Name: בידוד והלחנת ניתוח של צמח מונומרים פוליאסטר שומנים ציפורן (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: למדו שיטה לבידוד וניתוח מונומרים פוליאסטר שומנים מצמחים באמצעות GC-MS. הטכניקה מאפשרת חקר ביוסינתזה של קוטין וסוברין בצמחים וניתוח הרכב ליפידים בדגימות עלים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענק מחקר למדעי הטבע וההנדסה (NSERC)-USRA ל-S.J., ועל ידי מענק NSERC-Discovery ל-I.M. אנו מודים לריצ'רד בורגו, מייגן ריינס ואמנדה פלוק על הסיוע הטכני. זרעים של מוטציות att1-1 ו-att1-2 סופקו באדיבות על ידי ד"ר ג'יאן-מין ג'ואו, המכון לגנטיקה וביולוגיה התפתחותית, בייג'ינג, סין.

הערה: פרוטוקול זה הותאם מאל Bonaventure et. (2004), מולינה et al. (2006), לי ואח &#39;. (2013) 7,10,11. צעדים 1-5 מסוכמים באיור 1. Delipidation 1. רקמות הערה: תמיד לשטוף את כל כלי הזכוכית וכובעים עם כלורופורם, ומאפשר לי יבש מתחת למכסת מנוע קטר, לפני השימוש. זהירות: בצע הומוגניזציה רקמות וכל שלבי העברת הממס תחת מכסה המנוע קטר; תמיד לובשים מעיל, כפפות מעבדה ומשקפי בטיחות סנסציה כדי למנוע מגע ישיר עם כימיקלים וכדי להגן על הדגימות מזיהום. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אמבטיה מחממים מים ולחסום חום עד 85 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוקל כ 0.5 גרם של כל דגימת עלה לתוך צינורות 20 מ&quot;מ-שקל מראש x 125 מ&quot;מ מבחן זכוכית עם polytetrafluoroethylene פקקי הברגה (PTFE) -faced. כולל ארבעה חזרות לדגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום 2-propanol בארלנמייר (כ 125 מיליליטר, 25 מיליליטר לגרם של SAMPle). להוסיף 2,6-די-טרט-בוטיל-4-methylphenol (הידוע גם בhydroxytoluene butylated, BHT) לריכוז סופי של 0.01% (w / v). הערה: הוסף BHT מ% 5 (w / v) פתרון מניות במתנול (BHT מסייע למזער חמצון של חומצות שומן בלתי רוויות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון מחממים 2-propanol עד 85 מעלות צלזיוס באמבט מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 12 מיליליטר ממס 2-propanol חם על צינור אחד מדגם וחום במשך 15 דקות על 85 מעלות צלזיוס בגוש חום. צעד זה מנטרל lipases שעשוי להשתחרר מהתאים שיבשו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו צינורות להתקרר לטמפרטורת חדר ולטחון רקמה ביסודיות עם homogenizer עד השעיה הומוגנית מתקבלת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הדגימות בייקר מסלולית וללחוץ במשך 1-2 שעות ב 100 סל&quot;ד וטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה למשך 10 דקות ב 800 XG ולהשליך supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף נפח שווה של 2-propanol ולנער במשך 12 שעות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה למשך 10 דקות ב 800 XG ולהשליך supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 12 מיליליטר CH3 Cl: CH 3 OH (2: 1, נ / V) לשאריות (25 מיליליטר לגרם של מדגם) ולנער לילה ב 100 סל&quot;ד וטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה למשך 10 דקות ב 800 XG ולהשליך supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 12 מיליליטר CHCl 3: CH 3 OH (1: 2, נ / V) לשאריות ולנער לילה ב 100 סל&quot;ד וטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה למשך 10 דקות ב 800 XG ולהסיר ממס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו דגימות יבשות מתחת למכסת מנוע קטר הלילה בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האוויר יבש השאריות ולאחר מכן למקם בייבוש ואקום מעל CaCl נטול מים 2 או 4 קאסו עד שהגיע למשקל קבוע (3-5 ימים). </li></ol> 2. Depolymerization: Methanolysis עם נתרן methoxide (איור 2) זהירות: בצע צעדים 2.3-2.4, 2.7-2.8, 2.10-2.11, 2.13-2.15 ו2.17-2.18 מתחת למכסת מנוע קטר; תמיד לובשים מעיל, כפפות מעבדה ומשקפי בטיחות סנסציה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גוש חום מחממים עד 60 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול מבחנות המכילות שאריות יבשות (חשובות לחישובים נוספים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף תקנים פנימיים על צינור אחד: 25 heptadecanoate ωL תיל (1 מ&quot;ג / מיליליטר מניות) וω-pentadecalactone 25 μl (1 מ&quot;ג / מיליליטר מניות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 0.9 מיליליטר אצטט מתיל, 1.5 methoxide מיליליטר נתרן, ושל 3.6 מיליליטר מתנול על צינור אחד וכובעם. לחלופין, להכין תערובת תגובה עם שלושת ריאגנטים אלה ולהוסיף aliquots 6 מ&quot;ל לכל דגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות חום למשך 2 שעות ב 60 ° C ומערבולת מעת לעת במרווחים של 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו דגימות להתקרר לטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 10 מיליליטר של dichloride תילן (CH 2 Cl 2) ושל 1.5 מיליליטר של חומצה אצטית קרחונית כדי לחלץ את אסטרים מתיל חומצת שומן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף תמיסת מלח (0.5 M NaCl) למלא כל צינור וכובע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות מערבולת דקות 1 ו צנטריפוגות במשך 10 דקות ב 800 x גרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את השלב האורגני (נמוך) כדי לנקות צינורות בגודל בינוניים (16 x 125 מבחנות זכוכית מ&quot;מ עם פוליtetrafluoroethylene כובע בורג -faced (PTFE)). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף תמיסת מלח (0.5 M NaCl) למלא כל צינור וכובע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות מערבולת דקות 1 ו צנטריפוגות במשך 10 דקות ב 800 x גרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר שלב המימי (עליון) וחזור על שלבים 2.11-2.12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את כל השלב המימי (העליון). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף סולפט נטול מים נתרן (Na 2 SO 4) לממס, מכסה את הצינורות, ומערבולת דקות 1; דגימות יכולות עכשיו להיות שנותרו עד היום הבא. בניתן להשאיר דגימות שלב זה הלילה מתחת למכסת מנוע קטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה למשך 2 דקות ב 800 XG קומפקטי מלח Na 2 SO 4 בתחתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את השלב האורגני לצינור חד פעמי זכוכית קטנה (13 x 100 מבחנות זכוכית מ&quot;מ עם polytetrafluoroethylene (כובע בורג -faced PTFE)). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתאדות הממס ליובש תחת חנקן ולהמשיך לשלב derivatization. אם לא מעובד באופן מיידי, החנות התאדתה דגימות ב -20 ° C (דגימות יכולות להיותמאוחסן הסימפונית לפני שלב האידוי). </li></ol> 3. הכנה של נגזרים עבור גז כרומטוגרפיה זהירות: בצע את השלבים 3.1.2 ו3.1.5 - 3.1.8 מתחת למכסת מנוע קטר; תמיד לובשים מעיל, כפפות מעבדה ומשקפי בטיחות סנסציה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נגזרי Trimethylsilyl <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גוש חום מחממים עד 100 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף של פירידין 100 μl ושל BSTFA (N, O Bis-trimethylsilyl-trifluoroacetamide) 100 μl לכל צינור ומכסה אותם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות חום של 100 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו דגימות להתקרר לטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתאדות דגימות תחת חנקן בטמפרטורת חדר. הימנעו הפעלת חום לדגימות, מונומרים תנודתיות מאוד בשלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl של 1: 1 (V / V) heptane: טולואן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות מערבולת דקות 1 ו צנטריפוגות במשך 2 דקות ב 800 x גרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף דוגמאות לבקבוקוני GC ולהמשיך GC ניתוח / MS. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אצטילנגזרים הערה: acetylation, לשנות צעדים 3.1.1-3.1.3 לעיל כדלקמן (לא מוצג בוידאו); צעדים 3.1.4-3.1.8 זהים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גוש חום מחממים עד 60 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף של פירידין 100 μl ושל אנהידריד אצטית 100 μl (AC 2 O) לצינורות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות חום שעה 1 ב 60 ° C. </li></ol></li></ol> 4. GC / MS ניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בעמודת נימים HP-5 (30 0.25 מ&quot;מ x 0.25 עובי MX מיקרומטר סרט) או (כלומר., Diphenyl 5%, polysiloxane דימתיל 95%) שווה ערך. תכנית GC עם זרימת ספק הליום גז שנקבעה ברמה של 1.5 מיליליטר / דקה וטמפרטורת תנור המתוכנת 150-300 מעלות צלזיוס ב 3 מעלות צלזיוס / דקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בהזרקת פיצול (01:10 יחס פיצול) וספקטרומטר מסה מוגדר לסריקת מצב על 40-600 האמו (יינון השפעת אלקטרונים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור טבלת רצף כוללים ממס (ריק), WT ומשכפל מוטציה, כל שיטת ניתוח cutin באמצעות מצויינים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממס עומסובקבוקוני מדגם על הקרוסלה, להוסיף הקסאן לבקבוקוני שטיפה-מזרק בautosampler במידת צורך, ולהתחיל את הרצף. לאחר הרצף הושלם, סך עקבות chromatogram היון זמינות עבור כל הדגימות. </li></ol> ניתוח נתונים 5. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזהות מונומרים פוליאסטר שומנים על ידי השוואת הספקטרום ההמוני של כל שיא לספקטרום מסה שפורסם או על ידי חיפוש בספרייה מסחרית אם זמין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשיא כל שזוהה בchromatogram הנוכחי היון הכולל, להשתמש הפעמים השמירה שלהם כדי למצוא את האזורים על שולחן תוצאות האינטגרציה מGC התוכנה / MS (איור משלימה 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל מונומר (עמודות א.ב.), להוסיף את אזור הערכים נמצאו בטבלת האינטגרציה (איור 1 נוסף, עמודת D) לעמודה המתאימה לכל לשכפל מדגם בטבלת Excel של מונומרים (קובץ נוסף 2, טורי CF), שהוא גיליון אלקטרוני לכמת ארבידופסיסנגזרי cutin TMSi. השתמש בקובץ נוסף 3 אם נגזרי acetylated מוכנים במקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף את תחומי הסטנדרטים הפנימיים (IS) לעמודות (HK). לאלו מונומרים שאינם derivatized, אסטרים מתיל כלומר חומצות שומן (ג&#39;יימס), ואסטרים דימתיל חומצת dicarboxylic (DCA DMEs), להשתמש 17: 0 תהילה (IS1) כלכימות (תאים מוצלים סגולים בטבלת מונומר; נוסף קבצי 2/3). למונומרים hydroxylated, כוללים אלכוהול ראשוני, חומצת ferulic וחומצות ω-הידרוקסי, להשתמש 15: 0 FAME 15 הידרוקסי-(IS2) כבחירה לכימות מתחם (תאים-shadded ירוקים בטבלת מונומר; משלימה קבצי 2/3) . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף משקל עלה יבש לכל לשכפל לעמודות AX-תואר ראשון (קובץ נוסף 2) או AQ-AT (קובץ נוסף 3); לחלופין, לסרוק עלים לחשב שטח פנים ולהוסיף ערכי שטח לשולחן מונומר להביע המון מונומר ליחידהשטח פנים. </li></ol>

