Name: Mechano-פרופיל קל ומדויק על מערכי Micropost (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: למדו פרופיל מכני מדויק של תאים בודדים באמצעות מערכי Micropost ותוכנת MechProfiler. השיטה מספקת תובנות לגבי תכונות מכניות של תאי סרטן עצם אנושיים ומסייעת בחקר תפקיד הצמצום בהתפשטות גרורות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי הוועדה לטכנולוגיה וחדשנות (CTI) שוויץ מענק 14796-PFLS-LSCTI. מערכי MicroPost סופקו בנדיבות על ידי MicroDuits GmbH.

1. תאים culturing על מערכי Micropost הערה: כל הצעדים חייבים להתבצע בארון בטיחות ביולוגית על מנת להבטיח סטריליות. הכרכים הניתנים כאן הם לצלוחיות תרבית תאי T25. צפיפות המתכון וזריעת תאי תרבית תאים בינונית מותאמות לשורות תאי סרטן עצמות HuO9 וM132. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תרבית תאים לזריעה על מערך micropost. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את איכות תרבית תאים על ידי הנחת בקבוק התרבות במיקרוסקופ אור רגילה. ודא שהתאים להראות צמיחה טיפוסית ומורפולוגיה ידי אומדן כמה תחתית בקבוק התרבות מכוסה. כיסוי של 70% -80% משקף שיעור צמיחה בריא. שים לב לכמות צף תאים כפי שהם מייצגים תאים מתים ו / או תרבות מגודל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Trypsinize תאים על ידי הסרת בינונית ושטיפה עם 4 מיליליטר 1x בופר פוספט חיץ (PBS). להוסיף 0.8 מיליליטר 1x טריפסין חומצה / Ethylenediaminetetraacetic (EDTA) לדגור על RT עד התאלסלק S, אשר לוקח בערך 2-4 דקות. בדוק את התהליך עם מיקרוסקופ ולעתים לנצל את הבקבוק בעדינות כדי לתמוך בדחיקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 מיליליטר תרבית תאים בינוני (המדיום השתנה Dulbecco הנשר (DMEM) / F12 עם סרום 10% שור עוברי (FBS), פניצילין 1% / streptavidin (עט / סטרפטוקוקוס)) כדי לעצור את התגובה ולשטוף תאים שיורית שעדיין יושבים בתחתית של הבקבוק. בהמשך לכך פיפטה השעיה זו מעלה ומטה מספר פעמים כדי לקבל תערובת הומוגנית. הקפד פיפטה כל הפתרונות על פני שטח הצמיחה המקורי של הבקבוק כדי לקבל דחיקה יעילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את ההשעיה התא לצינור 15 מיליליטר ו צנטריפוגות זה באמצעות צנטריפוגות בראש טבלה ברמה של 0.5 XG במשך 3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant מחדש להשעות את התא גלולה ב 5 מיליליטר בינוני על ידי pipetting למעלה ולמטה 5 פעמים. הקפד להימנע מהדור של בועות תוך כדי כך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע צפיפות תאים באמצעות תא ספירת תאים וmicrosco אורפ. בדוק את ההשעיה התא בתא ספירת תאים לאגרגטים תא ולהבטיח שתהיה לי תאים בודדים בלבד לניסוי הבא. פיפטה שוב למעלה ולמטה כמה פעמים אם התאים נוטים ליצור אגרגטים להפריד ביניהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את ההשעיה התא עם מדיום מספיק כדי להשיג פתרון תא של 25,000 תאים / מיליליטר. מערבבים אותו היטב על ידי צינור היפוך הסגור מספר פעמים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מערך micropost לזריעת תאים. הערה קריטית: אל פיפטה על גבי מערך micropost ישירות כמו זה עלול לפגוע בmicroposts, במיוחד כאשר בועות לא רצויות הם הציגו. יתר על כן, לוודא כי מערך micropost לא מתייבש כמתרחש כוחות הנימים להוביל לקריסה של microposts. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את מצע הזכוכית עם מערך micropost להתמודד בטוב של צלחת 12 גם באמצעות פינצטה ולהרטיב אותו על ידי הוספת 1 מיליליטר אתנול (99%). לדגור על RT במשך 20-30 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את אתנולבשלבים על ידי הוספה כ 1 מיליליטר מים המיוננים סטרילי (מים DI) בצד טוב וaspirating בערך 1 מיליליטר בעזרת פיפטה העברה או מכשיר שאיפה. חזור על שלב זה לפחות 3 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את DI-המים עם PBS-חיץ באותו אופן על ידי הוספה וaspirating כ 1 מיליליטר. חזור על פעולה זו 3 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את PBS-החיץ עם מדיום על ידי הוספה וaspirating כ 1 מיליליטר של מדיום. חזור על פעולה זו 3 פעמים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון פיפטה 1 מיליליטר תא (25,000 תאים) בחלק העליון של כל מערך micropost מוכן. לסגור צלחת רב היטב ולהעביר אותו לחממה (CO 2% 5, 37 מעלות צלזיוס). בואו התאים לדבוק ולגדול על גבי microposts ל6 -7 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את תהליך ההדבקה מדי פעם באמצעות אור מיקרוסקופ. בדוק שרוב התאים מופיעים פרושים על פני מספר רב של microposts. </li></ol> 2. תאי תיקון ומכתים הערה: כל הצעדים וכרכים הניתנים כאן הם לטוב אחד של צלחת 12 גם. מומלץ לעבד לא יותר מארבע שנתי עשר הבארות בכל פעם, כדי למנוע התייבשות של הבארות לאחר השאיפה של כל נוזל, אשר יגרום לקריסה של microposts. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינוני לשאוב מהבאר ותאים לשטוף 2X עם 1 מיליליטר PBS-חיץ. הקפד להחיל כוח עדין בזמן שטיפה עם PBS להסיר פסולת תא שהצטברה על מערך micropost במהלך דגירה ולנתק תאים מתים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את התאים עם 0.5 מיליליטר 3.7% תמיסת פורמלדהיד שנאגרו במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את פתרון פורמלדהיד על ידי שטיפת 2x מערך micropost עם 1 מיליליטר מים די סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם התאים עם צבע (0.05% כחול מבריק Coomassie ב -50% מים, 40% אתנול ו -10% חומצה אצטית) לכ -90 שניות. לשטוף פתרון מכתים עודף מ2x עם 1 מיליליטר מים די סטרילי. מוסיף מים DI 1 מיליליטר לmicropost מערך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק תוצאת צביעה באמצעות מיקרוסקופ אור. לא חזורהוא מכתים צעד, אם גוף תא הוא קלוש מכדי להיות דמיינו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערכי micropost חנות עם התאים המוכתמים על גבי במקרר ב 4 מעלות צלזיוס. להבטיח כדי לשמור אותם מתחת למים בכל העת. </li></ol> הדמיה 3. סלולארי הערה: שלב 4 חל רק על מיקרוסקופים ללא אופטיקה אינסוף מתוקן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף DI-מים 2 מיליליטר לצלחת פטרי עם תחתית זכוכית דקה להדמיה ברזולוציה גבוהה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את מערך micropost באמצעות פינצטה לתוך צלחת ההדמיה עם microposts פונה כלפי מעלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צלחת פטרי הדמיה בשלב ניד של מיקרוסקופ אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את טבעת הפיצוי של העדשה המשמשת להדמיה עד המספר על הסולם מייצג את העובי הכולל של כל החומרים בדרך האופטית כדי לפצות על חוסר ההתאמה במדדי שבירה של מצע הזכוכית, אלסטומר סיליקון ונוזל על גבי. זה צריך להוביל להופעה בהירה של micropostsליבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור את איריס בצד התאורה עד 50% ולהסיר כל טבעות ניגוד שלב מהנתיב האופטי המאפשר מצב בהיר שדה רגיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יישר את מערך micropost שmicroposts יוצר קו אופקי על פני שדה התצפית. הגדרת נקודת התחלה (למשל, למעלה משמאל) ולהעביר את שלבי צלחת פטרי על הבמה סריקת מערך micropost תוך לקיחת תמונות רבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את כל התמונות עם הגדרת הרזולוציה הגבוהה ביותר עבור המצלמה באמצעות מטרת 20X או 40X. שואף להיות תא בודד במרכז התמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטאטא לאורך ציר z דרך המצע עד הטיפים micropost הם בפוקוס. השתמש בגלגל פוקוס כוונון העדין של המיקרוסקופ ולהפוך אותו לכיוון התמקדות בתחתית micropost כ 2-3 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע נוהל הדמיה סטנדרטי על ידי לקיחת סדרה של תמונות מבחן סעיף מערך אחד שוטף את הפרמטרים הדמיה אחד בכל פעם (למשל, זמן חשיפה,הגדרת איריס, הגדרות מנורה וכו &#39;). ניתוח תמונות עם MechProfiler ולקבוע סט פרמטר מתאים לניתוח מהיר ואמין. </li></ol> ניתוח 4. תמונה עם תוכנות הקוד פתוח &quot;MechProfiler&quot; הערה: ניתן להפעיל כל פונקציות התוכנה עם התקן הצבעה באמצעות לחצן העכבר השמאלי. עם זאת, מפעיל מיומן יהיה להשתמש במקשי הקיצור המתועדים נועדו להיות במחצית השמאלית של המקלדת כדי לאפשר עיבוד תמונה בשתי ידיים יעילה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל MechProfiler תוכנת ניתוח תמונה ולפתוח מגוון של תמונות שצריכות להיות מנותחים על ידי לחיצה על &quot;פתח&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את כל הפרמטרים לסעיף &quot;הגדרות&quot; שניתן על ידי מפתח התוכנה. לקבוע את הפרמטרים שחייבים להיות מוגדר אישית (כלומר, סף גובה ומרחק מינימאלי) בהתאם לנהלים שתוארו בפירוט על ידי התוכנה ידנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח תמונהשל אחד על אחד על ידי חיתוכם לאזור של עניין באמצעות &quot;חתוך&quot; (לחץ וגרור עם כפתור העכבר לחוץ למטה). לחץ לחיצה כפולה בתוך המלבן נמשך לסיים פעולה זו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סימון כל מתווה גלויה תא אחד על אחד על ידי לחיצה על &quot;צייר קווי המתאר תא&quot; ולהשתמש בסמן שיער הצלב לציור כולל את כל microposts התא מצורף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבטל את כל microposts לא רצוי על ידי לחיצה על &quot;בטל הודעות&quot; ולהשתמש בסמן שיער הצלב לציור. הקף את כל microposts ששייך לתא מחוץ לתמונה או הקטע שהסיטו מכל סיבה אחרת, אבל לא על ידי התא של עניין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל שגרת התוכנה &quot;מצא centroids&quot; על ידי לחיצת עכבר. התאם את מסנן הגדרה ממש ליד הכפתור &quot;מצא centroids&quot; עד שכל microposts רשום, אשר גלוי על ידי צלב אדום במרכזם. אם הגדרת המסנן היא גם microposts הנמוך יתעלם, אם הוא גבוה מדי muעמדות ltiple תסומן לmicropost יחיד. שמור את מסנן הגדרה קבוע במהלך פגישת ניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בפונקצית עריכה הידנית &quot;העריכה ידנית&quot; לcentroids עם עמדות micropost מרובות או שלא נענו. השתמש בשיער צלב עכבר כדי לבחור את micropost בשאלה על ידי לחיצה וגרירתו על פני. לחץ לחיצה כפולה בתוך המלבן ומניחה את הסמן האדום החסר בסעיף התמונה המוגדל, אשר באופן אוטומטי סוגר. בטל micropost כזה אם הוא מחוץ לקווי מתאר התא נמשך (ראה שלב 4.5) לפני שימשיך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצא את רשת micropost האידיאלית על ידי הפעלת הפונקציה &quot;צור רשת&quot; בלחיצת עכבר. להבטיח את המיקום מתאים עם הראש האמיתי micropost, שמוצג על ידי טבעת כחולה, בתוך קווי המתאר התא נמשך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתקן כל יצרנית רשת במקומה בתוך שטח התא שבו צורך בשימוש בפונקציה המקבילה &quot;מנואל ערוך&quot; בלחיצת עכבר. השתמש בשיער הצלב כדי לבחור את micropost בquestion על ידי לחיצה וגרירתו על פני. לחץ לחיצה כפולה בתוך המלבן מופיע ולמקם את הסמן הכחול החסר בסעיף התמונה המוגדל, אשר באופן אוטומטי סוגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בכפתור &quot;חישוב הסטיות&quot; על ידי לחיצת עכבר לקבל היסטוגרמה של ערכי הסטייה מחושבים על בסיס ההבדל בין העמדה של micropost בתוך סעיף התמונה והרשת האידיאלית שנוצרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את הניתוח המלא כולל השולחנות של ערכים על ידי לחיצת עכבר על &quot;שמור&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך ניתוח התמונה או על ידי לחיצה על &quot;איפוס צפה&quot; ולנתח סעיף אחר של תמונות או לחיצת עכבר על &quot;התמונה הבאה&quot;, בו בנוחות ניתן לעשות זאת באמצעות מפתח גדפן מקלדת תקין. </li></ol> 5. ניתוח נתונים - Mechanoprofiling <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את הקובץ &quot;results.xls&quot; עם תכנית גיליון אלקטרוני משרד מהתיקייה עם התמונות מנותחות. הוא מכיל את הנתונים עם אלערכי l מחושבים כוללים את כל סטיות micropost ואמצעים נגזרים סטנדרטיים כגון עבודה (כלומר, אנרגיית עיוות מצע) על ידי התא נותח. </li></ol>

