Name: תא Assay חינם לחקר הכרומטין Decondensation בסוף מיטוזה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 4 s
Description: חקור מנגנוני דה-קונדנסציה של כרומטין בסוף מיטוזה באמצעות מערכת תא-חינם עם תמצית ביצי Xenopus laevis וכרומטין מתאי HeLa. שיטה זו מאפשרת מניפולציה ביוכימית ומחקר מבודד של תהליכי מחזור התא.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי קרן המחקר הגרמנית וERC (AN377 / 3-2 ו309,528 CHROMDECON לWA) ומלגת דוקטורט של Boehringer Ingelheim חטיבות לAKS איור 1 &amp; 2 הם נדפסו מתא התפתחותית 31 (3), Magalska et al., פונקצית ATPases כמו-RuvB בdecondensation הכרומטין בסוף מיטוזה, 305-318, 2014, באישור סוג מElsevier.

<ol><li>Lohka, M. J., Masui, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+in+vitro+of+sperm+pronuclei+and+mitotic+chromosomes+induced+by+amphibian+ooplasmic+components%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Formation in vitro of sperm pronuclei and mitotic chromosomes induced by amphibian ooplasmic components.</a> Science. 220, 719-721 (1983).</li>
<li>de la Barre, A. E., Robert-Nicoud, M., Dimitrov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+mitotic+chromosomes+in+Xenopus+egg+extract%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Assembly of mitotic chromosomes in Xenopus egg extract.</a> Methods Mol Biol. 119, 219-229 (1999).</li>
<li>Maresca, T. J., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+studying+spindle+assembly+and+chromosome+condensation+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Methods for studying spindle assembly and chromosome condensation in Xenopus egg extracts.</a> Methods Mol Biol. 322, 459-474 (2006).</li>
<li>Galy, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+gp210+in+mitotic+nuclear-envelope+breakdown%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">A role for gp210 in mitotic nuclear-envelope breakdown.</a> J Cell Sci. 121, 317-328 (2008).</li>
<li>Chan, R. C., Forbes, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+study+of+nuclear+assembly+and+nuclear+import+using+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro study of nuclear assembly and nuclear import using Xenopus egg extracts.</a> Methods Mol Biol. 322, 289-300 (2006).</li>
<li>Gillespie, P. J., Gambus, A., Blow, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+use+of+Xenopus+egg+extracts+to+study+DNA+replication+and+chromatin+associated+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Preparation and use of Xenopus egg extracts to study DNA replication and chromatin associated proteins.</a> Methods. 57, 203-213 (2012).</li>
<li>Gant, T. M., Wilson, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Nuclear assembly.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 13, 669-695 (1997).</li>
<li>Magalska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RuvB-like+ATPases+function+in+chromatin+decondensation+at+the+end+of+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">RuvB-like ATPases function in chromatin decondensation at the end of mitosis.</a> Developmental Cell. 31, 305-318 (2014).</li>
<li>Belmont, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+chromosome+structure+and+condensation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitotic chromosome structure and condensation.</a> Curr Opin Cell Biol. 18, 632-638 (2006).</li>
<li>Lavoie, B. D., Tuffo, K. M., Oh, S., Koshland, D., Holm, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+chromosome+condensation+requires+Brn1p%2C+the+yeast+homologue+of+Barren%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Mitotic chromosome condensation requires Brn1p, the yeast homologue of Barren.</a> Mol Biol Cell. 11, 1293-1304 (2000).</li>
<li>Philpott, A., Leno, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleoplasmin+remodels+sperm+chromatin+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Nucleoplasmin remodels sperm chromatin in Xenopus egg extracts.</a> Cell. 69, 759-767 (1992).</li>
<li>Philpott, A., Leno, G. H., Laskey, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+decondensation+in+Xenopus+egg+cytoplasm+is+mediated+by+nucleoplasmin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Sperm decondensation in Xenopus egg cytoplasm is mediated by nucleoplasmin.</a> Cell. 65, 569-578 (1991).</li>
