כימות תוחלת חיים של חוליות
בעלי חיים רבים מפסיקים באופן טבעי לגדול עם הגעתם לבגרות, ולאחר מכן הם עוברים הזדקנות או "הזדקנות" עד למות. משך הזמן בין לידתו של אורגניזם למוות נקרא ת…
ניסויי כימות תוחלת חיים מאפשרים למדענים לבחון את ההשפעות הגנטיות והסביבתיות על תוחלת החיים של האורגניזם. אורגניזמים מודל חסרי חוליות, כגון זבוב הפירות Drosophila melanogaster ואת תולעים עגולות Caenorhabditis elegans, הוכיחו מאוד שימושי בהקשר זה. על ידי ביצוע ניסויים המודדים ומתמרנים את תוחלת החיים באורגניזמים אלה, מדענים החלו להבין את הגורמים המשפיעים על תהליך ההזדקנות.
בסרטון זה תלמדו על כמה עקרונות מאחורי תוחלת החיים וההזדקנות, פרוטוקולים בסיסיים למדידת תוחלת החיים בתולעת ובזבוב הפירות, ודרכים שבהן ניסויים אלה מיושמים.
לפני שמסתכלים על ההליכים הניסיוניים למדידת תוחלת החיים, חשוב להבין תחילה מהו תוחלת חיים והזדקנות.
תוחלת החיים היא כמות הזמן שאורגניזם חי ומתפקד, בין לידה למוות. אורגניזמים מסוימים, כמו צמחים רבים, עשויים תיאורטית לחיות לנצח. בינתיים, רוב בעלי החיים יפסיקו באופן טבעי לגדול, אפילו בתנאים אידיאליים, ולאחר מכן הם יזדקנו או "סננסה" עד למות.
מדענים עדיין לא לגמרי מבינים למה אורגניזמים מזדקנים. גורמים מגוונים, כולל קרינה ונזקים כימיים מהסביבה, ותוצרי לוואי רעילים מהתהליכים המטבוליים שלנו, הוצעו כולם למלא תפקיד בהזדקנות.
כדי לחקור גורמים אלה, החוקרים מנצלים את זמני הדור הקצר של אורגניזמים מודל חסר חוליות, כגון תולעים וזבובים, המאפשרים למדענים להתבונן דורות רבים במשך ימים או שבועות, ולא חודשים, כמו במקרה של מודלים יונקים כגון עכברים. הם גם די נוחים למניפולציה גנטית, עם כלים זמינים רבים המאפשרים גנים ספציפיים להיות מופעל או כבוי בקלות כדי לבחון את ההשפעות שלהם על תהליך ההזדקנות.
כעת, לאחר שלמדנו מדוע מודלים של חוסר חוליות הם נוחים מאוד למחקרי הזדקנות, בואו נסתכל על האופן שבו ניסויים למדידת תוחלת חיים מבוצעים בתולעים. בקצרה, ניסויים אלה כוללים איסוף תולעי הורים, סנכרון גיל צאצאיהם, טיפול בתולעי זחל עם תרופה לעיכוב רבייה, ולבסוף העברת תולעים לבדיקת לוחות וספירת תולעים שחיות או חיות.
בתחילת ההליך, יש צורך להשיג מספר מספיק של בעלי חיים תואמי גיל על ידי סנכרון אצווה של תולעים לכל להטיל ביצים בו זמנית. כדי לעשות זאת, תולעים ראשונות נשארות על אותה צלחת תרבות במשך כשבוע, ומאפשר להם לצרוך את כל המזון הזמין, ובכך לגרום רעב. חלק מזחלי התולעים המורעבים ייכנסו למצב קשה ועצוב צמיחה בשם "דאואר". לאחר מכן, זחלי דאואר אלה מועברים לצלחת טרייה. בסביבה עשירה במזון זה, זחלי הדאואר יחזרו למחזור חייהם ויהפכו לצעירים בוגרים ברבייה.
לבסוף, לאחר יומיים תולעים בוגרות אלה מועברות על צלחת טרייה אחרת ומותר להטיל ביצים עד 24 שעות. לאחר מספר מספיק של ביצים נרכשים, המבוגרים מוסרים מהצלחת, וביצים הם דגירה ב 20 מעלות צלזיוס במשך 2-3 ימים כדי לאפשר את התולעים לבקוע ולגדול לשלב זחל L4.