<ol><li>Kolattukudy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biopolyester+membranes+of+plants%3A+cutin+and+suberin%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Biopolyester membranes of plants: cutin and suberin.</a> Science. 208 (4447), 990-1000 (1980).</li>
<li>Kolattukudy, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyesters+in+higher+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Biochem.+Eng.+Biot%22%5BJournal%5D)">Polyesters in higher plants.</a> Adv. Biochem. Eng. Biot. 71, 1-49 (2001).</li>
<li>Yeats, T. H., Rose, J. K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+formation+and+function+of+plant+cuticles%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">The formation and function of plant cuticles.</a> Plant Physiol. 163 (1), 5-20 (2013).</li>
<li>Pollard, M., Beisson, F., Li, Y., Ohlrogge, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+lipid+barriers%3A+biosynthesis+of+cutin+and+suberin%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Building lipid barriers: biosynthesis of cutin and suberin.</a> Trends Plant Sci. 13 (5), 236-246 (2008).</li>
<li>Beisson, F., Li-Beisson, Y., Pollard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solving+the+puzzles+of+cutin+and+suberin+polymer+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Solving the puzzles of cutin and suberin polymer biosynthesis.</a> Curr. Opin. Plant Biol. 15 (3), 329-337 (2012).</li>
<li>Heredia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysical+and+biochemical+characteristics+of+cutin%2C+a+plant+barrier+biopolymer%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Biophysical and biochemical characteristics of cutin, a plant barrier biopolymer.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1620 (1-3), 1-7 (2003).</li>
<li>Bonaventure, G., Beisson, F., Ohlrogge, J., Pollard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+aliphatic+monomer+composition+of+polyesters+associated+with+Arabidopsis+epidermis%3A+occurrence+of+octadeca-cis-6%2C+cis-9-diene-1%2C+18-dioate+as+the+major+component%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Analysis of the aliphatic monomer composition of polyesters associated with Arabidopsis epidermis: occurrence of octadeca-cis-6, cis-9-diene-1, 18-dioate as the major component.</a> Plant J. 40 (6), 920-930 (2004).</li>
<li>Franke, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoplastic+polyesters+in+Arabidopsis+surface+tissues+-+A+typical+suberin+and+a+particular+cutin%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">Apoplastic polyesters in Arabidopsis surface tissues - A typical suberin and a particular cutin.</a> Phytochemistry. 66 (22), 2643-2658 (2005).</li>
<li>Vogg, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tomato+fruit+cuticular+waxes+and+their+effects+on+transpiration+barrier+properties%3A+functional+characterization+of+a+mutant+deficient+in+a+very-long-chain+fatty+acid+-ketoacyl-CoA+synthase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">Tomato fruit cuticular waxes and their effects on transpiration barrier properties: functional characterization of a mutant deficient in a very-long-chain fatty acid -ketoacyl-CoA synthase.</a> J. Exp. Bot. 55 (401), 1401-1410 (2004).</li>
<li>Molina, I., Bonaventure, G., Ohlrogge, J., Pollard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lipid+polyester+composition+of+Arabidopsis+thaliana+and+Brassica+napus+seeds%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">The lipid polyester composition of Arabidopsis thaliana and Brassica napus seeds.</a> Phytochemistry. 67 (23), 2597-2610 (2006).</li>
<li>Li-Beisson, Y., et al. Acyl-lipid metabolism. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLi-Beisson%2C+Y+%22The+Arabidopsis+Book%22">The Arabidopsis Book</a>. 11, e0161(2013).</li>
<li>Christie, W. W. Mass Spectrometry of Fatty Acid Derivatives. , LipidHome. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.lipidhome.co.uk/ms/masspec.html">http://www.lipidhome.co.uk/ms/masspec.html</a> (2015).</li>
<li>Molina, I., Ohlrogge, J. B., Pollard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deposition+and+localization+of+lipid+polyester+in+developing+seeds+of+Brassica+napus+and+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Deposition and localization of lipid polyester in developing seeds of Brassica napus and Arabidopsis thaliana.</a> Plant J. 53 (3), 437-449 (2008).</li>
<li>Xiao, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+CYP86A2+represses+Pseudomonas+syringae+type+III+genes+and+is+required+for+cuticle+development%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis CYP86A2 represses Pseudomonas syringae type III genes and is required for cuticle development.</a> EMBO J. 23 (14), 2903-2913 (2004).</li>
<li>Christie, W. W., Han, X. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChristie%2C+WW+%22Lipid+Analysis+-+Isolation%2C+Separation%2C+Identification+and+Lipidomic+Analysis%22">Lipid Analysis - Isolation, Separation, Identification and Lipidomic Analysis</a>. , 4th edition, Oily Press. Bridgwater, U.K. 446(2010).</li>
<li>Walton, T. J., Kolattukudy, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+the+structures+of+cutin+monomers+by+a+novel+depolymerization+procedure+and+combined+gas+chromatography+and+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Determination of the structures of cutin monomers by a novel depolymerization procedure and combined gas chromatography and mass spectrometry.</a> Biochemistry. 11 (10), 1885-1896 (1972).</li>
<li>Matzke, K., Riederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+into+the+chemical+constitution+of+cutins+and+suberins+from+Picea+abies+%28L.%29+Karst.%2C+Quercus+robur+L.%2C+and+Fagus+sylvatica+L%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">A comparative study into the chemical constitution of cutins and suberins from Picea abies (L.) Karst., Quercus robur L., and Fagus sylvatica L.</a> Planta. 185 (2), 233-245 (1991).</li>
<li>Riederer, M., Schönherr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+gas+chromatographic+analysis+of+methyl+esters+of+hydroxy+fatty+acids+derived+from+plant+cutin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr%22%5BJournal%5D)">Quantitative gas chromatographic analysis of methyl esters of hydroxy fatty acids derived from plant cutin.</a> J. Chromatogr. 360, 151-161 (1986).</li>
<li>Moire, L., Schmutz, A., Buchala, A., Yan, B., Stark, R., Ryser, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycerol+Is+a+Suberin+Monomer.+New+Experimental+Evidence+for+an+Old+Hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Glycerol Is a Suberin Monomer. New Experimental Evidence for an Old Hypothesis.</a> Plant Physiol. 119 (3), 1137-1146 (1999).</li>
<li>Graça, J., Schreiber, L., Rodrigues, J., Pereira, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycerol+and+glyceryl+esters+of+omega-hydroxyacids+in+cutins%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">Glycerol and glyceryl esters of omega-hydroxyacids in cutins.</a> Phytochemistry. 61 (2), 205-215 (2002).</li>
<li>Eglinton, G., Hunneman, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gas+chromatographic-mass+spectrometric+studies+of+long+chain+hydroxy+acids-I%3A+The+constituent+cutin+acids+of+apple+cuticle%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">Gas chromatographic-mass spectrometric studies of long chain hydroxy acids-I: The constituent cutin acids of apple cuticle.</a> Phytochemistry. 7 (2), 313-322 (1968).</li>
<li>Espelie, K. E., Köller, W., Kolattukudy, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((9%2C16-dihydroxy-10-oxo-hexadecanoic+acid%2C+a+novel+component+in+citrus+cutin%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Phys.+Lipids%22%5BJournal%5D)">9,16-dihydroxy-10-oxo-hexadecanoic acid, a novel component in citrus cutin.</a> Chem. Phys. Lipids. 32 (1), 13-26 (1983).</li>
<li>Holloway, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracuticular+lipids+of+spinach+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">Intracuticular lipids of spinach leaves.</a> Phytochemistry. 13 (10), 2201-2207 (1974).</li>
<li>Holloway, P. J., Deas, A. H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epoxyoctadecanoic+acids+in+plant+cutins+and+suberins%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">Epoxyoctadecanoic acids in plant cutins and suberins.</a> Phytochemistry. 12 (7), 1721-1735 (1973).</li>
<li>Holloway, P. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHolloway%2C+PJ+%22The+chemical+constitution+of+plant+cutins%22">The chemical constitution of plant cutins</a>. Cutler, D. F., Alvin, K. L., Price, C. E. , Academic Press. London. 45-85 (1982).</li>
<li>Croteau, R., Fagerson, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+constituent+cutin+acids+of+cranberry+cuticle%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">The constituent cutin acids of cranberry cuticle.</a> Phytochemistry. 11 (1), 353-363 (1972).</li>
</ol>

