Name: זיף-אותת התניה קלסית ומצמץ בעיניה עכברי ראש הקבועות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: למדו התניה קלאסית של מצמוץ בעיניים בעכברים ראש-קבועים באמצעות גירוי זיפים. שיטה זו מאפשרת חקר מנגנוני למידה וזיכרון בנוירוביולוגיה עם דגש על הפחתת מתח בניסויים התנהגותיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו מומנה על ידי משרד ההגנה (W81XWH-13-01-0243) לבין המכון הלאומי לבריאות (R37 AG008796). אנו מודים אלן בייקר בחנות המכונה של אוניברסיטת נורת&#39;ווסטרן לבניית מנגנון גליל-קבוע הראש. אנו מודים לד&quot;ר Shoai האטורי על הנחייתו ב Matlab ו- Solidworks. אנו מודים לד&quot;ר ג&#39;ון כוח עבור תוכנת LabVIEW ששלטה הניסוי.

<ol><li>Clark, R. E., Squire, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classical+conditioning+and+brain+systems%3A+the+role+of+awareness%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Classical conditioning and brain systems: the role of awareness.</a> Science. 280 (5360), 77-81 (1998).</li>
<li>Thompson, R. F., Kim, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memory+systems+in+the+brain+and+localization+of+a+memory%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Memory systems in the brain and localization of a memory.</a> PNAS. 93 (24), 13438-13444 (1996).</li>
<li>Solomon, P. R., Vander Schaaf, E. R., Thompson, R. F., Weisz, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampus+and+trace+conditioning+of+the+rabbit%27s+classically+conditioned+nictitating+membrane+response%5BTitle%5D)+AND+%22Behav+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Hippocampus and trace conditioning of the rabbit's classically conditioned nictitating membrane response.</a> Behav Neurosci. 100 (5), 729-744 (1986).</li>
<li>Moyer, J. R., Deyo, R. A., Disterhoft, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampectomy+disrupts+trace+eye-blink+conditioning+in+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Behav+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Hippocampectomy disrupts trace eye-blink conditioning in rabbits.</a> Behav Neurosci. 104 (2), 243-252 (1990).</li>
<li>Weiss, C., Bouwmeester, H., Power, J. M., Disterhoft, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampal+lesions+prevent+trace+eyeblink+conditioning+in+the+freely+moving+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Behav+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Hippocampal lesions prevent trace eyeblink conditioning in the freely moving rat.</a> Behav Brain Res. 99 (2), 123-132 (1999).</li>
<li>Weiss, C., Disterhoft, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+prefrontal+cortical+memory+mechanisms+with+eyeblink+conditioning%5BTitle%5D)+AND+%22Behav+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Exploring prefrontal cortical memory mechanisms with eyeblink conditioning.</a> Behav Neurosci. 125 (3), 318-326 (2011).</li>
<li>Aiba, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficient+cerebellar+long-term+depression+and+impaired+motor+learning+in+mGluR1+mutant+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Deficient cerebellar long-term depression and impaired motor learning in mGluR1 mutant mice.</a> Cell. 79 (2), 377-388 (1994).</li>
<li>Skelton, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bilateral+cerebellar+lesions+disrupt+conditioned+eyelid+responses+in+unrestrained+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Behav+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Bilateral cerebellar lesions disrupt conditioned eyelid responses in unrestrained rats.</a> Behav Neurosci. 102 (4), 586-590 (1988).</li>
<li>Takehara, K., Kawahara, S., Takatsuki, K., Kirino, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-limited+role+of+the+hippocampus+in+the+memory+for+trace+eyeblink+conditioning+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Time-limited role of the hippocampus in the memory for trace eyeblink conditioning in mice.</a> Brain Res. 951 (2), 183-190 (2002).</li>
<li>Weiss, C., Disterhoft, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evoking+blinks+with+natural+stimulation+and+detecting+them+with+a+noninvasive+optical+device%3A+A+simple%2C+inexpensive+method+for+use+with+freely+moving+animals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Meth%22%5BJournal%5D)">Evoking blinks with natural stimulation and detecting them with a noninvasive optical device: A simple, inexpensive method for use with freely moving animals.</a> J Neurosci Meth. 173, 108-113 (2008).</li>
<li>Royer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+timing%2C+rate+and+bursts+of+hippocampal+place+cells+by+dendritic+and+somatic+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Control of timing, rate and bursts of hippocampal place cells by dendritic and somatic inhibition.</a> Nature. 15 (5), 769-775 (2012).</li>
<li>Goldey, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removable+cranial+windows+for+long-term+imaging+in+awake+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protoc%22%5BJournal%5D)">Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice.</a> Nature Protoc. 9 (11), 2515-2538 (2014).</li>
<li>Lovett-Barron, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+inhibition+in+the+hippocampus+supports+fear+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dendritic inhibition in the hippocampus supports fear learning.</a> Science. 343 (6173), 857-863 (2014).</li>