<li>Burglin, T. R., Mattaj, I. W., Newmeyer, D. D., Zeller, R., De Robertis, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+nucleoplasmin+from+Xenopus+laevis+oocytes+and+analysis+of+its+developmental+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Cloning of nucleoplasmin from Xenopus laevis oocytes and analysis of its developmental expression.</a> Genes Dev. 1, 97-107 (1987).</li>
<li>Whitaker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+at+fertilization+and+in+early+development%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+reviews%22%5BJournal%5D)">Calcium at fertilization and in early development.</a> Physiological reviews. 86, 25-88 (2006).</li>
<li>Gasser, S. M., Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+methods+for+the+isolation+of+individual+and+clustered+mitotic+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Improved methods for the isolation of individual and clustered mitotic chromosomes.</a> Exp Cell Res. 173, 85-98 (1987).</li>
<li>Eisenhardt, N., Schooley, A., Antonin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+in+vitro+assays+to+analyze+the+function+of+transmembrane+nucleoporins+and+targeting+of+inner+nuclear+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Xenopus in vitro assays to analyze the function of transmembrane nucleoporins and targeting of inner nuclear membrane proteins.</a> Methods Cell Biol. 122, 193-218 (2014).</li>
<li>Wignall, S. M., Deehan, R., Maresca, T. J., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+condensin+complex+is+required+for+proper+spindle+assembly+and+chromosome+segregation+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The condensin complex is required for proper spindle assembly and chromosome segregation in Xenopus egg extracts.</a> J Cell Biol. 161, 1041-1051 (2003).</li>
<li>Forbes, D. J., Kirschner, M. W., Newport, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+formation+of+nucleus-like+structures+around+bacteriophage+DNA+microinjected+into+Xenopus+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Spontaneous formation of nucleus-like structures around bacteriophage DNA microinjected into Xenopus eggs.</a> Cell. 34, 13-23 (1983).</li>
<li>Hartl, P., Olson, E., Dang, T., Forbes, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+assembly+with+lambda+DNA+in+fractionated+Xenopus+egg+extracts%3A+an+unexpected+role+for+glycogen+in+formation+of+a+higher+order+chromatin+intermediate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nuclear assembly with lambda DNA in fractionated Xenopus egg extracts: an unexpected role for glycogen in formation of a higher order chromatin intermediate.</a> J Cell Biol. 124, 235-248 (1994).</li>
<li>Sandaltzopoulos, R., Blank, T., Becker, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+repression+by+nucleosomes+but+not+H1+in+reconstituted+preblastoderm+Drosophila+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Transcriptional repression by nucleosomes but not H1 in reconstituted preblastoderm Drosophila chromatin.</a> EMBO J. 13, 373-379 (1994).</li>
<li>Ulbert, S., Platani, M., Boue, S., Mattaj, I. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+membrane+protein-DNA+interactions+required+early+in+nuclear+envelope+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Direct membrane protein-DNA interactions required early in nuclear envelope assembly.</a> J Cell Biol. 173, 469-476 (2006).</li>
<li>Zhang, C., Clarke, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin-independent+nuclear+envelope+assembly+induced+by+Ran+GTPase+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Chromatin-independent nuclear envelope assembly induced by Ran GTPase in Xenopus egg extracts.</a> Science. 288, 1429-1432 (2000).</li>
<li>Paulson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+chromosome+clusters+from+metaphase-arrested+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Isolation of chromosome clusters from metaphase-arrested HeLa cells.</a> Chromosoma. 85, 571-581 (1982).</li>
<li>Ramadan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cdc48%2Fp97+promotes+reformation+of+the+nucleus+by+extracting+the+kinase+Aurora+B+from+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cdc48/p97 promotes reformation of the nucleus by extracting the kinase Aurora B from chromatin.</a> Nature. 450, 1258-1262 (2007).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