לא הוכרז על ניגוד עניינים.

שלא כמו biopolymers האחר כגון דנ&quot;א וחלבונים, השומנים פוליאסטר צמח אינו עשוי מתבנית. במקום זאת, יצירותיהם תלויות בספציפית של האנזימים הנמצאים ברקמות שהופכות את הפולימרים תאיים אלה. ככזה, אנליזות כימיות של מרכיב רכיבים קריטיים להבין הרכב פוליאסטר שומנים. שיטות כימיות לדבוק אג&quot;ח אסתר כוללות סבון, hydrogenolysis, transmethylation-זרז חומצה, ו- זרז בסיס transmethylation 2. לכל אחד מהם יתרונות וחסרונות. סבון מייצר חומצות שומן חופשיות הידרוקסי שיכול לעבור תגובות המשניות. Hydrogenolysis עם ליתיום אלומיניום הידריד (4 LiAlH) 16 שמש במשך ניתוח cutin 7. Hydrogenolysis מפחית פחמנים פונקציונליות לאלכוהול והמבנים המקוריים צריכים להסיק על ידי deuteriolysis עם deuteride אלומיניום ליתיום (LiAlD 4).חסרון של גישה זו הוא הדרישה של GC / MS ברזולוציה גבוהה כדי להשוות את מידת deuteriation של polyols השומן שהושג לעשות משימות של המבנים שלהם. transesterification זרז-חומצה עם trifluoride ורון methanolic (BF 3) כבר בשימוש תכוף בdepolymerizations cutin ושַׁעֲמָן 8,17,18, אבל יש מגיב חיי מדף מוגבלים ועשוי להציג את החפצים בשל תופעות תגובות 15. חומצה גופרתית methanolic גם תשואות אסטרים מתיל של מונומרים אבל עם פרופורציות גדולות יותר של חומצות שומן 2-הידרוקסי, אשר ככל הנראה לא רכיבי פוליאסטר השומנים נכונים, בהשוואה לשיטות אחרות 10. שיטת transesterification הזרז-NaOMe המתוארת בפרוטוקול זה מייצרת אסטרים מתיל חומצת השומן שderivatized על ידי silylation של קבוצות הידרוקסיל, מתן ספקטרום מסה אופייני לזיהוי, או על ידי acetylation לספק נגזרים יציבים יותר של קבוצות הידרוקסיל FOכימות r. חסרון אחד של שיטה זו הוא שהידרוליזה מתחרה עם transesterification כאשר המים נמצאים בתגובה. מים מגיבים עם NaOMe (הזרז) ומייצרים NaOH, אשר בתורו hydrolyses אסטרים מתיל חומצת שומן להניב חומצות חופשיות (איור 2 ד). זה צד תגובה רצויה משום ששתי פסגות תהיה נוכחת לכל חומצת שומן: תיל אסטר ונגזר אסתר TMSi, ובכך מסבכים את הניתוח. שימוש בחומרים כימיים נטול מים והוספה מתיל אצטט כשיתוף ממס להתחרות עם סבון הם צעדים חיוניים ובכך למנוע הידרוליזה (איור 2 ד). Cutin ושַׁעֲמָן מכילים בין גליצרול 1 ו -26% 4. עם זאת, מונומר זה לא יזוהה על ידי תנאי הניסוי מתוארים בפרוטוקול זה. גליצרול הוא הידרופילי מאוד, ובניגוד למונומרים התיל אסטר חומצת שומן, יבוטל במהלך שלבי ממס השטיפה מימיים. מגבלה זו גםpplies לשיטות אחרות cutin depolymerization, אבל גליצרול ניתן לקבוע בשכבה המימית המתקבלת לאחר transesterification באמצעות שיטה האנזימטית. לחלופין, ניתן לכמת באמצעות תנאים מתונים יותר (לדוגמא., 0.05 M NaOMe) ללא מיצוי במים נוסף כדי לזהות את כל מונומרים, כולל גליצרול 19,20 .Although שימושי לצורך כימות גליצרול, תנאים קלים בדרך כלל לתת depolymerization שלם של cutin ו שַׁעֲמָן. אם GC מצמידים את גלאי יינון להבה (FID) זמין, ניתן לנתח את כל משכפל במכשיר זה למטרות כמותי, אחרי פסגות של מדגם מייצג זוהו על ידי GC / MS. לחלופין, ניתן לזהות מונומרים בGC / עקבות FID אם ידועים מדדי שימורם. יש גלאי יינון הלהבה גבוהה במיוחד רגישות ומגוון רחב של מידתיות, שהוא קריטי לכימות של רכיבי מדגם גדולים והקטניםבריצות יחידה. בנוסף, הוא חזק וקל לתחזוקה ותפעול 15. הפרוטוקול המתואר מאפשר הבידוד, זיהוי, וכימות אמין ושחזור של מונומרים פוליאסטר שומנים צמחיים, המאפשר אפיון הכימי של מוטציות שונות בהרכב של מונומרים פוליאסטר שומנים אחד או יותר. ההליך הוא מדרגי, זה יכול להתאים בקלות לעבד כמויות קטנות וכמות גדולות של חומרים צמחיים שונים, כוללים שורשים, זרעים, עלים, גבעולים ופרחים. נתוני רפאים המוניים של מונומרים פוליאסטר שומנים ממינים רבים שפורסמו לדוגמא., 21-26 ומהווים משאבים יקרי ערך כדי לזהות מונומרים ידועים מתי התאמת פרוטוקול זה לרקמות ו / או מינים אחרים. שיטה זו ישימה לחקירות של ביוסינתזה, רגולציה, וההפצה של פוליאסטר שומנים בצמחים גבוהים יותר.

