בידוד והלחנת ניתוח של צמח מונומרים פוליאסטר שומנים ציפורן

צמחי כלי דם מסתמכים על שכבות חוץ-תאיות המתפקדות כמחסומים עמידים למים בין רקמות הצמח לסביבה החיצונית. תאים ליפופיליים אלה, בעוד שהם מבנים קשורים, מגבילים זיהום פתוגני ומווסתים את ההובלה הפסיבית של גזים, מים וחומרים מומסים לתוך רקמות הצמח והחוצה מהן. מחסום חשוב אחד הוא ציפורן הצמח, מבנה מורכב ייחודי לצמחים.

Cutin הוא פוליאסטר שומני גליצרול בלתי מסיס המהווה את המטריצה המבנית של הקוטיקולה וקשור לשעוות הניתנות למיצוי ממסים. כאן אנו מציגים טכניקה אמינה לבדיקת הרכב פוליאסטרים ליפידים ולהחזיק רקמות צמחיות שומניות. בפרוטוקול זה, דגימות רקמה שלמות נקצרות, הומוגניות וממצות, רעועות על ידי סדרה של מיצוי ממס להסרת שומנים מסיסים בממס, כולל שעווה קוטיקולרית ושעווה מסוימת.

טריגליצרול בשומנים ממברניים. לאחר מכן הדגימות עוברות דה-פולימריזציה למונומרים השומנים המרכיבים אותן על ידי תחמוצת נתרן מת' מזרזת מתיל ליזה. ריאגנטים לסימולציה מתווספים לקבוצות טרנס מתילאט הידרוקסיל לנגזרות תאי הטרימתיל המתאימות להם המתאימות לניתוח כרומטוגרפי של גז.

שאריות נגזרות מועברות לאחר מכן לבקבוקוני GC ונטענות ל-A-G-C-M-S לניתוח, ויוצרות כרומטוגרמה, המאפיינת את ההרכב המונומרי של ביו-פוליאסטרים. קיים בדגימות שחולצו. כאן אנו קוצרים דגימות עלים שלמים מסוג בר ושתי מוטציות של צמחי ARABIDOPSIS ANA בוגרים.

למיצוי וניתוח, הוסף 0.5 גרם רקמה לצינורות זכוכית נקיים שנשטפו מראש בכלורופורם. מניחים 100 מיליליטר איזופרופנול בבקבוק ומוסיפים בוטילאט הידרוקסי טולואן לריכוז של 0.01%BHT הוא נוגד חמצון שנוסף להגנה על קשרים כפולים וחומצות שומן מפני חמצון במהלך מיצוי ממסים. מחממים את הממס באמבט מים לכ- 85 מעלות.

הוסף 25 מיליליטר איזופרופנול מחומם לגרם רקמת צמח ודגר את הדגימות ב-LOC החום ב-85 מעלות למשך 15 דקות. הניחו לשפופרות להתקרר לטמפרטורת החדר ועם הגנה על האוזניים והעיניים. לבסוף, טוחנים דגימות עם הומוגנייזר כדי להשיג צינורות איטום פיזור הומוגניים עם מכסי בורג ומנערים ב-100 סל"ד עבור דגימת צנטריפוגה אחת עד שתיים ב-800 גרם למשך 10 דקות.

כדי להפריד את השלב האורגני מהחומרים בצפיפות גבוהה יותר הדחוסים לתוך הגלולה, הסר והשליך את הסופרנטנט באמצעות פסטר או פרופנט. היזהר להימנע מהפרעה לגלולה. הוסף נפח שווה של איזופרופנול בטמפרטורת החדר ונער דגימות למשך הלילה.

ב-100 סל"ד, צנטריפוגה את הדגימות והשליכו את הסופרנטנט. אני מוסיף 25 מיליליטר של תמיסה של שניים לאחד של כלורופורם, מתנול, פרגרם של רקמה, ומנער את הדגימות צנטריפוגה למשך הלילה ומשליך את השלב האורגני. לאחר מכן חזור על תהליך זה באמצעות תמיסת מתנול כלורופורם אחת עד שתיים.

יבש את הגלולה למשך הלילה והעביר צינורות ממכסה האדים לייבוש ואקום המכיל סידן גופרתי נטול מים כדי לייבש דגימות לאורך תקופה של שלושה ימים לפחות או עד להשגת מסה קבועה. לאחר ייבוש יסודי, הדגימות מוכנות לפירוק על ידי מטליזה מזורזת של תחמוצת נתרן מת'. הוסף שתי תמיסות של תקנים פנימיים לצינורות המכילים רקמות יבשות באמצעות מזרק זכוכית, החל מ-25 מיקרוליטר של מתיל HETO דקנואט, ו-25 מיקרוליטר של אומגה פנטק ולקטון.