<li>Chettih, S. N., McDougle, S. D., Ruffolo, L. I., Medina, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+timing+of+motor+output+in+the+mouse%3A+the+role+of+movement+oscillations+in+eyelid+conditioning%5BTitle%5D)+AND+%22Front+in+Integ+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Adaptive timing of motor output in the mouse: the role of movement oscillations in eyelid conditioning.</a> Front in Integ Neurosci. 5 (72), (2011).</li>
<li>Heiney, S. A., Wohl, M. P., Chettih, S. N., Ruffolo, L. I., Medina, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebellar-Dependent+Expression+of+Motor+Learning+during+Eyeblink+Conditioning+in+Head-Fixed+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cerebellar-Dependent Expression of Motor Learning during Eyeblink Conditioning in Head-Fixed Mice.</a> J Neurosci. 34 (45), 14845-14853 (2014).</li>
<li>Siegel, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trace+Eyeblink+Conditioning+in+Mice+is+Dependent+upon+the+Dorsal+Medial+Prefrontal+Cortex%2C+Cerebellum%2C+and+Amygdala%3A+Behavioral+Characterization+and+Functional+Circuity%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Trace Eyeblink Conditioning in Mice is Dependent upon the Dorsal Medial Prefrontal Cortex, Cerebellum, and Amygdala: Behavioral Characterization and Functional Circuity.</a> eNeuro. , (2015).</li>
<li>Galvez, R., Weiss, C., Cua, S., Disterhoft, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+precisely+timed+stimulation+of+mouse+whiskers+in+a+freely+moving+preparation%3A+application+for+delivery+of+the+conditioned+stimulus+in+trace+eyeblink+conditioning%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Meth%22%5BJournal%5D)">A novel method for precisely timed stimulation of mouse whiskers in a freely moving preparation: application for delivery of the conditioned stimulus in trace eyeblink conditioning.</a> J Neurosci Meth. 177 (2), 434-439 (2009).</li>
<li>Gruart, A., Sánchez-Campusano, R., Fernández-Guizán, A., Delgado-Garcìa, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Differential+and+Timed+Contribution+of+Identified+Hippocampal+Synapses+to+Associative+Learning+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">A Differential and Timed Contribution of Identified Hippocampal Synapses to Associative Learning in Mice.</a> Cereb Cortex. , (2014).</li>
<li>Weiss, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+Eyeblink+Conditioning+and+Decreased+Hippocampal+Volume+in+PDAPP+V717F+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Impaired Eyeblink Conditioning and Decreased Hippocampal Volume in PDAPP V717F Mice.</a> Neurobiol Dis. 11 (3), 425-433 (2002).</li>
<li>Galvez, R., Weiss, C., Weible, A. P., Disterhoft, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vibrissa-signaled+eyeblink+conditioning+induces+somatosensory+cortical+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Vibrissa-signaled eyeblink conditioning induces somatosensory cortical plasticity.</a> J Neurosci. 26 (22), 6062-6068 (2006).</li>
<li>Galvez, R., Weible, A. P., Disterhoft, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+barrel+lesions+impair+whisker-CS+trace+eyeblink+conditioning%5BTitle%5D)+AND+%22Learn+%26+Memory%22%5BJournal%5D)">Cortical barrel lesions impair whisker-CS trace eyeblink conditioning.</a> Learn & Memory. 14 (1), 94-100 (2007).</li>
<li>Johnson, K. R., Zheng, Q. Y., Erway, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Major+Gene+Affecting+Age-Related+Hearing+Loss+Is+Common+to+at+Least+Ten+Inbred+Strains+of+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">A Major Gene Affecting Age-Related Hearing Loss Is Common to at Least Ten Inbred Strains of Mice.</a> Genomics. 70 (2), 171-180 (2000).</li>
<li>Tseng, W., Guan, R., Disterhoft, J. F., Weiss, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trace+eyeblink+conditioning+is+hippocampally+dependent+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Trace eyeblink conditioning is hippocampally dependent in mice.</a> Hippocampus. 14 (1), 58-65 (2004).</li>
<li>Joachimsthaler, B., Brugger, D., Skodras, A., Schwarz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spine+loss+in+primary+somatosensory+cortex+during+trace+eyeblink+conditioning%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Spine loss in primary somatosensory cortex during trace eyeblink conditioning.</a> J Neurosci. 35 (9), 3772-3781 (2015).</li>
<li>Boele, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebellar+and+extracerebellar+involvement+in+mouse+eyeblink+conditioning%3A+the+ACDC+model%5BTitle%5D)+AND+%22Front+in+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cerebellar and extracerebellar involvement in mouse eyeblink conditioning: the ACDC model.</a> Front in Cell Neurosci. 3 (19), (2010).</li>
<li>Koekkoek, S. K. E., Den Ouden, W. L., Perry, G., Highstein, S. M., De Zeeuw, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+kinetic+and+frequency-domain+properties+of+eyelid+responses+in+mice+with+magnetic+distance+measurement+technique%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Monitoring kinetic and frequency-domain properties of eyelid responses in mice with magnetic distance measurement technique.</a> J Neurophysiol. 88 (4), 2124-2133 (2002).</li>
<li>Ward, R. L., Flores, L. C., Disterhoft, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infragranular+barrel+cortex+activity+is+enhanced+with+learning%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Infragranular barrel cortex activity is enhanced with learning.</a> J Neurophysiol. 108 (5), 1278-1287 (2012).</li>
</ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

