בידוד והלחנת ניתוח של צמח מונומרים פוליאסטר שומנים ציפורן

צמחים כליים נסמכים על שכבות חוץ-תאיות המתפקדות כמחסומים עמידים למים בין רקמות הצמח לסביבה החיצונית. שכבות תאים ליפופיליות אלו, יחד עם מבנים קשורים, מגבילות זיהומים פתוגניים ומסדירות את ההובלה הפסיבית של גזים, מים וחומרים מומסים אל תוך רקמות הצמח ומחוצה להן. מחסום חשוב אחד הוא הקוטיקולה של הצמח, מבנה מורכב הייחודי לצמחים.

קוטין הוא פוליאסטר ליפי של גליקרול שאינו ממיס, המהווה את המטריקס המבני של הקוטיקולה והוא קשור לשעווה הניתנת להמיסה בממסים. כאן אנו מציגים טכניקה מהימנה לבדיקת הרכבן של פוליאסטרים ליפיים ורקמות צמחים דלות ליפידים. בפרוטוקול זה, דגימות של רקמה שלמה נאספות, עוברות הומוגניזציה וניקויי ליפידים יסודיים באמצעות סדרה של מיצויים בממסים כדי להסיר ליפידים ממיסים, כולל שעוות קוטיקולריות ואפיקוטיקולריות.

טריגליצרול בליפידים של ממברנה. הדגימות עוברות דה-פולימריזציה למונומרים ליפידיים מרכיבים באמצעות מתילליזה המזורזת על ידי נתרשיום מתוקסיד. מתווספים ריאגנטים לסימולציה כדי לבצע טרנס-מתילציה של קבוצות הידרוקסיל לנגזרות trimethyl cell התואמות, המתאימות לניתוח בכרומטוגרפיה גזית.

שאריות נגזרות מועברות לאחר מכן לבקבוקי GC ונטענות למכשיר A-G-C-M-S לצורך אנליזה, המייצרת כרומטוגרמה המאפיינת את ההרכב המונומרי של פוליאסטרים ביולוגיים. אלו נמצאים בדגימות שחולצו. כאן אנו אוספים דגימות של עלים שלמים מצמחי Arabidopsis ANA בוגרים, מסוג בר (wild type) ושני מוטנטים.

לצורך מיצוי ואנליזה, הוסיפו 0.5 גרם רקמה למבחנות זכוכית נקיות שנשטפו מראש בכלורופורם. הכניסו 100 מיליליטר של איזופרופנול לבקעי and הוסיפו butylated hydroxy toluene לריכוז של 0.01% BHT הוא נוגש חמצון המתווסף כדי להגן על קשרים כפולים ועל חומצות שומן מחמצון במהלך מיצויים בממס. חממו מראש את הממס באמבט מים לטמפרטורה של כ-85 מעלות.

הוסיפו 25 מיליליטר של איזופרופנול מחומם לכל גרם של רקמת צמחים והדגירו את הדגימות ב-LOC בחום ב-85 מעלות למשך 15 דקות. המתינו לקירור המבחנות לטמפרטורת החדר, תוך שימוש במיגון לאוזניים ולעיניים. לבסוף, גרסו את הדגימות באמצעות הומוגניзатор כדי להגיע לפיזור הומוגני, אטמו את המבחנות עם פקקי הברגה ונערעו ב-100 RPM למשך דקה עד שתיים, ואז סבבו את הדגימות בצנטריפוגה ב-800 G למשך 10 דקות.

כדי להפריד את הפאזה האורגנית מהחומרים בעלי הצפיפות הגבוהה יותר הדחוסים במשקע, הסירו והשליכו את הנוזל העליון בעזרת פיפטת פסטור או פרופנט. היזהרו לא להפריע למשקע. הוסיפו נפח שווה של isopropanol בטמפרטורת החדר ונערה את הדגימות למשך הלילה.

סובב את הדגימות בצנטריפוגה במהירות של 100 RPM והסר את העליון. הוסף 25 מיליליטר של תמיסת כלורופורם ומתנול ביחס של שניים לאחד, לכל גרם רקמה, ונער את הדגימות למשך הלילה; סובב בצנטריפוגה והסר את הפאזה האורגנית. לאחר מכן, חזור על תהליך זה תוך שימוש בתמיסת כלורופורם ומתנול ביחס של אחד לשניים.

ייבשו את המשקע למשך לילה והעבירו את המבחנות ממסרק המנוי למייבש בוואקום המכיל סידן סולפט אנהידרי כדי לייבש את הדגימות במשך שלושה ימים לפחות או עד להשגת מסה קבועה. לאחר ייבוש יסודי, הדגימות מוכנות לדפלורציה באמצעות מתאלייזיס המזורז על ידי נתרן מתוקסיד. הוסיפו למבחנות המכילות רקמות יבשות שני תמיסות של סטנדרטים פנימיים באמצעות מזרק זכוכית, החל מ-25 µL של methyl HETO decanoate, ו-25 µL של omega pentec and lactone.