Xenopus laevis תמציות ביצה הן כלי שימושי מאוד לשחזר בנאמנות תהליכים תאיים במבחנה, ומערכת זו שימשה בהצלחה באפיון של אירועי מחזור התא וחלוקת תא 2, 3,5,6,17. בשל חנויות גדולות של רכיבים גרעיניים מוחרם בביצה במהלך oogenesis, תמציות ביצה הן מקור מצוין של מרכיבים תאיים. בהשוואה לגישות אחרות כמו RNAi בשורות תאי רקמות יונקים או מניפולציה גנטית, היא מציעה כמה יתרונות: מערכת התא ללא מאפשרת לימוד תהליכים תאיים שבכדאיות סלולרית תהיה אחרת הגבלה. יתר על כ...

תמצית ביצת laevis Xenopus היא כלי רב עוצמה ומיושם באופן נרחב כדי ללמוד אירועים הסלולר מסובכים בפשטות של assay תא ללא. מאז התיאור הראשון שלהם על ידי Lohka &amp; 1 Masui הם כבר בשימוש נרחב ללמוד תהליכי mitotic כגון הכרומטין עיבוי 2, הרכבה ציר 3, התמוטטות מעטפת גרעין 4, אלא גם תחבורת nucleocytoplasmic 5 או DNA שכפול 6. אירועים המתרחשים בסוף מיטוזה, הכרחיים להרפורמציה של גרעין interphasic כגון הרפורמציה מעטפת גרעין והרכבה מחדש מורכבת נקבובית הגרעיני הם הרבה פחות מובנים בהשוואה לאירועי mitotic המוקדמים אך ניתן ללמוד באופן דומה באמצעות תמצית ביצת צפרדעי 7. יש לנו לאחרונה הוקם assay המבוסס על תמצית ביצת צפרדעים ללמוד decondensation הכרומטין בסוף מיטוזה 8, תהליך נחקר תחת שמחכה ליTS אפיון מפורט. בmetazoans, הכרומטין מרוכז מאוד בכניסה mitotic על מנת לבצע בנאמנות הפרדה של החומר הגנטי. כדי להבטיח שהכרומטין נגיש לביטוי גנים ושכפול ה- DNA במהלך שלבי הביניים, זה צריך להיות דה-נדחס בסוף מיטוזה. בבעלי חוליות, הכרומטין הוא עד חמישים ולקפל יותר דחוס במיטוזה לעומת הביניים 9, בניגוד לשמרים שבו דחיסת mitotic היא בדרך כלל נמוכה בהרבה, למשל, כפול רק בס cerevisiae 10. decondensation הכרומטין חוליות כבר למד בעיקר בהקשר של ארגון מחדש DNA הזרע לאחר הפריית ביצית. מנגנון מולקולרי, שבי nucleoplasmin, חלבון ביצית בשפע, מחליף protamines זרע ספציפי לH2A ההיסטונים וH2B מאוחסן בביצה. תהליך זה גם הובהר באמצעות תמצית Xenopus ביצת 11, 12. עם זאת, הביטוישל nucleoplasmin מוגבל לביציות 13 והכרומטין mitotic אינו מכיל protamines הזרע ספציפי אלה. לכן הכרומטין decondensation בסוף מיטוזה הוא nucleoplasmin עצמאי 8. במבחנת התגובה decondensation אנו מעסיקים תמצית המופקת מהביצים מופעלות X. laevis ואשכולות הכרומטין המבודדים מתאי הלה מסונכרנים. טיפול בביצים עם ionophore סידן מחקה את שחרור סידן לתוך הביצית שנוצרה על ידי כניסת זרע במהלך הפריה. גל סידן גורם לחידוש מחזור התא והביצה, נעצר בmetaphase השני של המיוזה, התקדמות לשלבי הביניים הראשונים 14. לכן, תמציות ביצה מוכנות ביצי צורה מופעלת לייצג את מדינת יציאה / הביניים mitotic ומוכשרים כדי לגרום לאירועים ספציפיים ליציאת mitotic כמו decondensation הכרומטין, מעטפת גרעין ולהתעמק הרפורמציה מורכבת. לבידוד של CH mitoticromatin אשכולות השתמשנו גרסה מעט שונה של הפרוטוקול שפורסם על ידי גאסר וLaemmli 15, שבו אשכולות כרומוזום פורסמו על ידי תמוגה מתאי הלה מסונכרן במיטוזה ומבודדת במאגרים המכיל polyamine ידי centrifugations שיפוע.