<ol><li>Sharma, R. I., Snedeker, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+biomechanical+gradients+for+directed+bone+marrow+stromal+cell+differentiation+toward+tendon+and+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Biochemical and biomechanical gradients for directed bone marrow stromal cell differentiation toward tendon and bone.</a> Biomaterials. 31 (30), 7695-7704 (2010).</li>
<li>Suresh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomechanics+and+biophysics+of+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Biomechanics and biophysics of cancer cells.</a> Acta Biomater. 3 (4), 413-438 (2007).</li>
<li>Bartalena, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+assessing+adherent+single-cell+stiffness+in+tension%3A+design+and+testing+of+a+substrate-based+live+cell+functional+imaging+device%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Microdevices%22%5BJournal%5D)">A novel method for assessing adherent single-cell stiffness in tension: design and testing of a substrate-based live cell functional imaging device.</a> Biomed Microdevices. 13 (2), 291-301 (2011).</li>
<li>Tan, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+lying+on+a+bed+of+microneedles%3A+An+approach+to+isolate+mechanical+force%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Cells lying on a bed of microneedles: An approach to isolate mechanical force.</a> PNAS. 100 (4), 1484-1489 (2003).</li>
<li>Akiyama, Y., Hoshino, T., Iwabuchi, K., Morishima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Room+Temperature+Operable+Autonomously+Moving+Bio-Microrobot+Powered+by+Insect+Dorsal+Vessel+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+ONE%22%5BJournal%5D)">Room Temperature Operable Autonomously Moving Bio-Microrobot Powered by Insect Dorsal Vessel Tissue.</a> PloS ONE. 7 (7), (2012).</li>
<li>Biais, N., Ladoux, B., Higashi, D., So, M., Sheetz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperative+retraction+of+bundled+type+IV+pili+enables+nanonewton+force+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+Biology%22%5BJournal%5D)">Cooperative retraction of bundled type IV pili enables nanonewton force generation.</a> Plos Biology. 6 (4), 907-913 (2008).</li>
<li>Wuang, S. C., Ladoux, B., Lim, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+Chemo-Mechanical+Effects+of+an+Anti-Cancer+Drug+Emodin+on+Breast+Cancer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Probing the Chemo-Mechanical Effects of an Anti-Cancer Drug Emodin on Breast Cancer Cells.</a> Cell Mol Bioeng. 4 (3), 466-475 (2011).</li>
<li>Schoen, I., Hu, W., Klotzsch, E., Vogel, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+Cellular+Traction+Forces+by+Micropillar+Arrays%3A+Contribution+of+Substrate+Warping+to+Pillar+Deflection%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Probing Cellular Traction Forces by Micropillar Arrays: Contribution of Substrate Warping to Pillar Deflection.</a> Nano Lett. 10 (5), 1823-1830 (2010).</li>
<li>Lemmon, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear+Force+at+the+Cell-Matrix+Interface%3A+Enhanced+Analysis+for+Microfabricated+Post+Array+Detectors%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Chem+Biosyst%22%5BJournal%5D)">Shear Force at the Cell-Matrix Interface: Enhanced Analysis for Microfabricated Post Array Detectors.</a> Mech Chem Biosyst. 2 (1), 1-16 (2005).</li>
<li>Lam, R. H. W., Weng, S. N., Lu, W., Fu, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+subcellular+measurement+of+cell+stiffness+using+a+microengineered+stretchable+micropost+array+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Integr+Biol-UK%22%5BJournal%5D)">Live-cell subcellular measurement of cell stiffness using a microengineered stretchable micropost array membrane.</a> Integr Biol-UK. 4 (10), 1289-1298 (2012).</li>
<li>Roure, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+mapping+in+epithelial+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Force mapping in epithelial cell migration.</a> PNAS. 102 (39), 14122-14122 (2005).</li>
<li>Papenburg, B. J., Rodrigues, E. D., Wessling, M., Stamatialis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+the+role+of+material+surface+topography+and+wettability+on+cell-material+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Insights into the role of material surface topography and wettability on cell-material interactions.</a> Soft Matter. 6 (18), 4377-4388 (2010).</li>
<li>Badique, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directing+nuclear+deformation+on+micropillared+surfaces+by+substrate+geometry+and+cytoskeleton+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Directing nuclear deformation on micropillared surfaces by substrate geometry and cytoskeleton organization.</a> Biomaterials. 34 (12), 2991-3001 (2013).</li>
<li>Sniadecki, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+microposts+as+an+approach+to+apply+forces+to+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Magnetic microposts as an approach to apply forces to living cells.</a> PNAS. 104 (37), 14553-14558 (2007).</li>
<li>Weng, R. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+silicone-based+stretchable+micropost+array+membrane+for+monitoring+live-cell+subcellular+cytoskeletal+response%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A silicone-based stretchable micropost array membrane for monitoring live-cell subcellular cytoskeletal response.</a> Lab Chip. 12, 731-740 (2012).</li>
<li>Desai, R. A., Yang, M. T., Sniadecki, N. J., Legant, W. R., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabricated+Post-Array-Detectors+%28mPADs%29%3A+an+Approach+to+Isolate+Mechanical+Forces%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microfabricated Post-Array-Detectors (mPADs): an Approach to Isolate Mechanical Forces.</a> J Vis Exp. (8), e311(2007).</li>
<li>Yang, M. T., Fu, J. P., Wang, Y. K., Desai, R. A., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assaying+stem+cell+mechanobiology+on+microfabricated+elastomeric+substrates+with+geometrically+modulated+rigidity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Assaying stem cell mechanobiology on microfabricated elastomeric substrates with geometrically modulated rigidity.</a> Nat Protoc. 6 (2), 187-213 (2011).</li>
<li>Sniadecki, N. J., Han, S. J., Ting, L. H., Feghhi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropatterning+in+Cell+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Micropatterning in Cell Biology.</a> Methods in Cell Biol. 121, 61-73 (2014).</li>
</ol>

המחבר הראשי (NG) הוא מייסד שותף של MicroDuits GmbH, הספקית המסחרית של מערכי המיקרו-פוסטים ששימשו במחקר זה. לאף מחבר אחר אין ניגודי אינטרסים פוטנציאליים עם עבודה זו.

עבודה זו מבקשת לקדם את התחום של כוח המתיחה מיקרוסקופי על ידי באופן משמעותי הפחתת מחסומים טכניים ומעשיים לכניסה. מחסומים אלה באים משני צדדים. בראש ובראשונה הם האתגרים הטכניים לא טריוויאלית הרבים שיש להתגבר כדי לייצר reproducibly וניסוי עמלה מערך micropost. שנית, הוא הצורך באופן דומה לא טריוויאלית עבור ניתוח אוטומטי למחצה אמין של כוחות תא בודדים - תוך התחשבות שבניסוי טיפוסי עשוי לדרוש הניתוח של מאות או אפילו אלפים של תאים. הטכניקות שתוארו לעיל פותחו כדי להפוך micropost מיקרוסקופ כוח...