צמחים עילאיים להסתמך על שכבות תאיים המתפקדות כמחסומים עמידים למים בין רקמות צמח והסביבה החיצונית. המבנים הקשורים קיר תא lipophilic אלה מגבילים את הזיהום פתוגניים ולהסדיר את התחבורה הפסיבית של גזים, מים, וחומרים מומסים ובמתוך רקמות צמח 1. מחסומים כאלה הם ציפורן הצמח, מבנה synapomorphic ייחודי לצמחים 2, ומחסומי דיפוזיה המכיל שַׁעֲמָן שונים. הציפורן היא שכבת oleophilic המסונתזת על ידי תאי האפידרמיס וחייבת אותם באמצעות שכבת pectinaceous בצד תאי של דופן התא 3-5. זה סוגר את האיברים אוויריים העיקריים של צמחים גבוהים יותר, המתפקד כממשק חיוני בין רקמות צמח והסביבה. Cutin, המטריצה ​​המבנית של הציפורן, ושַׁעֲמָן שני פוליאסטר glycerolipid מסיס הקשורים שעוות ממס נשלף 2,4. l פולימרים אלהipids מורכב של נגזרי חומצת שומן רוויים ובלתי רוויים והם גם מבני ותפקודי דומים. עם זאת, הם נבדלים על ידי הבדלים אופייניים באתרי הרכב ותצהיר כימיים. שַׁעֲמָן הוא פוליאסטר אליפטי הממוקם בתוך קירות התא של רקמות פנימיות וחיצוניות מסוימות ויוצרות קיר המשני. רקמות Suberized כוללות periderms של שורשים, פקעות וקליפת עץ, endodermis שורש, שכבות מעיל זרע, ופצעים הגלידו 2. שלא כמו cutin, פוליאסטר שַׁעֲמָן בדרך כלל מכיל אלכוהול, רווי וחומצות dicarboxylic מונו-בלתי רווי, וחלק גדול ממונומרים מאוד ארוכת-שרשרת (C≥20). Cutin הוא פוליאסטר שומנים הנפוץ ביותר בצמחים עילאיים 6, והוא מורכב מגליצרול ונגזרי חומצת שומן interesterified C16-C18, כגון חומצות שומן-אפוקסי הידרוקסי הידרוקסי והוחלף 4. בעוד ההרכב של פולימרים cutinמשתנה בין מיני tracheophyte, מונומרים העיקריים השולט ביותר הם 10, 16-dihydroxy 16: 0,-9,10-אפוקסי 18-הידרוקסי 18: 0, ו9,10,18-trihydroxy 18: 0 חומצות שומן. מעניין לציין, עלה ארבידופסיס ונובע cutin מורכב בעיקר של 18: 2 חומצת dicarboxylic 7,8. שורש צמח גם להציג שונות ניכר בעובי, החל כמה ננומטרים לכמה מיקרומטרים 9. מאז בידוד ציפורן הוא צעד מייגע וגוזל זמן, במיוחד לעור קרני עלה דק מאוד כמו אלה של thaliana ארבידופסיס 8, שיטות העוקפות בידוד ציפורן פותחו ומאומתים 7,8. כאן, אנו מתארים פרוטוקול מפורט ללמוד הקומפוזיציה מונומר של cutin בעלי thaliana ארבידופסיס ידי methoxide נתרן (NaOMe) depolymerization -catalyzed וגז כרומטוגרפיה הבאה / ספקטרומטר מסה (GC / MS) ניתוח. פרוטוקול זה מציע שיטה חזקה למנסה לאמוד את שיתוףmposition של פוליאסטר שומנים צמח ברקמות delipidated כל, והותאם מפרוטוקולים שדווחו בעבר 7,10,11. דגימות רקמה שלמות הן ראשון הומוגני וממצה delipidated, הסרת שומני ממס לחילוץ כולל cuticular ושעוות epicuticular, שומני קרום, וtriacylglycerols. אז שאריות מועשרות קיר תא depolymerized למונומרים התיל אסטר המרכיבים אותן על ידי methanolysis-זרז methoxide נתרן. אסטרים מתיל חומצת שומן מופקים על החמצה, וderivatized להשיג נגזרי trimethylsilyl או אצטיל המקביל שלהם. שאריות derivatized תנודתיות מאוד, ויכולות להיות eluted מעמודת גז כרומטוגרפיה בטמפרטורה סבירה מבלי לשנות קונפורמציה המבנית שלהם במהלך ניתוח GC / MS.

