תחבורת ממברנה תהליכים נותחה על ידי מערכת שבב nanopore מקבילה מאוד ברזולוצית חלבון יחידה
16 באוגוסט 2016
הפרוטוקול המוצג מתאר את הניתוח של הובלה מתווכת חלבון ממברנה ברמת הטרנספורטר היחיד באמצעות שכבות דו-שכבתיות נטולות שומנים נטולות ממס המשתרעות על פני נקבוביות. זה מושג על ידי יצירת שבבי מערך ננו-נקבוביות המיוצרים בתפזורת, בשילוב עם איסוף וניתוח נתונים מקבילים ביותר, המאפשרים הקמה עתידית של הקרנות אפקטור חלבון ממברנה.
המטרה הכוללת של פלטפורמה מבוססת שבב ננו-מבנה זו היא לנתח את תפקוד חלבון הממברנה ברמה המולקולרית היחידה באופן מקביל מאוד. באמצעות יכולתו לפתור חלבונים בודדים, מושגות תובנות חדשות לגבי הובלת הממברנה ושטף. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום חלבון הממברנה, כגון מוליכות או התנהגות הובלה של תעלות בודדות או טרנספורטרים, במיוחד כאלה עם מטען לא אלקטרוגני.
היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא ההקבלה הגבוהה שלה הנגזרת מתכנון שבב ננו-מבנה, הכולל מאות אלפי ננו-נקבוביות וקריאת הפלואורסצנט של אירועי הובלה. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על מה שיוצר את המבחנים הטובים ביותר של ספריות יעילות לחלבוני ממברנה. מכיוון שהפלטפורמה מבוססת השבב מאפשרת תיעוד הובלה מקביל ואוטומטי ביותר.
בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו ילמדו במהירות כיצד להתמודד עם הטכניקה המוצגת. המיקוד תמיד היה ליצור בדיקה ידידותית למשתמש כך שכל מי שמעוניין יוכל לאמץ אותה. בדיקת הובלת ממברנה זו משתמשת בסיליקון על רקיק מבודד, מהונדס באמצעות תחריט יוני תגובה.
כ-1,000 שבבי בדיקה מיוצרים מכל רקיק. כל שבב מכיל 250,000 מיקרו-חללים. חללים אלה נאטמים על ידי שכבות דו-שכבתיות של שומנים המכילות את חלבוני ההובלה המעניינים.
הממברנה מהווה את ממשק החיישן. בתחילה, חומרים פלואורסצנטיים כלולים בצד אחד של שכבת השומנים הדו-שכבתית, המתאימה לחלק הפנימי של הליפוזומים מהם הם מורכבים. כל חלל ניתן להתייחסות באמצעות קריאת פלואורסצנטיות מולטי-ספקטרלית.
שכבה עליונה אטומה חוסמת את האותות הפלואורסצנטיים ממאגר החיץ, מה שהופך את השבב הביולוגי לתואם למיקרוסקופים פלואורסצנטיים הפוכים. באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי, פתחי הנקבוביות המסודרים באופן שווה וחספוס פני השטח של שכבת הסיליקון-דו חמצני נמדדו ב-3.6 ננומטר, אופטימלי לאיחוי שלפוחית. מיקרוסקופ אלקטרונים סורק מראה חתך רוחב דרך ננו-נקבוביות, הניגש לחללי הפמטוליטר בתוך שבב הסיליקון.
סרטון זה מציג את הכנת הפרוטאוליפוזומים, הכנת השבבים לבדיקה וביצוע הבדיקה הבסיסית. חבר בקבוק תחתון עגול שטוף אתנול למאייד סיבובי. יבש את סרט השומנים במשך 40 דקות בחום של 300 מיליבר, טמפרטורת אמבט מים של 30 מעלות צלזיוס ומהירות סיבוב מקסימלית ליצירת סרט שומנים הומוגני על דופן הזכוכית של הבקבוק.
לאחר מכן, בעזרת משאבה בעלת ואקום גבוה, יבש את סרט השומנים למשך 30 דקות נוספות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הוסף חמישה מיליליטר חיץ ושמונה חרוזי זכוכית שטופים באתנול לבקבוק כדי ליצור את השלפוחיות המולטי-למלריות. חבר את הבקבוק למאייד הסיבובי וסובב ללא ואקום ב 50 מעלות צלזיוס במהירות מרבית.