מבחני מבוססי תאי Mechano רגישים לאפשר לחקירת תאים חסיד, עם מגוון רחב של יישומים המשקפים את התפקיד המרכזי שמכניקה יכולה לשחק בביולוגיה של תא. יישומים אלה לעתים קרובות להתמקד במנגנונים המניעים את תהליכי subcellular או כל תא התנהגות. מצד אחד, גורמים סביבתיים חיצוניים, כגון הרכב נוסף סלולארי מטריצה ​​או מטריצת קשיחות יכולים להשפיע באופן דרמטי את התגובה המכנית וביולוגית של תא. 1 ניתן לראות אותו לאחר שימוש בכיתות רבות של תרכובות פעילים pharmaceutically, את ההשפעות של אשר לעתים קרובות מאופיין באמצעות מודלים תרבית תאים. 2 בנכסים האחרים יד genotypic, כגון אלה הנגרמים על ידי מוטציות גנטיות ספונטניות או מושרה בניסוי, יכול לגרום לשינויים מסומנים בפנוטיפ תא הקשורים לשינויים במבנה שלד התא ותפקודו. 3 דוגמאות אלה רק כמה מן רבים אפשרייםנושאים שphenotyping המכני של תאים הוא רלוונטי, וכל אלה נחקרו מועילים עם מערכי micropost. בשעת כתיבה זו, כ -200 מאמרים פורסמו מתארים אינטראקציה התא-micropost. עבודות אלה לדון בהיבטים התיאורטיים של עקרונות סטיית micropost כמו גם הוראות מעשיות בייצור שלהם. המאמר הראשון המתאר את האינטראקציה של תאים ומערכי micropost גמישים פורסם על ידי טאן ועמיתים בשנת 2003. 4 בניגוד למיקרוסקופ הקלאסי כוח המתיחה (TFM) שבו מצעים רכים רציפים משמשים לאמידת התכווצות תא nanonewton קנה מידה, טאן et al. תאר שיטה באמצעות קורות אנכיות צפופות מרובות עשויות אלסטומר סיליקון. היתרונות העיקריים של שיטה זו עולים משתי תכונות עיקריות. ראשון כדי לשנות את מצע נוקשות תא-לכאורה צריך רק לשנות את ממדי micropost תוך שמירההרכב המצע אחר קבוע ובכך להימנע מהבדלים בטופולוגיה משטח וכימיה. microposts השני מתנהג כמו מעיינות בודדות שניתן לנתח דיסקרטי עם כוח והחלטות מרחבית על סדר הידבקויות מוקד בודדים ויכול להפחית את האתגרים אנליטיים שטבועים לניתוח דומה על ידי TFM הסטנדרטי. היום המגוון הרחב של יישומים למערכי micropost עולה בהרבה על רק המיפוי של כוחות לכמה תאים בודדים. לדוגמא, אקיאמה מדווחת על שימוש ברקמת כלי גב מבודד מזחל עש כמפעיל למערך micropost, על מנת לפתח מיקרו-רובוט אוטונומי המונע בשריר חרקים. 5 עם זאת, יישומים שפורסמו רוב microposts התמקדו במחקרים של מצבים רפואיים כמו זיהום או סרטן. לדוגמא, מערכי micropost שימשו ללמוד דור הכוח של פילי סוג IV ארוזים של gonorrh Neisseriaמושבות oea המשויכת למפלי אות שיפור זיהום. 6 אחרים השתמשו microposts ללמוד תאי סרטן השד שטופלו בתרופות תרכובות מיקוד שלד התא. 7 סטייה של micropost מתוארת לעתים קרובות תוך שימוש בתאוריה קלסית קרן לשלוחה עם עומס סוף ההנחה התא מייחס רק לקצה קצו של micropost. כאן F הכוח ליישם שגורם δ סטייה תלוי בk &quot;קשיחות כיפוף&quot; של micropost ומחושב על ידי: <img alt="משוואת 1" src="/files/ftp_upload/53350/53350eq1.jpg" /> (1) עם E, אני, ולהיות L מודולוס של יאנג, רגע תחום אורך אינרציה וקרן בהתאמה. עם זאת, תוצאות ממשוואה זו נותנת קירוב כללי של הכוחות בעבודה מאז גז קרן וכיפוף גם רק כהשתאה מצע אינם נלקחים בACלִסְפּוֹר. בהתחשב בכך שmicroposts עשוי בדרך כלל מחומרים רכים כמו polydimethylsiloxane (PDMS) מבוסס גומי סיליקון הגורמים האלה צריכים להיות כלולים. . שון et al הראה שיש גורם תיקון כזה המבוסס על היחס של micropost (L / D) ונ &#39;יחס פואסון של הפולימר המתאים 8 זה ניתן על ידי.: <img alt="משוואה 2" src="/files/ftp_upload/53350/53350eq2.jpg" /> (2) עם ההטיה T (v) להיות מקדם הטיה הכולל הולם פרמטר = 1.3 ניתן למצוא כמו באותו המאמר: <img alt="משוואה 3" src="/files/ftp_upload/53350/53350eq3.jpg" /> (3) כלומר, הנוקשות המתוקנות של micropost k קור היא התוצר של K = עיקול k כיפוף קשיחות הטהור וגורם תיקון קורניתנו על ידי: <img alt="משוואה 4" src="/files/ftp_upload/53350/53350eq4.jpg" /> (4) לכן, יש לבצע חישובי כוח התא באמצעות הווריאציה מעודנת יותר של משוואה (1) קוראים עכשיו: <img alt="משוואה 5" src="/files/ftp_upload/53350/53350eq5.jpg" /> (5) ההשפעה של התיקון הופכת להיות ברורה יותר ברגע שהערכים אופייניים לממדי micropost משמשים. לדוגמא, micropost ארוך 15 מיקרון עם חתך עגול וקוטר של 5 מיקרומטר עשוי מגומי סיליקון מבוסס PDMS מוביל לגורם תיקון של 0.77 ולכן חישוב מתוקן היה להעריך את כוחות התא המופעל על ידי 23%. זה הופך להיות אפילו יותר קשה לmicroposts עם ההיבט ratios הקטן יותר. באופן מסורתי, ניתוח תמונת micropost גם היה מבוסס על תיאורית כיפוף קרן האידיאלית. בשנת 2005 הקבוצה שהיה חלוצה בשימוש בMICRמערכי opost פורסמו תוכנת ניתוח תמונה המתאימה לניתוח micropost 9 התוכנה דורשת רישיון תוכנה והמשתמש חייב לקחת שלוש תמונות לכל תפקיד.; אחד מכל המטוסים העליונים ותחתונים של micropost במצב הולכה ועוד אחד במצב הקרינה עם התא המוכתם. לאחר השוואת העמדות העליונה ותחתונים לכל micropost התוכנה קובעת שדה כוח וקטור ומחשבת פרמטרים הקשורים כמו כוח למשרה. חבילות תוכנה אחרות קיימות ועקרונות ניתוחם מוזכרים בקצרה במאמרים המקביל המתארים אותם, אבל חבילות תוכנה אנליטיים אלה הן בדרך כלל לא זמינות לציבור. 10,11 מערכי micropost מיועדים לכוחות תא מיפוי יכולים להיות מסווגים כאו להיות בפריסה מאונך micropost או אחד משושה, האחרון שבם יש את היתרון של פערים במרחק שווה בין כל microposts השכן. חה microposts הטיפוסייש חתך עגול וממדיהם נעים בין 1.0 מיקרומטר עד 10 מיקרומטר בקוטר 2 עד 50 מיקרומטר באורך. 4 עם זאת, microposts עם חתך אליפטי או מרובע גם דווח. 12,13 השימוש בתערובות סיליקון מבוסס PDMS כחומר micropost מאפשר להוספת חלקיקים לתוך התערובת. לדוגמא הוספת ננו-מוטות קובלט מאפשר הפעלה מגנטית של micropost ובכך נותן עוד תואר של חופש עיצובים ניסיוניים פוטנציאל. 14 רוב הקבוצות לייצר מערכי micropost על מצעים קשיחים שטוחים כמו מכסה זכוכית או בתוך צלחת פטרי. עם זאת, מאן ועמיתים לעבודה דיווחו לאחרונה מערך micropost נוצר על קרום מתיחה. 15 זה מאפשר היישום של כוחות תא מתיחה לתאים חסיד בזמן לימודי תגובות דינמיות לחיות תאי subcellular במונחים של התכווצות תא. ורוב estab המועסקים נרחבתהליך lished להכנת מערכי micropost מבוסס על יתוגרפיה הרכה כפי שתואר בפרוטוקולים תובנה של Sniadecki ועמיתים. 16-18 בתהליכי חדר נקי סטנדרטיים קצרים משמשים ליצירת microstructures על גבי פרוסות סיליקון באמצעות photoresist SU8. זה ואחריו תהליך העתקה שבו גומי סיליקון הוא יצוק על מבני העברתם לתוך תבניות. בשלב שני תבניות אלה משמשות לשכפל מיקרו הראשוני באמצעות גומי סיליקון על גבי מצע נבחר. עם זאת, למרות המספר הגדול והולך וגדל של פרסומים הקשורים ליישומם, הקמת תהליך ייצור לmicroposts לוקח כמות ניכרת של זמן אפילו למומחי מיקרו-הנדסה; יש שלבי תהליך רבים הדורשים אופטימיזציה והתאמה לסביבת המעבדה הספציפית ופריסת micropost להניב רמת איכות מקובלת. מערכי micropost מסחריים זמינים כעת במוכן-tפורמט o-שימוש (&quot;מחוץ למדף&quot;) עם איכות גבוהה באופן עקבי. ככזה הוא אלטרנטיבה לתהליך הייצור המורכב וארוך הנדרש לייצור באתר. במאמר זה מערך micropost זמין מסחרי שימש למיפוי כוחות סלולריים באמצעות תמונת מיקרוסקופ שדה בהיר אחד. חשוב ממאמר זה מתאר ומתעד תוכנת מלוא תפקודי קוד פתוח בשם MechProfiler, שזמינה להורדה כחומר משלים לכתב היד הזה. ניתן למצוא גם גרסה נשמרה באופן פעיל של התוכנה בhttp://www.orthobiomech.ethz.ch. השילוב של assay &quot;מחוץ למדף&quot; ותוכנת ניתוח קוד פתוח תואמת במידה ניכרת מוריד את משוכת הכניסה להשיג ניסויי TFM מדויקים. חוקרים ללא גישה למתקנים או חדר נקיים או מומחיות בפיתוח תוכנה יכולים לנתח כוחות סלולריים בהצלחה. זה מאפשר למשתמש להתמקד בmechanosפלט ensitivity assay ולא הטכנולוגיה עצמה, ועושה מדידות כוח המתיחה זמינות לקהילה רחבה יותר. יתר על כן, זה הוא צעד חשוב כדי לסלול את הדרך לכיוון הקרנה אוטומטית מלא של מערכי micropost. תוכנת ניתוח MechProfiler מעבדת תמונות בפורמט קובץ TIFF, PNG, BMP ו- JPG. ניתן לקחת את התמונות באמצעות הקרינה, לעומת שלב או מיקרוסקופ אור בהיר השדה. התכנית העצמאית פועלת יחד עם Matlab מהדר זמן הריצה החופשי (זמינה בכתובת: איור 12) ואלגוריתמים בסיסיים לאפשר לעיבוד תמונה יעיל, המאפשר למשתמש לעיבוד תמונות עם תאים בודדים או מרובים בכ -1 דקות. יתר על כן, תאים אלה יכולים גם להיות חיים או &quot;קבוע&quot;. תוכנת MechProfiler יכולה להגדיל את תפוקת ניתוח נתונים רבה על ידי הסתמכות על שחזור של מערכי micropost המסחרי האיכותי, # ספציפי יותר, ברירת המחדל ו8220;-הסיט אינם &quot;עמדה של כל הודעה במערך ניתן להניח נגד רשת אידיאלית (סטיות ייצור לרשת במערכים המשמשים למחקר זה היו פחות מ -100 ננומטר). בקיצור אחד פותח בחירה של קבצי תמונה לניתוח, יבוליהם לאזור של עניין, מגדיר את ההודעות מכוסות על ידי תאים או שצריך להיות מושלך, קובע פוסט עמדות, מחשבים את הסטיות / כוחות נגד הרשת האידיאלית, ולבסוף שומר את כל נתוני התא ספציפי עם אפשרות ליצוא, כולל לגיליון אלקטרוני משרדי סטנדרטי.