<table><tbody><tr><td>כימיקלים</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-פרופנול</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BPA451-4</td><td>ממס להסרת שומנים</td></tr><tr><td>נתרן גופרתי נטול מים</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>S421500</td><td></td></tr><tr><td>אנהידריד</td><td>אצטי סיגמא אולדריץ'</td><td>320102</td><td>חומר נגזרת</td></tr><tr><td>BSTFA (N,O-bis(trimethylsilyl)-trifluoroacetamide)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15222</td><td>חומר נגזרת</td></tr><tr><td>בוטילאט הידרוקסיטולואן (BHT)</td> <td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>101162</td><td>נוגד חמצון</td></tr><tr><td>סידן כלורי, נטול מים</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>C614-3</td><td>חומר ייבוש</td></tr><tr><td>סידן סופלט, נטול מים (DRIERITE- 8 MESH עם מחוון)</td> <td>Acros Organics</td><td>219090020</td><td>חומר ייבוש</td></tr><tr><td>כלורופורם (טריכלורומתאן)</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>C6074</td><td>ממס אורגני</td></tr><tr><td>חומצה אצטית קרחונית</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2401212</td><td>חומר החמצה</td></tr> גז <tr><td>נושא הליום, נוזל אוויר דחוס</td><td></td><td>ALPHAGAZ1-UN1046</td><td>גז נשא, GC/MS</td></tr><tr><td>Heptane</td><td>Fisher Scientific</td><td>H3501</td><td>ממס אורגני</td></tr><tr><td>הקסנים</td><td>פישר מדעי</td><td>H3024</td><td>ממס אורגני</td></tr><tr><td>מתנול</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>A4124</td><td>ממס אורגני, טרנסמתילציה תגובתי</td></tr><tr><td>מתיל אצטט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>296996</td><td>ממס אורגני</td></tr><tr><td>מתיל הפטדקנואט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>H4515</td><td>תקן פנימי (מלאי 1 מ"ג/מ"ל)</td></tr> <tr><td>מתילן דיכלוריד (דיכלורומתאן)</td> <td>פישר סיינטיפיק</td><td>D374</td><td>חנקן ממס אורגני</td></tr>, <tr><td>דחוס</td><td>Air Liquide</td><td>ALPHAGAZ1-UN1044</td><td>גז נשא, GC-FID</td></tr><tr><td>Pentadecanolactone</td><td>Fluka</td><td>76530</td><td>תקן פנימי (1 מ"ג/מ"ל מלאי)</td></tr> <tr><td>Pyridine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270970</td><td>קו-ממס לנגזרת</td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358212</td><td>תמיסת מלח</td></tr><tr><td>נתרן מתוקסיד (25wt.%)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>156256</td><td>Nucleophile</td></tr><tr><td>Toluene</td><td>FIsher Scientific</td><td>T2904</td><td>Organic Solvent</td></tr><tr><td>Plant Growth Supplies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pro-Mix PGX</td><td>Premier Tech Horticulture Ltd</td><td></td><td>Pro-Mix PGX מומלץ לגידול צמחי Arabidopsis (Eddy, R. and Hahn, D.T., 2012,http://docs.lib.purdue.edu/pmag/2) Purdue Methods for Arabidopsis Growth.&nbsp;</td></tr><tr><td>כיפת לחות PermaNest&nbsp;</td><td>Grower's Solution, LLC, Cookeville, TN&nbsp;</td><td>GD2211-24</td><td></td></tr><tr><td>מגשי צמחים Perma-Nest (22x11 אינץ</td><td>')Grower's Solution, LLC, Cookeville, TN&nbsp;</td><td>לא ישים</td><td></td></tr><tr><td>עציצי חממה מרובעים, 3.5 אינץ '&nbsp;</td><td>Grower's Solution, LLC, Cookeville, TN&nbsp;</td><td>P86</td><td></td></tr><tr><td>דשן צמחי לשימוש כללי, Plant-Prod 20-20-20</td><td>Premier Tech Home and Garden In., ברנטפורד, ON</td> N <td>/ A</td><td></td></tr><tr><td>Glassware</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מבחנה מזכוכית 13 x 100 מ"מ עם מכסה בורג עם פני טפלון</td><td>Kimble Chase Life Science and Research Products LLC</td><td>45066A-13100</td><td></td></tr><tr><td>מבחנה מזכוכית 16 x 125 מ"מ עם מכסה</td> <td>בורג טפלוןKimble Chase Life Science and Research Products LLC</td><td>45066A-16125</td><td></td></tr><tr><td>מבחנות זכוכית 20 x 125 מ"מ עם מכסה בורג עם פני טפלון</td><td>Kimble Chase Life Science and Research Products LLC</td><td>45066A-20125</td><td></td></tr><tr><td>מכסי בקבוקון GC</td><td>National Scientific</td><td>C400051A</td><td></td></tr><tr><td>GC מיקרו-תוספות בקבוקון</td><td>National Scientific</td><td>C4011631</td><td></td></tr><tr><td>בקבוקוני GC</td> National <td>Scientific</td><td>C40001</td><td></td></tr><tr><td>חד פעמי פסטר</td><td>פישר מדעי</td><td>1367820B</td><td></td></tr><tr><td>צלוחיות</td><td>פישר</td> ציוד <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> מדעי <tr><td>אלגרה X15R צנטריפוגה</td><td>בקמן קולטר</td><td></td><td></td></tr><tr><td>איזון אנליטי</td><td>פישר</td> רקדנית בטן מדעית <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>ניתן להשתמש בשייקר למטרה זו אם רקדנית בטן אינה זמינה</td></tr><tr><td>DB-5 נימי GC עמודה</td><td>J& W Scientific, קליפורניה, ארה"ב; &nbsp;</td><td></td><td>30 מ' x 0.25 מ"מ x 0.25 &mu; m עובי סרט</td></tr><tr><td>מייבש Isotemp</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>202 אמבט מים</td><td>פישר מדעי</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ISQ LT ספקטרומטר מסה quadupole יחיד</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>בלוק חום</td><td>פישר מאייד</td> חנקן מדעי <td></td><td></td></tr><tr><td></td> פוליטרון הומוגנייזר בירקמן <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>עקבות 1300 כרומטוגרף גז</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>רגולטור דו-שלבי</td><td>Air Liquide</td><td>Q1-318B-580</td><td></td></tr><tr><td>מייבש ואקום</td><td>פישר מערבל מערבולת מדעי פישר סיינטיפיק</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

בידוד והלחנת ניתוח של צמח מונומרים פוליאסטר שומנים ציפורן

Isolation and Compositional Analysis of Plant Cuticle Lipid Polyester Monomers

צמחים יבשתיים מייצרים ביופוליאסטרים אליפטיים חוץ-תאיים המשנים את דפנות התאים של רקמות ספציפיות. תאי אפידרמיס מסנתזים קוטין, פוליאסטר של גליצרול וחומצות שומן שעברו שינוי המהווים את מסגרת הקוטיקולה המכסה את משטחי הצמח האוויריים. סוברין הוא פוליאסטר שומני קשור המופקד על דפנות התא של רקמות מסוימות, כולל אנדודרמיס השורש והפרידרם של פקעות, קליפת עצים ושורשים. פולימרים ליפידים אלה משתנים מאוד בהרכבם בין מיני צמחים, ולעתים קרובות נבדלים בין רקמות בתוך מין בודד. כאן, אנו מתארים פרוטוקול מפורט לחקר הרכב המונומר של קוטין בעלים של Arabidopsis thaliana על ידי דה-פולימריזציה מזורזת של נתרן מתוקסיד (NaOMe), נגזרת, וניתוח כרומטוגרפיה גזית-ספקטרומטריית מסה (GC/MS) לאחר מכן. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לחקור את המונומרים של פוליאסטרים בלתי מסיסים המבודדים מרקמות צמחיות שלמות שעברו שומן הנושאות קוטין או סוברין. ניתן ליישם את השיטה לא רק כדי לאפיין את הרכב פולימרי השומנים במינים שלא נותחו בעבר, אלא גם ככלי אנליטי בגישות גנטיות קדימה ואחורה להערכת תפקוד הגנים המועמדים.

