אימות של מודל עכבר לשבש מכלולי LINC באופן ספציפי בתא

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא להמחיש את התועלת של מודל עכבר טרנסגני, המאפשר ביטוי מעורר וממוקד של מטמון EGFP מתויג פלואורסצנטי, שני פפטידים in vivo, וכתוצאה מכך שיבוש של קומפלקסי קישור אנדוגניים. בניסוי זה, ביטוי של מטמון מתויג פלואורסצנטי 2 יכוון לתאי פרקין במוח הקטן. גישה גנטית זו יכולה לענות על שאלות מפתח לגבי תפקידם של קומפלקסי קישור במיקום גרעיני בתוך רוב הרקמות השונות.

לביטוי המעורר והממוקד של E-G-F-P-K 2 יש מספר יתרונות. ראשית, זה דורש תוכנית רבייה אחת של עכברי קיי עם כל זן שייט קיים. שנית, גישה זו עוקפת את האליות הפרינטלית שנצפתה במודלים של עכברים של מוטציות קו נבט של רכיבים מורכבים של קישור.

לבסוף, שיטה זו מאפשרת לחקור את הפיזיולוגיה של מתחמי קישור בתוך תאים או רקמות ספציפיות. in vivo. קלואי פוטר, חברת מעבדה, תראה לכם את השלבים השונים הנדרשים כדי להמחיש את E-G-F-P-K 2 בתאי בורקין G במוח הקטן.

כדי להתחיל לגדל עכברי קלאק Z עם PCP שני עכברי CRE כדי לייצר PCP שני CAG C שני עכברים כמתואר בפרסומים קודמים. כאשר הגורים שנוצרו נולדים, בצע גנוטיפ. כדי לזהות את אלה המכילים גם EGFP וגם Cree Transgenes כפי שתואר קודם לכן, הכינו 50 מיליליטר של תמיסת סוכרוז 30% ב-PBS ואחסנו אותה בטמפרטורה שלילית של 20 מעלות צלזיוס עד ליום קצירת הרקמות בגיל המתאים, בצעו זלוף טרנס קרדיו של העכברים בהרדמה על מנת להכין את רקמת המוח לדיסקציה כמתואר בפרוטוקול הכתוב, הניחו את המוח המנותח בצלחת תרבית רקמות בגודל 10 סנטימטר עם 10 מיליליטר PBS והפרידו את המוח הקטן מהמוח הקטן.

לאחר מכן, השתמש באזמל כדי לנתח את המוח הקטן במישור הסגיטלי ולהעביר את החלקים לתמיסת סוכרוז של 30% ולאחסן אותו בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. הכינו slurry של קרח יבש ושני מתיל בוטאן. אפשר לטמפרטורת האמבטיה להתייצב למשך חמש דקות.

לאחר מכן, מלאו תבנית קריו בתרכובת OCT והניחו מחצית מהמוח הקטן המנותח לתוך התבנית באמצעות מיקרוסקופ מנתח וזוג מלקחיים. מקם את המוח הקטן כך שהמשטח המנותח הדו-צדדי שנמצא ליד קו האמצע של המוח הקטן פונה כלפי מעלה בתבנית. לאחר מכן העבירו את תבנית הקריו לתוך תמיסת העין היבשה למשך חמש דקות עד שתרכובת ה-OCT יצרה מטריצה לבנה מוצקה סביב דגימת הרקמה.

אחסן את הדגימה המוטמעת בטמפרטורה שלילית של 20 מעלות צלזיוס עד הצורך. סמן שקופיות פוליליזין שטופלו מראש לאיסוף קטעי רקמה והרכיב את גוש רקמות המוח הקטן על מחזיק הרקמה עם OCT טרי. לאחר שהבלוק מחובר היטב, הרכיבו את מחזיק הטישו וגלחו פרוסות של 40 מיקרומטר כדי להסיר עודפי OCT עד שמגיעים לטישו.

הגדר את העובי ל-15 מיקרומטר ואסוף את החלקים על ידי פנייה זהירה של קטע ה-OCT עם הצד המצופה פוליליזין של השקופית. אחסן את חלקי הרקמה בטמפרטורה שלילית של 20 מעלות צלזיוס עד להמשך הצביעה וההדמיה. כאשר מוכנים להמשיך, הפשירו את חלקי המוח הקטן בחושך כדי למנוע דהייה של החלבונים הפלואורסצנטיים.

