דור והתרבות של דם תולדה תאי אנדותל מאדם דם היקפי

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לייצר באופן אמין תאי אנדותל צמיחת דם מדם היקפי אנושי. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה של כלי הדם, כגון כיצד תפקוד לקוי של תאי אנדותל תורם למחלות לב וכלי דם כולל יתר לחץ דם עורקי ריאתי או מחלת פון וילברנד. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מייצרת באופן עקבי אוכלוסייה יציבה של תאי אנדותל צמיחת דם מנפח קטן של דם היקפי בוגר.

כדי להתחיל בהליך זה. עבור כל תורם, הוסף שלושה מיליליטר נתרן ציטראט לכל אחד משני צינורות הצנטריפוגה החרוטיים של 50 מיליליטר. לאחר מכן הוסף 30 מיליליטר מהדם שנאסף לכל צינור.

הפוך בעדינות את הצינורות פעמיים-שלוש לערבוב. לאחר מכן, יש לדלל 60 מיליליטר דם עם DPBS ביחס של אחד לאחד להטות את הצינור המכיל את שיפוע הצפיפות. מדיום צנטריפוגה בזווית של 20 מעלות עם משטח העבודה באמצעות עזר פיפטה ופיפטה סרולוגית של 25 מיליליטר.

שכבה איטית של 21 מיליליטר דם מדולל על גבי המדיום. לאחר מכן, צנטריפוגה את הדגימות ב-400 פעמים G למשך 35 דקות בטמפרטורת החדר עם המאיץ והניתוק במהלך הצנטריפוגה תיקון תמיסת קולגן ב-50 מיקרוגרם למיליליטר על ידי דילול מלאי. סוג קולגן אחד ב-10 מיליליטר של 0.02 חומצה אצטית מולרית סטרילית.

יש לסנן את תרחיף הקולגן לפני השימוש. לאחר מכן, הוסף 7.5 מיליליטר תמיסת קולגן לבקבוק תרבית תאים T 75. הניחו לבקבוק להיות מצופה למשך שעה בטמפרטורת החדר.

לאחר שעה של ציפוי, שאפו את תמיסת הקולגן ופיפטה 10 מיליליטר DPBS בבקבוק כדי לשטוף את שאריות החומצה האצטית. שאפו מה-DPBS וחזרו על הכביסה פעם נוספת. לאחר מכן הוסף חמישה מיליליטר של מדיום דור BOEC לבקבוק כדי למנוע מציפוי הקולגן להתייבש עד שתרחיף התא מוכן לציפוי.

לאחר צנטריפוגת שיפוע הצפיפות, אסוף בזהירות את שכבת מעיל האפי באמצעות פיפטת העברה סטרילית מפלסטיק והימנע מהעברת מדיום שיפוע הצפיפות. אוסף מעיל באפי אמור להניב כ-20 מיליליטר של תרחיף סל ופלזמה מכל צינור. לאחר מכן, יש לדלל את מתלה התא החד-גרעיני ב-DPBS ביחס של אחד לאחד ולהפוך לערבוב ואז צנטריפוגה בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות ב-300 פעמים G כאשר הבלם והמאיץ מכוונים למקסימום לאחר צנטריפוגה, שואבים את הסופרנטנט ומשעים מחדש את התאים על ידי הוספת מיליליטר אחד של מדיום ייצור BOEC לכל כדור ופיפטינג למעלה ולמטה שוב ושוב מושכים את כל מתלי התאים יחד וממלאים את נפח כולל עד 10 מיליליטר עם המדיום הנותר.

כדי לקבל הערכה של מספר התאים הכולל, יש לדלל 10 מיקרוליטר של תרחיף התאים ב-490 מיקרוליטר של תמיסת טורק כדי להניח את כדוריות הדם האדומות. לאחר מכן ספרו דגימה של 10 מיקרוליטר של תרחיף התאים המדולל באמצעות ציטומטר המו. לאחר מכן צלחת את תרחיף התא לבקבוק T 75 יחיד מצופה קולגן.

למעלה את הנפח הבינוני עד 15 מיליליטר לבקבוק ותרבות. התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באטמוספירה לחה המכילה 5% CO2. כעת החלף את המדיום כל יומיים על ידי הוספת 15 מיליליטר של דור BOEC טרי, מדיום לתרבית לסופי שבוע, ניתן לדחות את החלפת המדיום לשלושה ימים.

עקוב אחר בקבוק התרבית של BOEC ביום השביעי עד ה-14 להופעת מושבות צמיחה. זהה את המושבות כקבוצות מעגליות של תאים המציגים את המורפולוגיה הקלאסית של אבן האנדותל. לאחר זיהוי מושבה או מספר מושבות בבקבוק, המשיכו עם שינויים בינוניים ואפשרו למושבות לגדול לכ-1000 עד 2000 תאים למושבה.