הפרוטוקול המתואר בכתב היד הזה הוא להגדיר כדי לקבוע מונומרים פוליאסטר שומנים, צמצום התרומות של שומנים שאינם cutin 10 איור 1 מציג סקירה של assay, שלגמרי לוקח בין 8 (כלומר, cutin או שַׁעֲמָן.) -. 10 ימים (מקצירת רקמה ראשונית לקבלת נתונים GC), תלוי כמה זמן דגימות להתייבש. Methanolysis נבחר-זרז הבסיס (איור 2) השיטה לdepolymerize פוליאסטר קבלה תוקף בעבר לזרעי ארבידופסיס, המכילים שני cutin ושַׁעֲמָן. רקמות ראשונות הומוגני וממצות delipidated כדי להסיר שומני ממס שניתן להפיק. תשואת השאריות לאחר חילוץ, כאחוז ממשקל הטרי ראשוני, היא בדרך כלל 6% לא thaliana Col-0 עלים. שאריות מועשרות קיר תא מיובשות בייבוש ואקום ולאחר מכן depolymerized למונומרים התיל אסטר המרכיבים אותן על ידיזרז-בסיס transmethylation. דגירה של שעות נבחרה כזמן הקריטי הנדרש לdepolymerization והתאוששות של רכיבי פוליאסטר שומנים נכונים. פעמים דגירה כבר הביאו לעלייה בחומצות 2-הידרוקסי; אלה שעלולים לנבוע מsphingolipids קרום 10. Chromatogram טיפוסי אם cutin עלה סוג בר ארבידופסיס מוצג באיור 3, לנגזרי O -TMSi אתר (איור 3 א) ונגזרי -acetyl O (איור 3). שיא כל זוהה על ידי השוואה לספקטרום המוני מהספרות 7,8 ומאגר נתונים ציבורי 12 פרוטוקול וידאו .our מראה כיצד להכין נגזרי TMSi, אבל לחלופין ניתן acetylated דגימות לderivatize קבוצות הידרוקסיל. נגזרי Silylated טובים למטרות זיהוי משום שהם נותנים ספקטרום המוני אבחון. עם זאת, נגזרי acetylated הם יציבים יותר ואלטרנטיבה טובה לsilylationמונומרים פעם זוהו 10. (איור נוסף כדי לעזור ליישם פרוטוקול זה במעבדות שרק לי GC מצמידים את גלאי יינון להבה (FID), GC / FID עקבות מתאים לנגזרי acetylated של מונומרים cutin עלה WT ולסדרת הומולוג של סטנדרטים תיל אסטר חומצת שומן מוצג גם 4). שיטה זו היא איכותית ומזהה הבדלים כמותיים בין דגימות, ומכאן הערך שלה עבור ניתוח שעבר מוטציה. הכמויות של מונומרים פרט נקבעות תוך שימוש בשיטה סטנדרטית הפנימית של כימות, המאפשרת השוואות של שפע מונומר בין דגימות. יובהר, עם זאת, כי גודל השיא (סה&quot;כ ספירת יון) עלול שלא לשקף יחסים הטוחנות של מונומרים בפוליאסטר. אנו כוללים שולחנות עריכה של מונומרים לחשב כמויות מונומר בcutin עלה ארבידופסיס כאסטרים של חומצות שומן מתיל ונגזרי TMSi (קובץ נוסף 1), או אס<html> נגזרי Tyl (קובץ נוסף 2) של אלכוהול. לוחות אלה ייתכן שיהיו צורך מותאם אם דגימות שחולצו מאיברים שונים או מיני צמחים. ארבידופסיס תאליה na קולומביה כדוגמא, יש לנו ניתחתי (Col-0) עלים סוג בר ושני אללים null-המוטציה אפיינו בעבר את של גן CYP86A2 / ATT1, att1-1 (m-1) וatt1-2 (m-2 ) 13,14. monooxygenases ציטוכרום P450 של תת-משפחת CYP86A לקודד ω-oxydases המשוער ולהשתתף שבַׁעֲמָן וביוסינתזה מונומר cutin. התוצאות שלנו (איור 4) להפגין ירידה משמעותית בעומסים של שלושה מונומרים שומנים גדולים בעלי המוטציה בהשוואה לעלי WT. עולה בקנה אחד עם התפקוד של האנזים שחזה, 16: 0, 18: 2, 18 ו: 1 dicarboxylates הושפע במיוחד במוטציות att1. &quot;Src =&quot; / קבצים / ftp_upload / 53,386 / /&gt; 53386fig1.jpg &quot; איור 1. סקירה כללית של ניתוח פוליאסטר השומנים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/53386fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53386/53386fig2.jpg" /> איור 2. מנגנון של תגובת transmethylation זרז-NaOMe. אניוני methoxide nucleophilic לתקוף את הפחמן cabonyl של פוליאסטר שומנים כדי ליצור יציב tetrahedral ביניים (א), שמנתק קלות לאסטרים מתיל חומצת השומן ואניוני alkoxide (B). alkoxides אלה הם בסיסי המצומד, ומגיב עם מתנול, התחדשות אניוני methoxide catalytically הפעיל, ובכך לשמר את תגובות נוספות depolymerization (C). אם מים נמצאים במערכת, שהיא תגיב עם methoxide נתרן כדי ליצור סודיום הידרוקסיד, בסיס חזק שאופן בלתי הפיך hydrolyses אסטרים לייצר חומצות שומן חופשיות בלתי רצויות. מתיל אצטט נוסף כ-15 שיתוף הממס להסיר כמויות קטנות של נתרן הידרוקסידי בתוך המערכת (ד &#39;). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/53386fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53386/53386fig3.jpg" /> איור 3. Chromatogram הנציג הכולל יון של מונומרים cutin עלה thaliana ארבידופסיס wild-type. (א) אתר O -trimethylsilyl (TMSi) ו- (ב) נגזרי הידרוקסיל אצטט. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/53386fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> </&gt; <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/53386/53386fig4.jpg" /> איור 4. הרכב Cutin מונומר של WT thaliana ארבידופסיס ושני אללים המוטציה null של גן CYP86A2. (מוטציה-1 = att1-1; מוטציה-2 = att1-2) ברים שגיאה מייצגים סטיית התקן של הממוצע (n = 4) . מעובד מתוך 13, באישור © לקוול ההוצאה לאור (2007). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/53386fig4large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53386/53386supfig1.jpg" /> איור נוסף טבלת 1. שיא תוצאות האינטגרציה מGC התוכנה / MS. פסגות המתאימות מונומרים מזוהים וסטנדרטים פנימיים מזוהות על ידי retenti<html> בזמן (העמודה C) וערכי אזור הם נספר בטור ד <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/Supplemental_Figure_1.tif" target="_blank">&#39;אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53386/53386supfig2.jpg" /> קובץ 2. טבלה נוספת של מונומרים ארבידופסיס cutin (נגזרי אתר trimethylsilyl של אסטרים תיל חומצת שומן הידרוקסי). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/Supplemental_File_2_Cutin_template_TMSi.xls" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53386/53386supfig3.jpg" /> קובץ 3. לוח נוסף של מונומרים ארבידופסיס cutin (נגזרי -acetyl O של אסטרים תיל חומצת שומן הידרוקסי).com / קבצים / ftp_upload / 53,386 &quot;target =&quot; / Supplemental_File_3_Cutin_template_Acetylated_derivatives.xlsx _ blank &quot;&gt; אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/53386/53386supfig4.jpg" /> GC איור 4. נוסף / עקבות FID של (AB) תיל אסטר חומצת שומן (תהילה) סטנדרטים מדד שימור (פסגות מסומנות עם כל אורך שרשרת FAME רווי); ו- (ג) acetylated א מונומרים cutin עלה WT thaliana. מספרים בשיא מתאים ל: 16: 0 תהילה (1), ferulate (2), 18: 3 תהילה (3), 18: 1/18: 2 FAMEs (4), 18: 0 תהילה (5), sinapate (6 ), 16: 0 DCA (7), 16-OH 16: 0 תהילה (8), 18: 2 DCA (9), 18: 1 DCA (10) 18: 0 DCA (11), 18-OH 18: 2 תהילה (12), 18 18-OH: FAME 1 (13), 20: 0 תהילה (14), 10,16-diOH 16: 0 תהילה (15), 24: 0 תהילה (16). DCA: אסתר דימתיל חומצת dicarboxylic; תהילה: תיל אסטר חומצת שומן; IS1: תקן פנימי 1, 17: 0 תהילה; IS2: רח הפנימיandard 2, 15-OH 15: 0 תהילה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/Supplemental_Figure_4.tif" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.</a>

פוליאסטרים ליפידים מהווים את המרכיבים המבניים של שני שינויים בדופן התא, ציפורן הצמח ומחסומי דיפוזיה המכילים סוברין. בסרטון זה אנו מתארים שיטה לדה-פולימריזציה של קוטין מעלים שלמים נטולי שומן. ניתן ליישם את השיטה לחקירת מוטציות שנפגעו בביוסינתזה של קוטין או סוברין.

Terrestrial plants produce extracellular aliphatic biopolyesters that modify cell walls of specific tissues. Epidermal cells synthesize cutin, a polyester ...

