חיידקי עלה הסתננות Assay עבור אפיון פיין של תגובות הצמחים ביטחון באמצעות
1 באוקטובר 2015
כימות צמיחת פתוגנים הוא כלי רב עוצמה לאפיון תגובות חיסוניות שונות של Arabidopsis thaliana (להלן: Arabidopsis). השיטה המתוארת כאן מציגה בדיקת חדירת מזרק אופטימלית לכימות Pseudomonas syringae pv. מקוליקולה גידול ES4326 בעלים בוגרים של Arabidopsis.
המטרה הכללית של הליך זה היא לאפיין באופן כמותי את התגובה החיסונית של Arabidopsis diliana באמצעות בדיקת חדרת מזריק (syringe infiltration) מותאמת. הדבר משיג תחילה על ידי שימוש בחדרת מזריק להחדרה ידנית של חיידקים אל העלה דרך הפתחים הטבעיים הנקראים סתומה (stomata). השלב השני הוא השגת דיסקיות של רקמת עלה מזוהמת לאחר התפתחות תסמיני המחלה.
בשלב הבא, החיידקים מופקים מדיסקיות העלה באמצעות הומוגנזציה בסביבה בעלת תפוקה גבוהה. השלב הסופי הוא דילול סדרתי ופיזור (spotting) על צלחות לספירת חיידקים לצורך ספירת המושבות. בסופו של דבר, ניתן להסיק מתאם בין הצמיחה החיידקית בכל דיסקית עלה לבין העוצמה היחסית של התגובה החיסונית של הצמח.
שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובה לשאלות מפתח בתחום החסינות של צמחים, כגון זיהוי גנים התורמים לתגובות הגנה מפני עקה ביוטית. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות הוא שהיא מאפשרת כימות מדויק של צמיחת פתוגנים ברקמת הצמח הנגועה, ומסייעת במניעת שגיאות ניסיוניות הנגרמות מדגימת עלים במצבים התפתחותיים שונים. שיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי התגובה החסינית של הצמח לזיהום על ידי פתוגן חיידקי וירולנטי, וניתן ליישמה גם במערכות אחרות, כגון תגובות חיסוניות המופעלות על ידי חומצה סליצילית או תבניות מולקולריות הקשורות למיקרובים.
בדרך כלל, אנשים שאינם מכירים את השיטה זו יתקשו להחדיר את החיידקים אל העלה ללא פגיעה ברקמה. את הפרוצדורה הבאה ידגימו הפוסט-דוקטורנטית Hindu והסטודנטים לתואר מתקדם shalu ו-yali Soon מהמעבדה שלי. בסרטון זה יודגם המבחן לרגישות מוגברת למחלה.
לפני הניסוי, הכין מצעים של King's B או KB; הכן ליטר אחד של מצע KB מוצק כפי שמתואר בטקסט של הפרוטוקול והשאר אותו להתקרר על בוחש מגנטי. כאשר המצע התקרר לטמפרטורה שניתן לגעת בה, הוסף למצע 80% glycerol, מגנזיום סולפט בריכוז מולרי אחד וסטרפטומייצין; מזוג למצעי KB בשני גדלים שונים. פטרית הפטרי השמיעה תשמש כצלחת תרבית החיידקים הראשונית, ופטריית הפטרי הגדולה יותר תשמש כצלחת לספירת החיידקים.
יש לאחסן את הצלחותיות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס יומיים לפני זריעת הבדיקה. PSM ES 43 26. יש לזרוע חיידקים ממאגר גליצרין במינוס 80 מעלות צלזיוס על צלחת תרבית חיידקים KB strep ולהדגיר בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס למשך 24 עד 48 שעות ביום למחרת.
יש להכין את התרבית הנוזלית בתוך מבחנה סטרילית עם ארבעה מיליליטרים של מצע kb נוזלי המכיל 50 micrograms per milliliter של streptomycin. יש לנער ב-250 RPM בטמפרטורה של 28 degrees Celsius למשך לילה. צמחי ה-Arabidopsis עבור הניסוי גודלים בתנאים המפורטים בטקסט הפרוטוקול באותו היום שבו מושקת התרבית הבקטריאלית הנוזלית.
סמנו את עליכי העלה מספר חמש ושש בעזרת טוש קהה ועמיד למים, כדי לאפשר זיהוי קל של הרקמה המודבקת בעת הדגימה. כדי לשפר את פתיחת ה-STA ולהקל על חדירת תמיסת הפתוגן אל תוך העלה, השקו את הצמחים היטב על ידי השריה של התחתית למשך 20 דקות.