<table><tbody><tr><td>ספרמין טטרהידרוכלוריד</td><td>פלוקה אנליטי</td><td>85610-25G</td><td></td></tr><tr><td>ספרמידין טריהידרוכלוריד</td><td>סיגמא&nbsp;</td><td>S2501-5G</td><td></td></tr><tr><td>דיגיטונין בטוהר גבוה</td><td>Millipore</td><td>300410-1GM</td><td>PMSF רעיל</td></tr><tr><td></td><td>Applichem</td><td>A0999,0100</td><td></td></tr><tr><td>תימידין</td> רעיל <td>Calbiochem</td><td>6060</td><td></td></tr><tr><td>nocodazole</td><td>Calbiochem</td><td>487928</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת פורמלדהיד רעילה 37%</td><td>Roth</td><td>7398-1</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת טריפן כחולה רעילה (0.4% )</td><td>סיגמא</td><td>T8154</td><td>רעיל</td></tr><tr><td>1,4-דיתיותרייטול (DTT)</td><td>רוט</td><td>6908.2</td><td></td></tr><tr><td>AEBSF הידרוכלוריד</td><td>Applichem</td><td>A1421,0001</td><td></td></tr><tr><td>פפסטאטין</td><td>רוט</td><td>2936.1/2/3</td><td></td></tr><tr><td>לופפטין</td><td>רוט</td><td>CN334</td><td></td></tr><tr><td>אפרוטינין</td><td>רוט</td><td>A162.3</td><td></td></tr><tr><td>פרקול (חלקיקי סיליקה קולואידיים פתרון)</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>גלוטמין</td><td>Gibco</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>75 ס"מ&amp2; צלוחיות תרבית רקמות</td><td>Greiner Bio-one</td><td>658175</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי מומת בחום (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10500-064</td><td></td></tr><tr><td>הומוגנייזר (מטחנת רקמות 40 מ"ל)</td><td>Wheaton</td><td>357546</td><td></td></tr><tr><td>Neubauer Chamber</td><td>Assistent</td><td>441/1</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; צינורות צנטריפוגה של אוק רידג', פוליקרבונט (50 מ"ל)</td><td>Nalgene</td><td>3118-0050</td><td></td></tr><tr><td>100 ומיקרו; מסננת תאים m, ניילון</td><td>BD Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>ציטוכלזין B</td><td>Applichem</td><td>A7657,0010</td><td></td></tr><tr><td>ציקלוהקסימיד</td> רעיל <td>רוט</td><td>8682.3</td><td></td></tr><tr><td>L-ציסטאין</td> רעיל <td>Merck</td><td>1,028,381,000</td><td></td></tr><tr><td>hCG זמין כ-Ovogest</td><td>MSD</td><td></td> 1431593-PMSG <td></td></tr><tr><td>זמין כ-Intergonan</td><td>MSD</td><td>1431015</td><td></td></tr><tr><td>A23187 (תערובת סידן-מגנזיום-מלח</td>)<td>Enzo</td><td>ALX-450-002-M010</td><td></td></tr><tr><td>מחטי מזרק רעילות (1.20 x 40 מ"מ, 18 גרם x 1 1/2 אינץ')</td> <td>בראון</td><td>4665120</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Serva</td><td>10920.03</td><td></td></tr><tr><td>GTP, 2 Na x 3 H20</td><td>Roth</td><td>K056.1/2/3/4</td><td></td></tr><tr><td>מלח דיסודיום קריאטין פוספט</td><td>Calbiochem</td><td>2380</td><td></td></tr><tr><td>קריאטין פוספוקינאז</td><td>סיגמא</td><td>C3755-35KU</td><td></td></tr><tr><td>DMAP</td><td>סיגמא</td><td>D2629-1G</td><td></td></tr><tr><td>DAPI&nbsp;</td>צינורות צנטריפוגה רעילים <td>של Roche</td><td>10236276001</td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>Sigma</td><td>P-6148</td><td></td></tr><tr><td>עבור TLA 100 (7 x 10 מ"מ, 5/16 x 13/16 אינץ')</td><td>בקמן קולטר</td><td>343775</td><td></td></tr><tr><td>"Cell-Saver" (טיפים עם פתיחה רחבה, 1,000 ומיקרו; l)</td> <td>Biozym</td><td>729065</td><td></td></tr><tr><td>50% תמיסת גלוטארלדהיד, דרגה I</td><td>Sigma alderich</td><td>G7651-10 מ"ל</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת פולי-L-ליזין רעילה 0.1% (w/v) תמיסת פולי-L-ליזין</td><td>Sigma</td><td>P8920-100 מ"ל</td><td></td></tr><tr><td>צינורות תחתונים שטוחים (6 מ"ל, 16.0/55 מ"מ)</td> <td>Greiner Bio-one</td><td>145211</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield הרכבה בינונית</td><td>מעבדות וקטור</td><td>H1000</td><td></td></tr><tr><td>צינורות ל-TLA120 (11 x 34 מ"מ, 7/16 x 1 3/8 אינץ')</td><td>בקמן קולטר</td><td>343778</td><td></td></tr><tr><td>"Cell-Saver" (טיפים עם פתיחה רחבה, 200 ומיקרו; l)</td> <td>Biozym</td><td>729055</td><td></td></tr><tr><td>כיסויים 12 מ"מ</td><td>Thermo Scientific</td><td>0784 #1</td><td></td></tr></tbody></table>

תא assay חינם לחקר הכרומטין decondensation בסוף מיטוזה

A Cell Free Assay to Study Chromatin Decondensation at the End of Mitosis

במהלך מחזור התא של בעלי חוליות, הכרומטין עובר שינויים מבניים ותפקודיים נרחבים. עם הכניסה המיטוטית, הוא מתעבה באופן מסיבי לכרומוזומים בצורת מוט המועברים בנפרד על ידי מנגנון הציר המיטוטי. עיבוי כרומטין מיטוטי מניב כרומוזומים דחוסים צפופים פי חמישים כמו באינטרפאזה. במהלך היציאה מהמיטוזה, הכרומוזומים צריכים לבסס מחדש את מצב הבין-פאזה התפקודי שלהם, הסגור על ידי מעטפת גרעינית וכשיר לשכפול ושעתוק. תהליך הפירוק מתואר היטב מבחינה מורפולוגית, אך במונחים מולקולריים אינו מובן היטב: חסר לנו ידע על האירועים המולקולריים הבסיסיים ובמידה רבה על הגורמים המעורבים כמו גם על הוויסות שלהם. אנו מתארים כאן מערכת נטולת תאים המסכמת נאמנה את עיבוי הכרומטין במבחנה, המבוססת על אשכולות כרומטין מיטוטיים המטוהרים מתאי HeLa מסונכרנים ותמצית ביצית X. laevis. המערכת נטולת התאים שלנו מספקת כלי חשוב לאפיון מולקולרי נוסף של עיבוי כרומטין ותיאומו עם תהליכים המתרחשים בו זמנית במהלך יציאה מיטוטית כגון מעטפת גרעינית והרכבה מחדש של קומפלקס נקבוביות.

