תחבורת ממברנה תהליכים נותחה על ידי מערכת שבב nanopore מקבילה מאוד ברזולוצית חלבון יחידה

המטרה הכללית של פלטפורמה זו המבוססת על שבב בעל ננו-מבנה היא לנתח את תפקוד חלבון ממברנה ברמה המולקולרית הבודדת באופן מקבילי גבוה. הודות ליכולתה להבחין בין חלבונים בודדים, ניתן להשיג תובנות חדשות לגבי הובלה וזרימה בממברנה. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום חלבוני הממברנה, כגון המוליכות או התנהגות ההובלה של תעלות או נשאים בודדים, ובמיוחד כאלו עם מטען שאינו אלקטרוגני.

היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא המקביליות הגבוהה הנובעת מעיצוב שבב בעל מבנה ננומטרי, הכולל מאות אלפי ננו-נקבים (nanopores) וקריאה פלואורסצנטית של אירועי הובלה. השפעותיה של טכניקה זו משתרעות על יצירת המבחנים (assays) הטובים ביותר של ספריות יעילות עבור חלבוני ממברנה, מכיוון שהפלטפורמה מבוססת השבב מאפשרת תיעוד הובלה אוטומטי ומקבילי מאוד.

באופן כללי, אנשים שאינם מכירים שיטה זו ילמדו במהירות כיצד להשתמש בטכניקה המוצגת. המטרה הייתה תמיד ליצור בדיקה ידידותית למשתמש, כדי שכל מי שמעוניין יוכל לאמץ אותה. בדיקה זו להעברה דרך ממברנה עושה שימוש בכיסוי סיליקון על מבודד (silicon on insulated wafer), שתוכנן באמצעות תהליך של חריטה יונית תגובתית (reaction ion etching).

מכל פרוסה (wafer) מיוצרים כ-1,000 שבבי בדיקה. כל שבב מכיל 250,000 מיקרו-חלליים. חלליים אלו נסגרים על ידי שכבות ליפיד דו-שכבתיות המכילות את חלבוני התובלה הנבדקים.

הממברנה מהווה את הממשק של החיישן. בתחילה, חומרים פלואורסצנטיים מוגבלים לצד אחד של השכבה הליפידית הכפולה, המתאימה לחלק הפנימי של הליפוזומים מהם היא מורכבת. ניתן לגשת לכל חלל באמצעות קריאת פלואורסצנציה רב-ספקטרלית.

שכבה עליונה אטoma חוסמת את אותי הפלואורסצנציה ממאתר התמיכה, ובכך הופכת את הביו-צ'יפ לתואם למיקרוסקופי פלואורסצנציה הפוכים. באמצעות מיקרוסקופיית כוח אטומי, נמדדו פתחי הנקבים המסודרים באופן אחיד וחספוס פני השטח של שכבת הסיליקון-די-אוקסיד ב-3.6 nanometers, ערך אופטימלי עבור היתוך וזיקולות. מיקרוסקופיה אלקטרונית סורקת מראה חתך רוחב דרך nanopore, המאפשר גישה לחללי הפמטוליטר בתוך שבב הסיליקון.

סרטון זה מציג את הכנת הפרוטאו-ליפוזומים, את הכנת השבבים עבור הבדיקה ואת ביצוע הבדיקה הבסיסי. חברו בקבוק בעגול בתחתית שטוף אתנול למאדה סיבובי. ייבשו את שכבת הליפידים במשך 40 דקות בלחץ של 300 millibar, בטמפרטורת אמבט מים של 30 degrees Celsius ובמהירות סיבוב מקסימלית כדי ליצור שכבת ליפידים הומוגנית על דופן הזכוכית של הבקבוק.