<table><tbody><tr><td>צלוחיות תרבית תאים T25</td><td>Nunc</td><td>156367</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS-buffer</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>0.5% Trypsin-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>15400054</td><td></td></tr><tr><td>בינוני DMEM/F12</td><td>Sigma</td><td>D8437</td><td></td></tr><tr><td>FBS South</td><td>America Life Technologies</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין 100x</td><td>סיגמא</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>בקבוקוני צנטריפוגה 15 מ"ל</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.502&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>מערך Micropost מצופה מראש בקולגן I/Fibronectin</td><td>MicroDuits</td><td>MPA-col1/FN</td><td>מידות Micropost: &Oslash;=6.4&#160; ומיקרו; m, l=18.2 ומיקרו; m; grid=13 ומיקרו; M, Kcorr=2.87&#160; n/&מיקרו; מ</td></tr><tr><td>אתנול שרירי בטן p.A.</td><td>Merck</td><td>100.983</td><td></td></tr><tr>תמיסת <td>פורמלין Nunc</td><td>150628</td><td></td><td>צלחת 12 בארות</td></tr><tr><td>, ניטרלית חוצצת 10%</td> <td>Sigma</td><td>HT5011</td><td></td></tr><tr><td>כחול מבריק G-250</td><td>Sigma</td><td>27815</td><td>Coomassie כחול</td></tr><tr><td>מתנול ACS p.A.</td><td>Merck</td><td>1.06009</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אצטית</td><td>סיגמא</td><td>695092</td><td></td></tr><tr><td>צלחת תחתונה מזכוכית</td><td>WillCo Wells BV</td><td>GWSb-3522</td><td>קוטר 35 מ"מ, צמצם 22&nbsp; mm</td></tr><tr><td>T-100 Eclipse</td><td>Nikon</td><td>n/a</td><td>מיקרוסקופ הפוך</td></tr><tr><td>D3-L3</td><td>Nikon</td><td>n/a</td><td>שולט מצלמה</td></tr><tr><td>DS Fi2</td><td>מצלמת</td> <td>ניקון</td><td></td></tr></tbody></table>

