Name: אימות של מודל עכבר לשבש מכלולי LINC באופן ספציפי בתא (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: חקור מודל עכבר טרנסגני לביטוי מכוון של EGFP-KASH2 בתאי פורקינייה במוח הקטן. שיטה זו מאפשרת הפרעה ספציפית במכלולי LINC לחקר מיקום גרעיני בתאי עצב.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים לצוות ליבת המורפולוגיה וההדמיה, של ליבת הגנטיקה המולקולרית (מחלקת עיניים ומדעים חזותיים) ושל עכבר הגנטיקה Core באוניברסיטת וושינגטון בסנט לואיס בית הספר לרפואה. המחברים נתמכים על ידי תכנית המענק הקטנה ממרכז מקדונל לתאי ומולקולרית לנוירוביולוגיה, מרכז התקווה להפרעות נוירולוגיות, העין הלאומית (# R01EY022632 לDH), National Eye Institute מרכז Core גרנט (# P30EY002687) ו מענק בלתי מוגבל ממחקר למניעת עיוורון למחלקת עיניים ומדעים חזותיים.

הצהרת אתיקה: נהלים כרוכים בנושאי בעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית הטיפול בבעלי חיים והשימוש (IACUC) באוניברסיטת וושינגטון בסנט לואיס. 1. גידול העכבר וGenotyping <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתרבות עכברי Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) עכברים עם Tg (PCP2-Cre) לייצר Tg (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) 19,20. הערה: בעוד שאר פרוטוקול זה מתמקד בשימוש בקו Tg העכבר (PCP2-Cre) כדי להגביל ביטוי EGFP-KASH2 לתאי פורקינג בתוך המוח הקטן, הליך דומה יכול להיות אחריו עם כל עכבר אחר Tg (Cre) ( איור 2 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע genotyping לזהות גורי מחסה שני transgenes EGFP וCre כפי שתואר קודם לכן 19. </li></ol> 2. הכנת חומרים לאוסף Dissection ורקמות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן של סוכרוז 30% PBS (30 סוכרוז גרם / 100 של 1x PBS מיליליטר) ולאחסן 100 מיליליטר ב -20 ° C. היום של ח הרקמהarvesting, הפשרה ועומס ~ 30-35 מיליליטר של תמיסת סוכרוז לתוך מזרק 35 מיליליטר לזילופי transcardial. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 40 מיליליטר של PFA 4% בPBS (10 מיליליטר 16% paraformaldehyde ו -30 מיליליטר PBS). טען ~ 30-35 PFA מיליליטר של 4% למזרק 35 מיליליטר לזילופי transcardial. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא את צלחת תרבית רקמת 10 סנטימטרים עם 10 מיליליטר של PBS לנתיחה רקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן קוקטייל קטמין / xylazine בהיקף של 16 מ&quot;ג / מיליליטר קטמין ו -3 מ&quot;ג / מיליליטר xylazine. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון של 70% אתנול לנתיחה. </li></ol> 3. Dissection ואוסף רקמות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מזרק 1 מיליליטר, להזריק 500 μl של קוקטייל קטמין / xylazine לכל 25 גרם של משקל גוף ולחכות ~ 15 דקות. לחלופין, להשתמש בשיטת הרגעה אישרה מוסדי אחרת שמתאימה למערכת הביולוגית של עניין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על ההרגעה, בעדינות לצבוט כפה האחורית כדי לאשר את חוסר תגובה לכאב, להצמיד את כל כפות על מגש קלקר עם צד הגב שלהעכבר כלפי מטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרסס את הבטן עם 70% אתנול ולעשות חתך מהבטן התחתונה לחלק העליון של כלוב הצלעות כדי לקבל גישה ללב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות חתך קטן בעלייה הימנית של הלב ולהכניס את המזרק המכיל תמיסת סוכרוז 30% לתוך החדר השמאלי של הלב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Perfuse הפתרון בשיעור של ~ 2-5 מיליליטר לדקה. כאשר ריק, להסיר את המזרק וחזור עם 4% פתרון PFA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוציא סיכה העכבר ממגש הקלקר ולערוף כדי לגשת למוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את העור סביב ראשו של בעל החיים באמצעות מלקחיים ומספריים. נקבו חור בחלק האחורי של הגולגולת עם מחט ולהסיר בזהירות את הגולגולת עם מספריים ומלקחיים לנתח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהמוח הוא בבירור נגיש, להשתמש במלקחיים כדי להסיר את המוח הקטן ולמקם אותו ב- PBS. לחצות את המוח הקטן במטוס sagittal עם