<html> תלות בזמן של תגובת decondensation איור 1 מציג כמובן זמן אופייני של assay decondensation. האשכול של כרומוזומים גלויים בתחילת התגובה decondenses ומתמזג אחת, סיבוב גרעין חלק ו. כאשר תמצית הביצה הוא הוחלף על ידי סוכרוז חיץ אשכול כרומוזום נשאר מרוכז, אשר מצביעים על כך שפעילות decondensation נוכחת בתמצית הביצה. decondensation הכ...

המנגנונים המולקולריים של דה-קונדנסטציה של כרומטין מיטוטי דחוס מאוד אינם מוגדרים כהלכה. אנו מציגים בדיקה נטולת תאים המבוססת על אשכולות כרומטין מיטוטיים שבודדו מתאי HeLa ותמצית ביצי Xenopus laevis המשחזרת נאמנה את תהליך העיבוי במבחנה.

תא Assay חינם לחקר הכרומטין Decondensation בסוף מיטוזה

During the vertebrate cell cycle chromatin undergoes extensive structural and functional changes. Upon mitotic entry, it massively condenses into rod ...

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לשחזר באופן נאמן את דה-קונדנסציית (פירוק דחיסות) הכרומטין המתרחשת בסיום המיטוזה, בתוך פשטות של בדיקה נטולת תאים (cell-free assay). שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחומי מחקר המיטוזה, שכן היא מאפשרת את אפיון המנגנון המולקולרי של דה-קונדנסציית הכרומטין וזיהוי הגורמים המעורבים בבקרה זו. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן לבצע בה מניפולציות ביוכימיות בקלות על הכרומטין.ניתן לחקור דקולוניזציה באופן מבודד, בנפרד מאירועי מחזור תא אחרים. כדי להתחיל, יש לבודד מקבצי כרומטין מיטוטיים מתאי helo ולהכין את הבאפרים להכנת תמצית ביצי IIC של xenopus lavis כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט המצורף. לאחר ההכנה, השתמש במזרק של 5 מיליליטר המצויד במחט בכיל 27 כדי להזריק 500 international units של הורמון גונדוטרופין כוריוני אנושי לצפרדעים שגרמו להן לבייוץ.הזריקו לצפרדעים תחת העור של שקיק הלימפה הגבי (dorsal lymph sac) בערב שלפני הניסוי כדי להשרות את שחרור הביצים. לאחר ההשראה, החזיקו את הצפרדעים בטמפרטורה של 18 degrees Celsius למשך 13 עד 17 שעות במכלי דגים אינדיבידואליים המכילים 1.2 liters של mark's modified ringers buffer. לאחר שהצפרדעים הטילו את ביציהן, הסירו את הביצים שכבר הופעלו יחד עם ביצים שנראות פגומות. אספו אותן על ידי שפיכת תוכן המכלים לתוך כוסי כימיות מזכוכית בנפח של 600 עד 1000 milliliter בצורה נכונה.מיון הביצים הוא קריטי שכן איכות הביצים הכוללת תלויה בשלב זה. הסירו ביצים שהופעלו, בעלות מראה סיבי או ביצים שנראות פגומות בכל דרך אחרת. כמו כן, המשיכו להסיר ביצים פגומות גם בשלבים מאוחרים יותר.שפכו את העליון (supernatant) של S לאחר שהביצים שוקעות, ולאחר מכן מלאו שוב את הכוסית בבופר טרי. חזרו על תהליך זה ארבע פעמים כדי לשטוף את הביצים לאחר השטיפה האחרונה. הסירו את העליון פעם נוספת ומלאו את הכוסית בתמיסת cysteine בריכוז 2%L כדי להבדיל את הביצים.