mechano-פרופיל קל ומדויק על מערכי micropost

Easy and Accurate Mechano-profiling on Micropost Arrays

מצעי תרבית תאים עם מיקרו-פוסטים גמישים משולבים מאפשרים למשתמש לחקור את האינטראקציות המכניות בין תאים לסביבתם הקרובה. במיוחד, אינטראקציות תא-מצע הן העניין העיקרי. כיום מערכי מיקרו-פוסטים הם שיטה מאופיינת ומבוססת היטב עם מגוון רחב של יישומים שפורסמו בעשור האחרון. עם זאת, נראה שיש הסתייגות בקרב ביולוגים להתאים את הטכניקה בשל התהליך הארוך והמאתגר של ייצור מיקרו-פוסטים יחד עם היעדר תוכנה נגישה בקלות לניתוח תמונות של תאים המקיימים אינטראקציה עם מיקרו-פוסטים. 
קריאת הכוח ממיקרו-פוסטים היא קלה באופן מפתיע. מיקרו-עמוד מתנהג כמו קפיץ עם התא מחובר באופן אידיאלי בקצהו. בהתאם לגודל, תא מפעיל כוח מהשלד הציטולוגי שלו דרך נקודת הידבקות מוקדית אחת או יותר למיקרו-פוסט, ובכך מסיט את המיקרו-פוסט. כמות הסטייה קשורה ישירות לכוח המופעל בכיוון ובגודל. מספר המיקרו-פוסטים המכוסים על ידי תא ודפוסי הפוסט סטייה אופייניים ומאפשרים קביעת ערכים כמו כוח לעמוד, ופרמטרים ביולוגיים רלוונטיים רבים המאפשרים "פרופיל מכני" של פנוטיפים של תאים.
שיטה נוחה ליצירת פרופילים מכניים מתוארת כאן המשלבת את הדור הראשון של מיקרו-פוסטים מוכנים לשימוש מסחרי עם חבילת תוכנה שפותחה בתוך החברה ונגישה כעת לכל החוקרים. כהדגמה של יישום טיפוסי, תמונות בודדות של תאי סרטן העצם צולמו במיקרוסקופ שדה בהיר לפרופיל מכני של מודלים של קו תאים של גרורות. שילוב זה של חיישני כוח משיכה מסחריים ותוכנת קוד פתוח לניתוח מאפשר לראשונה יישום מהיר של טכניקת מערך המיקרו-פוסטים בעבודת מעבדה שגרתית הנעשית על ידי משתמשים שאינם מומחים. יתר על כן, תהליך ניתוח חזק ויעיל מאפשר למשתמש לנתח מספר רב של תמונות מיקרו-פוסט בצורה חסכונית ביותר בזמן.

היתרון העיקרי של הטכניקה המתוארת טמון בפשטות שלה ופוטנציאל להשתלבות מהירה ויעילה לעבודת מעבדה שגרתית. השילוב של מערכי חיישן מסחריים באיכות גבוהה יחד עם תוכנות קוד פתוח מספק מידע על mechano-רגישות שאחרת היה דורש גישה למתקני חדר נקי ובידע המעמיק של ניתוח תמונה ופיתוח תוכנה. איור 1 מדגים את זרימת העבודה של השיטה שהוצגה. זה מתחיל בהכנה וזריעת תאים על גבי מערך micropost. לאחר תיקון ומכתים את תאי מערכי micropost מוכנים להדמיה. חלק מהטכניקה המרכזי הוא ניתוח התמונה באמצעו...

מתוארים פרוטוקולים לכימות אינטראקציות מכניות בין תאים דבקים ומצעים מיקרו-מובנים. אינטראקציות אלו קשורות קשר הדוק להתנהגויות תאים חיוניות כולל נדידה, התפשטות, התמיינות ואפופטוזיס. הפרוטוקולים מציגים תוכנת ניתוח תמונות בקוד פתוח הנקראת MechProfiler, המאפשרת קביעת הכוחות המעורבים עבור כל מיקרו-פוסט.

Mechano-פרופיל קל ומדויק על מערכי Micropost

Cell culture substrates with integrated flexible microposts enable a user to study the mechanical interactions between cells and their immediate ...