בעזרת עט מחסום הידרופובי, צייר מלבן סביב היקף חלקי הרקמה. הוסף כ -500 מיקרוליטר של 4% אלדהיד פרפורמי לחלקים למשך חמש דקות כדי לתקן את הרקמה. לאחר מכן השתמש בוואקום כדי לשאוב את הקיבוע, והקפיד במיוחד לא להפריע לקטעי הרקמה בעזרת פיפטה.

מרחו בעדינות PBS על השקופית מבלי להפריע לחלקי הרקמות. לאחר חמש דקות, השתמש בוואקום עוד פיפטה כדי להסיר בזהירות את הנוזל, חזור על שטיפת ה-PBS בסך הכל שלוש פעמים. לאחר מכן, הוסף למגלשות כ -500 מיקרוליטר של תמיסת חסימה ודגר אותן למשך 10 דקות.

הסר ולאחר מכן החלף את תמיסת החסימה באותה תמיסה המכילה 1 עד 300 דילולים של נוגדנים קושרי קלוריות או שני נוגדנים. לאחר מכן הסר את תמיסת הנוגדנים ושטוף את השקופיות עם PB S3 פעמים. דגרו את המגלשות למשך שעה בטמפרטורת החדר בחושך.

לאחר מכן, הכינו דילול אחד עד 1000 של רצפת Alexa אנטי ארה"ב 5 94 עבור השקופיות המסומנות בכריכת הפרה ואנטי Alexa Fluor 5 94 עבור Nesprin שתי שקופיות מסומנות בתמיסת החסימה ואחסנו את התמיסות בחושך עד שיהיה צורך בהן. הסר בעדינות את שטיפת ה-PBS הסופית וכסה את החלקים בנוגדנים המשניים המדוללים למשך שעה בחושך. לאחר הדגירה, הסר את תמיסת הנוגדנים המשנית.

לאחר מכן יש למרוח כתם גרעיני כגון DPI ב-300 ננו-מולרית ב-PBS למשך חמש דקות. לאחר מכן, שטפו את החלקים פעמיים נוספות ב-PBS. הסר כמה שיותר תמיסת PBS וכסה את קטע הרקמה בטיפה אחת של מדיום הרכבה.

הניחו כיסוי זכוכית על גבי חלק הרקמה הימנעו מבועות אוויר והניחו בצד למשך 15 עד 30 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. לאחר מכן השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לדמיין את צביעת הנוגדנים ואת החלבונים הפלואורסצנטיים. עבור פרוסות מוח קטן, השתמש במטרה של 20 x או 40 x.

כדי להציג את שני החישוקים הגרעיניים של E-G-F-P-C כפי שמוצג כאן, ניתן לדמיין את E-G-F-P-C שניים ישירות בפרוסות המוח הקטן בערוץ Fitzy. יתר על כן, הקולוקליזציה של EGFP עם קשירת פרה, המסמנת באופן ספציפי תאי פרקין, מאשרת כי ביטוי E-G-F-P-C 2 מוגבל לתאי פרקין בתוך תאי פרקין. מטמון EGFP 2 מכוון למעטפת הגרעין כפי שמצוין על ידי דפוסי RIM חיוביים של EGFP שנצפו סביב הגרעין.

בדוגמה זו, ביטוי שני של מטמון EGFP זוהה ביותר מ-70% מתאי פרקין חיוביים הקשורים לפרות. מטמון EGFP שני מעביר נספרין אנדוגני מהמעטפת הגרעינית באמצעות רוויה של תחומי שמש זמינים. בהתאם, NESIN 2 אנדוגני נעקר מהמעטפת הגרעינית של תאי פרקין המבטאים מטמון EGFP 2.

בעוד שתאי פרקין שאינם מבטאים E-G-F-P-C שניים שומרים על נזין אנדוגני שניים במעטפת הגרעין כצפוי, אינטראקציה בקרה, שאינם מבטאים CRE רקומבינאז מציגים NESIN 2 במעטפת הגרעינית של כל אוכלוסיית תאי הביקיני 1. אז בלוקים של רקמות CT זמינים. E-G-F-P-K שניים ניתנים להמחשה תוך כארבע שעות.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור כי מידת קיבוע ה-PFF ו/או תנאי ההטמעה יכולים להשפיע באופן דרסטי על האנטיגניות של האפיטופ שלך. לכן חשוב מאוד לקבוע את תנאי הקיבוע האופטימליים המשמרים את האפיטופ הספציפי שלך. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשתמש במודל העכברים הטרנסגניים של CK כדי למקד את הביטוי של קשיו VGFP לרקמות ספציפיות.