לפני האריזה, קבע את מספר התא לכל מושבה באמצעות הערכה חזותית גסה. לאחר מכן העבירו את התאים על ידי שטיפת הצלוחיות פעמיים עם 10 מיליליטר DPBS. הוסיפו חמישה מיליליטר של אחד x tripsin EDTA ודגרו באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות.

לאחר חמש דקות, נטרלו את הטריפסין עם 10 מיליליטר של מדיום המכיל FBS והכניסו את התאים לתלייה עם פיפטינג חוזר ונשנה. לאחר מכן צנטריפוגה את המתלה ב -300 פעמים G למשך חמש דקות. השעו מחדש את התאים ב-15 מיליליטר של דור BOEC טרי, מדיום, וצלחו את כל תרחיף התא לבקבוק T 75 חדש ללא ציפוי קולגן. נמשך.

המדיום משתנה עד שהתאים מתכנסים ומעברים. התאים כפי שתוארו קודם לכן להמשך לוחית האריזה. לא פחות מ-750,000 תאים לבקבוק T 75 מכיוון שצפיפות תאים נמוכה עלולה לגרום ל-BO eecs להפסיק להתרבות.

בהליך זה, טריפסין מסתכל על התאים ומצנטריפוגה אותם ב-300 פעמים G למשך חמש דקות. לאחר מכן, שאפו את החטיפה והשעו מחדש את התאים ב -10 מיליליטר מדיום. אסוף דגימה של 10 מיקרוליטר של תרחיף התאים ובצע ספירת תאים ידנית.

לאחר מכן, צנטריפוגה שוב את הדגימה והשעו אותה מחדש במדיום שימור קריו קר כקרח בקצב כפול 10 לששת התאים למיליליטר. הוסף 0.5 מיליליטר של תרחיף תאים לכל בקבוקון והנח את הבקבוקונים בכלי שימור קריו איזופרופנול קר כקרח. לאחר מכן מניחים את הכלי במקפיא שלילי של 80 מעלות צלזיוס למשך שעתיים לפחות לפני ההעברה לחנקן נוזלי.

כדי להפשיר את התאים, הוסף 10 מיליליטר של מדיום חם מראש לצינור צנטריפוגה חרוטי של 15 מיליליטר. הסר את התאים מחנקן נוזלי והפשיר באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס בתסיסה עדינה עד שנותר רק גביש קרח קטן בבקבוקון. לאחר מכן הוסף את תכולת הבקבוקון טיפה לצינור הצנטריפוגה החרוטי וסובב מטה ב -300 פעמים G למשך חמש דקות.

לאחר מכן, שאפו את הסופרנטנט והחייאה השעו את גלולת התא. הוסף את מתלה התא לבקבוק T 75 ומלא את הבינוני עד 15 מיליליטר. בתמונה זו, מושבות הצמיחה, המופיעות כאוספים של תאים דמויי אנדותל מסודרות בשכבה חד-שכבתית מרוצפת ומתפשטות באופן רדיאלי החוצה מנקודה מרכזית המקיפה את מושבות הצמיחה הן התאים המונוציטים הדבקים המהווים את הרוב המכריע של התאים בתרבויות מוקדמות לאחר האריזה, ה-bo Oecs המתרבים מאוד משתלטים על התרבית כאשר התאים המונוציטים שאינם מתרבים מתים או לא מצליחים להתחבר מחדש.

להלן תמונה אימונופלואורסצנטית מייצגת של אימונוס Bo Oecs צבוע בנוגדנים כנגד סמן פני השטח של תאי האנדותל CD 1 44. ובתמונה זו היו B oecs כתם חיסוני עם נוגדן כנגד פקטור הגליקופרוטאין בדם פון וילברנד. לאחר המאסטר, טכניקה זו יכולה להיעשות תוך פחות משעתיים אם היא מבוצעת כראוי.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לעבד את דגימות הדם בהקדם האפשרי ורצוי תוך שעתיים מרגע האיסוף. בעקבות הליך זה, ניתן להשתמש בתאים כדי לחקור את תפקוד תאי האנדותל בבריאות ובחולי, או לתכנת אותם מחדש לתאי גזע חזקים מושרים לשימוש במחקרי התמיינות, מידול מחלות או טיפול תאי לאחר פיתוחו. טכניקה זו סללה לנו את הדרך לחקור את ההשפעה של מוטציות בקולטן החלבון המורפוגנטי של העצם מסוג 2 על הפתוגנזה של יתר לחץ דם עורקי ריאתי הן בתאי אנדותל צמיחת דם של המטופלים והן ב-IPSC גוזר תאי שריר מצב רוח.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לייצר ולאפיין תאי אנדותל יציבים של צמיחת דם מנפח קטן של דם היקפי. אל תשכח שעבודה עם דם אנושי לא מוקרן עלולה להיות מסוכנת ביותר ותמיד יש ללבוש ציוד מגן אישי, כולל כפפות וחלוק מעבדה בעת ביצוע הליך זה.