליות לתרופות לסרטן. כאן מוצג פרוטוקול להערכת מולקולות קטנות לעיכוב מתיל-טרנספראז של DNA. בדיקה זו משתמשת באנדונוקלאז למתילציה זוגית של דנ"א ליצירת פלואורסצנציה ומאפשרת לנטר את פעילות האנזים בזמן אמת.

בדיקת מתילציה רציפה של דנ"א מצומד אנדונוקלאז מבוססת פלואורסצנציה לסינון מעכבי מתיל-טרנספראז של DNA

למדו שיטה לכימות פעילות PEMT בתמציות תאים שלם מלישמניה. השיטה משתמשת בהעברת קבוצות מתיל רדיואקטיביות ללא צורך בניקוי אנזים, ומספקת תובנות למטבוליזם של ליפידים בטפילים.

במבחנה Assay למדוד Phosphatidylethanolamine Methyltransferase פעילות

גלה סרטונים נוספים