לאחר 45 דקות, התמיסה תיראה חלבית, ללא שאריות של סרט שומנים על הקירות. העבירו את הבקבוק מתחת לגז אינרטי לאמבטיה אולטרסאונד, והפכו אותו לסוניקציה במשך ארבע דקות בטמפרטורת החדר. סוניקציה משבשת את הליפוזומים והופכת אותם לחד-שמיים.
כעת, פצלו את תמיסת ה-LUV למיליליטר אחד, ובצעו חמישה מחזורי הפשרה בהקפאה באמצעות חנקן נוזלי ואמבט מים של 40 מעלות צלזיוס. זה מוביל לקרע, סידור מחדש וצמיחה של הליפוזומים. בשלב ההקפאה האחרון, אחסן את כל הדגימות במינוס 80 מעלות צלזיוס.
לפני שחזור אליקוט LUV, הוצא את הליפוזומים על ידי העברת האליקוט דרך קרום מסנן פוליקרבונט של 400 ננומטר 17 פעמים, באמצעות מיני מכבש. לאחר מכן, ערער את יציבות ה-LUVs על ידי הוספת 4% Triton X-100 עבור 0.25% בתמיסה. דגרו על התערובת במשך חמש דקות בחום של 50 מעלות צלזיוס.
כעת, ערבבו חלק אחד של MscL מטוהר ושונה ל-20 חלקים של הליפוזומים הרוויים בחומרי ניקוי, והמשיכו בדגירה למשך 30 דקות. לאחר הדגירה, קחו 100 מיקרוליטר והוסיפו נפח אחד של 30 מילי-מולארי סידן. דגרו על תערובת זו במשך חמש דקות בחום של 50 מעלות צלזיוס.
כעת, הסר את חומר הניקוי מהדגימה שטופלה בסידן ולא מטופלת. מוסיפים לכל אחד מהם חרוזים ביולוגיים רטובים במאגר טריס, ודוגרים אותם למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס על צלחת מסתובבת. לפני הניסוי, בדוק תכשיר באמצעות מבחן פעילות.
כדי להתחיל, מערבבים בסיס אלסטומר לחומר הריפוי, ומייבשים את התערובת לחלוטין כך שהיא מזעזעת. יש להשתמש בדבק תוך 30 דקות כשהוא מוכן. בינתיים, תוך נקיטת אמצעי זהירות, נקו מגלשת זכוכית כיסוי באמצעות חמישה מיליליטר כלורופורם, שנמרחו ממזרק זכוכית, ותנו למגלשה להתייבש.
כעת, בעזרת פיפטה של 10 מיקרוליטר, הפקידו את הדבק המוכן על זכוכית הכיסוי. לאחר מכן, הסר בזהירות שבב מלוח הוופל בעזרת פינצטה עדינה. כשהצד המצופה של השבב כלפי מעלה, הפקידו אותו על הדבק ושפשפו אותו בעדינות לתוך השקופית כדי לפזר את הדבק באופן שווה.
אל תתנו לבועות אוויר להילכד מתחת, או לכל דבק לעלות מעל השבב. כמו כן, הפוך את ההרכבה כך שתתאים למחזיק השקופיות בן שמונה החדרים. כעת יבשו את המכלולים למשך שעתיים בחום של 65 מעלות צלזיוס במייבש ארון.
מאוחר יותר, הסר את שכבת המגן על השבבים עם כמה שטיפות ממס בטמפרטורה של 54 מעלות צלזיוס. ראשית הנח את השבבים המותקנים למחזיק שקופיות. לאחר מכן, דגרו אותם בשלוש אמבטיות ממס למשך 10 דקות כל אחת.
איזופרופנול, אצטון ואיזופרופנול. לאחר מכן, שטפו בזהירות וביסודיות את הצ'יפס במים טהורים במיוחד. השלם את התהליך על ידי ייבוש השבבים תחת זרם עדין של גז חנקן.