אזמל ולהעביר לפתרון סוכרוז 30% לילה בשעה 4 מעלות צלזיוס. הערה: כדי prepהקטעים פרפין, לתקן את המוח הקטן לילה ב 4 מעלות צלזיוס PFA 4% לפני הטבעה וחתך רקמות. </li></ol> 4. עיבוד רקמות וחתך <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תרחיף של קרח יבש ווטאן 2-מתיל. לאפשר את הטמפרטורה של האמבטיה לאזן במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא cryomold עם מתחם OCT ולמקם את מחצית המוח הקטן החצוי לתבנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מיקרוסקופ לנתח וזוג מלקחיים עמדת המוח הקטן, כך שהמשטח החצוי (ליד קו האמצע של המוח הקטן) פונה כלפי מעלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את cryomold לslurry הקרח היבש במשך 5 דקות עד למתחם אוקטובר יצר לבנה מטריצה ​​מוצקה סביב דגימת הרקמה. הערה: כעת ניתן לאחסן הדגימה הקפואה ב -20 ° C אם נדרש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התווית מראש שטופלה שקופיות פולי-ליזין לאיסוף קטעי רקמה ולהכין את cryostat פי הוראות היצרן כדי לאסוף 15 מיקרומטר חלקים של והנוזלbellum. כדי לאסוף את החלקים, פנה בזהירות את סעיף אוקטובר עם הצד המצופה פולי-ליזין של השקופית. כדי לשמר את הכיוון של הסעיף, לא לסובב את השקופיות במהלך שלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סעיפי רקמות חנות ב -20 ° C עד שתמשיך עם כתמים והדמיה. </li></ol> 5. מכתים והדמיה של המוח קטן סעיפים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרונות לפני מכתים הרקמות הבאים: ~ 50 מיליליטר של PBS ~ 5-10 מיליליטר של PFA 4% ב- ​​PBS ~ 10-20 מיליליטר של 0.5%, 10% חמורים בדם Triton X-100 ב PBS </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלקי המוח הקטן הפשרה. חשוב לציין, לצמצם את החשיפה שלהם לכל מקור של אור רציף והאינטנסיבי כדי למנוע דהייה של EGFP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות עט מחסום הידרופובי, לצייר מלבן סביב סעיפי רקמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פוסט לתקן את החלקים עם PFA 4% במשך 5 דקות. השתמש מספיק נוזלי כדי לכסות את כל השטח שמסומן על ידי המחסום הידרופובי (בדרך כלל ~ 500 μl). באמצעות ואקום או פיפטה, מחדשלהזיז את מקבע להיות זהיר במיוחד שלא להפריע את סעיפי רקמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם טפטפת, בעדינות להחיל PBS בשקופית מבלי להפריע סעיפי רקמות. לאחר 5 דקות להשתמש בוואקום או פיפטה כדי להסיר את הנוזל בזהירות. חזור על PBS לשטוף כולל של שלוש פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה, להחיל בזהירות את הדילול המתאים של נוגדנים עיקריים (3 μl Calbindin ו / או נוגדן Nesprin2 לμl 900 של פתרון) ב 0.5% X-100, 10% חמורים בדם טריטון בPBS. דגירה של שעה אחת בטמפרטורת חדר בחושך. הערה: EGFP-KASH2 יהיה גלוי על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי הישיר על חלקים קפואים, ואין צורך להשתמש בנוגדן אנטי-EGFP. עם זאת, אם חלקי פרפין ערוכים, הדמיה של EGFP-KASH2 דורשת immunodetection עם נוגדן אנטי-EGFP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את פתרון הנוגדן ולשטוף עם PBS שלוש פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1: 1,000 דילולים של נוגדנים משני Alexa-פלואוריד ב 0.5% Triton X-100,10% חמורים בדם בPBS וחנות בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר בעדינות ולשטוף PBS הסופי ולהחיל את דילול נוגדנים משני במשך שעה אחת בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את פתרון נוגדנים משני, לשטוף ולשטוף את הסעיף שלוש פעמים. במידת הצורך, יחול כתם גרעיני, כגון DAPI (~ 300nM), במהלך יישום PBS הראשון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר לחלוטין את פתרון PBS מרחבי הרקמה והמקום ~ 5-7 μl של ההרכבה תקשורת בקטע הרקמה. מניחים coverslip זכוכית על גבי קטע הרקמה ומניח בצד ל~ 15-30 דקות בטמפרטורת חדר בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי מצויד במסננים המתאימים לדמיין EGFP וכל אורכי גל אחרים מתאימים לנוגדנים משני המשמשים בצעדים 5.8 / 5.9. בפרוסות המוח הקטן, להשתמש אובייקטיבי 20X כדי להציג המכון גרעיני EGFP-KASH2. </li></ol>