כדי למדוד את תוחלת החיים של התולעת, זחלים אלה מועברים לצלחות המכילות את התרופה FUDR, אשר מדכאת רביית תולעים מבלי להשפיע על תוחלת החיים של מבוגרים. במהלך הניסוי, כדי לקבוע אם תולעים חיות או מתות, ניתן טפח על הלוח כדי לצפות בתנועת התולעת. עבור תולעים ישנות יותר, ייתכן שיהיה צורך לתדלק בעדינות את ראש התולעת כדי לעורר תגובה. הסר תולעים מתות ותיעד את מספר התולעים המתות והחיות. יש להעביר את בעלי החיים לצלחות טריות כל 2-3 ימים כדי למנוע רעב.
כעת, לאחר שהראינו לכם כימות תוחלת חיים בתולעים, בואו נבחן כיצד זה נעשה בזבובי פירות. בקצרה, ההליך כרוך לאפשר לנקבות להטיל ביצים בכלוב מיוחד, לאסוף ביצים, לאפשר לזחלים להתפתח לזבובים, למיין זבובים על בסיס מין, ולבסוף לספור זבובים מתים המופיעים לאורך זמן.
כדי להשיג זבובים מותאמי גיל, זבובים בוגרים ממוקמים בכלוב איסוף ביצים, המכיל צלחות מיץ פירות-אגר מפוספס עם משחת שמרים. הביצים שנאספו נשטפות, מונחות בבקבוקי גדילה של זחלים, ודגרות במשך כ -10 ימים כדי שהזבובים יתפתחו. זבובים בוגרים בני יום אחד מועברים לבקבוקי מזון למבוגרים ודגרה במשך יומיים כדי לאפשר להם להגיע לבגרות מינית.
לאחר מכן נאספים זבובים אלה, מתרדמים וממוינים לזכרים ולנקבות כדי להימנע מבלבול מדידות תוחלת החיים עם גורמים ספציפיים למין. לאחר מכן, זבובים חד-מיניים ממוקמים בבקבוקוני גדילה. כל יומיים, זבובים צריכים להיות "הפך" לתוך בקבוקונים חדשים עם מזון טרי. זבובים מתים מקבלים ציון על ידי ספירת אלה שנותרו בחקירה הישנה, כמו גם אלה שנפלו לתוך המכבל החדש.
כעת, לאחר שלמדתם את הפרוטוקולים הבסיסיים למדידת תוחלת חיים במודלים לא חוליתיים, בואו נבחן כיצד מדענים מתאימים את הטכניקות האלה לחקר הביולוגיה של ההזדקנות ואריכות הימים.
חוקרים חוקרים את ההשפעות של גורמים שונים, כגון טמפרטורה ותרופות, על תוחלת החיים. במחקר מסוים זה, מדענים תרבם תולעים במדיה נוזלית ב 96-היטב לוחות microtiter, כך ההשפעות של חומרים מרובים ותנאי גדילה ניתן לבדוק בבת אחת. הם מצאו כי, למשל, גידול התולעים ב 25°C, ולא 20°C, ירידה תוחלת החיים של התולעת, כמו גם ריכוזים גבוהים של התרופה נוגדת דיכאון Mirtazepine.
ניתן לשלב צילומים של תוחלת חיים גם עם טכניקות כגון הפרעות RNA, או RNAi, כדי לזהות גנים המשפיעים על הישרדות בעלי החיים. RNAi היא טכניקה ניסיונית רבת עוצמה המשתמשת ב- RNAs קצרים כדי להקטין, או "נוקאאוט", את רמת הביטוי של גן יעד. כאן, מדענים טיפלו בתולעים עם RNAi נגד הגן bec-1, ואז הדביקו אותם בחיידקים הפתוגניים סלמונלה וביצעו בדיקת הישרדות. תולעים עם 7-1 שהופל הראו ירידה ניכרת בתוחלת החיים בהשוואה לתולעים שבהן הגן מתבטא כרגיל.
לבסוף, ניסויי כימות תוחלת חיים משמשים כדי להעריך את ההשפעה של תנאי גדילה שונים על אריכות הימים של בעלי חיים. בניסוי זה, מדענים תרביתי תולעים תואמות גיל על סדרה של לוחות עם כמות משתנה של מזון חיידקי. משטר גדילה זה, הנקרא הגבלה קלורית או תזונתית, נצפתה כהשפעה משמעותית על תוחלת החיים של התולעת.