לאחר שתיים עד ארבע דקות, החליפו לתמיסת באפר טרייה המכילה L cysteine. הגדירו את תהליך הדה-ג'לינג (de geling) כשלם כאשר נפח הביצים פוחת באופן דרסטי והביצים הופכות לדחוסות יותר, לאחר כחמש עד שבע דקות. לאחר מכן, שטפו בזהירות את הביצים ב-mark's modified ringers buffer באמצעות שפיכה ומילוי מחדש של הבאפר על דופן הכוס, במקום ישירות על הביצים.לאחר מכן, הפעילו את הביציות ב-100 milliliters של Marx modified ringers buffer המכיל שמונה µL של 2 mg/mL של Calcium ion. 4, הפסיקו את ההפעלה כאשר התכווצות ה-animal cap הופכת לנראית.לחלופין, 10 דקות לאחר ההפעלה, שטפו את הביצים בזהירות בבופר Mark's modified Ringer's על ידי שפיכה ומילוי מחדש של הבופר, ושאיפת הנוזל לאחר השטיפה האחרונה. דגרו את הביצים בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות בבופר Mark's modified Ringer's. לאחר מכן, הכינו מבחנות צנטריפוגה של 5 מיליליטר המכילות 50 µl של בופר סוכרוז ו-50 µl של מעכב פרוטאז בריכוז של 100 fold.ערבב 5 µL של DTT בריכוז 1 M,‏ 12.5 µL של cyclo heximide, ו-2.5 µL של cyto. B. שטוף את הביצים פעמיים בבופר סוכרוז קר, ולאחר מכן העבר אותן למבחנות צנטריפוגה. באמצעות פיפט פסטור פלסטיק עם פתח רחב, דחוס את הביצים על ידי סבב של המבחנות למשך דקה אחת במהירות של 130 G. לאחר הצנטריפוגה, הסר את עודפי הבופר באמצעות פיפט פסטור פלסטיק ומלא את החלל הנותר בביצים נוספות.לאחר מכן, סנטריפוגו את המבחנות המלאות בביצה ברוטור תנודתי (swing rotor) של 5x6 מ"ל למשך 20 דקות בטמפרטורה של 4 °C ובכוח של 21,000 ×g. כאשר התמיסה מופרדת כעת לשלוש שכבות, החדירו מזרק של 5 מ"ל עם מחט בנבב (gauge) 16 דרך דופן המבחנה אל השכבה האמצעית, שבין החלמון הצהוב למעלה לבין שאריות הביצה כהות הצבע בתחתית. העבירו את התמצית הפאזית במהירות נמוכה (low speed phasic extract) למבחנה נקייה על קרח, ולאחר מכן הוסיפו 10 µL של מעכב פרוטאז (protease inhibitor) בדילול של 100-fold.ערבבו 1 µL של DTT בריכוז 1 M, ‏2.5 µL של cyclo heximide בריכוז 20 mg/mL, ו-0.5 µL של cyto B. הוסיפו 10 mg/mL לכל מיליליטר מהתמצית במהירות נמוכה (low speed extract). סובבו את התמצית הפאזית במהירות נמוכה למשך 12 דקות ב-355,000 ×g ברוטור של 10 על 2 mL. לאחר מכן, הסירו בעדינות את שכבת השומן שמעל והעבירו את הסופרנאט המכיל את התמצית במהירות גבוהה (high speed extract) למבחנה נקייה.שלב זה הוא קריטי להפקת דגימה באיכות גבוהה. יש לוודא שהנוזל שמוסר אינו מכיל זיהומים משכבת הליפידים העליונה או מהשכבה התחתונה המפריעה. העבר בעזרת פיפטה 18 µL של התמצית במהירות גבוהה אל מבחנת תגובה בנפח 1.5 mL, ולאחר מכן הוסף 0.5 µL של glycogen ו-0.5 µL של energy mix.הוסיפו 0.3 µL של 6-dimethylpurine ו-0.7 µL של mitotic clusters. השתמשו בטיפים בעלי פתח רחב כדי לערבב את התגובה מיד עם הוספת הכרומטין, וזאת כדי למנוע גזירה (shearing) של הכרומטין המפורק. לאחר הערבוב, דגרו את תערובת התגובה למשך עד שעתיים בטמפרטורה של 20 °C.