<ol><li>Hutchison, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lamins%3A+building+blocks+or+regulators+of+gene+expression%3F+Nature+reviews%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Lamins: building blocks or regulators of gene expression? Nature reviews.</a> Molecular cell biology. 3, 848-858 (2002).</li>
<li>Stuurman, N., Heins, S., Aebi, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+lamins%3A+their+structure%2C+assembly%2C+and+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+structural+biology%22%5BJournal%5D)">Nuclear lamins: their structure, assembly, and interactions.</a> Journal of structural biology. 122, 42-66 (1998).</li>
<li>Crisp, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+of+the+nucleus+and+cytoplasm%3A+role+of+the+LINC+complex%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Coupling of the nucleus and cytoplasm: role of the LINC complex.</a> The Journal of cell biology. 172, 41-53 (2006).</li>
<li>Haque, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUN1+interacts+with+nuclear+lamin+A+and+cytoplasmic+nesprins+to+provide+a+physical+connection+between+the+nuclear+lamina+and+the+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+cellular+biology%22%5BJournal%5D)">SUN1 interacts with nuclear lamin A and cytoplasmic nesprins to provide a physical connection between the nuclear lamina and the cytoskeleton.</a> Molecular and cellular biology. 26, 3738-3751 (2006).</li>
<li>Hodzic, D. M., Yeater, D. B., Bengtsson, L., Otto, H., Stahl, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sun2+is+a+novel+mammalian+inner+nuclear+membrane+protein%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Sun2 is a novel mammalian inner nuclear membrane protein.</a> The Journal of biological chemistry. 279, 25805-25812 (2004).</li>
<li>Starr, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KASH+and+SUN+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Current+biology+%3A+CB%22%5BJournal%5D)">KASH and SUN proteins.</a> Current biology : CB. 21, R414-R415 (2011).</li>
<li>Mellad, J. A., Warren, D. T., Shanahan, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nesprins+LINC+the+nucleus+and+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Nesprins LINC the nucleus and cytoskeleton.</a> Current opinion in cell biology. 23, 47-54 (2011).</li>
<li>Fridolfsson, H. N., Starr, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinesin-1+and+dynein+at+the+nuclear+envelope+mediate+the+bidirectional+migrations+of+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Kinesin-1 and dynein at the nuclear envelope mediate the bidirectional migrations of nuclei.</a> The Journal of cell biology. 191, 115-128 (2010).</li>
<li>Meyerzon, M., Fridolfsson, H. N., Ly, N., McNally, F. J., Starr, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UNC-83+is+a+nuclear-specific+cargo+adaptor+for+kinesin-1-mediated+nuclear+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">UNC-83 is a nuclear-specific cargo adaptor for kinesin-1-mediated nuclear migration.</a> Development. 136, 2725-2733 (2009).</li>
<li>Padmakumar, V. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enaptin%2C+a+giant+actin-binding+protein%2C+is+an+element+of+the+nuclear+membrane+and+the+actin+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+cell+research%22%5BJournal%5D)">Enaptin, a giant actin-binding protein, is an element of the nuclear membrane and the actin cytoskeleton.</a> Experimental cell research. 295, 330-339 (2004).</li>
<li>Roux, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nesprin+4+is+an+outer+nuclear+membrane+protein+that+can+induce+kinesin-mediated+cell+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Nesprin 4 is an outer nuclear membrane protein that can induce kinesin-mediated cell polarization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 2194-2199 (2009).</li>
<li>Wilhelmsen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+novel+outer+nuclear+membrane+protein%2C+associates+with+the+cytoskeletal+linker+protein+plectin%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">a novel outer nuclear membrane protein, associates with the cytoskeletal linker protein plectin.</a> The Journal of cell biology. 171, 799-810 (2005).</li>
<li>Wilson, M. H., Holzbaur, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nesprins+anchor+kinesin-1+motors+to+the+nucleus+to+drive+nuclear+distribution+in+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Nesprins anchor kinesin-1 motors to the nucleus to drive nuclear distribution in muscle cells.</a> Development. 142, 218-228 (2015).</li>
<li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KASH+protein+Syne-2%2FNesprin-2+and+SUN+proteins+SUN1%2F2+mediate+nuclear+migration+during+mammalian+retinal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Human+molecular+genetics%22%5BJournal%5D)">KASH protein Syne-2/Nesprin-2 and SUN proteins SUN1/2 mediate nuclear migration during mammalian retinal development.</a> Human molecular genetics. 20, 1061-1073 (2011).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syne-1+and+Syne-2+play+crucial+roles+in+myonuclear+anchorage+and+motor+neuron+innervation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Syne-1 and Syne-2 play crucial roles in myonuclear anchorage and motor neuron innervation.</a> Development. 134, 901-908 (2007).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nesprin+1+is+critical+for+nuclear+positioning+and+anchorage%5BTitle%5D)+AND+%22Human+molecular+genetics%22%5BJournal%5D)">Nesprin 1 is critical for nuclear positioning and anchorage.</a> Human molecular genetics. 19, 329-341 (2010).</li>
<li>Stewart-Hutchinson, P. J., Hale, C. M., Wirtz, D., Hodzic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+requirements+for+the+assembly+of+LINC+complexes+and+their+function+in+cellular+mechanical+stiffness%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+cell+research%22%5BJournal%5D)">Structural requirements for the assembly of LINC complexes and their function in cellular mechanical stiffness.</a> Experimental cell research. 314, 1892-1905 (2008).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUN1%2F2+and+Syne%2FNesprin-1%2F2+complexes+connect+centrosome+to+the+nucleus+during+neurogenesis+and+neuronal+migration+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">SUN1/2 and Syne/Nesprin-1/2 complexes connect centrosome to the nucleus during neurogenesis and neuronal migration in mice.</a> Neuron. 64, 173-187 (2009).</li>
<li>Razafsky, D., Hodzic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+and+tissue-specific+disruption+of+LINC+complexes+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Temporal and tissue-specific disruption of LINC complexes in vivo.</a> Genesis. 52, 359-365 (2014).</li>
<li>Razafsky, D., Hodzic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+variant+of+Nesprin1+giant+devoid+of+KASH+domain+underlies+the+molecular+etiology+of+autosomal+recessive+cerebellar+ataxia+type+I%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+disease%22%5BJournal%5D)">A variant of Nesprin1 giant devoid of KASH domain underlies the molecular etiology of autosomal recessive cerebellar ataxia type I.</a> Neurobiology of disease. 78, 57-67 (2015).</li>
<li>Razafsky, D., Blecher, N., Markov, A., Stewart-Hutchinson, P. J., Hodzic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LINC+complexes+mediate+the+positioning+of+cone+photoreceptor+nuclei+in+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">LINC complexes mediate the positioning of cone photoreceptor nuclei in mouse retina.</a> PloS one. 7, e47180(2012).</li>
<li>Razafsky, D. S., Ward, C. L., Kolb, T., Hodzic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+regulation+of+linkers+of+the+nucleoskeleton+to+the+cytoskeleton+during+mouse+postnatal+retinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleus%22%5BJournal%5D)">Developmental regulation of linkers of the nucleoskeleton to the cytoskeleton during mouse postnatal retinogenesis.</a> Nucleus. 4, 399-409 (2013).</li>
</ol>