לאחר 20 דקות, נקז את עודפי המים. ביצוע ההדבקה של צמחי ה-arabidopsis הושלם. היום שאחרי תחילת התרבית הנוזלית.
העבר את תרבית החיידקים לשפופרת מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 milliliter וסבב במהירות של 9,600 Gs למשך שתי דקות. בטמפרטורת החדר, השלך את העלייה (supernatant) והשהה מחדש את משקע החיידקים ב-one milliliter של Magnesium chloride סטרילי בריכוז 10 millimolar; דלל את תגלי החיידקים עם nine milliliters של 10 millimolar magnesium chloride בשפופרת צנטריפוגה של 50 milliliter. לאחר מדידת הצפיפות האופטית של החיידקים, דלל את החיידקים באמצעות 10 millimolar magnesium chloride עד ל-OD 600 סופי של 0.0002.
עבור בדיקת הזיהום ב-EDS. לצורך החדרת הנוזל (infiltration) משתמשים במזרק ללא מחט עם קצה קהה בנפח של מיליליטר אחד, המוכר בדרך כלל כמזרק אינסולין. מלאו את המזרק ב-0.5 עד 0.6 מיליליטר של התמיסה הבקטריאלית המדוללת כדי להשיג שליטה טובה יותר במהלך תהליך ההחדרה; אין למלא את המזרק עד לקיבולתו המלאה.
חשוף את פני השטח התחתונים של העלה על קצה האצבע המורה, ולאחר מכן, בעזרת האגודל, כוון בעדינות את מיקום העלה. מקם את המזרק בצורה אנכית כנגד פני השטח של העלה כדי להבטיח פיזור אחיד של הלחץ ולהפחית את הנזק לעלה. השתדל להימנע מאזור העורק המרכזי במהלך ההסננה.
דחפו באיטיות את הבוכנה כדי להחדיר את התמיסה הבקטריאלית. כניסת הנוזל למזופיל של העלה תזוהה על ידי צבע כהה יותר של העלה; החדירו את התמיסה לכל שטח פני העלה, גם אם הדבר דורש מספר ניסיונות. עם השלמת ההחדרה, ספגו בעדינות את העלה בעזרת נייר סופג כדי להסיר את עודפי תמיסת הפתוגן.
בצעו בדיקה חזותית של רקמת העלה הנגועה כדי לאתר נזקים. השאירו את הצמחים שהוחדרו לחומר לייבש במשך שעה עד שעתיים, ולאחר מכן החזירו את הצמחים לתנאי הגידול המקוריים שלהם. רססו כיפה שקופה במים וכסו את הצמחים הנגועים למשך שעתיים.
לאחר מכן, סננו את כיפת הפטרייה כדי ליצור פתח של שתיים עד שלוש אינץ', והשאירו אותה כך לאורך שאר ניסוי ההדבקה, הנמשך בדרך כלל שלושה ימים. יום אחד לפני כימות גדילת הפתוגן, ייבשו מראש את צלחות מצע ה-KB בגודל 150 מילימטר על 15 מילימטר.
ייבשו את הפלטות על ידי השארתן בטמפרטורת החדר למשך כ-24 שעות. עיבדו את הרקמה הנגועה לאחר הופעת הסקלרוזיס (Sclerosis), המזוהה על ידי הצהבה של הרקמה הנגועה בגנוטיפים הרגישים, אך לפני התפתחות של נגעים נמקריים. עבור כל גנוטיפ, הכינו שש מבחנות ריסוק.
הניחו כדור טחינה אחד מפלדת אל-חלד והוסיפו 500 µL של מגנזיום כלוריד סטרילי בריכוז 10 mM לכל מבחנה. לאחר מכן, הסירו את העלה המודבק מהצמח ונקבו דיסקה של עלה באמצעות מחסן נייר בעל חור אחד בעזרת פינצטה באופן אקראי; הניחו שתי דיסקאות עלה משני צמחים שונים בכל מבחנת טחינה. אטמו את המבחנות והומוגניזו את הרקמה באמצעות הומוגניזר בעל תפוקה גבוהה במהירות מקסימלית למשך 10 דקות.