מיזוג מצמוץ מקרי קלסי הוא צורה של למידה אסוציאטיבית כי הוא כלי שימושי להבנת התשתית העצבית הבסיסית למידה וזיכרון. שיטות קודמות מועסקות מיזוג מצמוץ מקרי במכרסמים כגון עכברים מעורבים בתא שאפשר את החיה לנוע בחופשיות. תכשיר קבוע ראש למיזוג מצמוץ מקרי בעכברים, באמצעות המנגנון שתואר על ידי Chettih et al. ו Heiney et al. והכי מנוצל לאחרונה מיזוג מצמוץ מקרי עקבות אור עורר סיגל ואח &#39;. מציע מספר יתרונות, כגון מתן אפשרות בודאות נהלים ניסויים להתבצע במהלך מיזוג מ...

מיזוג מצמוץ מקרי הוא צורה של מיזוג הפבלובית ומערכת מודל לחקירת המנגנונים העצביים של למידה וזיכרון אסוציאטיביים. זה נחקר במינים שונים, כולל בני אדם, ארנבות, חתולים, חולדות ועכברים. הפרדיגמה מקריא שני גירויים לזווג: גירוי מותנה ניטראלי (CS; למשל, בטון, בזק של אור, או גירוי זיף), וכן גירוי מותנה בולט (ארה&quot;ב, לדוגמה, שרבוב אוויר לעין, או הלם periorbital). ארה&quot;ב מעוררת תגובת מצמוץ מקרית מותנית, הרפלקסיבית (כלומר, UR). בסופו של דבר, לאחר כמה מצגות של CS-US לזווג, הנושא לומד לקשר בין CS עם ארה&quot;ב. למידה זו באה לידי ביטוי בצורה של תגובה מותנית (CR), מצמוץ מקרי שהושר על ידי CS לבד שמקדים את המצגת של ארה&quot;ב. מיזוג מצמוץ מקרי בצורת עקבות כולל מרווח ללא גירוי של כמה שעותאלפיות undred שמפריד בין CS ובארצות הברית (איור 1). מיזוג Trace הוא צורה של למידה הצהרתית שכן הוא דורש מודעות של תלויות גירוי 1. הפער הזמני דורש החיה לשמור על &quot;זכר&quot; עצבי של CS באזורי מוח קדמיים כגון ההיפוקמפוס מנת שארה&quot;ב ואת CS לקיים קשרים 1-6. יחד עם אזורי המוח הקדמיים, מיזוג עקבות תלוי גם המוחון 7. מיזוג מצמוץ מקרי הוא, אם כן, הפרדיגמה שימושי לחקירה את הרב הגוני של זיכרון, לרבות רכישה, איחוד, ויחזור. במהלך מיזוג מצמוץ מקרי, קבוצת ביקורת של חיות מוצגת עם גירויים מזווגים בסדר אקראי כדי לבדוק תגובות pseudoconditioning או מרוגשים אל CS כי עלול להיגרם על ידי מצגת בארה&quot;ב לבדה יותר מאשר בקשר CS-ארה&quot;ב למד. Appara נפוץtus לחקירת מיזוג מצמוץ מקרי במכרסמים הוא חדר שבו מכרסם רשאי לנוע בחופשיות במהלך תהליך ההכשרה 8-10. עם סוג זה של מכשירים, לקשור מצורף בדרך כלל כיסוי ראש כי היא מודבקת הגולגולת של המכרסם. את הרצועה מאפשרת המשלוח של ארה&quot;ב (ולפעמים CS) ו להעברת התגובה של החיה לגירויים אלה (כלומר, תגובת המצמוץ המקרית) 10. לקשור עצמו עשוי להיות שונה בהתאם לסוג של גירויים נמסרו ואיך תגובת המצמוץ המקרית נרשמת. הסיבה לשימוש &quot;בחופשיות-נעו&quot; עכברים קשורים למיזוג מצמוץ מקרי היא שעכברים להיאבק איפוק. למרות מינים אחרים עשויים להיות נוחים יותר לקבל איפוק, היתרון העיקרי של שימוש בעכברים בניסויי מיזוג מצמוץ מקריים הוא כי הרוב המכריע של זנים מוטנטים זמינים מהונדסים גנטי הם זני עכבר. בנוסף נאבק, מיל מלאtraint של עכברי תוצאות במצוקה חריפה. תכשיר עכבר קבוע ראש ממזער לחץ יגדיל את המידע הפיזיולוגי שניתן להשיג במהלך מיזוג מצמוץ מקרי. לדוגמה, מערכת זו תאפשר הדמיה של נוירונים בקליפת המוח עם מיקרוסקופיה 2-פוטון 11. ראש-קבוע הכנות שמשו בניסויים קודמים עבור הדמיה אופטית של הקורטקס באמצעות שתלים גולגולתי נשלפים, הקלטות אלקטרו vivo של המוח המכרסם עם מערכי tetrode, שני פוטוני הדמית סידן, וגם כפלטפורמת מיזוג מצמוץ מקרי בעכברים 11 -16. במערכת קבועת הראש, גירוי והקלטות אמינים מובטחים ללא ריסון מלא של העכבר (איור 2). כיסוי ראש כמו זה המשמש במערכת לנוע בחופשיות מודבקת הגולגולת של העכבר. במהלך אימונים, לא את הקצה העליון מודבק מחבר מחובר ברים מעל<html> הליכון גלילי על מנת לייצב את ראשו של המכרסמים (איור 2 א). הליכון הגלילי מאפשר לעכבר לנוח בנוחות, אבל אם העכבר מעוניין בכך, גם מאפשר את זה כדי לרוץ או ללכת. עם השימוש במערכת זו, עכברים יכולים להיות מאומנים עם רטט זיף כמו CS לבין התחשמלות periorbital קלה כמו ארה&quot;ב (איור 1). ארה&quot;ב היא מועברת דרך חוטים להציב בניתוח מתחת לרוחב העור לעין. קל CS מועבר באמצעות מסרק המחובר מפעיל כיפוף מלבני 2 שכבתי (איור 2 ב). את מסרק הינע כיפוף ואז מחוברים בסיס מגנטי כי הוא עבר במקום הנכון בזמן אימון והוא מותאם בגין משלוח אופטימלי עבור כל חית פרט. מסרק ממוצבת שהיא רוכבת עליו השפם שנבחר. במהלך מסירת CS, אות נשלחת הינע כיפוף כי מחליף את המסרק מוביל הרטט של שפם 17. = &quot;jove_content&quot;&gt; גירויים אחרים כגון בטון או בזק של אור שמשו גירויים מותנים יעילים עכברי 16,18,19 בעבר. הגירוי זיף הסיבה נבחר עבור CS ב פרדיגמה ניסויית זה היא התלות של חיות בעכברים על vibrissae שלהם עבור קלט מידע חושי במהלך חיפושים. גירוי זיף הוכח להיות CS אמין ויעיל 20. יתר על כן, בהתחשב המצע ומבוסס ומאורגן קליפת המוח של מערכת vibrissae (כלומר, בקליפה לחבית), גירוי זיף כמו CS מספק כלי אלגנטים למיפוי שינויים הקורטיקלית פלסטי הקשורות למידת מצמוץ מקרי מיזוג 20,21. מערכת קבועת ראש מאפשרת גירוי המדויק של שפם שנבחר להשוות תגובות בין הנוירונים מגורים ונוירונים קבלה תשומות מפאות הלא מגורה. לבסוף, זנים רבים של עכברים להפגין אובדן שמיעה כתוצאה מהזדקנות כמבוגר צעיר יחסית <sup&gt; 22, וסגירת עפעף במהלך כהרף המותנה משנת CS ויזואלית (למרות CS ויזואלי עושה לשפר בעיות עם תגובות בהלה 16). גירוי זיף אינו מושפע משני של סיבוכים אלה. מתפרסמים כאן שינויים ייחודיים וחשובים על הכנות קבועות ראש אחרות למיזוג מצמוץ מקרי, כוללים שיטות למסירת CS וארה&quot;ב, ורכישת תגובת המצמוץ המקרית. המהימנות של המנגנון הזה ואת הפרדיגמה הכשרת מיזוג מצמוץ מקרי מודגמת על ידי הלימוד עקום מעכברים ממוזגים עקומה למידה שטוחה יחסית מחיות מלאות pseudoconditioned (איור 7 א).