לאחר מכן, בעזרת משאבת ואקום גבוה, ייבשו את שכבת הליפידים למשך 30 דקות נוספות בטמפרטורת החדר. בשלב הבא, הוסיפו לבקבוק חמישה מיליליטר של בופר ושמונה כדוריות זכוכית שנטהו באתנול כדי להכין את הוזיקולות הרב-שכבתיות (multilamellar vesicles). חברו את הבקבוק למאדה הסיבובי והסובבו ללא ואקום בטמפרטורה של 50 °C במהירות מקסימלית.

לאחר 45 דקות, התמיסה תיראה חלבית, ללא שכבת ליפידים שרידית על הדפנות. העבירו את הבקבוק תחת גז אינרטי לאמבט אולטרסוני, ובצעו סוניקציה למשך ארבע דקות בטמפרטורת החדר. הסוניקציה מפרקת את הליפוזומים והופכת אותם לחד-שכבתיים (unilamellar).

כעת, חלק את תמיסת ה-LUV למנובות של מילליטר אחד, ובצע חמישה מחזורי הקפאה והפשרה באמצעות חנקן נוזלי ואמבט מים בטמפרטורה של 40 degrees Celsius. פעולה זו מובילה לפריצה, ארגון מחדש וצמיחה של הליפוזומים. בשלב ההקפאה האחרון, אחסן את כל הדגימות בטמפרטורה של minus 80 degrees Celsius.

לפני שחזור של מנה (aliquot) של LUV, בצעו אקסטרוזיה לליפוזומים על ידי העברת המנה דרך ממбраנת סינון פוליקרבונט של 400 nanometer כ-17 פעמים, באמצעות מיני-אקסטרודר. לאחר מכן, destabilize את ה-LUVs על ידי הוספת 4%Triton X-100 בריכוז של 0.25% בתמיסה. דגרו את התערובת למשך חמש דקות בטמפרטורה של 50 degrees Celsius.

כעת, ערבבו חלק אחד של MscL מטוהר ומו модиפיקציה עם 20 חלקים של ליפוזומים רוויים בדטרגנט, והמשיכו בדגירה למשך 30 דקות. לאחר הדגירה, קחו מנה של 100 µL והוסיפו נפח אחד של קלקין 30 mM. דגרו תערובת זו למשך חמש דקות בטמפרטורה של 50 °C.

כעת, הסירו את הדטרגנט מהדגימה שעברה טיפול בcalcine ומהדגימה שלא טופלה. הוסיפו bio-beads רטובים בבופר Tris לכל אחת מהן, והדגירו אותן למשך לילה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס על פלטה מסתובבת. לפני הניסוי, בדקו את התכשיר באמצעות בדיקת פעילות (activity assay).

ראשית, ערבבו בסיס אלסטומר אל תוך חומר ההקשחה, וייבשו את התערובת לחלוטין עד להשלמת התהליך. יש להשתמש בדבק בתוך 30 דקות מרגע הגעתו למצב מוכן. בינתיים, תוך נקיטת אמצעי זהירות, נקו זכוכית כיסוי באמצעות חמישה מיליליטר של כלורופורם, שיוinje ממזרק זכוכית, והניחו לשקופית להתייבש.

כעת, באמצעות פפט של 10 µL, הניחו את הדבק שהוכן על זכוכית הכיסוי. לאחר מכן, הסירו בזהירות שבב מלוח השבבים בעזרת פינצטה עדינה. הניחו את השבב על הדבק כאשר הצד המצופה פונה כלפי מעלה, והצמידו אותו בעדינות לשקף כדי לפזר את הדבק באופן אחיד.

אל תאפשרו לבועות אוויר להילכד למטה, או לכל חומר דביק להגיע למעלה אל השבב. כמו כן, בצעו את ההרכבה כך שהיא תתאים למחזיק השקופיות בעל שמונה התאים. כעת ייבשו את ההרכבות במשך שעתיים בטמפרטורה של 65 °C במייבש ארון.

בהמשך, הסירו את השכבה המגנה מהשבבים באמצעות מספר שטיפות בממס בטמפרטורה של 54 °C. ראשית, הניחו את השבבים המורכבים במחזיק שקופיות. לאחר מכן, הדגרימו אותם בשלושה רחצה של ממס למשך 10 דקות כל אחת.