חזור על תהליך זה במידת הצורך עד שהרקמה תהיה הומוגנית היטב והתמיסות יהפכו לירוקות עקב שחרור כלורופיל מהעלים המודבקים במהלך ההמתנה. לצורך ההומוגניזציה, מלא כל באער בשש השורות הראשונות של פלטת תרבית בעלת 96 באערים ב-180 µL של Magnesium chloride בריכוז 10 mM. העבר 20 µL מת suspension של הרקמה הטחונה לכל באער בשורה הראשונה של פלטת ה-96 באערים, וערבב על ידי שאיבה והזרקה חוזרת של הנוזל באמצעות פיפט.
אם שברי רקמה קטנים סתמו את הקצה, קצצו אותו בשני עד שלושה מילימטרים כדי לסייע בהשגת הנפח הנכון של התמיסה, ובכך לספק מספיק מקום לטיפה בחלקו העליון של הלוח; מקמו את הרקמות מגנוטיפים שונים בשורות לסירוגין. כדי להכין דילול סדרתי של פי עשרה, העבירו 20 µL של תמיחת רקמה לשורה השנייה וחזרו על פעולה זו עד לדילול השישי. באמצעות קצות פיפטה מחולקים, העבירו 20 µL של התמיסה מלוח ה-96 בעל הדפנות ללוח KB בגודל 150 millimeter על 15 millimeter.
עבדו מהסספנסיה המדוללת ביותר לסספנסיה המרוכזת ביותר, כדי שלא יהיה צורך להחליף קצות פיפטה בין הדילוציות. ייבשו את הפיתח בטמפרטורת החדר כאשר המכסה פתוח מעט. ברגע שלא ניתן להבחין בנוזלים נוספים על פני השטח של הפיתח, סגרו את המכסה, הפכו את הפיתח והדגירו אותו בטמפרטורת החדר.
דגרו את הצלחות למשך 40 עד 60 שעות עד להופעת המושבות. ודאו כי החיידקים על הצלחות משקפים את הירידה הצפויה של פי עשרה ביחידות יוצרות מושבות (CFU).
ספרו את החיידקים לפני שהם גדלים יתר על המידה והמושבות מתמזגות. קבעו את מספר החיידקים בדילול הנמוך ביותר שבו אין מושבות חופפות. בדרך כלל, הדילול המועדף לספירה יכיל בין 10 ל-50 מושבות, וערך זה עשוי להשתנות בין חזרות טכניות.
כדי לחשב את רמות השגשוג הבקטריאלי, קבעו את מספר היחידות יוצרות המושבות (CFU) לכל דיסקית עלה באמצעות נוסחה זו, כאשר R הוא מספר השורה ו-T הוא מספר הבקטריות בכל שכפול טכני. הנתונים משמשים לאחר מכן להפקת גרף. כל נקודת נתון מיוצגת כממוצע של שישה שכפולים טכניים בסקלה לוגריתמית.
סטיות התקן מייצגות את רווח הביטחון של 95% עבור הממוצע של המחלה המוגברת. הרגישות ל-P-S-M-E-S 43 26 נבדקה על ידי הדבקה באינוקולום בעל OD 600 של 0.0002. התוצאות מראות כי למוטנטים NPR one dash one בעלי רגישות גבוהה יש כ-2.5 log או פי 300 יותר צמיחה של פתוגן בהשוואה לצמחי wild type Columbia zero.
ניתן לשנות את בדיקת החדרת המזרק כדי להעריך שכבות שונות של תגובה חיסונית. כדי להעריך חסינות המופעלת על ידי חומצה סליצילית, נעשה שימוש במריחה חיצונית של נתרן סליצילאט להפעלת התגובה החיסונית, אשר נמדדת על ידי צמיחת הפתוגן. אובדן של NPR1, המתפקד כקולטן לחומצה סליצילית וכמסייע מרכזי בבקרת שעתוק של גנים מטרה התלויים בחומצה סליצילית, מוביל לחוסר רגישות למריחה חיצונית של נגזרת החומצה הסליצילית.
כדי לאפיין חסינות המופעלת על ידי תבניות מולקולריות הקשורות למיקרובים, צמחים טופלו מראש בשני מעוררים מוכרים. FLAG 22 ו-L 18; צמחיסוג הפרא Columbia zero שטופלו ב-FLAG 22 הראו הפחתה של סדר גודל אחד או פי 10 באוכלוסיית החיידקים, בעוד שצמחי המוטציה FLS two לא הצליחו להפעיל את אפקט הגבלת הצמיחה החיידקית. באופן דומה, צמחי המוטציה EFR לא הגיבו לטיפול מוקדם ב-L 18.
לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לכמת את התגובה החיסונית של Arabic opsys באמצעות בדיקת חדירה באמצעות מזרק. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לנטר את התפתחות המחלה ולדגום את הרקמה לאחר הופעת corsis. ה-pseudomona pather cul cola S phos 3, 2 6 הוא פתוגן hemi atrophic.
לפיכך, יש לבצע את הדגימה לפני המעבר לשלב הנויטרופי. לאחר הליך זה, ניתן לבצע שיטות נוספות כגון quantitative real time PCR ואנליזת Western blood כדי לענות על שאלות נוספות, כמו איזה מסלול איתות חיסוני ספציפי נפגע. אל תשכחו שאתם עובדים עם חיידקים חיים.
למרות ש-Pseudomona Senge אינה פתוגנית לבני אדם, אנא זכרו להשליך כראוי חומרים מתכלים מזוהמים וצמחים נגועים בעת ביצוע פרוצדורה זו.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מפרט שיטה לכימות צמיחת פתוגנים ב-Arabidopsis thaliana לצורך הערכת תגובות חיסוניות. בדיקת חדרת המזרק (syringe infiltration) המותאמת מאפשרת הזרקה של Pseudomonas syringae אל העלים, ובכך מקלה על חקר החסינות של הצמח.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- אימונולוגיה של צמחים
- אינטראקציה עם פתוגנים
- אנליזה כמותית
רקע
- Arabidopsis thaliana הוא אורגניזם מודל בביולוגיה של צמחים.
- הבנת התגובות החיסוניות של צמחים היא קריטית לשיפור העמידות של גידולים חקלאיים.
- Pseudomonas syringae הוא פתוגן חיידקי נפוץ המשפיע על צמחים.
- כימות הצמיחה של הפתוגן יכול להספק תובנות לגבי מנגנוני ההגנה של הצמח.
מטרת המחקר
- לאפיין את התגובה החיסונית של Arabidopsis thaliana.
- לפתח שיטה אופטימלית לכימות פתוגנים.
- להצליב את הצמיחה הבקטריאלית עם עוצמת התגובות החיסוניות של הצמח.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- חדירה באמצעות מזרק להחדרת חיידקים לרקמת העלה.
- איסוף דיסקות עלים נגועות לאחר הופעת תסמינים.
- הומוגניזציה בסביבת תפוקה גבוהה להפקה של חיידקים.
- דילול סדרתי וזריעה על מצע כדי לספור מושבות חיידקים.
תוצאות עיקריות
- כימות מוצלח של צמיחת Pseudomonas syringae.
- ביסוס קורלציה בין צמיחה חיידקית לבין עוצמת התגובה החיסונית.
- שיטה מיוטבת המשפרת את היעילות של ניתוח הפתוגן.
- השגת תובנות לגבי מנגנוני ההגנה של Arabidopsis thaliana.
מסקנות
- בדיקת חדירה באמצעות מזרק יעילה לחקר חסינות צמחים.
- שיטות כמותיות יכולות לשפר את ההבנה של אינטראקציות בין צמחים לפתוגנים.
- ניתן להחיל גישה זו על מיני צמחים אחרים לצורך מחקר רחב יותר.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
שיטה זו מאפשרת הערכה כמותית של תגובות חיסוניות בצמחים על ידי מדידת צמיחת נגיעים ברקמה נגועה, ובכך מספקת מדד הדיר שניתן לשחזור לצורך תיקוף מטרות במסלולי הגנה של צמחים. היא תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטית על ידי בידוד שכבות חיסוניות ספציפיות, כגון חסינות המופעלת על ידי חומצה הסליצילית וחסינות המופעלת על ידי MAMP, ובכך מאפשרת בחינה מדויקת של תפקוד גנים בתגובה למעיקה ביוטית. הבדיקה מייצרת נתונים כמותיים וניתנים להרחבה שיכולים להנחות החלטות בשלבי הגילוי המוקדמים בקווי פיתוח של ביוטכנולוגיה חקלאית המתמקדים בתכונות עמידות למחלות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר חקירה של גנים ספציפיים התורמים לתגובות הגנה מפני עקה ביוטית באמצעות קורלציה כמותית של צמיחת הפתוגן.
- ערך תפעולי: מונע טעויות ניסיוניות הנובעות מדגימת עלים במצבים התפתחותיים שונים על ידי שימוש באיסוף סטנדרטי של דיסקיות עלים.