<table><tbody><tr><td>רולר קצף Exervo TeraNova 36 אינץ' x 6 אינץ'&nbsp;</td><td>אמזון</td><td>B002ONUM0E</td><td>לפרספקס</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> צילינדר <td>בהתאמה אישית; מוטות מתכת בעובי 1 ס"מ</td></tr><tr><td>(12.7&nbsp; קוטר מ"מ)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>בורג מכונה 4-40 בהתאמה אישית (.25&nbsp; ב. ארוך)</td> <td>אמזון אספקת</td><td>B00F33Q8QO</td><td>עבור צילינדר</td></tr><tr><td>עיצוב קלאסי מסרק שיער</td><td>Conair</td><td>93505WG-320</td><td>לגירוי שפם</td></tr><tr><td>2 שכבות מלבני כיפוף מפעיל</td><td>Piezo Systems</td><td>T220-A4-303X&nbsp;</td><td>לגירוי שפם</td></tr><tr><td>ערכת הלחמה ושטף</td><td>מערכות פייזו</td><td>MSF-003-NI</td><td>לגירוי שפם</td></tr><tr><td>בסיס מגנטי</td><td>Thor Labs</td><td>MB175</td><td>לגירוי שפם</td></tr><tr><td>מוט הברגה לבסיס</td><td></td><td></td> מגנטי רצועות <td>בהתאמה אישית</td></tr><tr><td>המבוססות על מחברי רצועת ניילון מסדרת 221 מבית Electronic Connector Corp.</td><td></td><td></td><td>בהתאמה אישית, מבוסס על וייס ודיסטרהופט, 2008</td></tr><tr><td>TO-220 Style Transistor</td><td>Amazon Supply</td><td>B0002ZPZYO&nbsp;</td><td>למחבר; לכנפיים</td></tr><tr><td>Relia-Tac Sockets</td><td>Electronic Connector Corp.</td><td>220-S02</td><td>למחבר</td></tr><tr><td>Relia-Tac Pins</td><td>Electronic Connector Corp.</td><td>220-P02</td><td>לכיסוי ראש</td></tr><tr><td>0-80 בורג מכונת נירוסטה (באורך 1 אינץ')</td> <td>אמזון אספקת</td><td></td><td>B000FN68EE בורג נעילה</td></tr><tr><td>0-80 אגוז משושה למכונת נירוסטה (עובי 5/32 אינץ')</td> <td>אספקת אמזון</td><td>B000N2TK7Y</td><td>בורג נעילה ראש</td></tr><tr><td>לוקטיט סופר דבק-נוזלי</td><td>לוקטיט</td><td>1365896</td><td>דבק ציאנואקרילי; לבורג הנעילה</td></tr><tr><td>הגדרה מהירה אפוקסי</td><td>אס חומרה</td><td>18613</td><td>עבור מערכת גירוי מחבר ושפם</td></tr><tr>ניתן לפרק<td>חוטי</td><td></td><td></td> כבל <td>Ethernet כבל Ethernet כדי להשתמש בחוטים הבודדים עבור המחבר</td></tr><tr><td>חוטי נירוסטה מצופים פולימיד (2&nbsp; ב. ארוך, 0.005 אינץ'. קוטר)</td> <td>פלסטיק אחד</td><td>005sw / 2.0 37365 S&nbsp;</td><td>לכיסוי ראש, EMG וחוטי זעזועים</td></tr><tr><td>חוט נירוסטה לא מצופה (.005&nbsp; ב. קוטר)</td> <td>AM Systems</td><td>792800</td><td>לכיסוי ראש, חוטי הארקה</td></tr><tr><td>Tenma Variable Autotransformer</td><td>Tenma</td><td>72-110</td><td>לגירוי השפם; ריאוסטט להתאמת הזרם למפעיל הכיפוף</td></tr><tr><td>מגבר</td><td>A-M Systems</td><td>1700</td><td>מגבר לסינון והגברה של אותות EMG</td></tr><tr><td>WPI A385R מבודד גירוי</td><td>World Precision Instruments</td><td>31405</td><td>עבור הלם חשמלי</td></tr><tr><td>איזותזיה (איזופלורן)</td><td>הנרי שיין: בריאות בעלי חיים</td><td>50031</td><td>לניתוח; הרדמה</td></tr><tr><td>Buprenex הזרקה CIII</td><td>Reckett Benckiser Pharmaceuticals Inc</td><td>NDC 12496-0757-1</td><td>לניתוח; משכך כאבים</td></tr><tr><td>דמעות אקווה: חומר סיכה משחת עיניים&nbsp;</td><td>Akorn</td><td>NDC 17478-062-35</td><td>משחת דמעות מלאכותית למניעת יובש בעיניים בזמן הרדמה</td></tr><tr><td>רפידות הכנה Povidine-Iodine</td><td>PDI</td><td>NDC 10819-3883-1</td><td>לניתוח;</td></tr><tr><td>ניתן לרכוש רפידות</td><td></td><td></td> הכנת אלכוהול אנטיספטיות <td>בכל בית מרקחת סטנדרטי</td></tr><tr><td>ידיות אזמל כירורגיות מנירוסטה (מס' 3)</td> <td>Integra Miltex&nbsp;</td><td>4-7.</td> <td>לניתוח</td></tr><tr><td>להבי אזמל כירורגיים מנירוסטה</td><td>Integra Miltex</td><td>4-310 או 4-315</td><td>לניתוח; מספר 10 או 15 להב אזמל</td></tr><tr><td>3% מי חמצן</td><td></td><td></td><td>ניתן לרכוש מכל בית מרקחת סטנדרטי</td></tr><tr><td>Micro Clip</td><td>Roboz</td><td>RS-5459</td><td>לניתוח, כדי לעכב את העור</td></tr><tr><td>00-90 בורג מכונה מנירוסטה (0.0625&nbsp; ב. ארוך)</td> <td>אספקת אמזון</td><td>B002SG89X4&nbsp;</td><td>לניתוח, לעטוף חוט הארקה מסביב</td></tr><tr><td>כלי סיבובי מקצועי</td><td>אגוז חלול</td><td>29637</td><td>מקדחה ידנית לניתוח, לקידוח חורים בגולגולת</td></tr><tr><td>חרוט הפוך</td><td>Roboz</td><td>RS-6282C-34</td><td>קוץ חרוט הפוך גודל 34; לניתוח, לקידוח חורים בגולגולת</td></tr><tr><td>מקדח חותך חריטה</td><td>Dremel</td><td>106</td><td>חותך חריטה; 1.6 מ"מ; לניתוח, לקידוח חורים בגולגולת</td></tr><tr><td>C& B Metabond-Quick! מערכת מלט "B" בסיס מהיר</td><td>Parkell</td><td>S398</td><td>לניתוח; מערכת מלט דבק; חשוב למניעת ניתוק כיסוי ראש</td></tr><tr><td>C& B Metabond-Quick! מערכת מלט שקופה L-אבקת</td><td>Parkell</td><td>S399</td><td>לניתוח; מערכת מלט דבק; חשוב למניעת עקירת כיסוי ראש</td></tr><tr><td>C& B Metabond-Quick! מערכת צמנט "C" זרז TBB אוניברסלי 0.7 מ"ל</td><td>Parkell</td><td>S371</td><td>לניתוח; מערכת מלט דבק; חשוב למניעת עקירת כיסוי ראש</td></tr><tr><td>C& B Metabond-Quick! מערכת מלט צלחת ערבוב קרמית עם רצועת טמפרטורה</td><td>Parkell</td><td>S387</td><td>לניתוח; מערכת מלט דבק; חשוב למניעת עקירת כיסוי ראש</td></tr><tr><td>פינצטה שוויצרית, סגנון #5</td><td>World Precision Instruments</td><td>504506</td><td>לניתוח</td></tr><tr><td>אפליקטורים פוריטניים עם קצה כותנה</td><td>VWR International</td><td>10806-005&nbsp;</td><td>לניתוח</td></tr><tr><td>ערכת מלט אחיזת איטום שיניים</td><td>Dentsply</td><td>675570</td><td>לניתוחים; מלט דנטלי</td></tr></tbody></table>