איזופרופנול, אצטון ואיזופרופנול. לאחר מכן, שטפו את השבבים בזהירות וביסודיות במים אולטרה-טהורים. השלימו את התהליך על ידי ייבוש השבבים תחת זרם עדין של גז חנקן.

כעת, הכינו שקף דביק בעל שמונה בארות והניחו אותו הפוך על סביבת העבודה. לאחר מכן, הרימו בזהירות והצמידו את שקפי הכיסוי אל השקף הדביק, כאשר השבבים פונים כלפי הבארות. המתינו מספר דקות להתרחעות המבנה לפני שתמשיכו.

לפני השלישי עם בדיקת התעתוק (translocation assay), שטפו היטב את מכלול השבב, כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב, וסיימו ברחצץ של Tris buffer. לאחר מכן, החליפו את תמיסת הרחצץ ב-DOPEd Tris buffer, המכיל חמישה מילימולר calcium chloride ומיקרומולר אחד של צבע Oy647. לאחר מכן, הוסיפו פרוטאו ליפוזומים לתא השבב עד לריכוז סופי של מיליגרם אחד למילילטר, והמתינו שעה אחת.

לאחר שעה, שטפו את השבבים ארבע פעמים עם 400 µL של באפר Tris נטול סידן. כעת, הוסיפו לכל באר את הצבע המבוקר עד לריכוז של 5 µM, והמשיכו בבדיקה. לאחר מכן, התקינו את מחזיק השבבים על מיקרוסקופ פלואורסצנציה (epifluorescence), והתמקדו בשולי שבב הננו-נקבים כדי לאתר את המיקרו-חללים.

לאחר שהמיקרו-חלליים (microcavities) נמצאים במיקוד, סרקו את מערך הננו-נקבים כדי למצוא אזור המציג את יחס התקרה הגבוה ביותר. פרטים נוספים מופיעים בפרוטוקול הכתוב. ליפוזומים הוכנו ונבדקו מבחינת התפלגות הגודל והפיזור שלהם.

הליפוזומים שהוכנו היו גדולים יותר מקוטר הנקב של הבדיקה, דבר שהוא חיוני. ליפוזומים בעלי פיזור צר (Monodispersed) הם רצויים אף הם. לפני הניסוי, נבדק חלבון ה-MscL המודף בהכנת הליפוזומים באמצעות בדיקת fluorescence dequenching.

היחס של ליפוזומים המכילים MscL מושף פעיל היה הולם כדי להמשיך בניסוי התעתקה. על גבי הביו-צ'יפ, נצפתה התעתקה של מומס של מטרה פלואורסצנטית דרך תעלת ה-MscL המושפה. המודולטור הכימי, MTSET, שימש לפתיחת תעלות ה-MscL ההנדסיות באמצעות דחייה אלקטרוסטטית.

נוטררה הירידה העוקבת בפלואורסצנציה בתוך חלל החלל. תהליך זה הוכח כבעל הדירות גבוהה, עם אירועי שחרור (efflux) עקביים מאוד. עקומות השחרור שהתקבלו התקבצו לשתי אוכלוסיות נפרדות, המתאימות לאירועי תעתוק של תעלה בודדת או של מספר תעלות.

המערכת הייתה מסוגלת לעקוב אחרי עד שלושה צבעים פלואורסצנטיים ייחודיים בניתוח בזמן אמת. הדבר מאפשר הבחנה מדויקת בין תוצאות חיוביות, אירועי efflux מונו-אקספוננציאליים, קינטיקה מורכבת, חדירות ליפידים וקרעים של ממבס. לאחר רכישת המיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו בשלבים עוקבים, דהיינו: הכנת השבב, הכנת הדגימה, דימוי וניתוח, ובכך להפוך את הפרוטוקול כולו למודולרי.