כדי ליזום פילמור עמוק, הוסף 0.9 מיליליטר של מתיל אצטט לדגימות, ואחריו 1.5 מיליליטר של זרז תחמוצת נתרן מת' ו-3.6 מיליליטר מתנול. דגירה של דגימות ב-60 מעלות למשך שעתיים עם מערבולת תקופתית בתוך מערכת התגובה, פוליאסטרים ליפידים מגיבים עם אניונים של תחמוצת מת' נוקלאופיליים ליצירת חומרי ביניים טטרהדרליים לא יציבים, המתפרקים בקלות לחומצת שומן, אסטרי מתיל ואניונים תחמוצת. תחמוצות A אלה הן בסיסים מצומדים ומגיבות עם מתנול המחדשת את אניוני המת' הפעילים בקטאלי, ובכך מקיימות תגובות פילמור עמוקות נוספות.

אם יש מים במערכת, הם יגיבו עם תחמוצת נתרן מת' ליצירת נתרן הידרוקסיד. בסיס חזק הממיר באופן בלתי הפיך פוליאסטרים לחומצות שומן חופשיות לא רצויות. במקום fas למניעת הידרוליזה, מוסיפים מתיל אצטט כדי להסיר כל נתרן הידרוקסיד בתוך המערכת.

הניחו לצינורות להתקרר לטמפרטורת החדר. לאחר הדגירה, חלץ את המונומרים על ידי הוספת 10 מיליליטר מתילן דיכלוריד לכל צינור. לאחר מכן הוסף 1.5 מיליליטר של חומצה חומצית קרחונית כדי להחמיץ את הדגימות.

מלאו את הצינורות בתמיסת נתרן כלורי 0.5 מולארית, מערבולת היטב וצנטריפוגה למשך דקות. מתחת למכסה המנוע. העבירו בזהירות את השלב האורגני התחתון על ידי פיפט לצינורות נקיים שטופים מראש בגודל בינוני.

שוטפים שוב דגימות עם מערבולת תמיסת מלח וצנטריפוגה למשך 10 דקות. הסר את השלב המימי העליון, ולאחר מכן הוסף נתרן גופרתי נטול מים לדגימות כחומר ייבוש כדי להסיר כמויות עקבות של מים שנותרו בצנטריפוגה של דגימות מערבולת תמיסה, והעביר את הממס לניקוי צינורות בגודל קטן שטופים מראש, טען צינורות למאייד חנקן כדי לאדות את הממס ולקבל שאריות יבשות של מונומרים. בעזרת מזרק זכוכית, הוסף 100 מיקרוליטר פורין ו-100 מיקרוליטר B-S-T-F-A כדי להמיר קבוצות הידרוקסיל לנגזרות תאי טרימתיל נדיפים.

דגירה של דגימות בחום של 100 מעלות למשך 10 דקות. אפשר לצינורות להתקרר ולהתאדות תחת גז חנקן. הוסף 500 מיקרוליטר של תמיסת HEPTANE טולואן אחד לאחד לשאריות התמוססות אדומה, אשר לאחר מכן עוברות צנטריפוגה קצרה.

העבר דגימות נגזרות לבקבוקוני GC המכילים 400 תוספות מיקרוליטר. סוגרים את דגימות העומס של הבקבוקונים לתוך כרומטוגרף גז, המזריק אותן לתוך עמוד נימי לניתוח, לאחר מכן מתגלים על ידי ספקטרומטר מסה מרובע. נתונים גולמיים המתקבלים על ידי ניתוח GCMS מעובדים ומוצגים ככרומטוגרמה עבור כל דגימה.

מונומרים בודדים המתאימים לפסגות כרומטוגרפיות שונות מזוהים על ידי ספקטרום המסה הספציפי שלהם. בזמני שימור GC, כמויות המונומרים הבודדים נקבעות בשיטת הכימות הסטנדרטית הפנימית, המאפשרת לבצע השוואות של שפע המונומרים והרכבם בין הדגימות. מוצגות כאן כרומטוגרמות שכבת-על מניתוחים מייצגים של מונומרים, המשתחררים מרקמת עלה מורסה של ארנב המתאימה לסוג הבר ושני אללים מוטנטיים של גן המקודד אנזים P 4 50 mono oxygenase המדגימים פרופילים מונומריים מובחנים.

התוצאות שלנו מדגימות הבדלים משמעותיים, השפע של שלושה צמחי קוטין עיקריים, מונומרים, וצמחי בר ומוטנטיים של ארבידופסיס. פרוטוקול זה הוא שיטה חזקה לבדיקת ההרכב של פוליאסטרים ליפידים צמחיים על ידי בידוד, זיהוי וכימות של המונומרים המרכיבים אותם. ההליך ניתן להרחבה וניתן להתאים אותו בקלות לעיבוד כמויות גדולות של חומרים צמחיים שונים, כולל שורשים, זרעים, עלים ורקמות שלמות אחרות.

טכניקה זו ישימה למחקרים החוקרים את ויסות הביוסינתזה וההפצה של קוטין וסוברין בצמחים גבוהים יותר.