צמחים כליים נסמכים על שכבות חוץ-תאיות המתפקדות כמחסומים עמידים למים בין רקמות הצמח לסביבה החיצונית. שכבות תאים ליפופיליות אלו, יחד עם מבנים קשורים, מגבילות זיהומים פתוגניים ומסדירות את ההובלה הפסיבית של גזים, מים וחומרים מומסים אל תוך רקמות הצמח ומחוצה להן. מחסום חשוב אחד הוא הקוטיקולה של הצמח, מבנה מורכב הייחודי לצמחים.קוטין הוא פוליאסטר ליפי של גליקרול שאינו ממיס, המהווה את המטריקס המבני של הקוטיקולה והוא קשור לשעווה הניתנת להמיסה בממסים. כאן אנו מציגים טכניקה מהימנה לבדיקת הרכבן של פוליאסטרים ליפיים ורקמות צמחים דלות ליפידים. בפרוטוקול זה, דגימות של רקמה שלמה נאספות, עוברות הומוגניזציה וניקויי ליפידים יסודיים באמצעות סדרה של מיצויים בממסים כדי להסיר ליפידים ממיסים, כולל שעוות קוטיקולריות ואפיקוטיקולריות.טריגליצרול בליפידים של ממברנה. הדגימות עוברות דה-פולימריזציה למונומרים ליפידיים מרכיבים באמצעות מתילליזה המזורזת על ידי נתרשיום מתוקסיד. מתווספים ריאגנטים לסימולציה כדי לבצע טרנס-מתילציה של קבוצות הידרוקסיל לנגזרות trimethyl cell התואמות, המתאימות לניתוח בכרומטוגרפיה גזית.שאריות נגזרות מועברות לאחר מכן לבקבוקי GC ונטענות למכשיר A-G-C-M-S לצורך אנליזה, המייצרת כרומטוגרמה המאפיינת את ההרכב המונומרי של פוליאסטרים ביולוגיים. אלו נמצאים בדגימות שחולצו. כאן אנו אוספים דגימות של עלים שלמים מצמחי Arabidopsis ANA בוגרים, מסוג בר (wild type) ושני מוטנטים.לצורך מיצוי ואנליזה, הוסיפו 0.5 גרם רקמה למבחנות זכוכית נקיות שנשטפו מראש בכלורופורם. הכניסו 100 מיליליטר של איזופרופנול לבקעי and הוסיפו butylated hydroxy toluene לריכוז של 0.01% BHT הוא נוגש חמצון המתווסף כדי להגן על קשרים כפולים ועל חומצות שומן מחמצון במהלך מיצויים בממס. חממו מראש את הממס באמבט מים לטמפרטורה של כ-85 מעלות.הוסיפו 25 מיליליטר של איזופרופנול מחומם לכל גרם של רקמת צמחים והדגירו את הדגימות ב-LOC בחום ב-85 מעלות למשך 15 דקות. המתינו לקירור המבחנות לטמפרטורת החדר, תוך שימוש במיגון לאוזניים ולעיניים. לבסוף, גרסו את הדגימות באמצעות הומוגניзатор כדי להגיע לפיזור הומוגני, אטמו את המבחנות עם פקקי הברגה ונערעו ב-100 RPM למשך דקה עד שתיים, ואז סבבו את הדגימות בצנטריפוגה ב-800 G למשך 10 דקות.כדי להפריד את הפאזה האורגנית מהחומרים בעלי הצפיפות הגבוהה יותר הדחוסים במשקע, הסירו והשליכו את הנוזל העליון בעזרת פיפטת פסטור או פרופנט. היזהרו לא להפריע למשקע. הוסיפו נפח שווה של isopropanol בטמפרטורת החדר ונערה את הדגימות למשך הלילה.סובב את הדגימות בצנטריפוגה במהירות של 100 RPM והסר את העליון. הוסף 25 מיליליטר של תמיסת כלורופורם ומתנול ביחס של שניים לאחד, לכל גרם רקמה, ונער את הדגימות למשך הלילה; סובב בצנטריפוגה והסר את הפאזה האורגנית. לאחר מכן, חזור על תהליך זה תוך שימוש בתמיסת כלורופורם ומתנול ביחס של אחד לשניים.ייבשו את המשקע למשך לילה והעבירו את המבחנות ממסרק המנוי למייבש בוואקום המכיל סידן סולפט אנהידרי כדי לייבש את הדגימות במשך שלושה ימים לפחות או עד להשגת מסה קבועה. לאחר ייבוש יסודי, הדגימות מוכנות לדפלורציה באמצעות מתאלייזיס המזורז על ידי נתרן מתוקסיד. הוסיפו למבחנות המכילות רקמות יבשות שני תמיסות של סטנדרטים פנימיים באמצעות מזרק זכוכית, החל מ-25 µL של methyl HETO decanoate, ו-25 µL של omega pentec and lactone.כדי להתחיל פולימריזציה עמוקה, הוסיפו 0.9 milliliters של methyl acetate לדגימות, ולאחר מכן 1.5 milliliters של זרז sodium meth oxide ו-3.6 milliliters של methanol. דגרו את הדגימות בטמפרטורה של 60 degrees למשך שעתיים עם vortexing תקופתי בתוך מערכת התגובה; פוליאסטרים של ליפידים מגיבים עם אניוני meth oxide נוקלאופיליים ליצירת תוואים טטרהדרליים לא יציבים, המתפרקים בקלות לחומצות שומן, אסטרים של מתיל ואניוני oxide. אניוני oxide אלו הם בסיסים מצומדים ומגיבים עם methanol כדי להחזיר את אניוני meth IDE הפעילים של הזרז, ובכך שומרים על תגובות פולימריזציה עמוקות נוספות.אם קיים מים במערכת, הם יגיבו עם נתרת מתיל (sodium meth oxide) ליצירת נתרן הידרוקסיד. בסיס חזק זה הופך פוליאסטרים באופן בלתי הפיך לחומצות שומן חופשיות בלתי רצויות. כדי למנוע הידרוליזה, מתווסף מתיל אצטט להסרת כל נתרן הידרוקסיד הנמצא במערכת.יש להמתין עד שהמבחנות יתקררו לטמפרטורת החדר. לאחר הדגירה, יש לחלץ את המונומרים על ידי הוספה של 10 milliliters של methylene dichloride לכל מבחנה. לאחר מכן, יש להוסיף 1.5 milliliters של glacial acidic acid כדי להחמיץ את הדגימות.מלאו את המבחנות בתמיסת נתרן כלוריד בריכוז 0.5 מולרי, ערבבו היטב במערבל vortex וסובבו בצנטריפוגה למשך דקות. בצעו את הפעולה תחת מ hút (מכססת עשן). העבירו בזהירות את השכבה האורגנית התחתונה באמצעות פיפט למבחנות נקיות ששוטפו מראש, בגודל בינוני.שטפו שוב את הדגימות בתמיסת מלח, ערבבו במכשיר וורטקס וסובבו בצנטריפוגה למשך 10 דקות. הסירו את הפאזה המימית העליונה, ולאחר מכן הוסיפו לדגימות נתרת סולפט אניהידרית כחומר מייבש להסרת שאריות מים שנותרו בתמיסה, ערבבו את הדגימות בוורטקס, סובבו בצנטריפוגה, והעבירו את הממיס למבחנות קטנות ונקיות שנשטפו מראש; העמיסו את המבחנות למאייד חנקן כדי לאדות את הממיס ולקבל שאריות יבשות של מונומרים. באמצעות מזרק זכוכית, הוסיפו 100 µL של purine ו-100 µL של B-S-T-F-A כדי להמיר קבוצות הידרוקסיל לנגזרות trimethyl volatile.דגרו את הדגימות ב-100 °C למשך 10 דקות. הניחו למבחנות להתקרר ולאידוי תחת גז חנקן. הוסיפו 500 µL של תמיסת HEPTANE וטולואן ביחס של אחד לאחד כדי להמיס מחדש את השאריות, ולאחר מכן סבבו אותן קצרה בצנטריפוגה.העבירו את דגימות הנגזרות למבחנות GC המכילות אינסרטים של 400 microliter. סגרו את המבחנות והכניסו את הדגימות לגז כרומטוגרף, המזריק אותן לעמודה קפילרית לצורך אנליזה; התמליטים מזוהים לאחר מכן על ידי ספקטרומטר מסות ארבע-קוטירי (quadrupole). הנתונים הגולמיים שנרכשו באמצעות אנליזת GCMS מעובדים ומוצגים ככרומטוגרמה עבור כל דגימה.מונומרים בודדים התואמים לשיאים כרומטוגרפיים שונים מזוהים באמצעות ספקטרומי המסה הספציפיים שלהם. בזמני השהייה ב-GC, כמויות המונומרים הבודדים נקבעות באמצעות שיטת כימות של סטנדרט פנימי, המאפשרת ביצוע השוואות של שכיחות והרכב המונומרים בין דגימות. מוצגים כאן כרומטוגרמות חופפות מאנליזות מייצגות של מונומרים, ששוחררו מרקמת עלה של מורד (abscess) של ארנבת התואמת לסוג הפרא ושני אללים מוטנטיים של גן המקודד לאנזים P450 monooxygenase, המדגימות פרופילים מונומריים מובחנים.התוצאות שלנו מדגימות הבדלים משמעותיים בשפע של שלושה מונומרים עיקריים של קוטין בצמחי arabidopsis מסוג הפרא וצמחים מוטנטיים. פרוטוקול זה הוא שיטה חסונה לבדיקת ההרכב של פוליאסטרים ליפידיים בצמחים באמצעות בידוד, זיהוי וכמתית של המונומרים המרכיבים אותם. ההליך הוא בר-הרחבה וניתן להתאימו בקלות לעיבוד של כמויות גדולות של חומרים צמחיים שונים, כולל שורשים, זרעים, עלים ורקמות שלמות אחרות.טכניקה זו ישימה למחקרים הבוחנים את הבקרה על הביוסינתזה ואת ההפצה של קוטין וסוברין בצמחים גבוהים.