המטרה הכוללת של טכניקה זו היא לאסוף תכונות מכנו-ביולוגיות רלוונטיות מתאי בודדים מבודדים, על ידי ויזואליזציה של הכוחות הנובעים מאינטראקציות האופייניות של התא עם התשתית באמצעות מיקרוסקופיית אור סטנדרטית. השיטה המוצגת מהווה טכנולוגיית פלטפורמה עבור מכנו-ביולוגיה. היא יכולה לסייע בחקירת שאלות מפתח במחקר הסרטן, כגון תפקידה של התכווצות התא במטאסטזה של תאי סרטן.היתרונות העיקריים של הטכניקה הם מיצוי חסון של מידע נוירוביולוגי עם הכשרה מועטה של המשתמש. היא תואמת למיקרוסקופיה אופטית סטנדרטית ומיועדת לתפוקה גבוהה. שלישית, שיטה זו מספקת תובנה לגבי התכונות המכנו-ביולוגיות של תאי סרטן עצם אנושיים.ניתן ליישם זאת גם על סוגי תאים אוטולוגים, כגון תאי שריר חלק או קרדיומיוציטים. התחל בהנחת מצע הזכוכית כך שמערך המיקרו-עמודים פונה כלפי מעלה אל תוך באר של פלטת 12 בארות; הוסף בעקיפין מיליליטר אחד של 99% ethanol לבאר כך שהמצע יהיה מכוסה. ודא שלא נוצרות בועות במהלך כל שלבי הטיפול בנוזלים, וכי מערך המיקרו-עמודים מכוסה תמיד בשכבה דקה של נוזל.לאחר מכן, דגרו את המערך בטמפרטורת החדר למשך 20 עד 30 שניות לפני הוספת מיליליטר אחד של מים דה-יוניים סטריליים לדופן הבאר. ברגע שהם מתערבבים, שאבו כמיליליטר אחד מתמיסת האתנול מהבאר והוסיפו מיליליטר נוסף של מים דה-יוניים. חזרו על תהליך זה לפחות שלוש פעמים כדי להרטיב את הדגימה.בשלב הבא, החליפו את המים המיוננים בבאר ב-PBS באופן דומה, על ידי הוספה ולאחר מכן שאיבה של כמיליליטר אחד בכל פעם, ושחזרו זאת שלוש פעמים. לאחר מכן, השתמשו באותו תהליך כדי להחליף את ה-PBS במצע גידול. כעת, כאשר המערך מכוסה בכמיליליטר אחד של מצע גידול, פלטו בעזרת פיפט 25,000 תאים רלוונטיים במיליליטר אחד של מצע גידול אל תוך הבאר המכילה את מערך המיקרו-עמודים המוכן.לאחר מכן, סגרו את הפלטה הרב-בארית והעבירו אותה לדגירה בטמפרטורה של 37 °C וב-5% carbon dioxide. הניחו לתאים להיצמד ולגדול על גבי המיקרו-עמודים במשך שש עד שבע שעות, תוך מעקב אחר תהליך ההיצמדות. מדי פעם, באמצעות מיקרוסקופ אור, שאבו את המצע מהבאר ולאחר מכן שטפו את התאים פעמיים עם 1 mL של PBS.יש להפעיל כוח עדין בזמן השטיפה ב-PBS כדי להסיר שיירי תאים שהצטברו על מערך המיקרו-עמודים במהלך האינקובציה וכדי לנתק תאים מתים. לאחר מכן, יש להוסיף 0.5 milliliters של תמיסת פורמאלדהיד בבuffer בריכוז 3.7% למשך חמש דקות כדי לקבע את התאים. לאחר מכן, יש להסיר את תמיסת הפורמאלדהיד ולשטוף את מערך המיקרו-עמודים פעמיים באמצעות one milliliter של מים סטריליים דה-יוניים.עבור כל שטיפה, כסו את התאים המקובעים בצבע 0.05% kumasi brilliant blue ב-50% water, 40% ethanol ו-10% acetic acid למשך כ-90 שניות, ושטפו את תמיסת הצביעה העודפת בשתי שטיפות של מיליליטר אחד של sterile deionized water. לאחר מכן, הוסיפו מיליליטר אחד של deionized water למערך המיקרו-עמודים (micro post array) ובדקו את תוצאת הצביעה תחת מיקרוסקופ אור. התחילו בהוספת שני מיליליטרים של deionized water לצלוחית פטרי עם תחתית זכוכית דקה; בעזרת פינצטה, העבירו את מערך המיקרו-עמודים מלוח 12 הבארות אל צלוחית הדימוג כאשר המיקרו-עמוד פונה כלפי מעלה.לאחר מכן, הניחו את צלחת הפטרי לדימוי על הבמה הניידת של מיקרוסקופ אור. אם האופטיקה של המיקרוסקופ אינה מתוקנת לאינסוף (infinity corrected), סובבו את טבעת הפיצוי של העדשה המשמשת לדימוי עד שהמספר על הסקאלה ייצג את העובי הכולל של כל החומרים לאורך המסלול האופטי. לאחר מכן, הסירו כל טבעות ניגודיות פנים (face contrast rings) מהמסלול האופטי כדי לאפשר מצב שדה בהיר (bright field) רגיל, ואז הפחיתו את צמצם האיריס בצד התאורה ל-50%. יישרו את צלחת הפטרי כך שהעמודים המיקרוסקופיים של המערך יצרו קו אופקי או אנכי לרוחב שדה התצפית.הגדירו נקודת התחלה בפינה השמאלית העליונה והזיזו את צלחת הפטרי באופן מדורג על פני הבמה. סרקו את מערך המיקרו-עמודים תוך צילום תמונות רבות ברזולוציה גבוהה באמצעות עדשה אובייקטיבית של 20 x או 40 x. שאפו שבתמרכז כל תמונה בכל מיקום חדש יהיה תא בודד.סרוק לאורך ה-ZXs מבסיס המיקרו-עמוד לכיוון קצה המיקרו-עמוד עד שהקצה יהיה במיקוד, באמצעות גלגל הכיוון העדין של המיקרוסקופ. לאחר מכן, הנמך את מישור המיקוד בשני עד שלושה מיקרונים לכיוון בסיס המיקרו-עמוד.התחילו בהפעלת התוכנה mec, profiler, וטעינת טווח תמונות הדורשות ניתוח על ידי לחיצה על open ובחירת התמונות. לאחר מכן, עברו למסך ההגדרות (setting) והזינו את הפרמטרים בהתאם להוראות במדריך למשתמש של התוכנה. לבסוף, נתחו את התמונות אחת אחת.התחילו בבחירת כפתור החיתוך (crop), ולאחר מכן לחצו וגררו כדי ליצור מסגרת מלבנית סביב אזור העניין. בסיום, לחצו פעמיים בתוך המלבנית ששורטטה כדי להשלים את הפעולה. לאחר מכן, בחרו באפשרות שרטוט מתאר תא (draw cell outline) והשתמשו בסמן צלב כדי לשרטט מסגרת סביב כל המיקרו-עמודים (micro posts) המכוסים על ידי התא הנראה בתמונה.הסר מיקרו-עמודים (micro posts) שאינם רצויים על ידי לחיצה על discard posts, והשתמש בסמן כוונת לציור. לאחר מכן, הקף את כל המיקרו-עמודים השייכים לתא הנמצא מחוץ לחלק התמונה או אלו שסטו מסיבה כלשהי אחרת, אך לא על ידי התא הנבדק. לאחר מכן, לחץ על Find OIDs כדי להפעיל את תת-השגרת של התוכנה.כוון את הגדרת המסנן הנמצאת לצד כפתור find OIDs עד שכל המיקרו-פוסטים יירשמו, דבר המסומן על ידי איקס אדום במרכזם. אם קיימים מיקרו-פוסטים כפולים או מיקומים שפספסו, השתמש בפונקציית העריכה הידנית על ידי לחיצה על manual edit והשתמש בסמן העכבר כדי לבחור את המיקרו-פוסט הרלוונטי. לחץ פעמיים בתוך המלבן והצב סמן אדום בודד בחלק התמונה המוגדל, שנסגר באופן אוטומטי.מצא את רשת המיקרו-עמודים (micro post grid) האידיאלית על ידי הפעלת פונקציית יצירת הרשת באמצעות לחיצה בעכבר. ודא שהמיקום תואם לראש המיקרו-עמוד האמיתי, המודגש על ידי טבעת כחולה בתוך קו מתאר התא המצויר. לאחר מכן, תקן במידת הצורך כל סימון רשת שאינו במקומו בתוך אזור התא.בעזרת פונקציית העריכה הידנית המתאימה באמצעות לחיצה בעכבר, השתמשו בכוונת כדי לבחור את שאלת המיקרו-פוסטינג על ידי לחיצה וגרירה מעליה. לחצו פעמיים בתוך המלבן המופיע והציבו את הסמן הכחול המתוקן בחלק התמונה המוגדל, שנסגר באופן אוטומטי. לאחר מכן, לחצו על calculate deflections כדי לקבל היסטוגרמה של ערכי הסטייה המחושבים, המבוססים על ההפרש בין מיקום המיקרו-פוסט בתוך חלק התמונה לבין הרשת האידיאלית שנוצרה.לבסוף, שמרו את הניתוח המלא, כולל טבלאות הערכים. המשיכו בניתוח התמונות על ידי לחיצה על reset view כדי לנתח חלק נוסף של התמונה, או לחצו על next image show. להלן דוגמה לפרופיל של שני קווי תאי סרטן עצם: תאי Q oh nine, בעלי פוטנציאל גרורתי נמוך, ותאי M 132 בעלי פוטנציאל גרורתי גבוה, שנזרעו על משטחים מאותה סדרת ייצור.התוצאות מראות כי תאי Q oh nine נוטים להפעיל כוח רב יותר בנקודות ההצמדה שלהם מאשר תאים מטאסטטיים מאוד, וזאת על ידי סיווג ערכי הכוח. ביחס לשטח התא, נמצא כי הכוח הממוצע לתא גבוה יותר עבור תאי huo nine בהשוואה ל-M 132. כמו כן, הכוח הממוצע למיקרו-עמוד (micro post) עולה ככל שהתאים מתפשטים, עד שהכוח הממוצע לעמוד מגיע לערך יציב יותר.מעבר להבדלים, ניתן לכמת את השונות המורפולוגית עם תוצאות מעניינות. לדוגמה, בניגוד לתאי M 132 בעלי הפוטנציאל המטסטטי הגבוה, הנוטים לתפוס פחות מיקרו-עמודים, תאי HU oh nine מציגים פרופיל הטרוגני יותר מבחינת כיסוי המיקרו-עמודים. בקצרה, פרופיל ה-Meno עבור שורת התאים ההורית HU oh nine מגלה כי הם בדרך כלל מכסים שטח גדול יותר ומפעילים כוח מעט רב יותר על המיקרו-עמודים.בעוד שקו התאים הגרורתיים M 132 וסוג תאים אגרסיבי מכסים באופן אופייני פחות מיקרו-עמודים ומפעילים פחות כוח לכל מיקרו-עמוד. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לבצע את הפיפטינג בזהירות רבה וללעולם לא ישירות על מערך המיקרו-עמודים. יש להימנע מהחדרת בועות, שכן הן עלולות להוביל לקריסת המיקרו-עמודים.לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי אופן הפקת מידע ביולוגי מתאי בודדים מבודדים באמצעות micro post Aries בשילוב עם התוכנה mesh profile שלנו. תהנו מהתוצאות שלכם.