יש המחברים אין לחשוף.

השלב הקריטי ביותר ללמוד בהצלחה את התפקיד של מתחמי LINC in vivo באמצעות מודל Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) הוא לזהות קו מתאים Cre עכבר (ים). ואכן, אם Cre הוא פעיל בתא-סוגים אחרים מעורבים במסלולים דומים, זה יכול לסבך את הפרשנות של התוצאות. לפיכך, חשוב לבחון תאים סמוכים, כפי שמוצגים כאן בשכבות מולקולריות של התא וגרגיר של המוח הקטן (איור 2). כמו כן, על מנת למקסם את כל פנוטיפים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית חשוב לזהות מתח Cre עם ביטוי Cre נרחב על פני סוג התא של עני...

מעטפת הגרעין (NE) מפרידה nucleoplasm מציטופלסמה. הוא מורכב מקרום פנימי וחיצוני גרעיני (INM וONM, בהתאמה) המתחברים בנקבוביות גרעיניות. לומן שמסומן על ידי שני הקרומים נקרא חלל perinuclear (PNS). ONM היא הרחבה של הרשתית מחוספס endoplasmic (ER), וINM שומר על lamina הגרעיני, meshwork של חוטי ביניים מסוג V הגרעיני מיוצג על ידי א &#39;וב&#39; מסוג lamins 1,2. Linkers של Nucleoskeleton ומתחמי נוגדנים (LINC) הם מכלולי macromolecular כי היקף כל מעטפת הגרעין להתחבר פיזי הפנימית של הגרעין לחוטי cytoskeletal ומנועים מולקולריים (איור 1 א). הם מורכבים מאינטראקציות בין מוטיבים שמורים באבולוציה המאפיינים את שתי משפחות של חלבונים הטרנסממברני נפרד מNE: חלבוני שמש (Sad1 / Unc84) וNesprins (גרעיני המעטפה SPectRINS). ביונקים, ar Sun1 וSun2חלבונים הטרנסממברני דואר של INM שN-מסוף nucleoplasmic אזור אינטראקציה ישירות עם A- וlamins B-סוג 3-5. בצד השני של INM, בתוך PNS, חלבוני שמש נמל מתיחה שימור האבולוציוני של ~ חומצות אמינו 150 C-מסוף נקראות תחום SUN. תחומים SUN אינטראקציה ישיר עם קאש-שימור אבולוציוני (Klarsicht / Anc-1, עברו&quot; הומולוגיה) תחום, החתימה המולקולרית של Nesprins. תחומים קאש מורכבים ממתיחה של ~ 30 חומצות אמינו C-מסוף שבולטת לתוך PNS ואחריו תחום הטרנסממברני 6. לפחות ארבעה גנים שונים Nesprin (Nesprin1-4) לקודד קאש המכיל חלבונים שלמקם בNE 7. אזורי cytoplasmic של Nesprins, הגדלים משתנים מ~ 50kDa (Nesprin4) למדהים 1,000 kDa (ענק Nesprin1), מכילים spectrin מרובה חוזר כמו גם מוטיבים מסוימים המאפשר האינטראקציה שלהם עם רכיבי cytoskeletal כגון אקטין, plectin ומנועים מולקולריים 8 13. &lt;class = &quot;jove_content&quot; p&gt; מחקרים בבעלי חוליות וחסרי חוליות הראו כי Lamin / מנועים מולקולריים שמש / Nesprin / מהווים &quot;ציר&quot; אבולוציונית שימור שליטה הגירה ומעגן גרעיניים. מודלים עכבר נוק-אאוט כמה (KO) של רכיבים מורכבים LINC תוארו וסייעו במתן מסגרת להבנת התפקידים של חלבוני שמש וNesprin בNE במהלך התפתחות יונקים 9,14,15. עם זאת, מודלים אלה כמה חסרונות הנוכחיים משמעותיים, בעיקר: 1) קושי בפרשנות פנוטיפים בשל תא השפעות חד-אוטונומיות, 2) קושי בהבחנה תרומות phenotypical של קאש המכילים לעומת קאש-פחות Nesprin isoforms 16, 3) יתירות פונקציונלית של חלבוני שמש וNesprin בNE בסוגים רבים של תאים דורשת תוכניות רבייה מורכבות כדי להשבית את כל אינטראקציות SUN-קאש בעכברים 17 ו -4) קטלני סביב הלידה של עכברים החסרות לקאש-תחום של שניNesprins1 ו -2 מונעים את הניתוח של מבוגרים פנוטיפים 18. פרוטוקול זה מתאר מודל רומן עכבר נועד לשבש את כל אינטראקציות SUN-קאש in vivo, בתא אופן אוטונומי ומוסדר מבחינה התפתחותית, ובכך עוקף רב של החסרונות שתוארו לעיל. Cre / מודל עכבר מבוסס לקס זה מסתמך על שני מושגים חשובים: 1) תחום קאש של כל חלבון Nesprin ידוע מספיק כדי למקד EGFP לNE במערכות תרבית תאים ו -2) תחומים SUN אינטראקציה עם אבחנת תחומים קאש, כך ביטוי יתר של כל תחום קאש יהיה להרוות כל תחומי SUN אנדוגני ולהשבית מתחמי LINC באופן דומיננטי שלילי 17 (איור 1). פרוטוקול זה מתאר קצירת רקמה ומדרגות עיבוד משמשות כדי לאשר את השיבוש של כל אינטראקציות SUN-קאש בתאי פורקינג &#39;במוח הקטן.