זיף-אותת התניה קלסית ומצמץ בעיניה עכברי ראש הקבועות

Whisker-signaled Eyeblink Classical Conditioning in Head-fixed Mice

התניה של מצמוץ היא פרדיגמה נפוצה לחקירת המנגנונים העצביים העומדים בבסיס הלמידה והזיכרון. כדי לנצל טוב יותר את הרפרטואר הנרחב של טכניקות מדעיות הזמינות לחקר למידה וזיכרון ברמה התאית, אידיאלי שתהיה פלטפורמה גולגולתית יציבה. מכיוון שעכברים אינם סובלים בקלות איפוק, הם בדרך כלל מאומנים כשהם נעים בחופשיות בתא. מידע על גירוי מותנה (CS) וגירוי לא מותנה (US) מועבר ותגובות מצמוץ נרשמות באמצעות קשירה המחוברת לראש העכבר. במנגנון קבוע הראש המוצג כאן, עכברים מורשים לרוץ כרצונם בעוד ראשיהם מאובטחים כדי להקל על הניסויים. התניה אמינה של תגובת המצמוץ מתקבלת באמצעות מכשיר אימון זה, המאפשר מתן גירוי שפם כ-CS, שוק חשמלי פריאורביטלי כמו ארה"ב, וניתוח פעילות אלקטרומיוגרפית (EMG) מהעפעף כדי לזהות תגובות מצמוץ.