לאחר מכן, קבעו את הדגימה על ידי הוספת 0.5 milliliters של מקבע קר מאוד המכיל 4%paraldehyde, 0.5%glutaraldehyde ו-0.1 milligram per milliliter dpi. באמצעות טיפים עם פתח רחב, דגרו את הדגימה על קרח למשך 20 עד 30 דקות. לאחר מכן, צפו לוחות כיסוי עגולים בקוטר 12 millimeter בתמיסת poly L lysine בריכוז של 0.1%weight to volume, ודגרו את לוחות הכיסוי למשך חמש דקות כדי להגביר את זיקת לוחות הכיסוי.כדי לייבש את זכוכיות הכיסוי, הניחו אותן על נייר סינון לאחר מכן. לאחר הייבוש, הכניסו את זכוכיות הכיסוי המצופות לתחתית של מבחנות צנטריפוגה בעלות תחתית שטוחה בנפח ששה מיליליטר, כך שהצד המצופה פונה כלפי מעלה. לאחר מכן, הוסיפו 800 µL של כרית סוכרוז 30% והניחו את כל הדגימה המקובעת מעליה.סובב את הדגימה במשך 15 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס ו-2,500 ×g. לאחר מכן, שפוך את העליון (supernatant) והסר את זכוכית הכיסוי מהמבחנות על ידי דקיקה זהירה בתחתית מבחנת הצנטריפוגה בעזרת מחט בכיול 16 gauge. כאשר זכוכית הכיסוי מורמת על ידי המחט בצד אחד, השתמש בפינצטה כדי להסיר את זכוכית הכיסוי, שטוף אותה במהירות על ידי טבילה במים דה-יוניים, ולאחר מכן ייבש אותה בעדינות על ידי נגיעה בצדה בנייר סינון. לאחר מכן, הנח טיפה של מדיום קיבוע (mounting media) על סלייד של מיקרוסקופ והנח עליו את צד הדגימה של זכוכית הכיסוי.הנח את זכוכית הכיסוי על מדיום הקיבוע. ייבש את זכוכית הכיסוי בעדינות בעזרת נייר סופג, אטום את שולי זכוכית הכיסוי בעזרת לק שמרי את הפיתוח בחושך עד לצילומו. להלן מהלך הזמן הטיפוסי של בדיקת הדקומפנסציה.צבר הכרומוזומים הנראה בתחילת התגובה, decon, מעבה ומתמזג לגרעין עגול וחלק אחד. כאשר תמצית הביצית מוחלפת בבופר סוכרוז, צבר הכרומוזומים נשאר מעובה, מה שמעיד על נוכחות של פעילות דקומפנצציה בתמצית הביצית. בניסוי המוצג כאן, התווספו לתגובה אנלוגים של ATP או GTP שאינם עוברים הידרוליזה.שני תוספים אלו מעכבים את הדקונדנסציה (decondensation), מה שמוכיח שתהליך פעיל זה תלוי הן ב-ATP והן ב-GTP hydrolysis. לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו בערך בשעתיים עבור הכנת תמצית ביצי ברמות סינגפור, ושלוש שעות עבור בדיקת קידום הדקולוניזציה. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור שההצלחה תלויה באופן קריטי באיכות התמצית.במיוחד עבור דיפלציות אימונולוגיות (immuno depletions), מומלץ להשתמש בתמצית שהוכנה טריס בהתאם להליך זה. ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון דיפלציות אימונולוגיות והוספה של חלבונים רקומביננטיים, כדי לענות על שאלות נוספות, למשל אילו גורמים מעורבים. טכניקה זו תסלול את הדרך לחוקרים בתחומי המיטוזה או מבנה ותפקוד הגרעין לחקור את דה-הומניזציית הכרומטין כפי שהיא מתרחשת בסוף המיטוזה בתאי בעלי חיים.לאחר צפייה בסרטון זה, תגיעו להבנה טובה של אופן הכנת תמציות ביצי כבד של Xenopus וכיצד ליישם את השיטה לreconstitution של chromatin decolonization. זכרו כי עבודה עם Paraform Hyde, Hyde ו-DARPA עלולה להיות מסוכנת, ויש לנקוט באמצעי זהירות, כגון חבישת כפפות.