הרגע צפית בסרטון של JoVE על כימות תוחלת חיים בדוגמניות לא חוליות. סרטון זה דן בכמה מהעקרונות שמאחורי ההזדקנות ותוחלת החיים, בפרוטוקולים למדידת תוחלת החיים בתולעים וזבובים, ובכמה יישומים של ניסויי מדידת תוחלת חיים. בסופו של דבר, התקווה היא שניסויים אלה יסייעו למדענים למצוא את הגורמים והמסלולים השולטים בהזדקנות, ויאפשרו פיתוח טיפולים לטיפול במחלות הקשורות לגיל, כמו אלצהיימר ומחלות לב וכלי דם. תודה שצפיתם!
ניסויי כימות תוחלת חיים מאפשרים למדענים לבחון את ההשפעות הגנטיות והסביבתיות על תוחלת החיים של האורגניזם. אורגניזמים מודל חסרי חוליות, כגון זבוב הפירות Drosophila melanogaster ואת תולעים עגולות Caenorhabditis elegans, הוכיחו מאוד שימושי בהקשר זה. על ידי ביצוע ניסויים המודדים ומתמרנים את תוחלת החיים באורגניזמים אלה, מדענים החלו להבין את הגורמים המשפיעים על תהליך ההזדקנות.
בסרטון זה תלמדו על כמה עקרונות מאחורי תוחלת החיים וההזדקנות, פרוטוקולים בסיסיים למדידת תוחלת החיים בתולעת ובזבוב הפירות, ודרכים שבהן ניסויים אלה מיושמים.
לפני שמסתכלים על ההליכים הניסיוניים למדידת תוחלת החיים, חשוב להבין תחילה מהו תוחלת חיים והזדקנות.
תוחלת החיים היא כמות הזמן שאורגניזם חי ומתפקד, בין לידה למוות. אורגניזמים מסוימים, כמו צמחים רבים, עשויים תיאורטית לחיות לנצח. בינתיים, רוב בעלי החיים יפסיקו באופן טבעי לגדול, אפילו בתנאים אידיאליים, ולאחר מכן הם יזדקנו או "סננסה" עד למות.
מדענים עדיין לא לגמרי מבינים למה אורגניזמים מזדקנים. גורמים מגוונים, כולל קרינה ונזקים כימיים מהסביבה, ותוצרי לוואי רעילים מהתהליכים המטבוליים שלנו, הוצעו כולם למלא תפקיד בהזדקנות.
כדי לחקור גורמים אלה, החוקרים מנצלים את זמני הדור הקצר של אורגניזמים מודל חסר חוליות, כגון תולעים וזבובים, המאפשרים למדענים להתבונן דורות רבים במשך ימים או שבועות, ולא חודשים, כמו במקרה של מודלים יונקים כגון עכברים. הם גם די נוחים למניפולציה גנטית, עם כלים זמינים רבים המאפשרים גנים ספציפיים להיות מופעל או כבוי בקלות כדי לבחון את ההשפעות שלהם על תהליך ההזדקנות.
כעת, לאחר שלמדנו מדוע מודלים של חוסר חוליות הם נוחים מאוד למחקרי הזדקנות, בואו נסתכל על האופן שבו ניסויים למדידת תוחלת חיים מבוצעים בתולעים. בקצרה, ניסויים אלה כוללים איסוף תולעי הורים, סנכרון גיל צאצאיהם, טיפול בתולעי זחל עם תרופה לעיכוב רבייה, ולבסוף העברת תולעים לבדיקת לוחות וספירת תולעים שחיות או חיות.
בתחילת ההליך, יש צורך להשיג מספר מספיק של בעלי חיים תואמי גיל על ידי סנכרון אצווה של תולעים לכל להטיל ביצים בו זמנית. כדי לעשות זאת, תולעים ראשונות נשארות על אותה צלחת תרבות במשך כשבוע, ומאפשר להם לצרוך את כל המזון הזמין, ובכך לגרום רעב. חלק מזחלי התולעים המורעבים ייכנסו למצב קשה ועצוב צמיחה בשם "דאואר". לאחר מכן, זחלי דאואר אלה מועברים לצלחת טרייה. בסביבה עשירה במזון זה, זחלי הדאואר יחזרו למחזור חייהם ויהפכו לצעירים בוגרים ברבייה.