8-10 השבוע גבר בן עכברי C57BL6 / J אומנו על מיזוג מצמוץ מקרי עקבות על מנגנון הליכון הגלילי-קבוע הראש. 8 עכברים אומנו עם מצגות CS-US לזווג (קבוצת מותנית) ו -9 עכברים אומנו עם מצגות CS וארה&quot;ב מזווגות (קבוצת pseudoconditioned). קלטות EMG דוגמא תגובה מותנית עכבר מותנה מוצגות איורי 3 ו -4. הקלטות EMG עבור כל ניסוי ...

התכשיר המוצג כאן למיזוג מצמוץ עם סימן שפם בעכברים מקובעים בראש מגרה במדויק שפם ספציפי תוך מתן אפשרות לעכברים לנוע על הליכון גלילי. גירוי מותנה לגירוי שפם (CS) בשילוב עם גירוי לא מותנה של הלם פריאורביטלי (US) מביא ללמידה אסוציאטיבית אמינה על מכשיר זה.

Eyeblink conditioning is a common paradigm for investigating the neural mechanisms underlying learning and memory. To better utilize the extensive ...

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא להשתמש בהתקדמויות גנטיות בעכברים, ובהבנה שלנו את מערכת השפם, כדי לחקור את הבסיס הנוירוביולוגי של התניית מצמוץ עיניים, פרדיגמה הניתנת להסבה (translatable) לחקר למידה וזיכרון. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מכניסטיות בלמידה ובזיכרון באמצעות דימוי סידן ואלקטרופיזיולוגיה בעכברים שעברו מניפולציה גנטית, תוך גירוי שפם ספציפי במהלך ההתנייה. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא היכולת לקבע את ראשיהם של העכברים תוך מזעור הלחץ, על ידי אפשרותם של העכברים לנוע בקצב שלהם על מסוע גלילי.ההשלכות של טכניקה זו פונות לעבר טיפולים פוטנציאליים לליקויי זיכרון, כולל אלו הקשורים להזדקנות רגילה ולמחלת אלצהיימר. הכנת הגליל ומערכת גירוי השערות מפורטות כל אחת בפרוטוקול הטקסטואלי. חלק זה עוסק בהכנת התושבת לראש.פס הראש הוא פס בעל שבעה חורים המודפס בתלת-ממד, המדמה את פס הניילון מסדרת Amphenol 221 שאינו מיוצר יותר באופן מסחרי. מהחלק המודפס בתלת-ממד, הברגו את החור הראשון בפס עבור בורג מכני 0-80 באורך אינץ' אחד, והשאירו חור אחד ריק לאחר החור הראשון. לאחר מכן, בעזרת מלחציה, הכניסו חמישה פינים ממוסמני זהב בחמשת החורים הנותרים.הדחף את הפינים דרך החורים הצרים יותר בפלסטיק. לאחר מכן, בעזרת מקלף תרמי, קלף חצי סנטימטר של ציפוי פוליאימיד. לאחר מכן, הלחם את הקצה המקולף לאחד הפינים שבהם יש פתח.חתכו את חוט ההלחמה לאורך של בין שישה לשבעה מילימטרים וקלפו כשני מילימטרים מהחוט. כעת, חזרו על תהליך זה כדי לחבר ארבעה חוטים בסך הכל לחמישה הפינים. שני החוטים הראשונים יבצעו הקלטה של תגובות EMG של העפעף, בעוד שני החוטים השניים יספקו גירוי חשמלי לאזור הפריאורביטלי.אל הפין החמישי, הלחים תיל פלדה אל חלודה לא מבודד באורך חמישה סנטימטרים שישמש כהארקה חשמלית. לאחר ביצוע כל החיבורים, בדוק כל אחד מהם באמצעות מולטימטר כדי לוודא את ההמשכיות החשמלית שלהם. התחל עם בעל חיים תחת הרדמה מלאה, שאושרה באמצעות צביטה בבוהן.הזריקו מנה של buprenorphine hydrochloride כמשכך כאבים. לאחר מכן, מרחו כמות קטנה של משחה עינית על הקרניות וגלחו את החלק העליון של ראש החיה. לאחר מכן, קבעו את ראש החיה למסגרת סטריאוטקסית וחטאו את הקרקפת בשלוש שפשופים לסירוגין של povidone iodine ואלכוהול.באמצעות להב סקלפל מספר 10 או 15, בצעו חתך לאורך קו האמצע של הקרקפת, תוך חשיפת הגולגולת מהחלק הקדמי של העיניים ועד מעבר לעצם הבינ-פריאטלית (interparietal bone). הגדילו את חלקי העור באמצעות שישה מיקרו-קליפים (microclips), כדי לחשוף חלק נרחב ככל האפשר מהגולגולת, כולל הצדדים והחלק האחורי. לאחר מכן, השתמשו בסקלפל כדי לגרד ולהסיר את הפריאוסטום (periostium) מהגולגולת.לאחר מכן, נקו את חלקו העליון של הגולגולת עם 3%hydrogen peroxide שלוש פעמים. לאחר שהגולגולת התייבשה, קדחו שני חורים באמצעות מקדח קונוס הפוך בגודל 34, תוך הקפדה שלא לפגוע במוח. מקמו חור אחד לפני ה-bregma, וחור שני לפני ה-lambda, משמאל לקו האמצע כאשר מתניחים את העין הימנית, או להיפך.יש לקדוח חורים אלה בזהירות כדי שיתאימו לברגים, ויש להשקיע מאמץ רב כדי לא לפגוע במוח. הכניסו לחורים ברגים עבור החיבורים החשמליים. כל סיבוב מלא יוריד את הבורג ב-0.28 millimeters, כך ששני סיבובים מלאים יספיקו.בשלב הבא, צרו מספר גומחות קטנות בגולגולת כדי להגדיל את שטח הפנים עבור הדבק. מהחלק העליון המורכב, גלגלו את חוט ההארקה בתצורת שמינית סביב שני הברגים. השאירו מעט חופש בחוט ההארקה כדי שניתן יהיה למקם את החלק העליון בצורה נכונה.