כעת, הכינו שקופית דביקה עם שמונה בארות והניחו אותה לאחור על הספסל. לאחר מכן, הרם בזהירות ולחץ על מגלשות הכיסוי על המגלשה הדביקה כשהשבבים פונים לבארות. הניחו למכלול לנוח מספר דקות לפני שתמשיכו.
לפני שתמשיך בבדיקת הטרנסלוקציה, שטוף היטב את מכלול השבבים, כמתואר בפרוטוקול הטקסט, וסיים עם אמבט חיץ Tris. לאחר מכן, החליפו את תמיסת האמבטיה עם מאגר DOPEd Tris, המכיל חמישה מילי-מולרי סידן כלורי, וצבע מיקרו-מולרי אחד Oy647. לאחר מכן, הוסף פרוטאוליפוסומים לתא השבבים לריכוז סופי של מיליגרם אחד למיליליטר, והמתן שעה.
לאחר שעה יש לשטוף את הצ'יפס ארבע פעמים עם 400 מיקרוליטר של מאגר טריס נטול סידן. כעת, הוסף את הצבע המבוקר לכל באר לחמש מיקרומולר, והמשך בבדיקה. לאחר מכן, הרכיבו את מחזיק השבב למיקרוסקופ האפיפלואורסצנטי, והתמקדו בשולי שבב הננו-נקבוביות כדי למצוא את המיקרו-חללים.
לאחר שהמיקרו-חללים נמצאים בפוקוס, סרוק את מערך הננו-נקבוביות לאיתור אזור המציג את יחס התקרה הגבוה ביותר. הפרטים מסופקים בפרוטוקול הטקסט. ליפוזומים הוכנו ונבדקו לגודלם, פיזורם ופיזורם.
הליפוזומים המוכנים היו גדולים יותר מקוטר הנקבוביות לבדיקה, וזה חיוני. רצוי גם ליפוזומים חד-מפוזרים. לפני הניסוי, חלבון ה-MscL המותאם בתכשיר הליפוזום נבדק באמצעות בדיקת מרווה פלואורסצנטית.
היחס בין הליפוזומים המכילים MscL פעיל שונה היה מספיק כדי להמשיך בניסוי הטרנסלוקציה. על השבב הביולוגי נצפתה טרנסלוקציה מומסת של מטרה פלואורסצנטית דרך תעלת MscL שהשתנתה. המאפנן הכימי, MTSET, שימש לפתיחת תעלות ה-MscL המהונדסות באמצעות דחייה אלקטרוסטטית.
הירידה שלאחר מכן של הקרינה בתוך חלל החלל נוטרה. תהליך זה הוכיח את עצמו כבעל יכולת שחזור גבוהה, עם אירועי פליטה עקביים מאוד. עקומות הזרימה המתקבצות התקבצו בשתי אוכלוסיות נפרדות, המתאימות לאירועי טרנסלוקציה חד-ערוצית, או רב-ערוצית.
המערכת הצליחה לעקוב אחר עד שלושה צבעים פלואורסצנטיים ייחודיים עם ניתוח בזמן אמת. זה מאפשר הבחנה מדויקת של תוצאות חיוביות, אירועי פליטה חד-מעריכית, קינטיקה מורכבת, חדירות שומנים וקרעים בקרום. לאחר השליטה, ניתן לבצע טכניקה זו בשלבים עוקבים, כלומר הכנת שבב, הכנת דגימה, הדמיה וניתוח, מה שהופך את הפרוטוקול כולו למודולרי.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה
פרוטוקול זה מפרט פלטפורמה מבוססת שבב ננו-מבנה שנועדה לנתח את תפקוד חלבון הממברנה ברמת מולקולה יחידה. באמצעות שימוש בשבבי מערך ננו-נקבובית, השיטה מאפשרת פארלליזם גבוה באיסוף נתונים, ומספקת תובנות לגבי דינמיקת הובלה של הממברנה.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביופיזיקה
- ביולוגיה של הממברנה
רקע
- לחלבוני הממברנה יש תפקידים מכריעים בהובלה התאית.
- הבנת התנהגות של מוביל יחיד יכולה לחשוף תובנות על דינמיקת הממברנה.
- שיטות קיימות לרוב חסרות את הרזולוציה לנתח חלבונים בודדים.