<table><tbody><tr><td>סוכרוז</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Gibco</td><td>14200-075</td><td></td></tr><tr><td>16% תמיסת פרפורמלדהיד</td><td>מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>OCT תרכובת</td><td>רקמה-טק</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>שקופיות הידבקות</td><td>StatLab</td><td>M1000W</td><td></td></tr><tr><td>סרום חמור</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>ImmuEdge Pen</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן נגד קלבינדין</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>C9848</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן נגד EGFP</td><td>Abcam</td><td>ab13970</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן</td><td></td><td></td> נגד נספרין2 <td>שתואר בעבר בהפניה 21</td></tr><tr><td>הרכבה פלואורסצנטית מדיה</td><td>Dako</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>2-מתיל בוטאן</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>O3551</td><td></td></tr></tbody></table>

אימות של מודל עכבר לשבש מכלולי linc באופן ספציפי בתא

Validation of a Mouse Model to Disrupt LINC Complexes in a Cell-specific Manner

נדידה גרעינית ועיגון בתוך רקמות מתפתחות ובוגרות מסתמכת במידה רבה על מכלולי חלבון מקרומולקולריים גדולים הנקראים LInkers של שלד הנוקלאוס ושלד הציטו (קומפלקסים LINC). פיגומי חלבון אלה משתרעים על פני המעטפת הגרעינית ומחברים את פנים הגרעין לרכיבים של השלד הציטופלזמי שמסביב. קומפלקסים של LINC מורכבים משתי משפחות חלבונים שמורות אבולוציונית, חלבוני Sun ו-Nesprins המכילים מוטיבים של חתימה מולקולרית C-terminal הנקראים תחומי SUN ו-KASH, בהתאמה. חלבוני שמש הם חלבונים טרנסממברניים של הממברנה הגרעינית הפנימית שהתחום הנוקלאופלזמי ה-N-terminal שלהם מקיים אינטראקציה עם הלמינה הגרעינית בעוד שתחומי ה-SUN הטרמינליים C שלהם בולטים לתוך החלל הפרה-גרעיני ומקיימים אינטראקציה עם תחום KASH של Nesprins. לאיזופורמים קנוניים של נספרין יש מסוף N בגודל משתנה המקרין לתוך הציטופלזמה ומקיים אינטראקציה עם מרכיבי השלד הציטולוגי. פרוטוקול זה מתאר אימות של אסטרטגיית עכבר טרנסגנית שלילית דומיננטית המשבשת אינטראקציות SUN/KASH אנדוגניות באופן ספציפי לסוג התא. הגישה שלנו מבוססת על מערכת Cre/Lox העוקפת חסרונות רבים כגון קטלניות סביב הלידה ופנוטיפים לא אוטונומיים של תאים הקשורים למודלים של קו הנבט של השבתה של קומפלקס LINC. מסיבה זו, מודל זה מספק כלי שימושי להבנת תפקידם של מתחמי LINC במהלך ההתפתחות וההומאוסטזיס במגוון רחב של רקמות.

פרוטוקול זה ממחיש את התועלת של (/ EGFP-KASH2 CAG-LacZ) מודל עכבר Tg להגביל ביטוי EGFP-KASH2 לתאי המוח הקטן פורקינג באמצעות Tg עכברים (PCP2-Cre). בTg (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) צאצאים, מסגרת הקריאה פתוחה LacZ / V5 הוא נכרת בP6 ידי recombinase Cre ויגרמו לביטוי של EGFP-KASH2 הממוקד במיוחד לתאים (איור 2 א) פורקינג. כצפוי, EGFP-KASH2 מיועד למעטפת הגרעין כפי שצוין על ידי הדפוס כמו השפה-EGFP החיובי שנצפה סביב הגרעין (איור 2). על מנת למקסם את ...