כעת, מרחו צמנט לחיבור קר (cold luting cement). כסו את הגולגולת ואת הברגים בנדיבות והמתינו לייבוש הצמנט. לאחר שהצמנט התייבש, מקמו את תושבת הראש באופן אנכי, כאשר הפינים עומדים מעל הגולגולת.אבטחו את תג ההרשמה באמצעות מחזיק המחובר לזרוע מהמסגרת. על המחזיק להכיל חמישה שקעים مطلוי זהב לקבלת הפינים של תג ההרשמה. מקמו את שני חוטי ה-EMG על שריר ה-muscularis orbicularis oculi מעל מחסור העין.לאחר מכן, מקמו את שני חוטי הגירוי. הכניסו את הקצוות החשופים מתחת לעור, שני עד ארבעה מילימטרים זנבית (caudal) ישירות לעין. ודאו שהקצוות שלהם אינם נוגעים זה בזה.אם החוטים ארוכים עד כדי כך שהם עלולים לשרוט את עינו של בעל החיים, קצצו אותם או כופפו אותם לאחור. יש להשאיר חלק מהחוט חשוף. כעת, הדביקו את בסיס החוטים לגולגולת עם מעט דבק לוטים (luting cement) והמתינו שיתייבש.השתמש בכשמעט מחצית מהנפח ששימש קודם לכן. כדי להמשיך, הסר את המיקרו-קליפסים (microclips) והחזר את העור למקומו. המתן עד שהעור יתייצב באופן טבעי כדי למנוע מתיחה של העור שעלולה לעוות את העפעף, להפריע למצמוץ ובכך להרוס את הניסוי.לאחר שהעור התייצב, הסר את מחזיק כיסוי הראש ואטום את האזור החשוף באמצעות דנטל-צמנט (מלט שיניים). הימנע מטפטוף של צמנט על העיניים או על הפינים של כיסוי הראש. לאחר מכן, השתמש במקלון צמר גפן טבול בממס דנטל-צמנט כדי להחליק ולעצב את הצמנט שהתקשה חלקית לפי הצורך.לאחר שהצמנט התייבש לחלוטין, הוצא את בעל החיים מהמסגרת הסטריאוטקסיס והשאר אותו להתאושש על משטח חם לפני השבתו לכלוב הבית. התחל את תהליך ההרגלה של העכברים לאחר שחלפו לפחות חמישה ימי התאוששות. כדי לקבע את העכבר, אחז בו קצרות בזנב כדי להצמידו מאחורי הכתפיים.לאחר מכן, הרימו את העכבר מהבטן ומהטורסו. בשלב הבא, חברו מחבר לחלק העליון של הראש וסובבו את בורג הנעילה. לאחר מכן, הניחו את העכבר בעדינות על הגליל והחזיקו אותו ללא תזוזה, תוך שימוש בשני ברגים כדי להדק את המחבר למוטות שמעל הגליל.לאחר מכן שחררו את העכבר. בשני המפגשים הראשונים, אפשרו לעכבר להתרגל לגליל למשך אותו פרק זמן כשלב התניה. במהלך ההתרגלות, רשמו את קצב המצמוצים הספונטני.בנוסף, חשפו את העכברים למעורר רעידות השפם ללא הפעלת גירוי חשמלי. כאשר מערכת הפיזו קרובה לצד המותנה, השחילו את שיני המסרק על שפמות בודדות. בחרו את אותן השפמות עבור כל סשן.לאחר מכן, המשיכו באימון התנייה קלאסית כפי שמוצג בטקסט. עכברים זכרים מסוג C57 Black 6J בני שמונה עד עשרה שבועות אומנו באמצעות התנייה של מדהימת עין (eyeblink conditioning) מסוג trace במכשיר הליכה גלילי עם קיבוע ראש. הקלטות EMG נלקחו עבור כל ניסוי.אותיות ה-EMG עברו יישור (rectification) ואינטגרציה עם קבוע זמן של 10 millisecond, ולאחר מכן בוצע ממוצע של כל הניסויים. התפתחות התגובות המותנות לאורך 10 מפגשי אימון מראה כי בהדרגה גברה אמפליטודת התגובה וזמן השהייה של התגובה התקצר. התפתחות זו אינה נצפית בתגובות של עכברים במצב של התנייה מדומה (psuedoconditioned), שבהם הגירויים מוצגים בסדר אקראי.ניתן לראות את התפתחותן של תגובות מותנות המתוזמנות היטב, ולכן נלמדות היטב, גם בהיסטוגרמות של הזמן עד לשיא התגובה בעקבות תחילת ה-CS. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה בידיכם הבנה טובה של אופן הכנת התקן הראש (headpiece), השתלתו הכירורגית בעכבר, והצבת העכבר על מסילת הריצה הגלילית, לצורך התניית מצמוץ עיניים בקיבוע ראש. העכברים שלכם אמורים להפגין עקומת למידה טובה לאורך הימים בעודם רוכשים את ההתניה.לאחר השליטה בטכניקה, ניתן לבצע אותה בשעה אחת אם היא מבוצעת כהלכה. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להישאר ערניים ולשים לב לכל סימן של מצוקה אצל בעלי החיים. יש לנקוט בצעדים המתאימים כדי למזער את הלחץ המוטל על בעלי החיים.

whisker-signaled-eyeblink-classical-conditioning-in-head-fixed-mice

Research

JoVE Journal

Behavior

התנהגות

פרוטוקול זה מתאר כיצד להשתיק באופן זמני ומרחוק פעילות עצבית באזורי מוח נפרדים בזמן שחולדות עוסקות במשימות למידה וזיכרון. הגישה משלבת פרמקוגנטיקה (Designer-Receptors-Exclusively-Activated-by-Designer-Drugs) עם פרדיגמה התנהגותית (התניה חושית) שנועדה להבחין בין מרכיבים שונים של למידה.