easy-and-accurate-mechano-profiling-on-micropost-arrays

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

בסרטון זה אנו מדגימים כיצד לפברק ולנצל microfabricated גלאי מערך פוסט (mPADs) כדי להעריך מודולציות של contractility הסלולר.

Microfabricated פוסט מערך גלאים (mPADs): גישה לבודד כוחות מכניים

נדגים את ההתקנה וניתוח של microRNA טרום 96-היטב עבור מערכים QPCR באמצעות רובוט, כמו גם על ידי ביד עם פיפטה מדעי רב מטריקס Thermo.

פרופיל של טרום מיקרו RNAs ו רנ&quot;א באמצעות כמותי בזמן אמת PCR (qPCR) מערכים

תיאור של ההיווצרות של הפולימר microarray באמצעות טכניקת photopolymerization על שבב. אפיון משטח התפוקה הגבוהה באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי, מדידות זווית מגע מים, ספקטרוסקופיה Photoelectron רנטגן ושעה של ספקטרומטריית טיסה משנית יון המוני וassay מצורף תא גם תאר.

Microarrays פולימר לגילוי תפוקה גבוהה של Biomaterials

מאמר זה מפרט את הבנייה של חיישן microneedle מבוסס multiplexed. המכשיר מפותח עבור בדגימה באתרו וניתוח אלקטרוכימי של analytes מרובים בצורה מהירה סלקטיבית. אנחנו מדמיינים ברפואה קלינית מחקר ביו משתמש עבור אלה microneedle מבוססי חיישנים.

חיישן הולו Microneedle מבוסס על מרובב דרך העור אלקטרוכימי חישה

שיטת הקרנה פונקציונלית קומבינטורית לתובנה להשפעות של ההרכב המולקולרי של microenvironments על תפקודים תאיים מתוארת. השיטה מנצלת את הטכנולוגיות קיימות microarray מבוססים לייצר מערכים של microenvironments קומבינטורית מוגדר התומכים הידבקות תא וניתוח פונקציונלי.

ייצור ושימוש של microarrays Microenvironment (MEArrays)

סרטון זה מדגים טכניקה המיישמת טכנולוגיית מיקרו-מערך פפטידי כדי לאפיין את הספציפיות של נוגדנים המזהים שינויים לאחר תרגום (PTM) על פפטידי היסטון. שקופית מיקרו-מערך המכילה פפטידים מצומדים פלואורופורים משותקים עם שילובי PTM ידועים מטופלת בנוגדנים ספציפיים ל-PTM מטרה. תהליך זה מסייע לזהות את הספציפיות של הנוגדן למטרה ואת התגובתיות הצולבת הפוטנציאלית שלו עם PTM שאינם מטרה.

טכנולוגיית מיקרו-מערך פפטידי לפרופיל ספציפיות של נוגדנים

כתב יד זה מציג שיטה חזקה של בדיית קעורה microwells ללא צורך מתחם מתקני עלות גבוהה. באמצעות כוח מגנטי, חרוזים פלדה מערך דרך חור, מספר מאות microwells נוצרו במצע polydimethylsiloxane (PDMS) 3 ס"מ על 3 ס"מ.

חרוז לזווג עם מגנט במערך צורניים Microwells עם משתנה גיאומטריות קעורה

כאן אנו מציגים עבור סריקה מרחבית ננוליתוגרפיה בדיקה זמינה על-ידי יישור איטרטיביים של מערכי בדיקה, כמו גם הניצול של דפוסי ליטוגרפית ללימודי אינטראקציה תא-פני פרוטוקול.

ננוליתוגרפיה בדיקה סריקת שטח גדול בהנחייתם של יישור אוטומטי ויישומו המצע פבריקציה נוספת ללימודי תרבות תא

מאמר זה מתאר את המתודולוגיה מפורט כדי להכין מערך מרובב מלאכותי תאית MicroEnvironment (MACME) עבור תפוקה גבוהה מניפולציה גופנית, כימית רמזים היה שווה ויוו הסלולר microenvironments וכדי זיהוי הסביבה התאית אופטימלית עבור תאי גזע pluripotent אנושי (hPSCs) עם פרופיל תא בודד.

ייצור של מערך מרובבת MicroEnvironment הסלולר מלאכותי

מוצגת כאן שיטה לפנוטיפ מכני של תאים בודדים באמצעות פלטפורמה מיקרופלואידית מבוססת אלקטרוניקה הנקראת חישת נקבוביות מכאנו-צומת (mechano-NPS). פלטפורמה זו שומרת על תפוקה מתונה של 1-10 תאים לשנייה תוך מדידת התכונות הביופיזיות האלסטיות והצמיגיות של התאים.

חישת נקבוביות Mechano-node: פלטפורמה מהירה ונטולת תוויות למדידות ויסקואלסיות של תאים בודדים מרובי פרמטרים

לבדיקת דגימה בקנה מידה גדול עם רזולוציה ננומטרית יש מגוון רחב של יישומים, במיוחד עבור פרוסות מוליכים למחצה ננו-מפורקות. מיקרוסקופ כוח אטומי יכול להיות כלי נהדר למטרה זו, אך מוגבל על ידי מהירות ההדמיה שלהם. עבודה זו משתמשת במערכי קנטיליבר פעילים מקבילים ב- AFM כדי לאפשר בדיקות בתפוקה גבוהה ובקנה מידה גדול.

מיקרוסקופ כוח אטומי פעיל של בדיקה עם מערכי קנטיליבר קוואטרו-מקביליים לבדיקת דגימות בקנה מידה גדול בתפוקה גבוהה

למדו פרופיל מכני מדויק של תאים בודדים באמצעות מערכי Micropost ותוכנת MechProfiler. השיטה מספקת תובנות לגבי תכונות מכניות של תאי סרטן עצם אנושיים ומסייעת בחקר תפקיד הצמצום בהתפשטות גרורות.

Mechano-פרופיל קל ומדויק על מערכי Micropost

גלה סרטונים נוספים