חלבוני מעטפת גרעינית ממלאים תפקיד מרכזי בתהליכים ביולוגיים בסיסיים רבים והיו מעורבים במגוון מחלות אנושיות. פרוטוקול זה מתאר מודל עכבר חדש מבוסס Cre/Lox המאפשר בקרה מרחבית-זמנית של שיבוש מתחמי LINC.

אימות של מודל עכבר לשבש מכלולי LINC באופן ספציפי בתא

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the ...

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא להדגים את התועלת של מודל עכבר טרנסגני, המאפשר ביטוי מודע ומכוון של cache two, פפטיד בעל תג EGFP פלורסצנטי, ב-in vivo, ואת השבסוב התוצאתי של קומפלקסי link אנדוגניים. בניסוי זה, הביטוי של cache two המסומן פלורסצנטית יכוון לתאי פורין של המוחון. גישה גנטית זו יכולה לתת מענה לשאלות מפתח לגבי תפקידם של קומפלקסי link במיקום הגרעין ברקמות שונות של העכבר.לביטוי המושרה והמכוון של E-G-F-P-K two ישנם מספר יתרונות. ראשית, הוא דורש תכנית הרבעה בודדת של עכברי cay עם כל זן cruise קיים. שנית, גישה זו עוקפת את התמותה הפרינטלית שנצפתה במודלים של עכברים עם מוטציות של קו הנבט ברכיבי קומפלקס ה-link.לבסוף, שיטה זו מאפשרת לחקור את הפיזיולוגיה של קומפלקסי קישור בתוך תאים או רקמות ספציפיים. In vivo. קלואי פוטר, חברה במעבדה, תדגים בפניכם את השלבים השונים הנדרשים להדמיה של E-G-F-P-K two בתאי Purkinje של המוח הקטן.כדי להתחיל, הצליבו עכברי clac Z עם עכברי PCP two CRE כדי להפיק עכברי PCP two CAG C two כפי שמתואר בפרסומים קודמים. עם לידת הגורים שנוצרו, בצעו גנוטיפינג. כדי לזהות את אלה הנושאים הן את ה-EGFP והן את ה-Cree Transgenes כפי שתיארנו בעבר, הכינו 50 milliliters של תמיסת סוכרוז 30% ב-PBS ואחסנו אותה בטמפרטורה של negative 20 degrees Celsius עד ליום קציר הרקמה בגיל המתאים. בצעו פרפוזיה טרנס-קרדיאלית לעכברים תחת הרדמה על מנת להכין את רקמת המוח לדיסקציה כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. הניחו את המוח המבודד בצלחת תרבית רקמות של 10 centimeter עם 10 milliliters של PBS והפרידו את המוח הקטן (cerebellum) מהמוח הגדול (cerebra).בשלב הבא, השתמש בסקלפל כדי לבצע חיתוך של המוחון במישור הסגיטלי (sagittal plane), העבר את הפרוסות לתמיסת 30% sucrose ואחסן אותן בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. הכן תערובת של קרח יבש ו-two methyl butane. המתן חמש דקות לאיזון הטמפרטורה של האמבט.בשלב הבא, מלאו תבנית קריו בתרכובת OCT והניחו חצי אחד מהמוחון שהופרד לתוך התבנית באמצעות מיקרוסקופ דיסקציה ופינצטה. מקמו את המוחון כך שהמשטח שנחתך, הנמצא סמוך לקו האמצע של המוחן, פונה כלפי מעלה בתבנית. לאחר מכן, העבירו את תבנית הקריו לתערובת קרח יבשה למשך חמש דקות, עד שתרכובת ה-OCT תגבש מטריצה לבנה מוצקה סביב דגימת הרקמה.יש לאחסן את הדגימה המוטמנת בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס עד למועד השימוש. סמנו שקופיות polylysine שעברו טיפול מקדים לאיסוף נתחי רקמה, והצמידו את גוש רקמות המוח הקטן (cerebellar tissues) למחזיק הרקמה באמצעות OCT טרי. לאחר שהגוש מחובר בבטחה, התקינו את מחזיק הרקמה ובצעו גליחה של פרוסות בעובי 40 מיקרומטר כדי להסיר OCT עודף עד להגעה לרקמה.הגדירו את העובי ל-15 micrometers ואספו את החתכים על ידי הצמדה זהירה של חתך ה-OCT לצד של הזכוכית צבועה ב-polylysine. אחסנו את חתכי הרקמה בטמפרטורה של negative 20 degrees Celsius עד לשלב הצביעה והדימוג. כאשר תרצו להמשיך, הפשיתו את חתכי המוח הקטן (cerebellum) בחושך כדי למנוע דהייה של החלבונים הפלואורסצנטיים.