- ערך ניבוי: תומך בבדיקת היפותזות של מסלולי איתות חיסוניים על ידי קורלציה בין תהליכי התרבות חיידקים לבין החוזק החסוני היחסי של הצמח.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מספק פלט כמותי לסריקת גנוטיפים בעלי רגישות מוגברת למחלה (EDS) באמצעות דילול סדרתי וספירת יחידות יוצרות מושבות (CFU).
- ערך תפעולי: עושה שימוש בהומוגניזציה בתפוקה גבוהה ובעיבוד של פלטות בעלות 96 בארות להוצאה הדירה של חיידקים מרקמה מזוהמת.
- סקליביליות: מאפשרת הכנה של מספר שכורות טכניות עבור כל גנוטיפ כדי לתמוך בביטחון סטטיסטי במדידות גידול של פתוגנים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: ניתן להשלים בטיפולים מקדימים כגון חומצה סליצילית או MAMPs (למשל, FLAG 22, EF-Tu) כדי לנתח תגובות חיסוניות רב-שכבתיות ולהעריך מנגנוני פיצוי.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: מאפשרת להבחין בין פגמים בחסינות המופעלת על ידי חומצה סליצילית לבין חסינות המופעלת על ידי MAMP, באמצעות קריאות של צמיחת פתוגנים תחת תנאי טיפול מקדימים מבוקרים.
- ביטחון ניבוי: תומך בקידום מותאם סיכונים על ידי כימות מידת אובדן התגובה החיסונית, כגון עלייה של 2.5 log בצמיחה במוטנתי NPR1 לעומת סוג בר.
שילוב זרימת עבודה וצנרת עיבוד
הבדיקה משתלבת בתהליך העבודה של ביולוגיה של גילוי כקריאה תפקודית לתיקוף מטרות, במיקום שלאחר זיהוי הגנים ולפני מעקב מכניסטי, ובכך היא מאפשרת מיון כמותי של גנים מועמדים במערכת החיסון של הצמח.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות על ידי כימות צמיחת הפתוגן כקריאה ישירה של עוצמת התגובה החיסונית בעקבות הפרעה גנטית או טיפול מקדים.
- סריקה: מספק רקמה מזוהמת סטנדרטית המוכנה לבדיקה, לצורך מיצוי וכימות חיידקים הניתנים לשחזור בין גנוטיפים שונים.
- אנליזה: מייצר נתונים של צמיחת פתוגנים בסולם לוגריתמי עם רווחי סמך של 95%, המאפשרים השוואה סטטיסטית של פנוטיפים חיסוניים.
- מחקר תרגומי: מקשר לוולידציה בהמשך השלב באמצעות קורלציה עם שיטות כגון qPCR או Western blot, כדי לזהות מסלולי איתות חיסוניים ששובשו.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה הניתנת לשימוש חוזר להערכת שכבות של תגובה חיסונית על פני גנוטיפים, טיפולים מקדימים וזני פתוגנים מרובים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מספק ביטחון חיזוי בתיקוף המטרה באמצעות קורלציה כמותית של התרבות הפתוגן עם עוצמת התגובה החיסונית.
- ערך תפעולי: מבטיח שחזוריות באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים של חדירה, עיבוד רקמות ודילול סדרתי הממזערים שונות טכנית.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של המשך או הפסקה (go/no-go) בפיתוח תכונות על ידי הפחתת עמימות מכניסטית בניתוח נתיבי הגנה של צמחים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף של מטרות עמידות מותאם סיכונים, המבוסס על השפעה מדידה של הגבלת גדילת הפתוגן.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטכניקות של פתולוגיה של צמחים, כולל טיפול אספטי בחיידקים והחדרה של חיידקים לעלים ללא גרימת נזק לרקמה.
- תלוי בציוד כגון הומוגניזטורים בעלי תפוקה גבוהה, צנטריפוגות ואינקובטורים לצורך ספירה של חיידקים.
- מחייב סטנדרטיזציה בין צוותים להשגת עקביות בתזמון הופעת התסמינים, דגימת דיסקי-עלים וקריאת צלחות, על מנת להבטיח השוואתיות של הנתונים.
- כולל שיקולי התאמה בעת הרחבה למינים שונים של צמחים, זני פתוגנים או מעוררי מערכת חיסון מעבר למערכת של Arabidopsis-Pseudomonas syringae.
- כולל מגבלות מעשיות כגון הצורך לדגום רקמה לאחר הופעת התסמינים אך לפני התפתחות נגעים נקרוטיים, כדי למנוע השפעות מטעה של דגרדציה של הרקמה.