כדי להתחיל פולימריזציה עמוקה, הוסיפו 0.9 milliliters של methyl acetate לדגימות, ולאחר מכן 1.5 milliliters של זרז sodium meth oxide ו-3.6 milliliters של methanol. דגרו את הדגימות בטמפרטורה של 60 degrees למשך שעתיים עם vortexing תקופתי בתוך מערכת התגובה; פוליאסטרים של ליפידים מגיבים עם אניוני meth oxide נוקלאופיליים ליצירת תוואים טטרהדרליים לא יציבים, המתפרקים בקלות לחומצות שומן, אסטרים של מתיל ואניוני oxide. אניוני oxide אלו הם בסיסים מצומדים ומגיבים עם methanol כדי להחזיר את אניוני meth IDE הפעילים של הזרז, ובכך שומרים על תגובות פולימריזציה עמוקות נוספות.

אם קיים מים במערכת, הם יגיבו עם נתרת מתיל (sodium meth oxide) ליצירת נתרן הידרוקסיד. בסיס חזק זה הופך פוליאסטרים באופן בלתי הפיך לחומצות שומן חופשיות בלתי רצויות. כדי למנוע הידרוליזה, מתווסף מתיל אצטט להסרת כל נתרן הידרוקסיד הנמצא במערכת.

יש להמתין עד שהמבחנות יתקררו לטמפרטורת החדר. לאחר הדגירה, יש לחלץ את המונומרים על ידי הוספה של 10 milliliters של methylene dichloride לכל מבחנה. לאחר מכן, יש להוסיף 1.5 milliliters של glacial acidic acid כדי להחמיץ את הדגימות.

מלאו את המבחנות בתמיסת נתרן כלוריד בריכוז 0.5 מולרי, ערבבו היטב במערבל vortex וסובבו בצנטריפוגה למשך דקות. בצעו את הפעולה תחת מ hút (מכססת עשן). העבירו בזהירות את השכבה האורגנית התחתונה באמצעות פיפט למבחנות נקיות ששוטפו מראש, בגודל בינוני.

שטפו שוב את הדגימות בתמיסת מלח, ערבבו במכשיר וורטקס וסובבו בצנטריפוגה למשך 10 דקות. הסירו את הפאזה המימית העליונה, ולאחר מכן הוסיפו לדגימות נתרת סולפט אניהידרית כחומר מייבש להסרת שאריות מים שנותרו בתמיסה, ערבבו את הדגימות בוורטקס, סובבו בצנטריפוגה, והעבירו את הממיס למבחנות קטנות ונקיות שנשטפו מראש; העמיסו את המבחנות למאייד חנקן כדי לאדות את הממיס ולקבל שאריות יבשות של מונומרים. באמצעות מזרק זכוכית, הוסיפו 100 µL של purine ו-100 µL של B-S-T-F-A כדי להמיר קבוצות הידרוקסיל לנגזרות trimethyl volatile.

דגרו את הדגימות ב-100 °C למשך 10 דקות. הניחו למבחנות להתקרר ולאידוי תחת גז חנקן. הוסיפו 500 µL של תמיסת HEPTANE וטולואן ביחס של אחד לאחד כדי להמיס מחדש את השאריות, ולאחר מכן סבבו אותן קצרה בצנטריפוגה.

העבירו את דגימות הנגזרות למבחנות GC המכילות אינסרטים של 400 microliter. סגרו את המבחנות והכניסו את הדגימות לגז כרומטוגרף, המזריק אותן לעמודה קפילרית לצורך אנליזה; התמליטים מזוהים לאחר מכן על ידי ספקטרומטר מסות ארבע-קוטירי (quadrupole). הנתונים הגולמיים שנרכשו באמצעות אנליזת GCMS מעובדים ומוצגים ככרומטוגרמה עבור כל דגימה.

מונומרים בודדים התואמים לשיאים כרומטוגרפיים שונים מזוהים באמצעות ספקטרומי המסה הספציפיים שלהם. בזמני השהייה ב-GC, כמויות המונומרים הבודדים נקבעות באמצעות שיטת כימות של סטנדרט פנימי, המאפשרת ביצוע השוואות של שכיחות והרכב המונומרים בין דגימות. מוצגים כאן כרומטוגרמות חופפות מאנליזות מייצגות של מונומרים, ששוחררו מרקמת עלה של מורד (abscess) של ארנבת התואמת לסוג הפרא ושני אללים מוטנטיים של גן המקודד לאנזים P450 monooxygenase, המדגימות פרופילים מונומריים מובחנים.

התוצאות שלנו מדגימות הבדלים משמעותיים בשפע של שלושה מונומרים עיקריים של קוטין בצמחי arabidopsis מסוג הפרא וצמחים מוטנטיים. פרוטוקול זה הוא שיטה חסונה לבדיקת ההרכב של פוליאסטרים ליפידיים בצמחים באמצעות בידוד, זיהוי וכמתית של המונומרים המרכיבים אותם. ההליך הוא בר-הרחבה וניתן להתאימו בקלות לעיבוד של כמויות גדולות של חומרים צמחיים שונים, כולל שורשים, זרעים, עלים ורקמות שלמות אחרות.

טכניקה זו ישימה למחקרים הבוחנים את הבקרה על הביוסינתזה ואת ההפצה של קוטין וסוברין בצמחים גבוהים.