בעזרת עט למחסום הידרופובי, שרטטו מלבן מסביב להיקף נתחי הרקמה. הוסיפו כ-500 µL של 4% paraformaldehyde לנתחים למשך חמש דקות לצורך קיבוע נוסף של הרקמה. לאחר מכן, השתמשו בשואב ואקום כדי לשאוב את המקבע, תוך הקפדה מיוחדת לא להפר את נתחי הרקמה באמצעות פיפטה.מרחו בעדינות PBS על הפית השקופית מבלי להזיז את נתחי הרקמה. לאחר חמש דקות, השתמשו בפיפט עם ואקום כדי להסיר בזהירות את הנוזל, וחזרו על שטיפת ה-PBS שלוש פעמים בסך הכל. לאחר מכן, הוסיפו כ-500 microliters של תמיסת חסימה לפיתים והדגישו אותם ל-10 דקות.הסר ואז החלף את תמיסת החסימה באותה תמיסה המכילה דילולים של 1:300 של נוגדנים ל-cal binding או ל-nesin two. לאחר מכן, הסר את תמיסת הנוגדנים ושטוף את השקופיות עם PBS 3 פעמים. הדגר את השקופיות למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר, בחושך.בשלב הבא, הכינו דלול של 1:1000 של anti-US Alexa Fluor 594 עבור השקופיות המסומנות בקישור לפרה, ו-anti Alexa Fluor 594 עבור השקופיות המסומנות ב-Nesprin 2, בתוך תמיסתו החסימה, ואחסנו את התמיסות בחושך עד למועד השימוש. הסירו בעדינות את שטיפת ה-PBS האחרונה וכסו את החתכים בנוגדנים המשניים המדלולים למשך שעה אחת בחושך. לאחר הדגירה, הסירו את תמיסת הנוגדנים המשניים.לאחר מכן, יש להחיל צבע גרעיני כגון DPI בריכוז 300 nanomolar ב-PBS למשך חמש דקות. לאחר מכן, יש לשטוף את הנתחים פעמיים נוספות ב-PBS. יש להסיר כמה שיותר מתמיסת ה-PBS ולכסות את נתח הרקמה בטיפה אחת של תמיסת קיבוע (mounting medium).הנח זכוכית כיסוי מעל נתח הרקמה תוך הימנעות מבועות אוויר, והשאר למשך 15 עד 30 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. לאחר מכן, השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנציה כדי לדמיין את צביעת הנוגדנים ואת החלבונים הפלואורסצנטיים. עבור פרוסות של המוחון (cerebellum), השתמש בעדשה עם הגדלה של 20x או 40x.כדי לצפות בשתי טבעות הגרעין של E-G-F-P-C two כפי שמוצג כאן, ניתן לראות את E-G-F-P-C two באופן ישיר בחתכים של המוחון בערוץ Fitzy. יתרה מכך, הקולוקליזציה של EGFP עם קישוריות פרה (cow binding), המסמנת באופן ספציפי תאי פרקין, מאשרת כי הביטוי של E-G-F-P-C two מוגבל לתאי פרקין בתוך תאי פרקין. EGFP cache two מכוון למעטפת הגרעין, כפי שמעידים תבניות דמויות טבעת (RIM) חיוביות ל-EGFP שנצפו מסביב לגרעין.בדוגמה זו, ביטוי של EGFP cache two זוהה ביותר מ-70% מהתאי ה-Perkin החיוביים לקשירה של cow. EGFP cache two דוחף את ה-nesprin האנדוגני מהמעטפת הגרעינית באמצעות רוויה של דומייני sun הזמינים. בהתאם לכך, NESIN two אנדוגני נדחף מהמעטפת הגרעינית של תאי Perkin המבטאים EGFP cache two.בעוד שתאי Perkin שאינם מבטאים E-G-F-P-C two שומרים על nesin two אנדוגני במעטפת הגרעין כביקורת פנימית צפויה, תאים שאינם מבטאים CRE recombinase מראים NESIN two במעטפת הגרעין של כל אוכלוסיית תאי ה-bikini One. לכן, נתחי רקמות CT זמינים. ניתן להדגים את E-G-F-P-K two תוך כארבע שעות.במהלך ביצוע הליך זה, חשוב לזכור כי מידת הקיבוע של ה-PFF ו/או תנאי ההטמעה עשויים להשפיע באופן דרסטי על האנטיגניות של האפיטופ שלכם. לכן, חשוב מאוד לקבוע את תנאי הקיבוע האופטימליים המשמרים את האפיטופ הספציפי שלכם. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להשתמש במודל העכבר הטרנסגני CK two כדי לכוון את הביטוי של VGFP cashew לרקמות ספציפיות.