לבסוף, לאחר יומיים תולעים בוגרות אלה מועברות על צלחת טרייה אחרת ומותר להטיל ביצים עד 24 שעות. לאחר מספר מספיק של ביצים נרכשים, המבוגרים מוסרים מהצלחת, וביצים הם דגירה ב 20 מעלות צלזיוס במשך 2-3 ימים כדי לאפשר את התולעים לבקוע ולגדול לשלב זחל L4.
כדי למדוד את תוחלת החיים של התולעת, זחלים אלה מועברים לצלחות המכילות את התרופה FUDR, אשר מדכאת רביית תולעים מבלי להשפיע על תוחלת החיים של מבוגרים. במהלך הניסוי, כדי לקבוע אם תולעים חיות או מתות, ניתן טפח על הלוח כדי לצפות בתנועת התולעת. עבור תולעים ישנות יותר, ייתכן שיהיה צורך לתדלק בעדינות את ראש התולעת כדי לעורר תגובה. הסר תולעים מתות ותיעד את מספר התולעים המתות והחיות. יש להעביר את בעלי החיים לצלחות טריות כל 2-3 ימים כדי למנוע רעב.
כעת, לאחר שהראינו לכם כימות תוחלת חיים בתולעים, בואו נבחן כיצד זה נעשה בזבובי פירות. בקצרה, ההליך כרוך לאפשר לנקבות להטיל ביצים בכלוב מיוחד, לאסוף ביצים, לאפשר לזחלים להתפתח לזבובים, למיין זבובים על בסיס מין, ולבסוף לספור זבובים מתים המופיעים לאורך זמן.
כדי להשיג זבובים מותאמי גיל, זבובים בוגרים ממוקמים בכלוב איסוף ביצים, המכיל צלחות מיץ פירות-אגר מפוספס עם משחת שמרים. הביצים שנאספו נשטפות, מונחות בבקבוקי גדילה של זחלים, ודגרות במשך כ -10 ימים כדי שהזבובים יתפתחו. זבובים בוגרים בני יום אחד מועברים לבקבוקי מזון למבוגרים ודגרה במשך יומיים כדי לאפשר להם להגיע לבגרות מינית.
לאחר מכן נאספים זבובים אלה, מתרדמים וממוינים לזכרים ולנקבות כדי להימנע מבלבול מדידות תוחלת החיים עם גורמים ספציפיים למין. לאחר מכן, זבובים חד-מיניים ממוקמים בבקבוקוני גדילה. כל יומיים, זבובים צריכים להיות "הפך" לתוך בקבוקונים חדשים עם מזון טרי. זבובים מתים מקבלים ציון על ידי ספירת אלה שנותרו בחקירה הישנה, כמו גם אלה שנפלו לתוך המכבל החדש.
כעת, לאחר שלמדתם את הפרוטוקולים הבסיסיים למדידת תוחלת חיים במודלים לא חוליתיים, בואו נבחן כיצד מדענים מתאימים את הטכניקות האלה לחקר הביולוגיה של ההזדקנות ואריכות הימים.
חוקרים חוקרים את ההשפעות של גורמים שונים, כגון טמפרטורה ותרופות, על תוחלת החיים. במחקר מסוים זה, מדענים תרבם תולעים במדיה נוזלית ב 96-היטב לוחות microtiter, כך ההשפעות של חומרים מרובים ותנאי גדילה ניתן לבדוק בבת אחת. הם מצאו כי, למשל, גידול התולעים ב 25°C, ולא 20°C, ירידה תוחלת החיים של התולעת, כמו גם ריכוזים גבוהים של התרופה נוגדת דיכאון Mirtazepine.
ניתן לשלב צילומים של תוחלת חיים גם עם טכניקות כגון הפרעות RNA, או RNAi, כדי לזהות גנים המשפיעים על הישרדות בעלי החיים. RNAi היא טכניקה ניסיונית רבת עוצמה המשתמשת ב- RNAs קצרים כדי להקטין, או "נוקאאוט", את רמת הביטוי של גן יעד. כאן, מדענים טיפלו בתולעים עם RNAi נגד הגן bec-1, ואז הדביקו אותם בחיידקים הפתוגניים סלמונלה וביצעו בדיקת הישרדות. תולעים עם 7-1 שהופל הראו ירידה ניכרת בתוחלת החיים בהשוואה לתולעים שבהן הגן מתבטא כרגיל.