a-cell-free-assay-to-study-chromatin-decondensation-at-end

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

פרוטוקול זה מתאר כיצד הכרומטין immunoprecipitation (שבב) משמש ללימוד שינויים דינאמיים לתבנית הכרומטין המווסתים את שעתוק המושרה על ידי במסלול הולכת אותות.

הכרומטין immunoprecipitation (שבב) לשינוי Assay דינמי היסטון בביטוי הגנים המופעלת בתא האדם

ניתוח הכרומטין אינטראקציה ידי מנבא סוף תג הרצף (Chia-PET) היא...

הכרומטין ניתוח אינטראקציה עם מנבא סוף תג הרצף (Chia-PET) עבור מיפוי אינטראקציות הכרומטין הבנת תקנה תמלול

Metaphase לanaphase מעבר מופעל באמצעות anaphase-קידום מורכב (APC / C)-התלוי ubiquitination וההרס הבא של cyclin B. הנה, הקים מערכת ש, בעקבות דופק מרדף תיוג, מאפשר ניטור proteolysis B cyclin באוכלוסיות תאים שלמות ו מאפשר זיהוי של הפרעה על ידי המחסום המיטוטי.

לומד Proteolysis של cyclin B ברמת התא הבודד באוכלוסיות תאים שלמות

פרוטוקול זה מתאר שיטה להמחשת DNA חלבון איתות הפסקה כפולת גדיל הופעל בתגובה לניזק לדנ"א, כמו גם הלוקליזציה שלה במהלך מיטוזה.

שתי והדמית תא חייה תלת ממדית של חלבוני תגובת ניזק לדנ&quot;א

אנו מתארים שיטה חזקה לimmunoprecipitation הכרומטין באמצעות תאי T ראשוניים. השיטה מבוססת על גישות סטנדרטיות, אך משתמשת בקבוצה מסוימת של תנאים וריאגנטים המשפרים את היעילות למוגבלים בכמויות של תאים. חשוב מכך, תיאור מפורט של שלב ניתוח הנתונים מוצג.

הכרומטין immunoprecipitation יעיל באמצעות כמויות מגבילות של ביומסה

Oogenesis ביונקים ידוע להיות מועדת לטעויות, במיוחד עקב כרומוזום missegregation. כתב יד זה מתאר שיטות הכנה כרומטין להפיץ prophase העכבר, מפה של אני, oocytes ביים השני. טכניקות יסוד אלה מאפשרים לימוד חלבוני כרומטין מכורך כרומוזום מורפולוגיה ברחבי oogenesis יונקים.

כרומטין להפיץ את ההכנות לניתוח של העכבר Oocyte התקדמות מן Prophase כדי מפה של השני

הפלסטיות המדהימה של אדריכלות גרעיני נשלטת על ידי מנגנוני epigenetic דינאמי כולל ללא קידוד RNAs, DNA מתילציה, שינוי מיקום נוקלאוזום וכן היסטון הרכב השינוי. כאן נתאר פרוטוקול Formaldehyde-Assisted בידוד של הרגולציה אלמנטים (שלהם) אשר מאפשר קביעת כרומטין נגישות בצורה פשוטה, זולה הדירים.

בסיוע פורמלדהיד בידוד של אלמנטים הרגולציה על אמצעי נגישות כרומטין בתאים בתרבית

פרוטוקול זה מתאר שיטה קלה ונוחה כדי לתייג והמחש בשידור חי הכרומוזומים בתאים mitotic באמצעות תווית 2.0 BacMam Histone2B-GFP ומערכת מיקרוסקופיה קונפוקלית דיסק מסתובב.

תא חי הדמיה של הפרדה בין כרומוזום במהלך מיטוזה

כרומטין immunoprecipitation (שבב) הוא כלי רב עוצמה להבנת המנגנונים המולקולריים של רגולציה גנטית. עם זאת, השיטה כרוכה בקשיים בהשגת פיצול כרומטין באמצעות הטיה מכנית. כאן, אנו מספקים פרוטוקול משופר לצורך שיטת שבבים באמצעות עיכול אנזימטי.

כרומטין Immunoprecipitation שימוש בנוקלאוסים מיקרוקוקל בתאי מיונקים

כאן אנו מציגים פרוטוקול להערכת הדינמיקה של היווצרות צירים והתקדמות mitotic. היישום שלנו של הדמיה זמן לפקיעה מאפשר למשתמש לזהות תאים בשלבים שונים של mitosis, לעקוב ולזהות פגמים mitotic, ולנתח את הדינמיקה הציר ואת הגורל mitotic cell בעת חשיפה לתרופות נגד mitotic.

הדמיה של תא חי כדי להעריך את הדינמיקה של תזמון מטאמפאזה ואת הגורל התאים בעקבות Mitotic צירים רטבאליות

מיקרוסקופיה בהילוך מהיר היא כלי רב ערך לחקר מיוזה בשמרים ניצנים. פרוטוקול זה מתאר שיטה המשלבת סנכרון מחזור התא, מיקרוסקופיה בהילוך מהיר ודלדול מותנה של חלבון מטרה כדי להדגים כיצד לחקור את תפקודו של חלבון מסוים במהלך הפרדת כרומוזומים מיוטיים.

שימוש במיקרוסקופיה של קיטועי זמן ודלדול גרעיני ספציפי לשלב של חלבונים כדי לחקור מיוזה ב- S. cerevisiae

חקור מנגנוני דה-קונדנסציה של כרומטין בסוף מיטוזה באמצעות מערכת תא-חינם עם תמצית ביצי Xenopus laevis וכרומטין מתאי HeLa. שיטה זו מאפשרת מניפולציה ביוכימית ומחקר מבודד של תהליכי מחזור התא.

תא Assay חינם לחקר הכרומטין Decondensation בסוף מיטוזה

גלה סרטונים נוספים