שיטה להשתקה מרחוק עצבית פעילות במכרסמים בשלבים בדידים של למידה

מעקב eyeblink התניה קלאסית (ECC) נעשה שימוש כדי להעריך בהיפוקמפוס תלויי למידה associative בחולדות למבוגרים שהיו מנוהל ריכוז גבוה (11.9% v/v) של אלכוהול במהלך התפתחות המוח neonatal מוקדמת. באופן כללי, ECC שגרות הן כלי אבחון קול לגילוי חוסר תפקוד המוח על-פני הגדרות רבות הביו-רפואית ופסיכולוגית.

השימוש של התניה קלאסית Eyeblink מעקב כדי להעריך תפקוד בהיפוקמפוס במודל של עכברים של אלכוהול עוברית ספקטרום הפרעות

פיתוח אסטרטגיות עידון חדשות לעכברי מעבדה הוא משימה מאתגרת התורמת להגשמת עקרון 3R. פרוטוקול זה מציג אימון קליקר כתוכנית העשרה קוגניטיבית לעכברי מעבדה.

היכרות הדרכת Clicker בתור העשרה קוגניטיבית עבור עכברי מעבדה

פרוטוקול זה מתאר של eyeblink מיזוג הפרדיגמה המתאים עבור ניסויים עם תינוקות בת אחת. ציוד מסחרי או בהזמנה אישית יכול לשמש כדי לספק הגירויים, איסוף נתונים וניתוח צריכה להתבצע על וידאו והקלטות.

מיזוג Eyeblink קצר-עיכוב קלאסית אצל ילדים בת אחת-

המתואר כאן הוא מערכת ניסיונית אוטומטית המציעה חלופה למבחן שלושה בחדר וגם פותרת מספר אזהרות. מערכת זו מספקת פרמטרים התנהגותיים מרובים המאפשרים ניתוח קפדני של דינמיקה התנהגותית קטנה מכרסם במהלך העדפה חברתית והעדפה החדשנות חברתית בדיקות.

מערכת למעקב אחר הדינמיקה של התנהגות חברתית העדפה מכרסמים קטנים

פיתחנו פלטפורמה אחת למעקב אחר התנהגות בעלי חיים במהלך שתי משימות למידה אסוציאטיביות תלויות סיבים מטפסים. התכנון הזול מאפשר אינטגרציה עם ניסויים אופטוגנטיים או ניסויי הדמיה המכוונים לטיפוס על פעילות המוח הקטן הקשורה לסיבים תזונתיים.

פלטפורמה גמישה לניטור למידה אסוציאטיבית חושית תלוית מוח הקטן

כדי לחקור התנהגויות טיסה בהקשר של פחד, אנו מציגים פרוטוקול התניה שונה של פחד. פרוטוקול זה מבטיח שעכברים יפגינו באופן עקבי התנהגויות טיסה במהלך הצגת רמזים בהתניה של פחד.

התניה שונה של פחד לגרימת התנהגויות טיסה בעכברים

פרדיגמת הפחד התצפיתי מעריכה הקפאה עקיפה במכרסמים כמודל לאמפתיה רגשית. הליך זה כרוך בחשיפת מכרסמים צופים למפגינים ספציפיים המקבלים זעזועים מרתיעים בכף הרגל כדי לעורר תגובות הקפאה אמפתיות. על ידי שימוש במבחני פחד תצפיתיים, חוקרים יכולים לחקור את המנגנונים העצביים העומדים בבסיס אמפתיה רגשית.

פחד תצפיתי כמודל לאמפתיה רגשית בעכברים

פרוטוקול זה מספק שיטה למעקב אחר פזילה אוטומטית של העיניים במכרסמים לאורך זמן באופן התואם נעילת זמן למדדים נוירופיזיולוגיים. פרוטוקול זה צפוי להיות שימושי לחוקרים החוקרים מנגנונים של הפרעות כאב כגון מיגרנה.

שיטת פזילה אוטומטית לסנכרון זמן התנהגות ודינמיקה מוחית במחקרי כאב עכברים

הפרוטוקול מתאר כיצד למדוד את התגובה האופטו-מוטורית בסנאים קרקעיים בעלי 13 שורות, מין דומיננטי בחרוט עם תכונות רשתית הדומות למקולה האנושית. עיצוב הפלטפורמה משפר את הטיפול ומפחית חרדה, משפר את יכולתו של בעל החיים להישאר על המשטח המוגבה, ומאפשר הערכה לא פולשנית של שינויים בתפקוד הראייה.

ריסון בעלי חיים לא מרתיע המאפשר רישום של רפלקס אופטוטורי בסנאים קרקעיים

למדו התניה קלאסית של מצמוץ בעיניים בעכברים ראש-קבועים באמצעות גירוי זיפים. שיטה זו מאפשרת חקר מנגנוני למידה וזיכרון בנוירוביולוגיה עם דגש על הפחתת מתח בניסויים התנהגותיים.

זיף-אותת התניה קלסית ומצמץ בעיניה עכברי ראש הקבועות

גלה סרטונים נוספים