לבסוף, ניסויי כימות תוחלת חיים משמשים כדי להעריך את ההשפעה של תנאי גדילה שונים על אריכות הימים של בעלי חיים. בניסוי זה, מדענים תרביתי תולעים תואמות גיל על סדרה של לוחות עם כמות משתנה של מזון חיידקי. משטר גדילה זה, הנקרא הגבלה קלורית או תזונתית, נצפתה כהשפעה משמעותית על תוחלת החיים של התולעת.
הרגע צפית בסרטון של JoVE על כימות תוחלת חיים בדוגמניות לא חוליות. סרטון זה דן בכמה מהעקרונות שמאחורי ההזדקנות ותוחלת החיים, בפרוטוקולים למדידת תוחלת החיים בתולעים וזבובים, ובכמה יישומים של ניסויי מדידת תוחלת חיים. בסופו של דבר, התקווה היא שניסויים אלה יסייעו למדענים למצוא את הגורמים והמסלולים השולטים בהזדקנות, ויאפשרו פיתוח טיפולים לטיפול במחלות הקשורות לגיל, כמו אלצהיימר ומחלות לב וכלי דם. תודה שצפיתם!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: Why are fruit flies and roundworms used to study aging and lifespan?
Invertebrate model organisms like Drosophila melanogaster and Caenorhabditis elegans have short generation times, allowing scientists to observe multiple generations over days or weeks rather than months. They are also highly amenable to genetic manipulation with tools that enable specific genes to be turned on or off easily, making them ideal for examining genetic and environmental influences on aging.
Q2: What is the dauer stage and why is it important in worm lifespan experiments?
Dauer is a hardy, growth-arrested state that worm larvae enter when starved. To synchronize age-matched worms for lifespan studies, researchers induce dauer by starving worms on a culture plate for approximately one week. When transferred to food-rich environments, dauer larvae resume their life cycle and become reproductively mature, allowing scientists to obtain cohorts of uniformly aged animals for consistent experimental measurements.
Q3: How does FUDR treatment support lifespan measurement in worms?
FUDR is a drug that suppresses worm reproduction without affecting adult lifespan, making it essential for accurate lifespan quantification. By preventing reproduction, FUDR eliminates confounding variables from offspring and allows researchers to focus solely on measuring the survival of individual worms over time without interference from progeny.
Q4: What steps are involved in preparing age-matched fruit flies for lifespan studies?
Adult flies are placed in an egg collection cage with fruit juice-agar plates and yeast paste. Collected eggs are washed and incubated for about 10 days to develop into flies. One-day-old adults are transferred to food bottles for two days to reach sexual maturity, then anaesthetized and sorted by sex to avoid confounding lifespan measurements with sex-specific factors.
Q5: How can RNAi be combined with lifespan assays to study aging?
RNA interference, or RNAi, uses short RNAs to decrease the expression level of target genes. Scientists can treat worms with RNAi against specific genes, then perform survival assays to observe how gene knockdown affects lifespan. This technique helps identify genes that influence animal survival and aging processes by comparing lifespan in knockdown organisms versus controls with normal gene expression.
Q6: What environmental factors have been shown to influence invertebrate lifespan?
Temperature, drugs, pathogens, and diet significantly affect lifespan in invertebrate models. For example, growing worms at 25°C rather than 20°C decreased lifespan, as did high concentrations of the antidepressant Mirtazepine. Caloric or dietary restriction has also been observed to have significant effects on worm lifespan, demonstrating how growth conditions directly impact longevity.
Q7: How are high-throughput lifespan experiments conducted in invertebrates?
Researchers culture worms in liquid media in 96-well microtiter plates to test multiple substances and growth conditions simultaneously. This approach allows scientists to screen the effects of various drugs, environmental factors, and genetic modifications on lifespan in parallel. The data generated helps identify pathways controlling aging and supports the development of therapies for age-related diseases like Alzheimer's and cardiovascular disease.