validation-mouse-model-to-disrupt-linc-complexes-cell-specific

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

סרטון זה מתאר הליך של נוקאאוט גן מטרה באמצעות מערכת Cre-recombinase המושרה בטמוקסיפן בעקבות הזרקה תוך צפקית של טמוקסיפן במודל עכבר.

CreER-LoxP system-based Target Gene Inactivation: מערכת Cre Recombinase המושרה בטמוקסיפן לנוקאאוט של גן מטרה במודל עכבר

סרטון זה מדגים את היצירה של מודל עכבר דה-מיאלינציה מוקדית באמצעות הזרקת ליזופוספטידילכולין דו-נקודתית (LPC). גולגולת של עכבר מורדם חשופה. קואורדינטות ההזרקה נקבעות, ונקדח חור כדי לאפשר הזרקות LPC באתרים ממוקדים. LPC גורם לדמיאלינציה מוקדית של נוירונים באמצעות דלקת, בעוד שהזרקה של שתי נקודות מבטיחה את קיימותו.

ביסוס מודל עכבר דמיאלינציה מוקדית באמצעות הזרקה דו-נקודתית של ליזופוספטידילכולין

יש מיקרו RNA תפקידים משמעותיים במבנה המוח ותפקודו. כאן אנו מתארים שיטה לאכיפת מירנה היפוקמפוס יתר ביטוי באמצעות הזרקת stereotactic של lentivirus מירנה מביע מהונדס. גישה זו יכולה לשמש כדרך מהירה יחסית על מנת להעריך...

Lentiviruses הזרקת Stereotactic של microRNA-לבטא באזור CA1 היפוקמפוס העכבר והערכה של תוצאות ההתנהגות

וקטורים ויראליים לאפשר למניפולצית גן ממוקדת. אנחנו מדגימים את שיטה לביטוי גנים מותנים או אבלציה בחוט שדרת העכבר, באמצעות הזרקת stereotaxic של וקטור ויראלי לקרן האחורית, אתר בולט של קשר הסינפטי בין afferents החושיים הראשוניים ועצב של מערכת העצבים המרכזית.

הזרקת Stereotaxic של וקטור ויראלי למניפולציה גנטית מותנית בחוט השדרה המאוס

כאן אנו מתארים in vivo assay mutagenesis למספר קטן של תאי hematopoietic מטוהרים באמצעות מודל עכבר המהונדס לאצי. גן האצים יכול להיות מבודד כדי לקבוע את התדירות, מיקום והסוג של מוטציות DNA באופן ספונטני קם או לאחר החשיפה לgenotoxins.

זיהוי מוטציות DNA בתאי גזע / אב המטוהר Hematopoietic

nucleases מעצב כגון nucleases אצבע אבץ (ZFNs) וnucleases מפעיל כמו activator-שעתוק (TALENs) יכול לשמש כדי לשנות את הגנום של עוברי preimplantation עכבר על ידי מפעילה שני סוף nonhomologous להצטרף (NHEJ) ורקומבינציה הומולוגית מסלולים (HR). מקדמות אלה לאפשר את הדור המהיר של עכברים עם שינויים גנטיים מדויקים.

עכבר הגנום הנדסה באמצעות nucleases מעצב

כאן אנו מתארים הליך המבוסס על שימוש בחלקיקים לנטי-ויראלים לשינוי גנטי ארוך טווח של תאי גזע עצביים ו/או תאי אפנדימליים סמוכים להם בנישה הנוירוגנית הגחנית-תת-חדרית הבוגרת המאפשרת ניתוח נפרד של השפעות אוטונומיות ולא אוטונומיות של תאים, תלויות נישה על תאי גזע עצביים.

הנדסה גנטית יציבה ויעילה של תאי V-SVZ העכבר למבוגרים עבור הניתוח של הגזע עצבי נייד אוטונומי והשפעות חד אוטונומיות

פונקציות תא-אוטונומי של גנים במוח יכולים להילמד על ידי גרימת הפסד או רווח של פונקציה באוכלוסיות דלילה של תאים. כאן, אנו מתארים בתוך הרחם אלקטרופורציה לספק Cre recombinase לאוכלוסיות דליל לפתח נוירונים בקליפת המוח עם הגנים floxed לגרום לאובדן פונקציה בתוך vivo.

גרימת Cre-לקס רקומבינציה ב העכבר קליפת המוח דרך בתוך הרחם אלקטרופורציה

גרסאות גנטי המשויכים מחלות אנושיות מתחילים להיות חשפו, זה הופך יותר ויותר חשוב לפתח מערכות אשר במהירות והערכת החשיבות הביולוגית של משתנים אלה שזוהו. פרוטוקול זה מתאר שיטות להערכת תפקוד הגן האנושי במהלך המיוזה הנשי אני משתמש בעכבר oocytes.

באמצעות העכבר Oocytes כדי להעריך תפקוד הגן האנושי במהלך המיוזה אני

כאן, אנו מתארים פרוטוקול כדי ליצור מודל קיימא נשי מורטין עם כרומוזום לא אקראי הפעלה X, כלומר, maternally בירושה כרומוזום X אינו פעיל ב 100% של התאים. כמו כן, אנו מתארים פרוטוקול לבדיקת היתכנות, סבילות, ובטיחות של ההפעלה הפרמקולוגית של כרומוזום X לא פעיל ב vivo.

מודל עכבר שאינו אקראי עבור ההפעלה הפרמקולוגית של Mecp2 על כרומוזום X לא פעיל

פרוטוקול זה מתאר מיקרו-הזרקה ואלקטרופורציה in vivo לעריכת גנום בתיווך קריספר מוגבלת אזורית באובידוקט העכבר.

מודלים של עכברים מהונדסים בגנום סומטי המשתמשים במיקרו-הזרקה ובאלקטרופורציה של Vivo

חקור מודל עכבר טרנסגני לביטוי מכוון של EGFP-KASH2 בתאי פורקינייה במוח הקטן. שיטה זו מאפשרת הפרעה ספציפית במכלולי LINC לחקר מיקום גרעיני בתאי עצב.

אימות של מודל עכבר לשבש מכלולי LINC באופן ספציפי בתא

גלה סרטונים נוספים