- מחקר זה מציג גישה חדשנית המשתמשת בטכנולוגיית ננו-נקבובית.
מטרת המחקר
- לנתח את תפקוד חלבון הממברנה ברמה מולקולרית יחידה.
- לחקור את המוליכות וההתנהגות ההובלה של תעלות בודדות.
- לפתח בדיקות יעילות לסינון חלבון הממברנה.
שיטות ששימשו
- יצירת שבבי מערך ננו-נקבובית בייצור גדול.
- טכניקות איסוף נתונים פארלליות גבוהות.
- קריאה פלואורסצנטית של אירועי ההובלה.
- ניתוח התנהגות ההובלה של חלבונים עם מטען לא-אלקטרוגני.
תוצאות עיקריות
- רזולוציה מוצלחת של אירועי הובלה של חלבון יחיד.
- תובנות שהושגו לגבי דינמיקת ההובלה של חלבוני הממברנה.
- הוכחת פארלליזם גבוה באיסוף הנתונים.
- יישומים פוטנציאליים בפיתוח ספריות יעילות לחלבוני ממברנה.
מסקנות
- פלטפורמת שבב הננו-נקבובית היא כלי רב עוצמה לניתוח חלבון הממברנה.
- היא מאפשרת גילויים חדשים במנגנוני ההובלה של הממברנה.
- שיטה זו יכולה לקדם באופן משמעותי את תחום מחקר חלבון הממברנה.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
High-throughput, single-protein resolution analysis of membrane transporters addresses a critical bottleneck in early drug discovery, especially for non-electrogenic substrates. This nanopore chip platform enables robust, quantitative interrogation of transporter function, supporting predictive confidence and mechanistic de-risking at the target validation stage. Its scalability and automation-ready design position it as a strategic asset for portfolio triage and lead prioritization in membrane protein drug discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct measurement of single transporter activity, clarifying mechanistic hypotheses for membrane protein targets.
- Supports functional validation of transporters implicated in disease-relevant pathways.
- Facilitates biological de-risking by distinguishing between single- and multi-channel events.
- Provides quantitative data to inform predictive confidence and target selection decisions.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, reproducible assay conditions using SOP-driven chip preparation and readout.
- Enables high-content screening with automated, parallelized data acquisition across multiple chips.
- Supports multiplexed, multi-spectral fluorescent readouts for unbiased event classification and reduced false positives.
- Prepares validated biological systems for downstream compound screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns transporter function assays with disease-relevant systems by enabling functional reconstitution of diverse membrane proteins.
- Provides continuity from early discovery through preclinical validation by supporting scalable, quantitative transport measurements.
- Reduces translational risk by enabling mechanistic insights into transporter-mediated substrate flux.
Pipeline & Workflow Integration
This nanopore chip system integrates at the interface of target validation, assay development, and early screening, bridging discovery biology with translational research for membrane transporter targets.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and mechanistic de-risking by resolving single-protein transport events.
- Screening: Provides assay readiness and reproducibility through automated, parallelized workflows and quantitative outputs.
- Analytics: Enables real-time, multi-spectral fluorescence measurements for robust event discrimination and data quality.
- Translational Research: Facilitates continuity by accommodating functionally reconstituted transporters relevant to disease models.
- Enterprise Reuse: Offers a modular, scalable platform adaptable to a wide range of membrane protein targets and substrates.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in transporter target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and reproducible workflows for high-throughput membrane protein analysis.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by enabling robust early-stage data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of transporter-targeted programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in membrane protein reconstitution and fluorescence-based assay design.
- Needs access to automated inverted fluorescence microscopy and compatible analytical software.
- Demands cross-team standardization of SOPs for chip preparation and data analysis.
- Adaptable to a broad range of membrane proteins, provided a suitable fluorescent readout is established.
- Practical limitations include the need for non-electrogenic substrate detection via fluorescence.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:16
Bio-chip Overview
2:53
Preparation of Large Unilamellar Vesicles (LUVs)
4:45
Protein Reconstitution
6:14
Bio-chip Holder Preparation for the Translocation Assay
8:29
The Translocation Assay
9:47
Results: Quality Control Tests and Experimental Manipulations
11:28
Conclusion