isolation-compositional-analysis-plant-cuticle-lipid-polyester

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

לציפורן המפעל היא הכיסוי החיצוני דונגי על צמחים שיש לו תפקיד עיקרי חיסכון במים אלא גם מחסום חשוב נגד כניסתם של מיקרואורגניזמים פתוגניים. בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את ניתוח לציפורן מוטנטים צמח שזוהה על ידי קדימה הפוכה גישות הגנטיקה.

השימוש מוטאנטים eceriferum ארבידופסיס לחקור לציפורן ביוסינתזה הצמח

ביומסה הצמח הוא משאב מרכזי פחמן ניטרלי מתחדשת שיכול לשמש לייצור דלק ביולוגי. ביומסה הצמח מורכב בעיקר קירות התא, חומר מרוכב מורכבות מבנית כינה lignocellulosics. כאן אנו מתארים פרוטוקול לניתוח מקיף של התוכן הרכב ליגנין polyphenolic.

ניתוח מקיף של ההלחנה קירות התא הצומח (ביומסה Lignocellulosic) חלק א: ליגנין

ביומסה הצמח הוא משאב מרכזי פחמן ניטרלי מתחדשת שיכול לשמש לייצור דלק ביולוגי. ביומסה הצמח מורכב בעיקר קירות התא, חומר מרוכב מורכבות מבנית כינה lignocellulosics. כאן אנו מתארים פרוטוקול לניתוח מקיף של התוכן והרכב של פחמימות קיר נגזר.

ניתוח מקיף של ההלחנה קירות התא הצומח (ביומסה Lignocellulosic) חלק II: פחמימות

הרכב תמציות השומנים הקוטב הרכב חומצות שומן של glycerolipids הפרט נקבעים ניסוי פשוט חזקים פרופיל השומנים. לענין זה, glycerolipids מבודדים על ידי כרומטוגרפיה בשכבה דקה נתונה transmethylation של קבוצות acyl שלהם. Methylesters acyl שומן הם לכמת ידי כרומטוגרפיה גז נוזלי.

Thaliana ארבידופסיס פולאר Glycerolipid פרופיל ידי כרומטוגרפיה בשכבה דקה (TLC) יחד עם כרומטוגרפיה גז נוזלי (GLC)

אברי הצמח אוויר מוגנים על ידי לציפורן, הרכבה סופראמולקולרית biopolyester שעווה. אנו מציגים פרוטוקולים כדי לפקח על הסרת סלקטיבי של EPI-ושעוות intracuticular מ cuticles פירות עגבניות על סולמות מולקולרית מיקרו ידי NMR מצב מוצק וכן במיקרוסקופ כוח אטומי, בהתאמה, על מנת להעריך את יכולת cross-linking של biopolyesters cuticular מהונדסים.

בידוד מחקר Biophysical של cuticles פירות

בידוד ואפיון של תחום שומנים בדם של lipopolysaccharide (LPS) מחיידקי גרם שלילי מספק תובנה מנגנוני תא שטח על בסיס של עמידות לאנטיביוטיקה, הישרדות והכושר בקטריאלי, ואיך כימי שומנים מגוונים מינים מולקולריים דיפרנציאלי לווסת תגובות חיסוניים מולדים מארחות.

בידוד ואפיון כימי ליפידים מחיידקים גראם שליליים

דופן התא החיידקי מורכבת מפפטידוגליקן, רשת מקרומולקולרית של גדילי סוכר המוצלבים על ידי פפטידים. כרומטוגרפיה נוזלית עם ביצועים גבוהים מספקת רזולוציה גבוהה ותפוקה לגילויים חדשניים של הרכב פפטידוגליקני. אנו מציגים הליך לבידוד קירות התא (sacculi) והכנתם לאחר מכן לניתוח באמצעות UPLC.

בידוד והכנת קירות תא חיידקי לניתוח קומפוזיציוני על ידי כרומטוגרפיה נוזלית אולטרה ביצועים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבצע הפקת אתנול ליגנין ממספר מקורות ביומסה. השפעת התנאים החילוץ על התשואה ליגנין ותוכן β-O-4 מוצגים. Depolymerization סלקטיבית מבוצעת על lignins שהושג להשיג מוצרים גבוהה מונומר ארומטי.

מיצוי של ליגנין עם תכולה גבוהה של β-O-4 על-ידי הפקת אתנול מתון והשפעתו על התשואה Depolymerization

ב זוחלים, ליפידים העור של בני מינו הינן קריטיות לצורך איתות מינית, עם פוטנציאל השימוש בניהול מין פולש. כאן, אנו מתארים את הפרוטוקולים עבור חילוץ העור ליפידים מן המחסן עור או כל בעלי החיים, קביעת ניתוח המסה סה כ שומנים בדם ואת המפריד בין ליפידים באמצעות כרומטוגרפיה fractionation באמצעות העמודה.

בידוד כימי, כימות, הפרדת שומנים בעור של זוחלים

פרוטוקול מהיר ויעיל מוצג לבידוד של טיפות שומנים plastoglobule הקשורים אורגניזמים פוטוסינתטיים שונים. הכנה מוצלחת של פלסטוגלובולים מבודדים היא צעד ראשון מכריע שקדם למחקרים מולקולריים מפורטים כגון ניתוחים פרוטאומיים וליפידומיים.

בידוד טיפות שומנים פלסטוגלובול מרקמת עלי הצמח וציאנובקטריה

למדו שיטה לבידוד וניתוח מונומרים פוליאסטר שומנים מצמחים באמצעות GC-MS. הטכניקה מאפשרת חקר ביוסינתזה של קוטין וסוברין בצמחים וניתוח הרכב ליפידים בדגימות עלים.

בידוד והלחנת ניתוח של צמח מונומרים פוליאסטר שומנים ציפורן

גלה סרטונים נוספים